KR102132198B1 - CRISPR system specific for TERT promoter mutation and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TERT 프로모터 돌연변이에 특이적인 CRISPR interference (CRISPRi) 시스템을 이용한 DNA 표적용 조성물, 상기 시스템을 이용한 암의 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 및 이미징 조성물, CRISPR interference (CRISPRi) 시스템에 이용되는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA) 및 그의 이용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA) 및 이를 이용한 CRISPRi 시스템은 선택적이고 효과적으로 TERT 프로모터의 점돌연변이 (point mutation)을 표적하고 이의 활성을 억제할 수 있는 바, 이러한 후성편집기술을 통한 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이 TERT 프로모터 표적화는 새로운 암 치료법으로써 매우 적합할 것으로 기대된다.The present invention is a composition for DNA targeting using a CRISPR interference (CRISPRi) system specific for a TERT promoter mutation, a composition for preventing or treating cancer using the system, a diagnostic and imaging composition, and a single strand used in a CRISPR interference (CRISPRi) system Guide RNA (sgRNA) and its use. The single-stranded guide RNA (sgRNA) according to the present invention and the CRISPRi system using the same can selectively and effectively target the point mutation of the TERT promoter and inhibit its activity, -124 C through such epigenetic editing technology Targeting the >T or -146 C>T mutant TERT promoter is expected to be very suitable as a new cancer therapy.
Description
본 발명은 TERT 프로모터 돌연변이에 특이적인 CRISPR interference (CRISPRi) 시스템을 이용한 DNA 표적용 조성물, 상기 시스템을 이용한 암의 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 및 이미징 조성물, CRISPR interference (CRISPRi) 시스템에 이용되는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA) 및 그의 이용에 관한 것이다.The present invention is a composition for DNA targeting using a CRISPR interference (CRISPRi) system specific for a TERT promoter mutation, a composition for preventing or treating cancer using the system, a diagnostic and imaging composition, and a single strand used in a CRISPR interference (CRISPRi) system Guide RNA (sgRNA) and its use.
암은 우리나라에서 순환기 질환과 함께 가장 많이 발생하는 질환이다. 정상적으로 세포는 세포내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하며 세포수의 균형을 유지하며 살아간다. 이러한 세포가 손상을 받는 경우, 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 되어 통제되지 못하고 과다하게 증식할 뿐만 아니라, 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 경우가 있다. 이 상태를 암 또는 종양(cancer)이라 정의한다. Cancer is the most common disease with circulatory diseases in Korea. Normally, cells divide, grow and die by the intracellular regulation function, and maintain the balance of cell numbers. When these cells are damaged, they become abnormal cells whose proliferation and suppression are not regulated and become uncontrolled and excessively proliferative, and may invade surrounding tissues and organs to cause mass formation and destruction of normal tissues. This condition is defined as a cancer or tumor.
종양에는 양성종양과 악성종양이 있으며, 양성종양은 비교적 서서히 성장하며, 신체 여러 부위에 확산, 전이하지 않으며 제거하여 치유시킬 수 있는 종양을 말하고, 특이한 경우를 제외하고 대개의 양성종양은 생명에 위협을 초래하지는 않는다. 이와 달리 악성종양은 빠른 성장과 침윤성(파고들거나 퍼져 나감) 성장 및 체내 각 부위에 확산 전이(원래 장소에서 떨어진 곳까지 이동함)하여 생명에 위험을 초래하는 종양을 말한다.Tumors include benign tumors and malignant tumors. Benign tumors grow relatively slowly and do not spread, metastasize to various parts of the body and can be removed and healed. Most benign tumors are life-threatening except in unusual cases. Does not cause Malignant tumors, on the other hand, are tumors that pose a danger to life by rapid growth and invasive (digging or spreading) growth and spreading metastasis to each part of the body (moving away from the original site).
특히, 간세포암종 (hepatocellular carcinoma, HCC)은 우리나라 뿐만 아니라 전 세계적으로 암 관련 사망원인 3위에 있으며, 빈도가 증가하는 암종이다. HCC는 임상적, 병리적 그리고 분자적 수준에서 매우 이질적인 (heterogenous) 질환으로 80~90% 이상이 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV), C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV), 알코올 (alcohol), 대사성 질환 (metabolic etiologies) 등에 의하여 발생한 간경화에서 발생한다. HCC는 간경화 결절 (cirrhotic nodule, regenerating nodule) > 이형성 결절 (dysplastic nodule, DN) > 초기간세포암종 (early HCC) > 진행성 간세포암종 (progressed HCC) > 간내/간외 전이의 다단계 간세포암종 발암 (multistep hepatocarcinogenesis) 으로 정립되어 있으나 다른 암과는 달리 발생 및 진행 관련 유전자적 변화는 TP53, CTNNB1 유전자의 돌연변이와 소수의 유전자변이 이외에 거의 알려진 유전자 변이는 없다. In particular, hepatocellular carcinoma (HCC) is the third most common cause of cancer-related deaths in Korea and around the world, and is an increasing type of carcinoma. HCC is a very heterogeneous disease at the clinical, pathological and molecular level, with over 80% to 90% of hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and alcohol (alcohol), metabolic disease (metabolic etiologies) caused by cirrhosis. HCC is cirrhotic nodule, regenerating nodule> dysplastic nodule (DN)> early HCC> progressive HCC> multistep hepatocarcinogenesis However, unlike other cancers, genetic changes related to development and progression are almost no known genetic mutations other than mutations in the TP53 and CTNNB1 genes and a small number of genetic mutations.
또한, 피부암은 야외활동 증가와 같은 최근 생활 패턴 및 환경오염에 따른 오존층의 파괴로 인한 자외선의 유입량 증가로 인해 각종 유해물질이나 자외선의 노출 기회가 빈번해지고, 인간의 평균수명이 늘어나면서 자외선 축적량이 많은 고령 인구수가 늘어남에 따라 그 환자수가 전 세계적으로 지속해서 증가하고 있다. 피부암은 피부 악성 종양으로 대표적인 종류로는 기저세포암, 편평상피세포암, 흑색종이 있다. 그 중 흑색종은 피부, 눈알, 뇌척수 연막 등 멜라닌 세포가 존재하는 어느 부위에서나 발생할 수 있으며, 다른 피부암과 달리 성장 속도가 매우 빨라 발생 초기에 다른 장기로 전이율이 높고 재발하기 쉬워 악성도가 높은 종양으로 알려져 있다. 흑색종의 주요 전이 부위는 원발병소 이외의 피부이지만 그 밖에도 림프절, 뼈, 폐, 간, 비장 등 어떤 기관들도 침범될 수 있다. 특히 뇌와 척수로의 전이는 주요 사망 원인으로 꼽히고 있다. 미국의 국립 암 연구소(National Cancer Institute)가 추정하는 바에 따르면 2012년에 미국에서의 흑색종 환자는 996,587명으로 예측되었다. 또한 2009년에 미국 통계국 발표에 따르면 향후 50년 후 아시아인에게서 흑색종의 발병인구가 지금의 3배로 증가될 것으로 예측되었다. 실제로 우리나라의 경우, 건강보험심사평가원의 조사로는 지난 2010년부터 2014년까지 피부의 흑색종으로 진료받은 환자수가 5년 사이에 약 63% 증가한 것으로 나타났다. In addition, skin cancer is frequently exposed to various harmful substances or ultraviolet rays due to an increase in the amount of ultraviolet rays caused by the destruction of the ozone layer due to recent lifestyle patterns such as increased outdoor activities and environmental pollution. As the number of older populations increases, the number of patients continues to increase worldwide. Skin cancer is a malignant tumor of the skin. Representative types include basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, and melanoma. Among them, melanoma can occur anywhere on the skin, eyeball, and cerebrospinal fluid, where melanocytes are present, and unlike other skin cancers, the growth rate is very fast. It is known as a tumor. The primary metastatic site of melanoma is skin outside the primary site, but other organs such as lymph nodes, bones, lungs, liver, and spleen may also be affected. In particular, metastasis to the brain and spinal cord is considered the main cause of death. According to estimates by the National Cancer Institute in the United States in 2012, there were an estimated 996,587 melanoma patients in the United States. In addition, according to the US Bureau of Statistics released in 2009, it is predicted that in the next 50 years, the incidence of melanoma among Asians will triple. In fact, in Korea, a survey by the Korea Health Insurance Review and Assessment Service found that the number of patients treated for melanoma of the skin from 2010 to 2014 increased by about 63% in 5 years.
