KR102131494B1 - Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PCR-coupled Rolling Circle Amplification - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)과 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 키트 및 이를 이용한 표적 유전자 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 표적 유전자 검출용 키트에 의하면, 길이가 긴 RNA의 검출이 용이하지 않았던 종래기술의 문제점을 해결하여 길이가 긴 표적 핵산을 단 시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 검출 및 분석할 수 있다.The present invention relates to a polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction) and a rolling circle amplification (Rolling Circle Amplification)-based target gene detection kit and a target gene detection method using the same, according to the target gene detection kit of the present invention, length By solving the problem of the prior art, in which detection of long RNA was not easy, a long-length target nucleic acid can be detected and analyzed with excellent sensitivity and specificity within a short time.

Description

중합효소연쇄반응과 회전환 증폭을 이용한 타겟 핵산서열 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PCR-coupled Rolling Circle Amplification}Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PCR-coupled Rolling Circle Amplification}

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)과 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 키트 및 이를 이용한 표적 유전자 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction) and a rolling circle amplification (Rolling Circle Amplification) based target gene detection kit and a target gene detection method using the same.

신종 플루, 메르스 사태와 같은 고위험 감염성 질환들은 많은 사회적 비용을 초래한다. 때문에 미량의 유전자를 증폭하여 질병을 정확하게 진단하는 유전자 진단이 주목 받고 있다.High-risk infectious diseases, such as the swine flu and MERS outbreaks, are costly. For this reason, gene diagnosis, which accurately diagnoses diseases by amplifying a small amount of genes, is drawing attention.

현재까지 가장 널리 사용되는 유전자 증폭방법인 중합효소연쇄반응(PCR)은 역전사반응, taqman probe, 고해상도 용융분석(HRM) 기술(Do, H, et al, BMC Cancer, 2008 8(1)p 1-14), 잠긴 핵산(LNA)-폴리머라제연쇄반응(Arcila, M, et al, The Journal of Molecular Diagnostics, 2011 13(1): p 64-73), 정량적 PCR (Thierry, AR, et al, The Journal of Molecular Diagnostics, 2011 13(1): p 64-73), digital PCR (Laurent-Puig, P, et al, Nat Med, 2014 20(4): p 430-435) 등 다양한 기법들과 융합·응용되어 단일가닥 유전자(RNA, complementary DNA)부터 이중가닥 유전자(plasmid, genomic DNA)까지 대부분의 유전자 증폭에 적합하다. 하지만 반응 초반에 과량의 개시자에 의한 비 특이적인 반응과 반응 후반의 중합체의 재결합에 의한 증폭 효율감소 등의 문제로, 유전자 진단에 있어서 정확도와 민감도가 부적합한 경우가 종종 발생한다.Polymerase chain reaction (PCR), the most widely used gene amplification method to date, includes reverse transcription, taqman probe, and high-resolution melt analysis (HRM) technology (Do, H, et al, BMC Cancer, 2008 8(1)p 1- 14), locked nucleic acid (LNA)-polymerase chain reaction (Arcila, M, et al, The Journal of Molecular Diagnostics, 2011 13(1): p 64-73), quantitative PCR (Thierry, AR, et al, The Fusion of various techniques such as Journal of Molecular Diagnostics, 2011 13(1): p 64-73), digital PCR (Laurent-Puig, P, et al, Nat Med, 2014 20(4): p 430-435) It is suitable for amplification of most genes, from single-stranded genes (RNA, complementary DNA) to double-stranded genes (plasmid, genomic DNA). However, due to problems such as a non-specific reaction by an excessive amount of initiator at the beginning of the reaction and a reduction in amplification efficiency by recombination of the polymer at the end of the reaction, accuracy and sensitivity are often inadequate in genetic diagnosis.

