KR102131880B1 - Method for Methanol Production Using methanotroph without External Reducing Power - Google Patents
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Abstract
본 발명은 외부 환원력이 필요없는 메탄자화균을 이용한 메탄 이용 메탄올 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따르면 메탄올 생산 과정에서 MDH를 부분적으로 저해하여 촉매량과 환원력 양을 일정하게 유지함으로써 메탄올 생산량을 증가시킬 수 있으므로, 이를 효과적으로 메탄올 생산 공정에 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for producing methanol using methane using methane magnetization bacteria that does not require an external reducing power. According to the method, methanol production is increased by partially inhibiting MDH in the methanol production process to maintain a constant amount of catalyst and reducing power. Therefore, it can be effectively used in the methanol production process.
Description
본 발명은 외부 환원력이 필요없는 메탄자화균을 이용한 메탄 이용 메탄올 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 EDTA를 일정량 포함하는 조건에서 메탄자화균을 이용하여 촉매량과 환원력을 일정하게 유지함으로써 메탄올의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing methane using methane using methane magnetizing bacteria that does not require an external reducing power, and more specifically, the production of methanol by maintaining a constant amount of catalyst and reducing power using methane magnetizing bacteria under conditions including a certain amount of EDTA. It is about how to increase.
현재 보고된 메탄자화균을 이용한 메탄 이용 메탄올 생산 방법은 메탄올 탈수소화 효소의 블로킹을 통해 메탄으로부터 생산된 메탄올이 대사되지 않도록 하여 배양액에 축적시키는 방법을 사용하고 있다.The presently reported method of producing methane using methane using methane magnetization bacteria uses a method of preventing methanol produced from methane from being metabolized through blocking of methanol dehydrogenase and accumulating in a culture medium.
온화한 조건에서 메탄의 전환이 가능함에도 생물학적인 방법에 의한 메탄올 생산이 어려운 이유는 두 가지가 있다. 첫째, 메탄 산화 효소(methane monooxygenase; MMO)는 메탄의 전환을 위하여 환원력이 필요하다. 둘째, 생산된 메탄올은 메탄올 탈수소화 효소(dehydrogenase; MDH)에 의하여 분해된다.There are two reasons why it is difficult to produce methanol by biological methods even though methane can be converted under mild conditions. First, methane monooxygenase (MMO) needs a reducing power to convert methane. Second, the produced methanol is decomposed by methanol dehydrogenase (MDH).
메탄자화균(methanotroph) 세포 내에서는 메탄 전환에 필요한 환원력이 메탄올 산화로부터 회수되고, 이 과정에서 생성된 포름알데히드가 세포 대사를 통해 생장에 이용되므로 자연적인 메탄올 축적 유도는 매우 어려울 수밖에 없다. 따라서 현재까지의 메탄자화균에 의한 메탄올 생산 연구 결과를 보면, 생성된 메탄올의 분해를 방지하고자 MDH 저해제를 사용하고 있다. 그러나, 인위적으로 메탄올 탈수소화 효소의 활성을 억제할 경우 환원력이 부족하여 메탄 산화가 이루어지지 않는다.In the methanotroph cells, the reducing power required for methane conversion is recovered from methanol oxidation, and the formaldehyde produced in this process is used for growth through cell metabolism, so induction of natural methanol accumulation is inevitable. Therefore, looking at the results of methanol production by methane magnetizing bacteria to date, MDH inhibitors are used to prevent decomposition of the produced methanol. However, when artificially inhibiting the activity of methanol dehydrogenase, methane oxidation is not achieved due to insufficient reducing power.
따라서, 기존의 방법들은 이를 해결하기 위하여 메탄올 탈수소화 효소의 저해와 함께 외부 환원력으로 메탄올보다 고가인 개미산 등을 공급하고 있다.Therefore, the existing methods are supplying formic acid and the like, which are more expensive than methanol, as an external reducing power with the inhibition of methanol dehydrogenase to solve this.
이에 본 발명자들은 메탄올 탈수소화 효소(dehydrogenase; MDH)를 부분적으로 저해하였을 때 외부 환원력의 공급 없이 메탄올 생산 공정의 수행이 가능함을 확인하였다.Accordingly, the present inventors have confirmed that when methanol dehydrogenase (MDH) is partially inhibited, it is possible to perform a methanol production process without supplying an external reducing power.
이에, 본 발명의 목적은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박테리움 속(Methylobacterium), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)을 포함하는 메탄올 생산용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, the object of the present invention is the genus Methylomonas (Methylomonas), Methylobacterium (Methylobacterium), Methylomicrobium (Methylomicrobium), Methylobacter (Methylobacter), Methylococcus (Methylococcus), Methylococcus The genus lospera (Methylosphaera), the genus Methylocaldum, the genus Methyloglobus, the genus Methylosarcina, the genus Methyloprofundus, and the genus Methyloprofundus Methylothermus, Methylohalobius, Methylogaea, Methylomarinum, Methylovulum, Methylomarinovum, Methylomarinovum, Methyllove The genus Rum (Methylorubrum), Methyloparacoccus, Methylosinus, Methylocystis, Methylocellas, Methylocella, Methylocapsa, Methyllocapsa One or more strains selected from the group consisting of Methylofurula, Methylacidiphilum and Methylacidimicrobium and Methanol containing ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) It is to provide a composition for production.