이러한 흑색종은 초기에 진단되면 수술의 방법으로 쉽게 치료가 가능하지만 통증을 경험하게 되고 수술 후 얼마간은 피곤함을 느끼거나 위약감을 느끼게 되며 림프절을 절제한 경우에는 감염과 림프부종을 경험할 수 있다. 또한 수술범위나 종양의 위치, 개인의 체질에 따라 흉터가 남을 수 있다는 부작용이 있다. 게다가 흑색종은 종래의 화학요법제 및 방사선에 대한 높은 저항성을 가지기 때문에 초기 이상 진행되거나 재발한 경우에는 현재까지 특별한 치료방법이 없는 난치성 질환이다. 방사선 치료의 경우 방사선을 조사한 부위의 피부가 건조해지거나 붉게 변하며 모발이 빠질 수 있고 피부염이 생길 수 있다는 부작용이 있고, 항암화학요법에서 사용되는 치료제들은 다카르바진 (DTIC), 카르무스틴 (BCUN), 로무스틴 (CCNU), 시스플라틴 (cisplatin) 등이 있으며 이들을 단일요법으로 사용하기도 하고 복합요법으로 사용하기도 하는데 이들은 대부분은 인공으로 합성된 물질로, 그 효과는 미약할 뿐만 아니라 오심, 구토, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 몸살 증상, 설사 등과 같은 부작용이 매우 심각하다. If melanoma is diagnosed early, it can be easily treated by surgical methods, but it may experience pain and some feeling of fatigue or placebo after surgery, and if lymph nodes are excised, infection and lymphedema can be experienced. In addition, there is a side effect that scars may remain depending on the surgical range, the location of the tumor, and the constitution of the individual. In addition, melanoma is a refractory disease that has no special treatment until now if it has advanced or recurred because of its high resistance to conventional chemotherapeutic agents and radiation. In the case of radiation treatment, there is a side effect that the skin of the irradiated area may become dry or turn red, hair may fall out, and dermatitis may occur. Treatments used in chemotherapy are dacarbazine (DTIC) and carmustine (BCUN). , Lomustine (CCNU), cisplatin, etc. They are used as monotherapy or as complex therapy. Most of them are artificially synthesized substances, and their effects are not only weak, but also nausea, vomiting, and leukopenia. , Side effects such as thrombocytopenia, body aches and diarrhea are very serious.
최근 TERT promoter 체세포 돌연변이 (somatic mutation)이 melanoma, HCC 및 다른 몇몇 암에서 자주 나타난다는 보고가 있다. Melanoma의 경우 -124 C>T, -146 C>T 돌연변이가 보고되었고, TERT promoter의 -124 C>T somatic mutation이 HCC의 경우 약 59%에서 관찰된다고 보고된 바 있다. HCC 치료제로 사용되어지고 있는 소라페닙 (sorafenib)의 경우 약물로 인한 장기간의 생명 연장 이득이 없으며, 내성 유발 등 한계가 있기에 유전자 치료 등 효과적인 신규 치료법 개발이 절실히 필요하다.Recent reports have shown that TERT promoter somatic mutations are common in melanoma, HCC and some other cancers. In the case of Melanoma, -124 C>T, -146 C>T mutations were reported, and it was reported that -124 C>T somatic mutations of the TERT promoter were observed in about 59% of HCC. Sorafenib, which has been used as a therapeutic agent for HCC, has no long-term life-prolonging benefit from drugs and has limitations such as resistance induction, so it is urgently needed to develop effective new treatments such as gene therapy.
한편, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) / Cas9 system은 박테리아에서 발견된 면역 시스템 (immune system)으로 파지 (phage)에 대한 방어기작으로 작용한다. 단일가닥 가이드 RNA (sgRNA)에 의해 표적 DNA의 표적 염기가 인식되고 Cas9 단백질이 함유한 뉴클레아제 (nuclease) 활성에 의해 DNA 이중가닥절단 (double strand break, DSB)을 일으키는 RNA 유도형 유전자 가위이다. 기존의 ZFN, TALEN 유전자 가위에 비해, 20개의 염기서열을 인식하는 sgRNA와 Cas9 단백질 인식 PAM (protosapcer adjacent motif) 서열만 있으면 sgRNA의 서열 변화만을 통해 어느 DNA 부위든지 표적하여 편집할 수 있는 장점이 존재한다. 또한 복수의 sgRNA를 이용하여 동시에 복수의 표적도 가능하며, 그 효율 또한 ZFN과 TALEN에 비해 비약적으로 높다. 이는 세포실험과 동물실험을 통해 포유류 세포 및 동물에서도 매우 잘 작동함이 알려져 있다. On the other hand, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) / Cas9 system is an immune system found in bacteria that acts as a defense mechanism against phage. It is an RNA-guided gene scissor that recognizes the target base of target DNA by single-stranded guide RNA (sgRNA) and causes DNA double strand break (DSB) by the nuclease activity contained in the Cas9 protein. . Compared to the existing ZFN and TALEN gene scissors, the advantage of being able to target and edit any DNA region through only the sequence change of sgRNA is as long as the sgRNA that recognizes 20 base sequences and the Cas9 protein recognition PAM (protosapcer adjacent motif) sequence are present. do. In addition, a plurality of targets can be simultaneously performed using a plurality of sgRNAs, and the efficiency is also significantly higher than that of ZFN and TALEN. It is known that it works very well in mammalian cells and animals through cell experiments and animal experiments.
이에 본 발명자들은 HCC에서 발견되는 -124 C>T 또는 -146 C>T somatic TERT 프로모터 돌연변이 염기 부위를 표적하여 CRISPR system을 통해 mutant TERT 프로모터에 특이적으로 작동하고 wild TERT promoter에는 작동하지 않는 sgRNA를 제작 하였다. 또한 Cas9의 뉴클레아제 (nuclease) 활성이 없어 DSB를 일으키지 않는 돌연변이 (D10A / H840A) dead Cas9을 사용하고, 후성편집자로 알려진 KRAB을 도입하여 돌연변이 TERT 프로모터를 타겟팅하기 위한 CRISPR system을 구축하였다. 또한, 이에 따라, TERT 프로모터의 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이를 가지는 HCC만을 표적하기 위한 CRISPR interference (CRISPRi) system을 구축하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. Accordingly, the present inventors target a mutant base region of the -124 C>T or -146 C>T somatic TERT promoter found in HCC, and sgRNA that specifically works for the mutant TERT promoter through the CRISPR system and does not work for the wild TERT promoter. Was produced. Also, a CRISPR system for targeting the mutant TERT promoter was constructed by using a mutant (D10A / H840A) dead Cas9 that does not cause DSB due to lack of nuclease activity of Cas9 and introducing KRAB known as an epigenetic editor. In addition, according to this, a CRISPR interference (CRISPRi) system for targeting only HCCs having a -124 C>T or -146 C>T mutation of the TERT promoter was constructed and the present invention has been completed.
따라서 본 발명의 목적은 CRISPR interference (CRISPRi) 시스템을 이용한 DNA 표적용 조성물에 관한 것이다.Accordingly, an object of the present invention relates to a composition for DNA targeting using a CRISPR interference (CRISPRi) system.
또한, 본 발명의 목적은 상기 시스템을 이용한 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. In addition, the object of the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer using the system.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR interference (CRISPRi) 시스템에 이용되는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)에 관한 것이다.Further, another object of the present invention relates to a single strand guide RNA (sgRNA) used in a CRISPR interference (CRISPRi) system.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention
TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 상기 가이드 RNA를 암호화 하는 DNA; 및A guide RNA comprising a nucleotide sequence complementary to a TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter, or DNA encoding the guide RNA; And
Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 표적용 조성물을 제공한다. Provided is a composition for DNA targeting, comprising a Cas9 polypeptide or a polynucleotide encoding the same.
상기 조성물은 DNA의 발현을 억제하는 것일 수 있다. The composition may be to suppress the expression of DNA.
또한, 상기 TERT 프로모터는 1개 이상의 점 돌연변이 (point mutation)을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 TERT 프로모터는 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.In addition, the TERT promoter may include one or more point mutations, and the TERT promoter may include -124 C>T or -146 C>T mutations.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 TERT 프로모터의 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 20개의 뉴클레오타이드인 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드는 3‘ 말단으로부터 1 내지 5번째에 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 것일 수 있다. 특히, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 1 (5‘ - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA - 3’) 또는 서열번호 2 (5‘ - GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG - 3’)의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. In addition, the nucleotide may be 20 nucleotides comprising a base complementary to a -124 C>T or -146 C>T mutation of the TERT promoter, wherein the nucleotide is -124 C from 1'to 5'from the 3'end. >T or -146 C>T. In particular, the nucleotide may be made of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( 5' - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA -3' ) or SEQ ID NO: 2 ( 5'-GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG-3' ).
또한, 상기 Cas9은 생물학적으로 불활성화된 Cas (dCas)인 것일 수 있으며, 상기 Cas9 단백질은 C-말단, N-말단 또는 C-말단 및 N-말단에, KRAB, KOX, SID, MBD2, MBD3, DNMT1, DNMT3A 및 DNMT3B로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 도메인이 연결된 것일 수 있으며, 바람직하게는 N-말단에 KRAB 도메인이 연결된 것일 수 있다. In addition, the Cas9 may be a biologically inactivated Cas (dCas), and the Cas9 protein is C-terminal, N-terminal or C-terminal and N-terminal, KRAB, KOX, SID, MBD2, MBD3, One or more domains selected from the group consisting of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B may be linked, and preferably, the KRAB domain may be linked to the N-terminus.
또한, 본 발명은 상기의 DNA 표적용 조성물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for preventing or treating cancer, comprising the composition for DNA targeting.
또한, 본 발명은 상기 DNA 표적용 조성물을 포함하는, 암의 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing cancer, comprising the composition for DNA targeting.
또한, 본 발명은 상기 DNA 표적용 조성물을 포함하는, 암의 이미징 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides an imaging composition for cancer, comprising the composition for DNA targeting.
또한, 본 발명은 TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로서, TERT 프로모터의 -124 C>T 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 20개의 뉴클레오타이드인 것인, 단일 가닥 가이드 RNA를 제공한다.In addition, the present invention is a single-stranded guide RNA (sgRNA) comprising a nucleotide sequence complementary to a TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter, which is 20 nucleotides comprising a base complementary to a -124 C>T mutation of the TERT promoter. Phosphorus, single stranded guide RNA is provided.
상기 단일 가닥 가이드 RNA는 서열번호 1 (5‘ - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA - 3’) 또는 서열번호 2 (5‘ - GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG - 3’)의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.The single-stranded guide RNA may be composed of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( 5' - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA -3' ) or SEQ ID NO: 2 ( 5'-GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG-3' ).