이러한 배경 하에 증진된 감도를 가진 새로운 진단 플랫폼에 대한 연구 개발이 이루어지고 있으며, 최근에는 회전환 증폭(Rolling circle amplification; 이하 RCA라고 함)이 다양한 분야에서 이용되고 있다. 회전환 증폭은 원형의 주형 DNA를 기반으로 미량의 유전자를 온도 변화 없이 상온(25±5 ℃)에서, 반복되는 긴 길이의 단일가닥 DNA로 합성할 수 있는 효율적인 유전자 증폭법이다. 그러나, 선형의 패드락 프로브(padlock probe)의 양 말단을 원형으로 접합시키는 접합단계(ligation)와 짧은 길이 primer를 이용해 유전자를 회전환 증폭하는 증폭단계(amplification) 등 두 가지 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있고, 표적 핵산 자체의 이중나선 구조형성, 비 특이적 접합 또는 저 농도의 표적 핵산으로 인해 패드락 DNA에 표적 핵산을 어닐링 하지 못할 경우 단일 가닥 패드락 DNA의 연결은 매우 어려워지게 된다. 특히, 라이게이션 기반 RCA는 바이러스 RNA와 같은 긴 길이의 RNA (3,000 개 이상의 뉴클레오티드)의 직접 검출에는 적합하지 않다.Under this background, research and development of a new diagnostic platform with enhanced sensitivity has been made, and recently, rolling circle amplification (hereinafter referred to as RCA) has been used in various fields. Rotational ring amplification is an efficient gene amplification method that can synthesize a small amount of genes at a normal temperature (25±5°C) at a constant temperature (25±5°C) and repeat a long single-stranded DNA based on circular template DNA. However, it is cumbersome to go through two steps: a ligation step of circularly joining both ends of a linear padlock probe and an amplification step of amplifying a gene using a short length primer. In this case, when the target nucleic acid cannot be annealed to the padlock DNA due to the double-stranded structure formation of the target nucleic acid itself, non-specific conjugation, or low concentration of the target nucleic acid, the connection of the single-strand padlock DNA becomes very difficult. In particular, ligation-based RCA is not suitable for direct detection of long RNAs (over 3,000 nucleotides), such as viral RNA.

이에, 긴 길이의 핵산을 안정적으로 검출할 수 있고 고감도로 극소량의 핵산을 탐지할 수 있는 시스템의 개발이 필요한 실정이다.Accordingly, there is a need to develop a system capable of stably detecting a long nucleic acid and detecting a very small amount of nucleic acid with high sensitivity.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 길이가 긴 표적 핵산을 간편하고 높은 민감도로 선택적 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력한 결과, 표적 핵산의 이중 증폭, 새로운 헤어핀 프라이머와 패드락 프로브 및 G-사중나선 구조와 형광 검출을 이용하면 긴 길이의 표적 핵산을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.In order to solve the problems of the prior art as described above, the present inventors tried to establish an analysis method capable of selectively detecting a long target nucleic acid with simple and high sensitivity. As a result, double amplification of the target nucleic acid, new hairpin primer and padlock Using the probe and G-quadron structure and fluorescence detection, it was confirmed that a long-length target nucleic acid can be detected with high specificity and sensitivity, and the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은 길이가 긴 표적 핵산 검출용 키트를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a kit for detecting a target nucleic acid having a long length.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid using the kit.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 표적 유전자 결합 부위와 패드락 프로브(Padlock probe)에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 헤어핀 프라이머; 및 상기 헤어핀 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위, 표적 유전자 결합 부위, 형광 검출을 위한 표지자 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 패드락 프로브;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a hairpin primer comprising a target gene binding site and a binding site complementarily binding to a padlock probe; And a padlock probe including a primer binding site complementarily binding to the hairpin primer, a target gene binding site, a marker site for fluorescence detection, and a complementary binding site in a probe to form a dumbbell shape. Provided is a kit for detecting target genes based on Rolling Circle Amplification (RCA).

다른 측면에서, 본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 표적 유전자 증폭용 조성물을 추가적으로 포함하는 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit additionally comprising a composition for amplifying a target gene for polymerase chain reaction (PCR).