본 발명의 다른 목적은 메틸로모나스 속, 메틸로박테리움 속, 메틸로마이크로비움 속, 메틸로박터 속, 메틸로코커스 속, 메틸로스페라 속, 메틸로칼덤 속, 메틸로글로버스 속, 메틸로사르시나 속, 메틸로프로펀더스 속, 메틸로썰머스 속, 메틸로할로비우스 속, 메틸로게아 속, 메틸로마리넘 속, 메틸로벌럼 속, 메틸로마리노범 속, 메틸로러브럼 속, 메틸로파라코커스 속, 메틸로시너스 속, 메틸로시스티스 속, 메틸로셀라 속, 메틸로캡사 속, 메틸로퍼룰라 속, 메틸아시디필럼 속 및 메틸아시디마이크로비움 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주로부터 EDTA를 포함하는 배양액에서 전환반응을 유도하는 전환 단계를 포함하는 메탄올 생산 방법을 제공하는 것이다.Other objects of the present invention are in the genus methylomonas, genus methylobacterium, genus methylomicrobius, genus methylobacterus, genus melococcus, genus methylospera, genus methylocalum, genus methyloglobus, Methylrosarcina, Methylprofunders, Methylhalomers, Methylhalobius, Methyleroge, Methylaromarinum, Methyllobum, Methylmarolinovum, Methyluro The genus Loverum, Methylparacoccus, Methylocinus, Methylocystis, Methylocella, Methylcapsa, Methyloperula, Methyl acidilum and Methyl acidimicrobium It is to provide a methanol production method comprising a conversion step of inducing a conversion reaction in a culture medium containing EDTA from one or more strains selected from the group.
본 발명은 외부 환원력이 필요없는 메탄자화균을 이용한 메탄 이용 메탄올 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 EDTA를 일정량 포함하는 조건에서 메탄자화균을 이용하여 촉매량과 환원력을 일정하게 유지함으로써 메탄올의 생산량을 증가시킨다.The present invention relates to a method for producing methane using methane using methane magnetizing bacteria that does not require an external reducing power, and the method according to the present invention uses methane magnetizing bacteria under conditions containing a certain amount of EDTA to maintain a constant catalytic amount and reducing power to methanol. Increase the production of
본 발명자들은 EDTA를 일정량 포함하는 조건에서 메탄자화균을 이용하여 메탄올을 생산함으로써, 외부 환원력의 공급 없이도 메탄올의 생산량을 증가시켰다.The present inventors produced methanol using methane magnetization bacteria under conditions including a certain amount of EDTA, thereby increasing the production of methanol without supply of external reducing power.
본 발명의 구현을 위하여 1) 지속적으로 세포를 생산하는 세포 배양 장치와 2) 메탄올을 생산하는 메탄올 생산 장치를 구성하고, 메탄올 생산 과정에 배양 장치에서 생산된 세포를 공급하여 촉매량과 환원력 양을 일정하게 유지함으로써 메탄올 생산량을 증가시키고자 하였다.For the implementation of the present invention, 1) a cell culture device for continuously producing cells and 2) a methanol production device for producing methanol, and the cells produced in the culture device are supplied to the methanol production process to provide a constant amount of catalyst and reducing power. It was intended to increase the production of methanol by maintaining the same.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박테리움 속(Methylobacterium), 메틸로마이크로비움 속(Methylomicrobium), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로비움 속(Methylacidimicrobium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)을 포함하는 메탄올 생산용 조성물이다.One aspect of the present invention is the genus Methylomonas (Methylomonas), Methylobacterium (Methylobacterium), Methylomicrobium (Methylomicrobium), Methylobacter (Methylobacter), Methylococcus (Methylococcus), Methylose The genus Ferra (Methylosphaera), the genus Methlocaldum, the genus Methyloglobus, the genus Methylosarcina, the genus Methyloprofundus, the genus Methylothermusmus ), Methylohalobius, Methylogaea, Methylomarinum, Methylovulum, Methylomarinovum, Methylomarinovum Genus (Methylorubrum), Methyloparacoccus, Methylosinus, Methylocystis, Methylocellas, Methylocella, Methylocapsa, Methylopera Methanol production including one or more strains selected from the group consisting of the genus Methylofurula, Methylacidiphilum and Methylacidimicrobium, and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) It is a composition.
상기 균주는 기탁번호 KCTC 13004BP로 기탁된 메틸로모나스 속 DH-1인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The strain may be DH-1 of the genus Methylonas deposited with accession number KCTC 13004BP, but is not limited thereto.