또한, 본 발명은 TERT 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 1개 이상의 미스매치 (mismatch)를 부여하는 단계를 포함하는, 단일 가닥 가이드 RNA의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of preparing a single stranded guide RNA, comprising the step of conferring one or more mismatches to a nucleotide sequence complementary to a TERT promoter.
또한, 본 발명은 청구항 1의 DNA 표적용 조성물을 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, DNA 표적 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a DNA targeting method comprising the step of administering the composition for DNA targeting of
본 발명에 따른 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA) 및 이를 이용한 CRISPRi 시스템은 선택적이고 효과적으로 TERT 프로모터의 점돌연변이 (point mutation)을 표적하고 이의 활성을 억제할 수 있는 바, 이러한 후성편집기술을 통한 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이 TERT 프로모터 표적화는 새로운 암 치료법으로써 매우 적합할 것으로 기대된다.The single-stranded guide RNA (sgRNA) according to the present invention and the CRISPRi system using the same can selectively and effectively target the point mutation of the TERT promoter and inhibit its activity, -124 C through such epigenetic editing technology Targeting the >T or -146 C>T mutant TERT promoter is expected to be very suitable as a new cancer therapy.
도 1은 -124 C>T mutant TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter를 표적하는 프로토스페이서 (protospacer) 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 Mutant TERT promoter DNA 특이적 sgRNA 선별을 위한 in vitro DNA cleavage assay를 수행한 결과이다.
도 3은 CRISPR interference (CRISPRi) system의 개요를 도식화한 도이다.
도 4는 dCas9과 후성편집자 (epigenetic editor)들의 가능한 조합을 도식화한 도이다.
도 5는 세포실험을 통한 CRISPRi system 작동 여부를 Huh-7.5 간암세포주에서 reporter assay로 확인한 도이다. (A) 2-1 sgRNA, (B) 2-2 sgRNA.
도 6은 CRISPRi system 작동 여부를 Huh-7.5 간암세포주와 Hep3B 간암세포주에서 확인한 결과를 나타낸 도이다. 웨스턴 블랏 (western blot)을 통해 TERT 단백질 발현량을 확인하였다.
도 7은 Huh-7.5 간암세포주와 Hep3B 간암세포주에서 cell proliferation assay를 수행하여 CRISPRi system 작동에 의한 세포사를 확인한 도이다.
도 8에서 (A)는 2-1, 2-2 sgRNA의 P19 부위를 표시한 도이다. (B)는 2-1, 2-2 P19 mutant sgRNA를 이용한 in vitro DNA cleavage assay 결과를 나타낸 도이다. P19G: 2-1, 2-2 원본 sgRNA; P19C, P19A, P19U: 점 돌연변이 (point mutation) sgRNA.
도 9는 간암세포주 (A) Hep3B (wild TERT promoter), (B) Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter)에서 CRISPRi system 작동 여부를 확인한 결과이다. TERT protein 발현량을 웨스턴 블롯 (western blot)으로 확인하였다. P19G; 2-1, 2-2 원본 sgRNA; P19C, P19A, P19U: 점 돌연변이 (point mutation) sgRNA.
도 10은 CRISPRi system을 발현하는 아데노바이러스의 게놈 구조 모식도이다.
도 11은 간암세포주인 Hep3B (wild TERT promoter), Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter)에서 CRISPRi system을 발현하는 아데노바이러스에 의한 TERT 유전자 발현 감소를 RNA 수준에서 확인한 도이다. sg2-1: 2-1 원본 sgRNA; sg2-1 p19: P19C mutant sgRNA.
도 12는 간암세포주인 Hep3B (wild TERT promoter), Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter)에서 CRISPRi system을 발현하는 아데노바이러스에 의한 세포사 유도를 cell proliferation assay로 확인한 도이다. sg2-1: 2-1 원본 sgRNA; sg2-1 p19: P19C mutant sgRNA.1 is a diagram showing a protospacer sequence targeting a -124 C>T mutant TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter.
Figure 2 shows the results of performing an in vitro DNA cleavage assay for selecting a mutant TERT promoter DNA specific sgRNA.
FIG. 3 is a diagram schematically illustrating a CRISPR interference (CRISPRi) system.
4 is a diagram illustrating a possible combination of dCas9 and epigenetic editors.
5 is a diagram confirming whether the CRISPRi system works through a cell experiment by a reporter assay in a Huh-7.5 liver cancer cell line. (A) 2-1 sgRNA, (B) 2-2 sgRNA.
6 is a view showing the results of confirming the operation of the CRISPRi system in the Huh-7.5 liver cancer cell line and Hep3B liver cancer cell line. The amount of TERT protein expression was confirmed by western blot.
7 is a view confirming cell death by operating the CRISPRi system by performing a cell proliferation assay in the Huh-7.5 liver cancer cell line and the Hep3B liver cancer cell line.
In FIG. 8, (A) is a diagram showing the P19 sites of 2-1 and 2-2 sgRNA. (B) is a diagram showing the results of in vitro DNA cleavage assay using 2-1, 2-2 P19 mutant sgRNA. P19G: 2-1, 2-2 original sgRNA; P19C, P19A, P19U: point mutation sgRNA.
9 is a result confirming whether the CRISPRi system works in the liver cancer cell line (A) Hep3B (wild TERT promoter), (B) Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter). The amount of TERT protein expression was confirmed by western blot. P19G; 2-1, 2-2 original sgRNA; P19C, P19A, P19U: point mutation sgRNA.
10 is a schematic diagram of the genomic structure of adenovirus expressing the CRISPRi system.
11 is a diagram confirming the reduction of TERT gene expression by the adenovirus expressing the CRISPRi system in the hepatic cancer cell lines Hep3B (wild TERT promoter), Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter) at the RNA level. sg2-1: 2-1 original sgRNA; sg2-1 p19: P19C mutant sgRNA.
12 is a diagram confirming cell death induced by adenovirus expressing CRISPRi system in hepatic cancer cell lines Hep3B (wild TERT promoter), Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter) by cell proliferation assay. sg2-1: 2-1 original sgRNA; sg2-1 p19: P19C mutant sgRNA.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 The present invention
TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 상기 가이드 RNA를 암호화 하는 DNA; 및A guide RNA comprising a nucleotide sequence complementary to a TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter, or DNA encoding the guide RNA; And
Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 표적용 조성물을 제공한다. Provided is a composition for DNA targeting, comprising a Cas9 polypeptide or a polynucleotide encoding the same.
본원에서 사용된, 용어 "가이드 RNA" 는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다. As used herein, the term “guide RNA” refers to RNA that is specific to target DNA, capable of complexing with Cas protein, and bringing Cas protein to target DNA.
본 발명에서, 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA (single-chain RNA, sgRNA)일 수 있다.In the present invention, the guide RNA may be composed of two RNAs, CRISPR RNA (crRNA) and transactivating crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA), or a single generated by fusion of essential parts of crRNA and tracrRNA It may be single-chain RNA (sgRNA).
상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중RNA (dual RNA)일 수 있다.The guide RNA may be dual RNA including crRNA and tracrRNA.
만약 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 사용될 수 있다.If the guide RNA includes essential parts of crRNA and tracrRNA and complementary parts to the target, any guide RNA can be used in the present invention.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.The crRNA can be hybridized with the target DNA.
가이드 RNA는 RNA의 형태 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The guide RNA can be delivered to a cell or organism in the form of RNA or DNA encoding the guide RNA. The guide RNA may be in the form of an isolated RNA, RNA contained in a viral vector, or encoded in a vector. Preferably, the vector may be a viral vector, a plasmid vector, or an agrobacterium vector, but is not limited thereto.
상기 가이드 RNA는 TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. The guide RNA may include a nucleotide sequence complementary to a TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter.
상기 TERT 프로모터는 1개 이상의 점 돌연변이 (point mutation)를 포함할 수 있으며, 해당 돌연변이는 바람직하게는 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이일 수 있다.The TERT promoter may include one or more point mutations, and the mutations may be -124 C>T or -146 C>T mutations.
이에 따라서, 상기 뉴클레오타이드는 TERT 프로모터의 -124 C>T (chr5, 1,295,228 C>T hg19 coordinate) 또는 -146 C>T (chr5, 1,295,250 C>T hg19 coordinate) 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 20개의 뉴클레오타이드일 수 있다. Accordingly, the nucleotide comprises 20 bases complementary to the -124 C>T (chr5, 1,295,228 C>T hg19 coordinate) or -146 C>T (chr5, 1,295,250 C>T hg19 coordinate) mutations of the TERT promoter. It may be a nucleotide.
상기 뉴클레오타이드는 바람직하게는 3‘ 말단으로부터 1 내지 5 번째 위치에 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이에 대하여 상보적인 염기를 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 (5‘ - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA - 3’) 또는 서열번호 2 (5‘ - GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG - 3’)의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. The nucleotide may preferably include a base complementary to the -124 C>T or -146 C>T mutation at
본원에서 사용된, 용어 "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다.As used herein, the term “Cas protein” refers to the essential protein element in the CRISPR/Cas system and will form a complex with two RNAs called CRISPR RNA (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA). When it forms an active endonuclease or nickase (nickase).
Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas gene and protein information can be obtained from GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), but is not limited thereto.
Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열 (CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 기재되어 왔다. 이러한 단백질 패밀리 중, Cas1은 서로 다른 CRISPR/Cas 시스템 중에서 아주 흔한 (ubiquitous) 것으로 보인다. CRISPR-Cas 시스템은 세 종류가 있다. 이들 중에서, Cas9 단백질 및 crRNA 및 tracrRNA을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이며, 잘 알려져 있다. cas 유전자 및 반복 구조 (repeat structure)의 특정 조합은 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의하는데 사용되어 왔다.The CRISPR-associated (cas) gene encoding the Cas protein is often associated with the CRISPR repeat-spacer array. More than 40 different Cas protein families have been described. Among these protein families, Cas1 seems to be very common (ubiquitous) among different CRISPR/Cas systems. There are three types of CRISPR-Cas systems. Among them, the Type II CRISPR/Cas system involving Cas9 protein and crRNA and tracrRNA is representative and well known. Certain combinations of cas genes and repeat structures have been used to define eight CRISPR subtypes (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, and Mtube).
본 발명의 조성물은 단백질의 형태 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 Cas 요소를 포함할 수 있다. The composition of the present invention may include a Cas element in the form of a protein or a nucleic acid encoding a Cas protein.
바람직하게, Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체이다.Preferably, the Cas protein is a Cas9 protein or variant thereof.
상기 Cas9 단백질은 바람직하게는 생물학적으로 불활성화된 Cas (dCas)일 수 있다. The Cas9 protein may be biologically inactivated Cas (dCas).
상기 Cas9 단백질은 C-말단, N-말단 또는 C-말단 및 N-말단에, KRAB (Kruppel associated box), KOX (Kruppel-type zinc finger factor), SID (mSin interaction domain), MBD2(methyl-CpG binding domain protein 2), MBD3, DNMT1 (DNA Methyltransferase 1), DNMT3A (DNA methyltransferase 3A) 및 DNMT3B (DNA methyltransferase 3B)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 도메인이 연결된 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 Cas9 단백질은 N-말단에 KRAB 도메인이 연결된 것일 수 있다. The Cas9 protein is C-terminal, N-terminal or C-terminal and N-terminal, KRAB (Kruppel associated box), KOX (Kruppel-type zinc finger factor), SID (mSin interaction domain), MBD2 (methyl-CpG One or more domains selected from the group consisting of binding domain protein 2), MBD3, DNMT1 (DNA Methyltransferase 1), DNMT3A (DNA methyltransferase 3A) and DNMT3B (DNA methyltransferase 3B) may be linked. More preferably, the Cas9 protein may be a KRAB domain linked to the N-terminus.
또한, 본 발명은 TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및In addition, the present invention is a guide RNA comprising a nucleotide sequence complementary to the TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter; And
Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.It provides a composition for preventing or treating cancer, comprising a Cas9 polypeptide or a polynucleotide encoding the same.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다. The composition may be a pharmaceutical composition or a food composition.
본 발명에서 암은 고형암 또는 비고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들어 간, 폐, 유방, 피부 등 장기에 암 종양이 발생한 것을 말한다. 비고형암은 혈액 내에서 발생한 암이고, 혈액암으로도 불린다. 상기 암은 암종 (carcinoma), 육종(sarcoma), 조혈세포 유래의 암, 배세포 종양(germ cell tumor), 또는 모세포종(blastoma)일 수 있다. 암종은 상피세포(epithelial cells) 유래의 암일 수 있다. 육종은 각 조직이 골수 밖의 중간엽 세포(mesenchymal cell)에서 유래된 세포로부터 발생된 것일 수 있는 결합 조직(즉, 뼈, 연골, 지방, 및 신경)으로부터 유래된 암일 수 있다. 조혈세포 유래의 암은 골수를 떠나 림프절 및 혈액에서 성숙하는 경향이 있는 조혈 세포로부터 유래할 수 있다. 배세포 종양은 다능성 세포(pluripotent cell)로부터 유래된 암일 수 있다. 상기 다능성 세포는 정소 또는 난소에 종종 존재할 수 있다. 모세포종은 미성숙 전구 세포 또는 배아 조직으로부터 유래할 수 있다. 상기 암은 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.In the present invention, the cancer may be solid cancer or non-solid cancer. Solid cancer refers to a cancer tumor that has developed in organs such as the liver, lungs, breast, and skin. Non-solid cancer is a cancer that occurs in the blood and is also called blood cancer. The cancer may be carcinoma, sarcoma, hematopoietic cell-derived cancer, germ cell tumor, or blastoma. The carcinoma may be cancer derived from epithelial cells. Sarcoma may be cancer derived from connective tissue (ie, bone, cartilage, fat, and nerves) in which each tissue may originate from cells derived from mesenchymal cells outside the bone marrow. Hematopoietic cell-derived cancers can originate from hematopoietic cells that tend to leave the bone marrow and mature in lymph nodes and blood. The germ cell tumor can be a cancer derived from pluripotent cells. The pluripotent cells can often be present in the testis or ovary. The blastoma can be derived from immature progenitor cells or embryonic tissue. The cancer is pancreatic cancer, biliary tract cancer, neuroendocrine tumor, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, larynx cancer, stomach cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer , Skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer and ureter cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, thyroid cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, Lymphoma, myelodysplastic syndromes (MDS), myelofibrosis, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, and skin cancer.
바람직하게는, 상기 암은 간암 또는 피부암일 수 있다. Preferably, the cancer may be liver cancer or skin cancer.
본 발명에서 사용되는 용어인 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제하거나 암의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.The term "prevention", which is a term used in the present invention, refers to all actions that inhibit cancer or delay the onset of cancer by administration of the pharmaceutical composition. The term "treatment" refers to any act of improving or beneficially altering the symptoms of cancer by administration of the pharmaceutical composition.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 암이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may be used for a method for preventing or treating cancer, and specifically, the method for preventing or treating cancer may include the step of administering to an individual who is or is expected to develop cancer.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.The term "administration" of the present invention means introducing the composition to the individual in an appropriate manner.
본 발명의 용어 "개체"란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "individual" of the present invention means all animals, such as rats, mice, livestock, including humans, which may or may not develop cancer, and may be, but is not limited to, mammals, including humans.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 조성물을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" of the present invention means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the individual type and severity, age, sex, drug It can be determined according to the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and discharge, the duration of treatment, factors including the drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field. For example, the composition may be administered as an active ingredient at a dose of 0.01 to 500 mg/kg per day, specifically 10 to 100 mg/kg, and the administration may be administered once or several times a day. . In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may include the composition of the present invention in an amount of 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent in addition to the active ingredients described above. The carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., according to a conventional method. have. Specifically, when formulated, it may be prepared using diluents or excipients, such as fillers, weights, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, which are commonly used. Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. These solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients. In addition to liquids for oral administration and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be added. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) according to the desired method, and the dosage may be adjusted according to the patient's condition, weight, or disease. It depends on the degree, drug type, route of administration, and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
본 발명의 상기 조성물은 기타 항암제, 방사선 치료, 외과적 수술과 병행될 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택 및 병행될 수 있다. The composition of the present invention can be combined with other anti-cancer agents, radiation therapy, surgical procedures, and can be appropriately selected and combined by those skilled in the art.
또한, 본 발명은 상기 DNA 표적용 조성물을 포함하는, 암의 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing cancer, comprising the composition for DNA targeting.
또한, 본 발명은 상기 DNA 표적용 조성물을 포함하는, 암의 이미징 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides an imaging composition for cancer, comprising the composition for DNA targeting.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암의 발병 여부, 경과 또는 예후를 확인하는 것이다.The term "diagnosis" as used in the present invention means to identify the presence or characteristics of a pathophysiology. Diagnosis in the present invention is to confirm the onset, progress or prognosis of cancer.
상기 DNA 표적용 조성물은 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다. The DNA target composition may be combined with a phosphor for molecular imaging to diagnose cancer through imaging.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선 (near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량 (quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The molecular imaging phosphor refers to all materials that generate fluorescence, and it is preferable to emit red or near-infrared fluorescence, and a phosphor having a high quantum yield is more preferable, but is not limited thereto. .
상기 분자 영상용 형광체는 상기 DNA 표적용 조성물와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The molecular imaging phosphor is preferably a phosphor capable of binding to the DNA target composition, a fluorescent protein, or other imaging material, but is not limited thereto.
형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The phosphor is preferably, but not limited to, fluorescein, BODYPY, Tetramethylrhodamine, Alexa, Cyanine, allopicocyanine or derivatives thereof. Does not.
형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자 (EGFP), 적색 형광 프로테인 (red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The fluorescent protein is preferably, but not limited to, Dronpa protein, fluorescence chromogenic gene (EGFP), red fluorescent protein (DsRFP), cyanine phosphor that exhibits near infrared fluorescence, or other fluorescent protein.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.Other imaging materials are preferably iron oxide, radioactive isotopes, etc., but are not limited thereto, and may be applied to imaging equipment such as MR and PET.
또한, 본 발명은 TERT (Telomerase reverse transcriptase) 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)로서, TERT 프로모터의 -124 C>T 또는 -146 C>T 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 20개의 뉴클레오타이드인 것인, 단일 가닥 가이드 RNA을 제공한다. In addition, the present invention is a single-stranded guide RNA (sgRNA) comprising a nucleotide sequence complementary to a TERT (Telomerase reverse transcriptase) promoter, comprising a base complementary to a -124 C>T or -146 C>T mutation of the TERT promoter. A single stranded guide RNA is provided, which is 20 nucleotides.
바람직하게, 상기 단일 가닥 가이드 RNA는 서열번호 1 (5‘ - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA - 3’) 또는 서열번호 2 (5‘ - GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG - 3’)의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.Preferably, the single-stranded guide RNA may be composed of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( 5' - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA -3' ) or SEQ ID NO: 2 ( 5'-GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG-3' ).