또 다른 측면에서, 본 발명은 중합효소연쇄반응으로 표적 유전자를 증폭시키는 단계(S1); 상기 (S1) 단계에서 증폭된 이중 가닥의 표적 유전자로부터 단일 가닥의 표적 유전자를 수득하는 단계(S2); 상기 (S2) 단계에서 수득한 단일 가닥의 표적 유전자와 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브(Padlock probe)를 포함하는 반응용액을 반응시켜 RCA 개시복합체 형성과 함께 회전환 증폭(Rolling circle amplification)을 수행하여 단일 가닥의 유전자를 얻는 단계(S3); 상기 (S3) 단계에서 증폭된 단일 가닥의 유전자를 확인하는 단계(S4);를 포함하는, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is a step of amplifying the target gene by polymerase chain reaction (S1); Obtaining a single-stranded target gene from the double-stranded target gene amplified in the step (S1) (S2); By reacting a single strand of the target gene obtained in step (S2) and a reaction solution containing a hairpin primer and a padlock probe, RCA initiation complex formation and rolling circle amplification are performed to perform single ring amplification. Obtaining a strand gene (S3); It provides a method for detecting a target gene based on PCR-RCA double amplification, including the step (S4) of identifying a single-stranded gene amplified in the step (S3).

본 발명의 표적 유전자 검출용 키트에 의하면, 길이가 긴 RNA의 검출이 용이하지 않았던 종래기술의 문제점을 해결하여 길이가 긴 표적 핵산을 단 시간 내에 우수한 민감도와 특이도로 검출 및 분석할 수 있다.According to the target gene detection kit of the present invention, it is possible to detect and analyze a long-length target nucleic acid with excellent sensitivity and specificity within a short time by solving the problem of the prior art, in which it was not easy to detect a long RNA.

본 발명의 키트에 의하면, 다양한 바이러스의 아형까지도 구별해낼 수 있고, 극소량으로 존재하는 표적 핵산을 아토몰 수준까지 검출해낼 수 있다.According to the kit of the present invention, even subtypes of various viruses can be distinguished, and target nucleic acids present in a very small amount can be detected up to the level of atom.