상기 조성물은 EDTA를 0.01 내지 5.00 mM, 0.01 내지 2.00 mM, 0.01 내지 1.00 mM, 0.01 내지 0.80 mM, 0.10 내지 5.00 mM, 0.10 내지 2.00 mM, 0.10 내지 1.00 mM, 0.10 내지 0.80 mM, 0.20 내지 5.00 mM, 0.20 내지 2.00 mM 또는 0.20 내지 1.00 mM, 예를 들어, 0.20 내지 0.80 mM의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The composition is EDTA 0.01 to 5.00 mM, 0.01 to 2.00 mM, 0.01 to 1.00 mM, 0.01 to 0.80 mM, 0.10 to 5.00 mM, 0.10 to 2.00 mM, 0.10 to 1.00 mM, 0.10 to 0.80 mM, 0.20 to 5.00 mM, 0.20 to 2.00 mM or 0.20 to 1.00 mM, for example, may be included in a concentration of 0.20 to 0.80 mM, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 양태는 메틸로모나스 속, 메틸로박테리움 속, 메틸로마이크로비움 속, 메틸로박터 속, 메틸로코커스 속, 메틸로스페라 속, 메틸로칼덤 속, 메틸로글로버스 속, 메틸로사르시나 속, 메틸로프로펀더스 속, 메틸로썰머스 속, 메틸로할로비우스 속, 메틸로게아 속, 메틸로마리넘 속, 메틸로벌럼 속, 메틸로마리노범 속, 메틸로러브럼 속, 메틸로파라코커스 속, 메틸로시너스 속, 메틸로시스티스 속, 메틸로셀라 속, 메틸로캡사 속, 메틸로퍼룰라 속, 메틸아시디필럼 속 및 메틸아시디마이크로비움 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주로부터 EDTA를 포함하는 배양액에서 전환반응을 유도하는 전환 단계를 포함하는 메탄올 생산 방법이다.Other embodiments of the present invention, the genus methylomonas, genus methylobacterium, genus methylobacterium, genus methylobacterus, genus melococcus, genus methylospera, genus methylocalum, genus methyloglobus, Methylrosarcina, Methylprofunders, Methylhalomers, Methylhalobius, Methyleroge, Methylaromarinum, Methyllobum, Methylmarolinovum, Methyluro The genus Loverum, Methylparacoccus, Methylocinus, Methylocystis, Methylocella, Methylcapsa, Methyloperula, Methyl acidilum and Methyl acidimicrobium It is a methanol production method comprising a conversion step of inducing a conversion reaction in a culture medium containing EDTA from one or more strains selected from the group.
본 명세서상의 용어 "전환"은, 배양액 내의 물질을 이용하여 균주가 특정 물질을 생산하는 과정을 의미한다.The term "conversion" in the present specification means a process in which a strain produces a specific substance using a substance in a culture medium.
상기 균주는 기탁번호 KCTC 13004BP로 기탁된 메틸로모나스 속 DH-1인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The strain may be DH-1 of the genus Methylonas deposited with accession number KCTC 13004BP, but is not limited thereto.
상기 조성물은 EDTA를 0.01 내지 5.00 mM, 0.01 내지 2.00 mM, 0.01 내지 1.00 mM, 0.01 내지 0.80 mM, 0.10 내지 5.00 mM, 0.10 내지 2.00 mM, 0.10 내지 1.00 mM, 0.10 내지 0.80 mM, 0.20 내지 5.00 mM, 0.20 내지 2.00 mM 또는 0.20 내지 1.00 mM, 예를 들어, 0.20 내지 0.80 mM의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The composition is EDTA 0.01 to 5.00 mM, 0.01 to 2.00 mM, 0.01 to 1.00 mM, 0.01 to 0.80 mM, 0.10 to 5.00 mM, 0.10 to 2.00 mM, 0.10 to 1.00 mM, 0.10 to 0.80 mM, 0.20 to 5.00 mM, 0.20 to 2.00 mM or 0.20 to 1.00 mM, for example, may be included in a concentration of 0.20 to 0.80 mM, but is not limited thereto.
상기 전환 단계는 균주 세포 내의 NADH/NAD+ 비율을 0.5 이상으로 유지하며 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The conversion step may be performed while maintaining the NADH/NAD+ ratio in the strain cell at 0.5 or more, but is not limited thereto.
상기 전환 단계는 10 내지 50%(v/v), 10 내지 45%(v/v), 10 내지 40%(v/v), 10 내지 35%(v/v), 20 내지 50%(v/v), 20 내지 45%(v/v), 20 내지 40%(v/v), 20 내지 35%(v/v), 25 내지 50%(v/v), 25 내지 45%(v/v) 또는 25 내지 40%(v/v), 예를 들어, 25 내지 35%(v/v)의 메탄을 포함하는 가스 존재하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The conversion step is 10 to 50% (v/v), 10 to 45% (v/v), 10 to 40% (v/v), 10 to 35% (v/v), 20 to 50% (v) /v), 20 to 45% (v/v), 20 to 40% (v/v), 20 to 35% (v/v), 25 to 50% (v/v), 25 to 45% (v /v) or 25 to 40% (v/v), for example, 25 to 35% (v/v) may be performed in the presence of a gas containing methane, but is not limited thereto.