또한, 본 발명은 TERT 프로모터에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 1개 이상의 미스매치 (mismatch)를 부여하는 단계를 포함하는, 단일 가닥 가이드 RNA의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of preparing a single stranded guide RNA, comprising the step of conferring one or more mismatches to a nucleotide sequence complementary to a TERT promoter.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 표적용 조성물을 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, DNA 표적 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a DNA targeting method comprising the step of administering a composition for DNA targeting according to the present invention to isolated eukaryotic cells or eukaryotic organisms other than humans.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
실험예Experimental Example 1: One: TERTTERT wild / -124 mutant (C>T) promoter를 가지는 reporter reporter with wild / -124 mutant (C>T) promoter plasmidplasmid 제작 making
Wild / -124 mutant (C>T) TERT 프로모터를 얻기 위해 Hep3B (wild TERT promoter), Huh-7.5 (-124 (C>T) mutant TERT promoter) 세포에서 genomic DNA를 추출하였다. 1 x 106개 세포에 Quick Extract DNA Extraction solution (Epicentre) 200㎕를 넣은 후 65℃에서 6분간 반응한 뒤 15초 동안 볼텍싱 (vortexing) 하였다. 98℃에서 2분간 반응시키고 genomic DNA를 추출 하여 TERT promoter PCR의 주형으로 사용하였다. 2㎕ genomic DNA, 5X buffer, 200uM dNTP, 0.2uM forward primer, 0.2uM reverse primer, 0.4U phusion DNA polymerase (NEB)를 혼합한 뒤 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30 cycle을 반복하여 290bp 길이를 가지는 wild / mutant TERT promoter DNA를 얻어내었다. 얻어진 TERT promoter DNA는 pGL3-flrefly luciferase(F.luci) plasmid에 in-fusion HD cloning kit을 이용하여 클로닝 (cloning) 하였다.To obtain the Wild / -124 mutant (C>T) TERT promoter, genomic DNA was extracted from Hep3B (wild TERT promoter) and Huh-7.5 (-124 (C>T) mutant TERT promoter) cells. After 200 μl of Quick Extract DNA Extraction solution (Epicentre) was added to 1 x 10 6 cells, the mixture was reacted at 65° C. for 6 minutes and then vortexed for 15 seconds. After reacting at 98°C for 2 minutes, genomic DNA was extracted and used as a template for TERT promoter PCR. After mixing 2µl genomic DNA, 5X buffer, 200uM dNTP, 0.2uM forward primer, 0.2uM reverse primer, and 0.4U phusion DNA polymerase (NEB), it is 30 under conditions of 95℃ 30sec, 58℃30sec, 72℃30sec. The cycle was repeated to obtain wild/mutant TERT promoter DNA having a length of 290bp. The obtained TERT promoter DNA was cloned into a pGL3-flrefly luciferase (F.luci) plasmid using an in-fusion HD cloning kit.
실험예Experimental Example 2: 2: In vitroIn vitro DNA cleavage assay DNA cleavage assay
E. coli에서 정제한 Cas9 단백질과 in vitro 전사 (transcription)로 제작한 mutant TERT promoter를 표적하는 sgRNA로 TERT 프로모터 DNA 절단를 아가로스 겔에서 확인하였다. Substrate DNA로는 pGL3-wild/mutant TERT promoter-F.luci vector를 ScaI 제한효소 (restriction enzyme)로 선형화 (linearization) 시킨 DNA를 사용하였다. Substrate DNA 100ng, Cas9 reaction buffer (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT), 0.5 pmole Cas9 protein, 1 pmole sgRNA를 10㎕ volume으로 혼합한 뒤 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 250mM EDTA를 포함한 3X DNA dye를 반응액에 넣어 반응을 멈춘 뒤 1% TBE 젤 (gel)에 반응액을 로딩하여 절단된 DNA를 EtBr 염색으로 확인하였다.TERT promoter DNA cleavage was confirmed on an agarose gel with sgRNA targeting the mutant TERT promoter produced by E. coli purified Cas9 protein and in vitro transcription. As the substrate DNA, DNA obtained by linearizing the pGL3-wild/mutant TERT promoter-F.luci vector with a ScaI restriction enzyme was used. After mixing 100ng of Substrate DNA, Cas9 reaction buffer (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM KCl, 10mM MgCl 2 , 1mM DTT), 0.5 pmole Cas9 protein, 1 pmole sgRNA in 10 µl volume and react for 1 hour at 37℃. Ordered. 3X DNA dye containing 250 mM EDTA was added to the reaction solution to stop the reaction, and then the reaction solution was loaded onto a 1% TBE gel to confirm the cleaved DNA by EtBr staining.
실험예Experimental Example 3: 3: LuciferaseLuciferase assay assay
12-웰 플레이트에 1 x 105개의 Huh-7.5 세포를 배양한 뒤 50ng pTK-renilla luciferase plasmid, 500ng wild or mutant TERT promoter-firefly luciferase plasmid, 1㎍ sgRNA 발현 plasmid, 500ng dCas9 발현 plasmid를 opti-MEM 배지와 50ul volume이 되도록 섞은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 동시에 2ug의 polyethylenimine (PEI)를 opti-MEM 배지와 100ul volume이 되도록 섞은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 각각의 plasmid DNA 용액과 PEI 용액을 혼합한 뒤 상온에서 20분간 반응시켰다. 20분 뒤 반응액을 각각의 세포에 넣어 준 뒤 CO2 incubator에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 뒤 plasmid DNA와 PEI가 들어 있는 배양액을 제거한 뒤 새 배양액으로 교체해준 다음 48시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 48시간 뒤 배양액을 제거하고 1X PBS 용액으로 씻어준 뒤 passive lysis buffer (Promega) 100㎕를 넣어 준 뒤 상온에서 15분간 반응시켰다. 세포 용해물 (Cell lysate)을 마이크로튜브 (micro-tube)로 옮긴 뒤 13000rpm으로 1분간 원심분리하였다. 상기 용해물 10ul를 dual-luciferase assay kit (Promega)을 사용해 luminometer (Berthold)에서 luciferase 값을 측정하였다.After culturing 1 x 10 5 Huh-7.5 cells in a 12-well plate, opti-MEM for 50ng pTK-renilla luciferase plasmid, 500ng wild or mutant TERT promoter-firefly luciferase plasmid, 1μg sgRNA expressing plasmid, 500ng dCas9 expressing plasmid The mixture was mixed with the medium to a volume of 50 ul and reacted at room temperature for 5 minutes. At the same time, 2 ug of polyethylenimine (PEI) was mixed with opti-MEM medium to a volume of 100 ul, and then reacted at room temperature for 5 minutes. Each plasmid DNA solution and PEI solution were mixed and reacted at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, the reaction solution was put in each cell and cultured for 6 hours in a CO 2 incubator. After 6 hours, the culture medium containing plasmid DNA and PEI was removed, replaced with a new culture medium, and cultured in a CO 2 incubator for 48 hours. After 48 hours, the culture was removed, washed with 1X PBS solution, and 100 μl of passive lysis buffer (Promega) was added, followed by reaction at room temperature for 15 minutes. Cell lysate was transferred to a micro-tube and centrifuged at 13000 rpm for 1 minute. 10 ul of the lysate was measured using a dual-luciferase assay kit (Promega) in a luminometer (Berthold).