도 1은 중합효소연쇄반응(PCR)과 회전환 증폭(RCA)을 융합한 핵산 증폭 방법 및 형광 분석 방법을 사용한 핵산 검출 공정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 단일 가닥 H3N2 DNA를 표적으로 하여 회전환 증폭 산물을 아가로즈겔 전기영동으로 확인한 것으로, A는 표적 농도 증가에 따른 증폭 산물 증가; B는 반응 시간 증가에 따른 증폭 산물 증가; C와 D는 반응 시간 증가에 따른 티오플라빈 T에 의한 형광 증가 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 GQ-RCA 분석의 민감도와 선택성을 측정한 것으로, A는 H3N2 DNA의 농도를 단계적으로 희석하여 측정한 형광 스펙트럼; B는 형광강도와 H3N2 DNA 농도 로그 값 사이의 선형 상관관계(검출한계는 1.2 nM); C는 표적 DNA(H3N2, H1N1, Yamagata)의 형광 검출 결과; D는 C의 이미지 형광 값을 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 RT-PCR 앰플리콘과 람다 핵산말단분해효소를 처리한 RT-PCR 앰플리콘의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 ThT가 있는 상태에서 GQ-RCA를 수행하고 GQ-RCA 생성물의 형광 방출을 검사한 결과로, A는 H3N2 RNA의 농도를 단계적으로 희석하여 측정한 형광 스펙트럼; B는 형광강도와 H3N2 RNA 농도 로그 값 사이의 선형 상관관계; C는 인플루엔자 바이러스 RNA의 형광검출 결과; D는 C의 이미지 형광 값을 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 RCA 반응(0~40분) 동안 자외선을 조사하여 형광을 시각화 한 것으로, 표적 핵산은 H3N2 DNA, H3N2 바이러스 RNA 이고, Yamagata 바이러스 RNA 와 H1N1 바이러스 RNA는 비표적 핵산이며, RNA를 포함하지 않는 그룹과 티오플라빈 T만 포함하는 그룹을 대조군으로 하였다.
도 7은 본 발명의 PCR-GQ-RCA 시스템에 따른 민감도와 정량적 RT-PCR 방법에 따른 민감도를 비교한 결과이다.
도 8은 인플루엔자 바이러스 RNA 농도를 단계적으로 희석하여 실시간 RT-PCR 방법으로 각 농도 별 3번씩 수행한 결과를 형광강도와 cycle 수에 대하여 선형 그래프로 나타낸 것이다.
도 9의 A는 헤어핀을 형성하지 않는 프라이머와 선형의 패드락 프로브를, B는 헤어핀을 형성하는 프라이머와 덤벨 모양의 패드락 프로브를 각각 이용하여 표적 H3N2 DNA를 검출하는 원리를 도식화 한 것이다. C는 A와 B의 방법으로 H3N2 DNA 유무에 따른 형광 검출 결과이고, D는 C의 결과를 형광 스펙트럼으로 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram of a nucleic acid amplification method using a polymerase chain reaction (PCR) and a rotational ring amplification (RCA), and a nucleic acid detection process using a fluorescence analysis method.
Figure 2 is a single-stranded H3N2 DNA targeting the rotational ring amplification products confirmed by agarose gel electrophoresis, A increases the amplification product according to the target concentration increase; B increases amplification products with increasing reaction time; C and D show the result of fluorescence increase by thioflavin T with increasing reaction time.
Figure 3 is a measure of the sensitivity and selectivity of the GQ-RCA analysis, A is a fluorescence spectrum measured by diluting the concentration of H3N2 DNA stepwise; B is a linear correlation between fluorescence intensity and logarithmic value of H3N2 DNA (detection limit is 1.2 nM); C is a result of fluorescence detection of target DNA (H3N2, H1N1, Yamagata); D is a bar graph showing the image fluorescence value of C.
Figure 4 shows the results of the electrophoresis of RT-PCR amplicon and RT-PCR amplicon treated with lambda nucleic acid endonase.
5 is a result of performing GQ-RCA in the presence of ThT and examining the fluorescence emission of the GQ-RCA product, A is a fluorescence spectrum measured by diluting the concentration of H3N2 RNA step by step; B is a linear correlation between fluorescence intensity and logarithmic value of H3N2 RNA concentration; C is the result of fluorescence detection of influenza virus RNA; D is a bar graph showing the image fluorescence value of C.
Figure 6 is a visualization of the fluorescence by irradiating ultraviolet rays during the RCA reaction (0-40 minutes), the target nucleic acid is H3N2 DNA, H3N2 viral RNA, Yamagata virus RNA and H1N1 viral RNA are non-target nucleic acids, do not contain RNA The non-group and the group containing only thioflavin T were used as controls.
7 is a result of comparing the sensitivity according to the PCR-GQ-RCA system of the present invention and the quantitative RT-PCR method.
FIG. 8 is a linear graph of the fluorescence intensity and the number of cycles for the results of performing the influenza virus RNA concentration step by step in dilution and performing three times for each concentration using a real-time RT-PCR method.
9A is a diagram showing the principle of detecting a target H3N2 DNA by using a primer that does not form a hairpin and a linear padlock probe, and a B that uses a primer and a dumbbell-shaped padlock probe that form a hairpin, respectively. C is the result of fluorescence detection according to the presence or absence of H3N2 DNA in the method of A and B, and D is the result of C in the fluorescence spectrum.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 표적 유전자 결합 부위와 패드락 프로브(Padlock probe)에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 헤어핀 프라이머; 및 상기 헤어핀 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위, 표적 유전자 결합 부위, 형광 검출을 위한 표지자 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 패드락 프로브;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention is a hairpin primer comprising a binding site that complementarily binds to a target gene binding site and a Padlock probe; And a padlock probe including a primer binding site complementarily binding to the hairpin primer, a target gene binding site, a marker site for fluorescence detection, and a complementary binding site in a probe to form a dumbbell shape. A kit for detecting target genes based on amplification (Rolling Circle Amplification, RCA).