상기 전환 단계는 상기 가스를 10 내지 900분 동안 배기하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가스의 배기에 소요되는 최적 시간은 전체 배양액의 부피, 공정 수행 시간, 사용하는 균주의 종류 및 배지 조성을 포함하는 조건의 변동에 따라 적절히 조정될 수 있다.The conversion step may be performed by exhausting the gas for 10 to 900 minutes, but is not limited thereto. The optimum time required for the exhaust of the gas may be appropriately adjusted according to the fluctuations in conditions including the volume of the entire culture medium, the process execution time, the type of strain used, and the medium composition.
상기 전환 단계는 25 내지 35℃, 27 내지 35℃, 29 내지 35℃, 25 내지 32℃, 또는 27 내지 32℃, 예를 들어, 29 내지 32℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The conversion step may be performed at a temperature of 25 to 35°C, 27 to 35°C, 29 to 35°C, 25 to 32°C, or 27 to 32°C, for example, 29 to 32°C, but is not limited thereto. It is not.
본 발명은 외부 환원력이 필요없는 메탄자화균을 이용한 메탄 이용 메탄올 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따르면 메탄올 생산 과정에서 MDH를 부분적으로 저해하여 촉매량과 환원력 양을 일정하게 유지함으로써 메탄올 생산량을 증가시킬 수 있으므로, 이를 효과적으로 메탄올 생산 공정에 이용할 수 있다.The present invention relates to a method for producing methanol using methane using methane magnetization bacteria that does not require an external reducing power. According to the method, methanol production is increased by partially inhibiting MDH in the methanol production process to maintain a constant amount of catalyst and reducing power. Therefore, it can be effectively used in the methanol production process.
도 1은 본 발명의 메탄올 생산 경로를 보여주는 모식도이다.
도 2는 DH-1 균주의 메탄올 탈수소화 효소(dehydrogenase; MDH)의 활성에 대한 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 EDTA의 농도에 따른 DH-1 균주 세포의 MDH 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 EDTA를 첨가하지 않은 배지 조건하에서 DH-1 균주의 메탄 소비와 메탄올 생성을 비교한 그래프이다.
도 4b는 EDTA를 0.50 mM 첨가한 배지 조건하에서 DH-1 균주의 메탄 소비와 메탄올 생성을 비교한 그래프이다.
도 4c는 EDTA를 10.00 mM 첨가한 배지 조건하에서 DH-1 균주의 메탄 소비와 메탄올 생성을 비교한 그래프이다.
도 5a는 EDTA를 첨가하지 않은 배지 조건하에서 DH-1 균주 세포 내 NADH/NAD+ 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 EDTA를 0.50 mM 첨가한 배지 조건하에서 DH-1 균주 세포 내 NADH/NAD+ 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 EDTA를 10.00 mM 첨가한 배지 조건하에서 DH-1 균주 세포 내 NADH/NAD+ 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 DH-1 균주의 전환반응에서 EDTA의 농도를 달리한 배지 조건과 흡광도와의 관계를 나타낸 그래프이다.1 is a schematic view showing the methanol production route of the present invention.
2 is a graph showing the effect of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) on the activity of methanol dehydrogenase (MDH) of the DH-1 strain.
3 is a graph showing the MDH activity of DH-1 strain cells according to the concentration of EDTA.
Figure 4a is a graph comparing the methanol production and methane consumption of the DH-1 strain under medium conditions without the addition of EDTA.
Figure 4b is a graph comparing the methanol production and methane consumption of the DH-1 strain under medium conditions to which EDTA was added 0.50 mM.
Figure 4c is a graph comparing the methanol production and methane consumption of the DH-1 strain under medium conditions to which EDTA is added 10.00 mM.
5A is a graph showing the ratio of NADH/NAD + in DH-1 strain cells under medium conditions without the addition of EDTA.
5B is a graph showing the ratio of NADH/NAD + in DH-1 strain cells under medium conditions in which 0.50 mM EDTA was added.
5C is a graph showing the ratio of NADH/NAD + in DH-1 strain cells under medium conditions in which EDTA was added to 10.00 mM.