실험예Experimental Example 4: Western blot 4: Western blot
6-웰 플레이트에 3 x 105개의 Huh-7.5와 Hep3B 세포를 배양한 뒤 sgRNA와 KRAB-dCas9을 발현하는 plasmid DNA를 PEI를 이용해 형질감염시켰다. 2㎍의 pTZ-U6+1-sgRNA plasmid DNA와 1㎍의 3xFlag-KRAB-dCas9 plasmid DNA를 opti-MEM 배지와 100㎕ volume이 되도록 섞은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 동시에 2ug의 PEI를 opti-MEM 배지와 100㎕ volume이 되도록 섞은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 각각의 plasmid DNA 용액과 PEI 용액을 혼합한 뒤 상온에서 20분간 반응시켰다. 20분 뒤 반응액을 각각의 세포에 넣어 준 뒤 CO2 incubator에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 뒤 plasmid DNA와 PEI가 들어 있는 배양액을 제거한 뒤 새 배양액으로 교체해준 다음 48시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 48시간 뒤 배양액을 제거하고 1X PBS 용액으로 씻어준 뒤 150㎕ RIPA buffer (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS)를 넣어준 뒤 4℃에서 20분간 반응시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 마이크로튜브로 옮긴 후 4℃에서 30분 동안 rotation 시킨 후 15000rpm에서 15분간 원심분리 후 상층액만 따서 새로운 마이크로튜브에 옮겼다. SmartTM BCA protein assay kit을 이용해 total protein 정량값을 얻은 뒤 30㎍의 총 단백질을 10% SDS-PAGE에 로딩하였다. 이후 PVDF 막 (membrane)으로 트랜스퍼 (transfer)한 뒤 상온에서 1시간동안 블로킹 (blocking) 용액으로 블로킹하였다. 1차 항체가 들어 있는 블로킹 용액으로 교체한 뒤 4℃에서 16시간 동안 반응시키고, 0.1% Tween-20, 1X PBS 용액으로 5분씩 6회 세척하였다. 그 후, 2차 항체가 들어 있는 블로킹 용액으로 교체하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 0.1% Tween-20, 1X PBS 용액으로 5분씩 6회 세척한 뒤 막을 ECL 용액에서 1분간 반응시키고 x-ray 필름에 감광시킨 후 현상액 (developer)에 담그어 단백질 밴드를 확인하였다. 사용한 항체는 다음과 같다. 1차 항체: Anti-3xFlag antibody (Sigma), anti-human telomerase reverse transcriptase (TERT) (Fitzgerald), anti-tubulin (MBL), 2차 항체: Goat anti-mouse-HRP conjugated (Santa cruz), Anti-rabbit-HRP conjugated.After culturing 3 x 10 5 Huh-7.5 and Hep3B cells in a 6-well plate, plasmid DNA expressing sgRNA and KRAB-dCas9 was transfected with PEI. 2 μg of pTZ-U6+1-sgRNA plasmid DNA and 1 μg of 3xFlag-KRAB-dCas9 plasmid DNA were mixed with an opti-MEM medium to a volume of 100 μl and reacted at room temperature for 5 minutes. Simultaneously, 2ug of PEI was mixed with opti-MEM medium to a volume of 100 µl, and then reacted at room temperature for 5 minutes. Each plasmid DNA solution and PEI solution were mixed and reacted at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, the reaction solution was put in each cell and cultured for 6 hours in a CO 2 incubator. After 6 hours, the culture medium containing plasmid DNA and PEI was removed, replaced with a new culture medium, and cultured in a CO 2 incubator for 48 hours. After 48 hours, remove the culture solution, wash with 1X PBS solution, add 150 μl RIPA buffer (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS) and add 4℃. Was reacted for 20 minutes. The lysed cells were transferred to a 1.5 ml microtube, rotated at 4°C for 30 minutes, centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was picked and transferred to a new microtube. After obtaining the total protein quantitative value using the Smart TM BCA protein assay kit, 30 μg of total protein was loaded onto 10% SDS-PAGE. Thereafter, transfer was performed with a PVDF membrane, followed by blocking with a blocking solution at room temperature for 1 hour. After replacing with the blocking solution containing the primary antibody, the reaction was carried out at 4°C for 16 hours, and washed 6 times with 5% solution of 0.1% Tween-20 and 1X PBS. Subsequently, it was replaced with a blocking solution containing a secondary antibody for 1 hour at room temperature, washed 6 times for 5 minutes with 0.1% Tween-20, 1X PBS solution, and then the membrane was reacted for 1 minute in an ECL solution and x-ray. After photosensitive to the film, the protein band was identified by dipping in a developer. The antibodies used are as follows. Primary antibodies: Anti-3xFlag antibody (Sigma), anti-human telomerase reverse transcriptase (TERT) (Fitzgerald), anti-tubulin (MBL), secondary antibodies: Goat anti-mouse-HRP conjugated (Santa cruz), Anti- rabbit-HRP conjugated.
실험예Experimental Example 5: 5: TERTTERT 유전자 RT- Gene RT- PCRPCR
6-웰 플레이트에 3 x 105개의 Hep3B와 Huh-7.5 세포를 배양한 뒤 sgRNA와 KRAB-dCas9을 발현하는 아데노바이러스를 각각 감염시켰다. Hep3B 세포에는 10 MOI의 아데노바이러스를, Huh-7.5 세포에는 100 MOI의 아데노바이러스를 배양액에 섞어 감염시켰다. 48시간 뒤 배양액을 제거하고 1X PBS 용액으로 씻어준 뒤 500㎕ TRIZOL 시약을 넣고 상온에서 3분간 반응시켰다. TRIZOL 시약과 세포를 1.5ml 마이크로튜브로 옮긴 후 100㎕ 클로로포름 (chloroform) 용액을 넣어주고 볼텍싱하여 섞어준 뒤, 상온에서 5분간 반응시키고 4℃에서 10분 동안 원심분리 후 상층액만 따서 다시 새로운 마이크로튜브에 옮겼다. 동일양의 이소프로판올 (isopropanol) 용액을 넣고 상온에서 20분간 반응시킨 후 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 세포의 total RNA 침전물을 얻어내었다. DEPC-treated D.W에 침전된 RNA를 녹인 후 정량값을 얻었다. 5㎍의 total RNA에 500ng의 random primer (5‘-NNNNNN-3’)와 dNTP, 역전사 효소를 섞은 후 42℃에서 50분간 반응시켰다. 역전사 과정으로 얻어낸 cDNA 중 2㎕를 PCR에 이용하였다. cDNA 2㎕, 10pmole 5’ primer (5’-CATTTCATCAGCAAGTTTGGAAG), 10pmole 3’ primer (5’-TTTCAGGATGGAGTAGCAGAGG-3’)와 2x SYBR PCR master mix를 섞은 뒤 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 40cycle 조건으로 ABI StepOne Plus real-time PCR 기기에서 증폭시켰다.After culturing 3 x 10 5 Hep3B and Huh-7.5 cells in 6-well plates, adenovirus expressing sgRNA and KRAB-dCas9 were infected. Hep3B cells were infected with 10 MOI adenovirus and Huh-7.5 cells were mixed with 100 MOI adenovirus. After 48 hours, the culture solution was removed, washed with 1X PBS solution, and 500 μL TRIZOL reagent was added and reacted at room temperature for 3 minutes. After transferring TRIZOL reagent and cells to a 1.5 ml microtube, add 100 μl chloroform solution, mix by vortexing, react for 5 minutes at room temperature, centrifuge at 4° C. for 10 minutes, pick only the supernatant again Transferred to a microtube. The same amount of isopropanol solution was added and reacted at room temperature for 20 minutes, followed by centrifugation at 4°C for 40 minutes to obtain total RNA precipitate of cells. Quantitative values were obtained after melting the precipitated RNA in DEPC-treated DW. After mixing 500ng of random primer (5'-NNNNNN-3') with dNTP and reverse transcriptase in 5µg of total RNA, the mixture was reacted for 50 minutes at 42℃. 2 µl of cDNA obtained by reverse transcription was used for PCR. cDNA 2µl, 10pmole 5'primer (5'-CATTTCATCAGCAAGTTTGGAAG), 10pmole 3'primer (5'-TTTCAGGATGGAGTAGCAGAGG-3') mixed with 2x SYBR PCR master mix, 95℃ 30sec, 58℃ 30sec, 72℃ 30 Second, 40 cycle conditions were amplified in ABI StepOne Plus real-time PCR instrument.
실험예Experimental Example 6: Cell proliferation assay 6: Cell proliferation assay
96-웰 플레이트에 1 × 104의 세포를 배양한 뒤 sgRNA와 KRAB-dCas9을 발현하는 아데노바이러스를 감염시켰다. 72시간 후 Opti-MEM 100ul에 CellTiter 96 Aqueous one solution reagent(MTS, Promega)를 20% 추가하여 각 웰에 첨가한 후 1~4시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하고, 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.After culturing 1×10 4 cells in a 96-well plate, sgRNA and KRAB-dCas9 expressing adenovirus were infected. After 72 hours, 20% of CellTiter 96 Aqueous one solution reagent (MTS, Promega) was added to Opti-MEM 100ul, added to each well, and then incubated in a 37% 5% CO 2 incubator for 1-4 hours, and absorbance at 490 nm. By measuring the cell viability was confirmed.
실시예Example 1: -124 C>T mutant 1: -124 C>T mutant TERTTERT promoter DNA에 특이적으로 작용할 수 있는 that can act specifically on promoter DNA sgRNAsgRNA 제작 making
TERT promoter의 -124번째가 C>T 돌연변이 된 mutant TERT promoter만 표적할 수 있는 sgRNA를 제작하기 위해 염기서열 분석을 통해 CRISPR/Cas9 system이 적용될 수 있는 -124번째 돌연변이를 포함하는 9개의 protospacer 서열을 선정하였다 (도 1). To produce an sgRNA that can target only the mutant TERT promoter in which the -124th of the TERT promoter is C>T mutated, nine protospacer sequences containing the -124th mutation that can be applied to the CRISPR/Cas9 system through sequencing It was selected (Fig. 1).
선정한 프로토스페이서 서열을 가이드 서열 (guide sequence)로 가지는 9종의 sgRNA는 -124 C>T mutant TERT promoter와는 100% 일치하지만 wild TERT promoter와는 1개의 미스매치 (mismatch)를 가지는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 가지는 9종의 mutant TERT promoter 표적 sgRNA를 제작하였다. The nine sgRNAs that have the selected protospacer sequence as a guide sequence are 100% identical to the -124 C>T mutant TERT promoter, but have one mismatch with the wild TERT promoter. 9 mutant TERT promoter target sgRNAs with these characteristics were constructed.
-124 C>T 돌연변이를 가지는 mutant TERT promoter 특이적으로 작용하는지 확인하기 위해 in vitro DNA cleavage assay를 수행하였다. 9종의 sgRNA중에 2-1, 2-2번 sgRNA가 wild TERT promoter에 작용하지 않고 -124 C>T mutant TERT promoter 특이적 DNA cleavage를 유발하는 것을 확인하였다 (도 2). 이를 통해 2-1, 2-2번 프로토스페이서를 가이드 서열로 가지는 sgRNA들이 -124 C>T mutant TERT promoter에 특이적으로 작용함을 확인하였다. 2-1과 2-2 sgRNA 가이드 서열은 다음과 같다. In vitro DNA cleavage assay was performed to confirm that the mutant TERT promoter with -124 C>T mutation specifically works. Of 9 sgRNAs, it was confirmed that sgRNAs 2-1 and 2-2 did not act on the wild TERT promoter and induced -124 C>T mutant TERT promoter specific DNA cleavage (FIG. 2). Through this, it was confirmed that the sgRNAs having the 2-1 and 2-2 protospacers as guide sequences act specifically on the -124 C>T mutant TERT promoter. The 2-1 and 2-2 sgRNA guide sequences are as follows.