Figure 6 is a graph showing the relationship between the absorbance and the medium conditions with different concentrations of EDTA in the conversion reaction of the DH-1 strain.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1: EDTA의 최적 농도 결정Example 1: Determination of the optimal concentration of EDTA
메탄 한 분자의 전환에는 전자 두 개가 필요하며, 메탄올의 산화를 통해 전자 네 개가 생산될 수 있으므로 이론적으로는 MDH 효소 활성의 적절한 조절을 통해 메탄 1몰로부터 최대 1/2몰의 메탄올을 얻을 수 있다.Conversion of one molecule of methane requires two electrons, and since four electrons can be produced through oxidation of methanol, theoretically, it is possible to obtain up to 1/2 mole of methanol from 1 mole of methane through proper regulation of MDH enzyme activity. .
메탄올 탈수소화 효소(dehydrogenase; MDH) 활성 제어를 통한 메탄올의 선택적 생산을 위하여 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)를 사용하였다. EDTA는 금속 킬레이터로서 MDH에서 리실(lysyl) 또는 아르기닐(arginyl) 잔기의 고정을 통한 초기 결합을 방해함으로써 MDH의 전자 전달을 방해할 수 있어 이전의 메탄올 생산 연구에서 많이 사용되어 왔다.Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used for the selective production of methanol through control of methanol dehydrogenase (MDH) activity. EDTA, a metal chelator, has been used in many of the previous methanol production studies because it can interfere with the electron transport of MDH by interfering with the initial binding through the fixation of lysyl or arginyl residues in MDH.
50 mL NMS 배지가 포함된 500 mL 배플 플라스크(baffled flask)에 1 mL의 DH-1 스탁(stock, KCTC 13004BP)을 접종한 후 주기적으로 메탄/공기를 주입하며 600 nm에서 배양액의 흡광도(OD600)가 5 내지 6이 될 때까지 진탕배양기에서 30℃, 230 rpm으로 배양하여 도 1과 같은 경로로 반응을 유도하였다. 배양 시 외부 공기의 유입과 내부 메탄 또는 프로판의 유출을 방지하기 위하여 플라스크에 부틸 고무(butyl rubber) 재질의 셉텀(septum)이 있는 마개를 사용하였다. NMS 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.After inoculating 1 mL of DH-1 stock (stock, KCTC 13004BP) into a 500 mL baffled flask containing 50 mL NMS medium, periodically injecting methane/air and absorbing the culture at 600 nm (OD600) Incubation was performed at 30°C and 230 rpm in a shake incubator until 5 to 6 to induce a reaction in the same manner as in FIG. 1. In order to prevent the inflow of external air and the outflow of methane or propane during cultivation, a stopper with a butyl rubber septum was used in the flask. The composition of the NMS medium is shown in Table 1 below.
메탄올 전환 실험을 위하여 상기 배양한 배양액을 원심분리하고 상등액을 제거한 다음 PBS 버퍼(buffer)로 세척하는 과정을 2회 반복하였다. 이후 pH 8.5의 PBS 버퍼에 EDTA 농도를 0.00, 0.01, 0.10, 0.50, 1.00, 5.00 및 10.00 mM로 설정하여 추가한 다음 세척된 메탄자화균 세포를 OD 30이 되도록 추가하였다. 메탄:공기=3:7 부피비의 가스를 30분간 배기한 다음 진탕 배양기에서 30℃에서 230 rpm으로 교반하며 진행하였다.For the methanol conversion experiment, the cultured culture was centrifuged, the supernatant was removed, and the process of washing with PBS buffer was repeated twice. Afterwards, EDTA concentrations in PBS buffer at pH 8.5 were set to 0.00, 0.01, 0.10, 0.50, 1.00, 5.00 and 10.00 mM, and then washed methane magnetized cells were added to
다양한 EDTA 농도에서 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1의 MDH 활성에 대한 EDTA의 영향을 관찰하였다. MDH의 활성은 MDH가 메탄올을 산화시킬 때 발생하는 전자에 의한 DCPIP(2,6-dichlorophenolindophenol)의 환원속도를 측정하여 결정하였다 (참고문헌: 김희곤, 이상귀, 김시욱, "신규 type I 메탄자화세균 Methylobacterium sp. HG-1을 이용한 메탄올의 생합성", 공학기술논문지, 1(1), 33-37 (2008))The effects of EDTA on the MDH activity of Methylomonas sp. DH-1 at various EDTA concentrations were observed. The activity of MDH was determined by measuring the reduction rate of DCPIP (2,6-dichlorophenolindophenol) by electrons generated when MDH oxidizes methanol. Methylobacterium sp. Biosynthesis of methanol using HG-1", Journal of Engineering Technology, 1(1), 33-37 (2008))
도 2에서 확인할 수 있듯이, EDTA에 의한 저해 효과는 0.01 mM까지는 나타나지 않았으며, 이후 1.00 mM 농도까지는 급격히 증가하였다. 0.50 mM의 EDTA를 첨가하였을 때, MDH의 특이적 활성(specific activity)은 2.095 nmol/mg protein/min로서, 원래 활성의 31% 수준이었다. 1.00 mM 이상의 EDTA에서 활성은 서서히 저해되며 최종적으로 EDTA 농도가 10.00 mM에 이르면 MDH의 활성은 완전히 저해되었다. 메탄이 메탄올로 전환하는데 필요한 전자와 메탄올이 산화되어 얻을 수 있는 전자를 고려할 때, MDH의 활성이 1/3 내지 1/2일 때 메탄올을 가장 많이 축적할 수 있으리라 예상되어 EDTA 최적 농도를 0.50 mM로 결정하였다.As can be seen in Figure 2, the inhibitory effect by EDTA did not appear until 0.01 mM, and then rapidly increased to 1.00 mM concentration. When 0.50 mM EDTA was added, the specific activity of MDH was 2.095 nmol/mg protein/min, which was 31% of the original activity. In EDTA of 1.00 mM or higher, the activity was gradually inhibited, and finally, when the EDTA concentration reached 10.00 mM, the activity of MDH was completely inhibited. Considering the electrons required to convert methane to methanol and the electrons obtained by oxidation of methanol, it is expected that the highest concentration of methanol can be accumulated when the activity of MDH is 1/3 to 1/2, and the optimal concentration of EDTA is 0.50 mM. Decided.