2-1 : 5‘ - GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA - 3’ (서열번호 1)2-1: 5'-GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA-3'(SEQ ID NO: 1)
2-2 : 5‘ - GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG - 3’ (서열번호 2)2-2: 5'-GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG-3'(SEQ ID NO: 2)
실시예Example 2: 2: CRISPRiCRISPRi system 제작 및 최적의 조합 확인 System creation and optimal combination confirmation
-124 C>T mutant TERT promoter를 표적하여 TERT 유전자의 발현을 억제하기 위해 D10A / H840H 돌연변이를 가지는 뉴클레아제 활성이 없는 dead Cas9 (dCas9) 과 후성편집자 (epigenetic editor)를 도입한 CRISPRi system을 제작하였다 (도 3). 또한, dCas9을 기준으로 N-말단 / C-말단에 후성편집자 (epigenetic editor)인 KRAB과 DNA methyltransgerase 3A (DNMT3A)를 도입한 다양한 조합의 CRISPRi system을 제작하였다 (도 4). 그 다음, dCas9-후성편집자 단백질과 sgRNA로 구성된 CRISPRi system이 작동하는지 reporter assay를 통해 세포실험에서 확인하였다 (도 5). We produced a CRISPRi system that introduced a nuclease-free dead Cas9 (dCas9) and epigenetic editor with a D10A / H840H mutation to target the -124 C>T mutant TERT promoter and suppress the expression of the TERT gene. (Fig. 3). In addition, based on dCas9, various combinations of CRISPRi systems were prepared in which KRAB, an epigenetic editor, and DNA methyltransgerase 3A (DNMT3A) were introduced at the N-terminal/C-terminal (FIG. 4). Then, whether the CRISPRi system composed of the dCas9- epigenetic editor protein and sgRNA works, was confirmed in a cell experiment through a reporter assay (FIG. 5).
도 5의 A 및 B에 각각 나타낸 바와 같이, Mutant TERT promoter 특이적 sgRNA인 2-1, 2-2 sgRNA에 의해 mutant TERT promoter-luciferase reporter값이 wild TERT promoter-luciferase reporter에 비해 현저히 낮아, 2-1, 2-2 sgRNA가 luciferase 발현을 효율적으로 감소시킴을 확인한다. 다양한 dCas9-후성편집자 조합들 중에서는 KRAB-dCas9의 조합이 다른 dCas9-후성편집자 조합들보다 mutant TERT promoter 특이적으로 그 발현을 저해하는 것으로 확인되어 KRAB-dCas9의 조합이 CRISPRi system에 최적임을 확인하였다. As shown in A and B of Fig. 5, the mutant TERT promoter-luciferase reporter value was significantly lower than that of the wild TERT promoter-luciferase reporter by 2-1, 2-2 sgRNA, which is a specific sgRNA of the Mutant TERT promoter, 2- It is confirmed that 1, 2-2 sgRNA effectively reduces luciferase expression. Among various combinations of dCas9- epigenetic editors, the combination of KRAB-dCas9 was found to inhibit the expression of mutant TERT promoter specifically than other dCas9- epigenetic editor combinations, confirming that the combination of KRAB-dCas9 is optimal for the CRISPRi system. .
실시예Example 3: Transient DNA 3: Transient DNA transfection을transfection 통한 through TERTTERT 유전자 발현 감소와 Decreased gene expression 세포사Cell death 유도 확인 Induction confirmation
위에서 제작한 CRISPRi system이 염색체상의 TERT promoter에 작용하여 내재적 (endogenous) TERT 유전자 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 TERT protein 발현량 변화를 측정하였다. 구체적으로, wild TERT promoter를 보유한 Hep3B 간암 세포주와 -124 C>T mutant TERT promoter를 보유한 Huh-7.5 간암 세포주에 -124 C>T mutant TERT promoter를 표적하는 2-1, 2-2 sgRNA와 KRAB-dCas9을 발현하는 DNA를 각각의 세포에 공동 형질감염 (co-transfection) 시킨 뒤 TERT protein 발현량 변화를 확인하였다 (도 6). In order to confirm that the CRISPRi system prepared above inhibits endogenous TERT gene expression by acting on the TERT promoter on the chromosome, the TERT protein expression change was measured. Specifically, 2-1, 2-2 sgRNA and KRAB- targeting -124 C>T mutant TERT promoter are targeted to Hep3B liver cancer cell line with wild TERT promoter and Huh-7.5 liver cancer cell line with -124 C>T mutant TERT promoter. After the DNA expressing dCas9 was co-transfected into each cell, the change in the expression level of TERT protein was confirmed (FIG. 6 ).
도 6에 나타낸 바와 같이, 도입한 CRISPRi system에 의해 -124 C>T mutant TERT promoter를 보유한 Huh-7.5 세포주에서는 TERT protein 발현이 감소함을 확인 하였다. 반면, wild TERT promoter를 보유한 Hep3B 세포주는 TERT protein의 변화가 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 CRISPRi system은 -124 mutant TERT promoter에 특이적으로 작용함을 확인 하였다. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the TERT protein expression was decreased in the Huh-7.5 cell line having -124 C>T mutant TERT promoter by the introduced CRISPRi system. On the other hand, it was confirmed that the Hep3B cell line carrying the wild TERT promoter did not change the TERT protein. Through the above results, it was confirmed that the CRISPRi system according to the present invention specifically works on the -124 mutant TERT promoter.
또한, TERT protein의 발현 감소를 통해 세포사가 유도될 수 있는지를 cell proliferation assay를 통해 확인하였다 (도 7). In addition, it was confirmed through cell proliferation assay whether cell death can be induced through a decrease in the expression of TERT protein (FIG. 7 ).
도 7에 나타낸 바와 같이, 2-2 sgRNA를 도입 하였을 때 Huh-7.5 세포주에서 다른 sgRNA들보다 세포사를 더 유도함을 확인하였다. 반면, 2-2 sgRNA는 Hep3B 세포주에서는 세포사를 유도하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 2-2 sgRNA와 KRAB-dCas9 조합의 CRISPRi system이 -124 C>T mutant TERT promoter에 작용하여 TERT 유전자 발현 억제와 세포사를 유도할 수 있음을 확인 하였다. 대조군으로 사용한 2-8 sgRNA의 서열은 다음과 같다. As shown in FIG. 7, when 2-2 sgRNA was introduced, it was confirmed that Huh-7.5 cell line induces more cell death than other sgRNAs. On the other hand, it was confirmed that 2-2 sgRNA did not induce cell death in the Hep3B cell line. Through this, it was confirmed that the CRISPRi system of the 2-2 sgRNA and KRAB-dCas9 combination acts on the -124 C>T mutant TERT promoter to induce TERT gene expression inhibition and cell death. The sequence of 2-8 sgRNA used as a control is as follows.
2-8 : 5‘ - GUCCCCGGCCCAGCCCCUUC - 3‘ (서열번호 5)2-8: 5'-GUCCCCGGCCCAGCCCCUUC-3'(SEQ ID NO: 5)
실시예Example 4: 4: sgRNAsgRNA 가이드 서열에 점 돌연변이 (point mutation) 도입을 통한 Through the introduction of point mutations in the guide sequence CRISPRiCRISPRi system 최적화 system optimization
-124 C>T mutant TERT promoter를 표적하는 CRISPRi system을 더욱 최적화하기 위해 sgRNA 가이드 서열의 P19 (PAM distal 부위)에 단일 염기 돌연변이를 도입하여 wild TERT promoter 서열에 2개의 미스매치 (mismatch)가 형성되도록 하였다 (도 8A). 또한, 제작한 sgRNA들을 이용해 in vitro DNA cleavage를 통해 돌연변이 sgRNA들의 활성이 변하는지 확인하였다 (도 6B). 사용한 sgRNA의 서열을 하기에 나타내었다.To further optimize the CRISPRi system targeting the -124 C>T mutant TERT promoter, a single base mutation is introduced into P19 (PAM distal region) of the sgRNA guide sequence so that two mismatches are formed in the wild TERT promoter sequence. (Fig. 8A). In addition, it was confirmed whether the activity of mutant sgRNAs is changed through in vitro DNA cleavage using the prepared sgRNAs (FIG. 6B ). The sequence of the sgRNA used is shown below.
2-1 : 5‘- GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA -3’ (서열번호 1)2-1: 5'- GGGGCUGGGAGGGCCCGGAA -3' (SEQ ID NO: 1)
2-2 : 5‘- GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG -3’ (서열번호 2)2-2: 5'- GGGCUGGGAGGGCCCGGAAG -3' (SEQ ID NO: 2)
2-1 P19 : 5‘- G C GGCUGGGAGGGCCCGGAA -3’ (서열번호 3)2-1 P19: 5'- G C GGCUGGGAGGGCCCGGAA -3' (SEQ ID NO: 3)
2-2 P19 : 5‘- G C GCUGGGAGGGCCCGGAAG -3’ (서열번호 4)2-2 P19: 5'-G C GCUGGGAGGGCCCGGAAG -3' (SEQ ID NO: 4)
(각 sgRNA의 P19 부위에 G>C로의 점 돌연변이 (point mutation)를 도입하였으며, 돌연변이 부위는 밑줄과 Bold체로 표기하였다.) (A point mutation of G>C was introduced at the P19 site of each sgRNA, and the mutant sites are indicated by underlining and Bold.)
도 8B에 나타낸 바와 같이, 제작된 돌연변이 sgRNA들은 원본 sgRNA보다 더 좋은 DNA cleavage 활성을 유도함을 확인하였다 (도 8B). As shown in Figure 8B, it was confirmed that the prepared mutant sgRNAs induce better DNA cleavage activity than the original sgRNA (Figure 8B).