실시예 2: EDTA에 의한 MDH 저해 효과의 확인Example 2: Confirmation of MDH inhibitory effect by EDTA
EDTA에 의한 MDH 효소 저해가 in-vivo 상에서도 이루어지는지 확인하기 위하여 반응 버퍼(reaction buffer)에서 초기 메탄올 농도가 45 mM일 때 Methylomonas sp. DH-1 세포를 투입하여 메탄올 분해를 관찰하였다. 효소 활성 실험에서 도출한 0.00 mM, 0.50 mM, 그리고 10.00 mM의 EDTA 농도에서 DH-1 휴지 세포(resting cell)의 시간당 메탄올 소모량을 분석하였다.Methylomonas sp. when the initial methanol concentration in the reaction buffer was 45 mM to confirm that the MDH enzyme inhibition by EDTA was also performed in-vivo. DH-1 cells were added to observe methanol degradation. The methanol consumption per hour of DH-1 resting cells was analyzed at EDTA concentrations of 0.00 mM, 0.50 mM, and 10.00 mM derived from the enzyme activity experiment.
도 3에서 확인할 수 있듯이, EDTA가 포함되지 않았을 때 DH-1 세포는 4시간만에 메탄올을 모두 소모하였다. 그러나 MDH 활성이 대부분 저해를 받는 EDTA 10.00 mM이 포함된 조건에서는 4시간이 지나도 1.80 mM의 메탄올만을 소모함으로써 메탄올 분해가 거의 이루어지지 않았음을 확인할 수 있다. 한편, MDH 부분저해 조건인 EDTA 0.50 mM 포함 조건에서 DH-1 세포는 4시간 동안 투입 메탄올의 31%인 13.9 mM의 메탄올을 소모하여 실제 전세포 전환 실험에서도 MDH의 부분 저해가 가능함을 확인하였다.As can be seen in FIG. 3, when EDTA was not included, DH-1 cells consumed all methanol in 4 hours. However, it can be confirmed that methanol decomposition was hardly achieved by consuming only 1.80 mM methanol even after 4 hours in a condition that contained EDTA 10.00 mM, which is mostly inhibited by MDH activity. On the other hand, DH-1 cells under conditions including MDTA partially inhibited EDTA 0.50 mM consumed 13.9 mM methanol, which is 31% of the input methanol for 4 hours, and it was confirmed that partial inhibition of MDH is possible even in an actual whole cell conversion experiment.
실시예 3: 메탄올 전환 및 축적 정도의 확인Example 3: Confirmation of methanol conversion and accumulation
실시예 1 및 2에서 수행한 효소 활성 실험과 휴지 세포 실험으로부터 얻은 MDH 부분 저해 효과를 이용하여 실제 메탄 전환 실험을 수행하였다. Methylomonas sp. DH-1 세포를 투입하여 메탄의 소모를 관찰하였다.Actual methane conversion experiments were performed using the enzyme activity experiments performed in Examples 1 and 2 and MDH partial inhibitory effects obtained from resting cell experiments. Methylomonas sp. DH-1 cells were added to observe the consumption of methane.
도 4a에서 확인할 수 있듯이, MDH 저해를 받지 않는 EDTA가 없는 조건에서 메탄 전환 메탄올 생산 실험 결과, 반응 4시간 및 8시간째에 메탄의 소비량은 각각 36.28 mM, 37.10 mM이었다. 이는 대사 과정에 저해를 받지 않았기 때문에 세포 내에서 가장 많은 메탄 소비량을 보인 것으로 볼 수 있다.As can be seen in Figure 4a, as a result of methane conversion methanol production experiment in the absence of EDTA without MDH inhibition, the consumption of methane at 4 and 8 hours of reaction was 36.28 mM and 37.10 mM, respectively. It can be considered that it showed the largest amount of methane consumption in the cell because it was not inhibited by the metabolic process.
그러나 MDH 저해가 없는 조건에서 메탄올은 계속해서 산화되기 때문에 메탄올 축적은 거의 발생하지 않았다. 반응 4시간째에 최대 메탄올 생산은 0.273 mM였으며 메탄 소비 대비 메탄올 수율은 0.8%이었다. 반응 8시간째에 메탄올은 더 감소하여 0.224 mM였으며 메탄 소비 대비 메탄올 수율은 0.6%이었다.However, methanol accumulation hardly occurred because methanol continued to be oxidized in the absence of MDH inhibition. At 4 hours of reaction, the maximum methanol production was 0.273 mM and the methanol yield relative to methane consumption was 0.8%. At 8 hours of reaction, methanol was further reduced to 0.224 mM, and the methanol yield compared to methane consumption was 0.6%.
도 4b에서 확인할 수 있듯이, MDH 활성을 1/3 수준으로 낮춘 조건(EDTA 0.50 mM)에서 메탄올은 성공적으로 축적되었다. 메탄 소모량은 4시간 및 8시간째에서 각각 29.41 mM과 35.24 mM로서 EDTA가 없는 조건보다 줄어들었으나, 메탄올 농도는 반응 4시간째에 21.52 mM(0.69 g/l)로 빠르게 증가하였고 이 후, 반응 8시간째에 메탄올 생산은 최종 27.85 mM(0.892 g/l) 까지 증가하였다. 메탄 소비 대비 메탄올 생산 수율은 각각 4시간 및 8시간째에 73.1%, 79.0%였다.As can be seen in Figure 4b, methanol was successfully accumulated under the condition where MDH activity was lowered to 1/3 level (EDTA 0.50 mM). Methane consumption was 29.41 mM and 35.24 mM at 4 hours and 8 hours, respectively, which was lower than EDTA-free conditions, but the methanol concentration rapidly increased to 21.52 mM (0.69 g/l) at 4 hours of reaction, after which
도 4c에서 확인할 수 있듯이, MDH 완전 저해가 발생하는 EDTA 10.00 mM 조건에서는, 메탄올 산화를 통한 환원력 공급이 이루어지지 않으므로 메탄 전환이 이루어지지 않아 메탄 소비와 메탄올 축적이 모두 거의 발생하지 않았다. 반응 4시간째에 소비된 메탄은 3.62 mM, 생산된 메탄올 농도는 0.06 mM에 불과하였다.As can be seen in FIG. 4c, in EDTA 10.00 mM condition where MDH complete inhibition occurs, since methane conversion is not performed because reductive power supply through methanol oxidation is not performed, methane consumption and accumulation of methanol hardly occur. Methane consumed at 4 hours of the reaction was 3.62 mM, and the produced methanol concentration was only 0.06 mM.
결론적으로, MDH 부분 저해를 통하여 외부 환원력 없이도 최대 0.892 g/l의 메탄올을 생산할 수 있었다.In conclusion, MDH partial inhibition was able to produce up to 0.892 g/l methanol without external reducing power.
실시예 4: NADH/NAD+ 비율을 통한 세포 내 환원력 측정Example 4: Measurement of intracellular reducing power through NADH/NAD+ ratio
메탄자화균을 이용한 메탄의 전환과 메탄올 생산 과정에서 환원력 레벨(level)은 매우 중요한 역할을 담당한다. Methylomonas sp. DH-1 휴지 세포를 사용한 메탄올 전환에서 세포 내의 환원력 레벨을 판단하기 위하여, NADH/NAD+ 비율을 측정하였다.The conversion of methane using methane magnetization bacteria and the level of reducing power play a very important role in the production process of methanol. Methylomonas sp. To determine the level of reducing power in cells in methanol conversion using DH-1 resting cells, the NADH/NAD + ratio was measured.
도 5a에서 확인할 수 있듯이, MDH 저해를 받지 않는 EDTA가 없는 조건에서 전환 시간 동안 NADH/NAD+ 비율이 초기 상태에서 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Methylomonas sp. DH-1 내에서 메탄으로부터 생산되는 메탄올이 모두 메탄 생산에 필요한 환원력 공급에 다시 활용되는 것을 의미한다.As can be seen in Figure 5a, it was confirmed that the NADH / NAD + ratio is maintained in the initial state during the transition time in the absence of EDTA without MDH inhibition. This is Methylomonas sp. This means that all the methanol produced from methane in DH-1 is used again to supply the reducing power required for methane production.