상기 돌연변이 sgRNA들을 wild TERT promoter를 가지는 Hep3B 간암 세포주와 -124 C>T mutant TERT promoter를 가지는 Huh-7.5 간암 세포주에 DNA 형질감염 (transfection)으로 도입하여 실험을 수행하였다 (도 9). The mutant sgRNAs were introduced into the Hep3B liver cancer cell line with wild TERT promoter and Huh-7.5 liver cancer cell line with -124 C>T mutant TERT promoter by DNA transfection (Fig. 9).
도 9B에 나타낸 바와 같이, 2-1 sgRNA의 경우 -124 C>T mutant TERT promoter를 가지는 Huh-7.5 간암세포주에서 P19U 돌연변이를 도입한 sgRNA가 TERT protein의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 2-2 sgRNA의 경우 원본 2-2 sgRNA (P19G) 보다 P19C, P19A 돌연변이를 도입한 sgRNA가 TERT protein의 발현을 더욱 감소시킴을 확인하였다. As shown in Figure 9B, in the case of 2-1 sgRNA, it was confirmed that the sgRNA introducing the P19U mutation in the Huh-7.5 hepatocellular carcinoma cell line having -124 C>T mutant TERT promoter reduced the expression of TERT protein. In the case of 2-2 sgRNA, it was confirmed that the sgRNA introducing the P19C and P19A mutations further reduces the expression of TERT protein than the original 2-2 sgRNA (P19G).
반면, 도 9A에 나타낸 바와 같이, 2-1, 2-2 sgRNA 모두 wild TERT promoter를 가지는 Hep3B 간암세포주에서는 CRISPRi system에 의해 TERT protein 발현에 전혀 영향이 없음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 TERT promoter를 표적하는 CRISPRi system은 -124 C>T mutant TERT promoter 특이적으로 작용해 내재적 TERT protein 발현을 억제함을 확인하였다.On the other hand, as shown in Figure 9A, 2-1, 2-2 sgRNA in both Hep3B hepatocellular carcinoma cell line having a wild TERT promoter was confirmed that there is no effect on TERT protein expression by the CRISPRi system. Through this, it was confirmed that the CRISPRi system targeting the TERT promoter according to the present invention specifically inhibits the expression of the intrinsic TERT protein by acting specifically on the -124 C>T mutant TERT promoter.
실시예Example 5: 5: 아데노바이러스를Adenovirus 이용한 Used CRISPRiCRISPRi system 검증 system verification
상기 실시예에서 확인한 최적화된 형태인 KRAB-dCas9과 -124 C>T mutant TERT promoter를 표적하는 sgRNA를 아데노바이러스 벡터 시스템에 도입하여 단일 아데노바이러스에서 KRAB-dCas9과 sgRNA가 함께 발현될 수 있는 형태의 아데노바이러스를 제작하였다 (도 10). 2-1 sgRNA와 2-1, 2-2 sgRNA의 P19 부위에 점 돌연변이 (point mutation)를 도입한 sgRNA를 발현하는 아데노바이러스로 Hep3B (wild TERT promoter)와 Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter) 간암세포주를 감염시키고 TERT mRNA의 발현량을 관찰하였다 (도 11).The optimized forms identified in the above examples, KRAB-dCas9 and sgRNA targeting the -124 C>T mutant TERT promoter were introduced into the adenovirus vector system to form KRAB-dCas9 and sgRNA in a single adenovirus. Adenovirus was produced (Figure 10). It is an adenovirus expressing sgRNA that introduces a point mutation at the P19 region of 2-1 sgRNA and 2-1, 2-2 sgRNA. Hep3B (wild TERT promoter) and Huh-7.5 (-124 C>T mutant TERT promoter) The liver cancer cell line was infected and the expression level of TERT mRNA was observed (FIG. 11 ).
도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 sgRNA와 KRAB-dCas9을 발현하는 아데노바이러스를 이용한 CRISPRi system 전달에 의해 간암 세포주에서 세포내 TERT mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다. 구체적으로, -124 C>T mutant TERT promoter를 보유한 Huh-7.5 세포주에서는 sgRNA를 발현하지 않고, KRAB-dCas9만 발현하는 아데노바이러스에 비해 mutant TERT promoter를 표적하는 sgRNA들을 발현하는 아데노바이러스들에 의해 TERT 유전자의 발현이 90% 이상 감소함을 확인하였다. 반면, wild TERT promoter를 보유한 Hep3B 세포주에서는 Huh-7.5 세포주에 비해 감소 효과가 매우 적음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 sgRNA의 가이드 서열에 돌연변이를 도입할 경우 sgRNA의 활성에 변화를 줄 수 있음을 확인하였다. As shown in Figure 11, it was confirmed that the expression of intracellular TERT mRNA is reduced in the liver cancer cell line by CRISPRi system delivery using the adenovirus expressing the sgRNA and KRAB-dCas9. Specifically, in the Huh-7.5 cell line having a -124 C>T mutant TERT promoter, TERT by adenoviruses expressing sgRNAs targeting the mutant TERT promoter, compared to adenoviruses not expressing sgRNA but only KRAB-dCas9 It was confirmed that the expression of the gene was reduced by 90% or more. On the other hand, the Hep3B cell line with wild TERT promoter was found to have very little reduction effect compared to the Huh-7.5 cell line. Through the above results, it was confirmed that when a mutation is introduced into the guide sequence of the sgRNA, the activity of the sgRNA can be changed.
또한, TERT 유전자 발현의 감소에 의해 세포사가 유도될 수 있는지 확인하기 위해 cell proliferation assay를 수행하였다 (도 12). In addition, a cell proliferation assay was performed to confirm whether cell death can be induced by reducing TERT gene expression (FIG. 12 ).
도 12에 나타낸 바와 같이, wild TERT promoter를 보유한 Hep3B에서는 어떠한 아데노바이러스도 세포사를 유도하지 못함을 확인하였다. 반면, -124 C>T mutant TERT promoter를 보유한 Huh-7.5 세포주에서는 2-2 P19 sgRNA를 발현하는 CRISPRi system을 보유한 아데노바이러스에서 50%의 세포사를 유도함을 확인하였다. As shown in Figure 12, it was confirmed that no adenovirus induces cell death in Hep3B with wild TERT promoter. On the other hand, it was confirmed that in the Huh-7.5 cell line having a -124 C>T mutant TERT promoter, 50% of cell death was induced in adenovirus carrying a CRISPRi system expressing 2-2 P19 sgRNA.
상기 결과를 통해, -124 C>T mutant TERT promoter를 표적하는 2-2 P19 sgRNA와 KRAB-dCas9을 조합한 CRISPRi system이 -124 C>T mutant TERT promoter를 보유한 암세포에서 TERT 유전자의 발현 억제와 동시에 세포사까지 유도할 수 있는 최적의 system임을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 CRISPRi system을 사용하면 TERT 프로모터의 -124 또는 -146 C>T mutation을 가지는 암세포만을 표적하여 세포 특이적인 치료가 가능하고, 따라서 새로운 암 치료법으로써 유용하게 활용될 수 있다.Through the above results, the CRISPRi system combining 2-2 P19 sgRNA and KRAB-dCas9 targeting -124 C>T mutant TERT promoter simultaneously inhibited the expression of TERT gene in cancer cells with -124 C>T mutant TERT promoter. It was confirmed that it is the optimal system to induce even cell death. That is, when the CRISPRi system according to the present invention is used, cell-specific treatment is possible by targeting only cancer cells having -124 or -146 C>T mutation of the TERT promoter, and thus can be usefully utilized as a new cancer treatment method.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> CRISPR system specific for TERT promoter mutation and use thereof <130> DANKOOK1-4P-1 <150> KR 10-2017-0172385 <151> 2017-12-14 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-1 sgRNA <400> 1 ggggcuggga gggcccggaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-2 sgRNA <400> 2 gggcugggag ggcccggaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-1 sgRNA P19 <400> 3 gcggcuggga gggcccggaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-2 sgRNA P19 <400> 4 gcgcugggag ggcccggaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-8 sgRNA <400> 5 guccccggcc cagccccuuc 20 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> CRISPR system specific for TERT promoter mutation and use thereof <130> DANKOOK1-4P-1 <150> KR 10-2017-0172385 <151> 2017-12-14 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-1 sgRNA <400> 1 ggggcuggga gggcccggaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-2 sgRNA <400> 2 gggcugggag ggcccggaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-1 sgRNA P19 <400> 3 gcggcuggga gggcccggaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-2 sgRNA P19 <400> 4 gcgcugggag ggcccggaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-8 sgRNA <400> 5 guccccggcc cagccccuuc 20
Claims (17)
Cas9 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 발현 억제 및 DNA 표적용 조성물.A guide RNA comprising a nucleotide sequence complementary to a -124 C>T mutant Telomerase reverse transcriptase (TERT) promoter, or DNA encoding the guide RNA; And
A composition for inhibiting DNA expression and comprising a DNA target, comprising a Cas9 polypeptide or a polynucleotide encoding the same.
상기 TERT 프로모터는 1개 이상의 점 돌연변이 (point mutation)를 포함하는 것인, 조성물. The method according to claim 1,
The TERT promoter is a composition comprising at least one point mutation.
상기 뉴클레오타이드는 TERT 프로모터의 -124 C>T 돌연변이에 상보적인 염기를 포함하는 20개의 뉴클레오타이드인 것인, 조성물. The method according to claim 1,
The nucleotide is a composition of 20 nucleotides comprising a base complementary to the -124 C>T mutation of the TERT promoter.
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X091 | Application refused [patent] | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) |