도 5b에서 확인할 수 있듯이, MDH가 부분적으로 저해된 EDTA 0.50 mM이 포함된 조건에서의 NADH/NAD+ 비율은 전환 시간 동안 초기에 일부 감소하지만 어느 정도 유지되고 있음을 알 수 있었다. 생산된 메탄올은 부분 저해된 MDH의 활성에 따라 일부는 메탄 전환에 필요한 환원력으로 공급되고, 일부는 반응 버퍼(reaction buffer)에 축적되는 것으로 판단된다. 다만, 전체적인 NADH/NAD+ 비율이 낮기 때문에 메탄 전환 속도는 EDTA가 없는 조건보다는 늦어지는 것으로 판단되었다.As can be seen in FIG. 5B, it was found that the NADH/NAD + ratio in the condition containing 0.50 mM of EDTA partially inhibited by MDH was partially reduced during the conversion time, but was maintained to some extent. It is judged that the produced methanol is partially supplied with a reducing power necessary for methane conversion and partially accumulated in a reaction buffer according to the activity of partially inhibited MDH. However, because the overall NADH/NAD+ ratio is low, the rate of methane conversion was judged to be slower than that without EDTA.
도 5c에서 확인할 수 있듯이, MDH 활성을 완전히 저해시킨 EDTA 10.00 mM이 포함된 조건에서의 NADH/NAD+ 비율은 지속적으로 감소하였다. 메탄 전환에 필요한 환원력 제공 및 메탄올 산화가 원활히 이루어지지 않으므로 미량의 메탄 전환만이 관찰되는 것으로 해석할 수 있다. EDTA 10.00 mM 조건에서 NADH/NAD+ 비율은 반응 초기의 0.766에서 반응 8시간째에 0.254로 현저하게 낮아졌다.As can be seen in Figure 5c, the NADH / NAD + ratio in conditions containing EDTA 10.00 mM that completely inhibited MDH activity was continuously decreased. It can be interpreted that only a small amount of methane conversion is observed because it does not provide the reducing power necessary for methane conversion and the oxidation of methanol is not smooth. The NADH/NAD + ratio at EDTA 10.00 mM condition was significantly lowered from 0.766 at the beginning of the reaction to 0.254 at the 8th hour of the reaction.
실시예 5: 전환반응 중 세포 농도의 변화 확인Example 5: Confirmation of change in cell concentration during the conversion reaction
전환반응 중의 세포 흡광도(optical density; OD)값을 측정하였다.During the conversion reaction, the cell density (optical density) was measured.
도 6에서 확인할 수 있듯이, EDTA가 0.00 mM일 때 세포 OD 값은 초기에 31이었다가 반응 4시간 후 2.8 감소하였으나, 다시 반응 8시간 후에 0.8 회복되었다. 전체 반응과정에서 EDTA가 없을 경우 세포의 유지에도 큰 저해가 나타나지 않음을 확인했다.As can be seen in Figure 6, when the EDTA is 0.00 mM, the cell OD value was 31 at the beginning and then decreased by 2.8 after 4 hours of reaction, but recovered 0.8 after 8 hours of reaction again. It was confirmed that in the absence of EDTA in the entire reaction process, no significant inhibition was observed in cell maintenance.
그러나 EDTA가 포함된 경우 세포농도는 꾸준히 감소하였으며, 농도에 따라 그 정도가 심해졌다. MDH 부분 저해가 발생하는 EDTA 0.50 mM이 포함되었을 때 반응 4시간 및 8시간 후 세포 OD 값은 각각 6.5, 10.8 감소하였으며, 4시간 이후 메탄올의 생산 속도가 느려진 것은 이러한 생촉매 감소에서 야기한 것으로 판단된다.However, when EDTA was included, the cell concentration steadily decreased, and the degree of severity increased with concentration. When 0.50 mM EDTA containing MDH partial inhibition was included, cell OD values decreased by 6.5 and 10.8, respectively, after 4 hours and 8 hours of reaction, and it was thought that the production rate of methanol slowed down after 4 hours was caused by this reduction in biocatalyst. .
그리고 세포 내의 MDH가 완전히 저해된 EDTA 10.00 mM이 포함된 조건에서는 세포가 이전 조건보다 더 빠르게 감소되는 것을 확인하였다. 반응 4시간 및 8시간 후 세포 OD 값은 각각 24.5 및 27.55만큼 감소하여 대부분의 세포가 사멸된 것으로 분석되었다.And it was confirmed that the cells were reduced faster than the previous conditions in the conditions containing EDTA 10.00 mM, where MDH in the cells was completely inhibited. After 4 and 8 hours of reaction, the cell OD values decreased by 24.5 and 27.55, respectively, indicating that most of the cells were killed.
이러한 결과로부터 EDTA 농도가 MDH 활성 뿐 아니라 휴지 세포의 분해에도 영향을 미치는 것을 알 수 있었으며 지속적인 세포의 활성 및 세포 내 환원력 유지 방법이 상업적인 메탄올 생산 공정 개발을 위하여 마련되어야 할 것으로 보인다.From these results, it was found that the EDTA concentration affects not only MDH activity but also decomposition of resting cells, and it is expected that a method for sustaining cell activity and maintaining a reducing power in the cell should be prepared for commercial methanol production process development.
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