하기 도 1은 본 발명에 따른 검출 시스템의 핵심 구성 및 이를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 개략적인 개념을 도시한 도면으로서, 중합효소연쇄반응 및 단일가닥 DNA 생성; 생성된 단일 가닥에 헤어핀 프라이머가 혼성화 되고 헤어핀 프라이머의 노출된 부위에 패드락 프로브가 결합함으로써 RCA 개시복합체 형성; 및 회전환 증폭을 통해 G-사중나선 구조가 반복되는 긴 단일가닥 DNA의 생성 및 형광 검출을 보여주는 개념도이다.1 is a diagram showing a core configuration of a detection system according to the present invention and a schematic concept of detecting a target nucleic acid using the same, comprising: polymerase chain reaction and single-stranded DNA generation; The hairpin primer is hybridized to the resulting single strand and the padlock probe is bound to the exposed region of the hairpin primer to form an RCA-initiated complex; And a conceptual diagram showing the generation and fluorescence detection of long single-stranded DNAs in which the G-quartet structure is repeated through rotational amplification.

본 발명에서 용어 "표적 핵산"은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화 조건하에서 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적 핵산'은 '타겟 핵산' 또는 '표적 유전자'로 혼용되어 사용된다. 본 발명에서 표적 핵산은 동물, 식물, 세균, 바이러스, 진균 등으로부터 유래되는 유전자, 또는 유전 질환에 수반되는 돌연변이 된 유전자 등일 수 있다. 본 발명에서 표적 유전자는 DNA 또는 RNA 등의 핵산 단편을 의미하고 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNa, dsDNA, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA 또는 miRNA 일 수 있다.The term "target nucleic acid" in the present invention means a nucleic acid sequence to be detected, and is annealed or hybridized with a probe under hybridization conditions. 'Target nucleic acid' is used interchangeably with'target nucleic acid' or'target gene'. In the present invention, the target nucleic acid may be a gene derived from animals, plants, bacteria, viruses, fungi, or the like, or a mutated gene involved in a genetic disease. In the present invention, the target gene refers to a nucleic acid fragment such as DNA or RNA and may be single or double stranded, and may be DNA or RNA capable of representing sense or antisense strands, dsDNA, ssDNA, mixed ssDNA, mixed dsDNA, ssDNa, It can be dsDNA, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA or miRNA.

본 발명에서 용어 "상보적으로 결합하는 결합 부위" 또는 "상보적인 결합 부위"는 뉴클레오티드 서열 간에 상보적 염기 쌍을 형성할 수 있는 부위를 의미한다.In the present invention, the term "complementary binding site" or "complementary binding site" means a site capable of forming a complementary base pair between nucleotide sequences.

본 발명에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일가닥 핵산의 상보적인 염기서열들이 페어링(pairig)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.The term "hybridization" in the present invention means that the complementary base sequences of two single-stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing.

본 발명에서 용어 "회전환 증폭"이란 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프로브를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여 주형 DNA가 연속적으로 합성되도록 하는 것을 지칭한다.In the present invention, the term "reversion amplification" refers to a single-stranded circular DNA as a template, and is subjected to polymerization at isotherm using a complementary probe to continuously synthesize the template DNA.

본 발명에서 용어 "헤어핀 프라이머"는 스템-루프 구조를 형성하는 부분 헤어핀 프라이머로 표적 DNA와 패드락 프로브에 상보적인 부분을 모두 가지고 있으며, 평소에는 헤어핀 모양으로 자가 구조(self-structure)를 이루고 있어 패드락 프로브에 상보적인 부분이 노출되지 않아 서로 결합할 수 없지만, 표적 핵산이 존재하는 경우, 헤어핀 프라이머가 단일 가닥의 표적 핵산과 결합하면서 패드락 프로브에 상보적인 부분이 노출되어 패드락 프로브에 결합할 수 있게 된다.The term "hairpin primer" in the present invention is a partial hairpin primer forming a stem-loop structure, which has both a complementary part to a target DNA and a padlock probe, and usually forms a self-structure in the form of a hairpin. Although the complementary parts of the padlock probe are not exposed and cannot bind to each other, when the target nucleic acid is present, the hairpin primer binds to the padlock probe by exposing the complementary part to the padlock probe while binding to the single-stranded target nucleic acid I can do it.

본 발명에서 용어 "패드락 프로브"는 회전환 증폭의 주형으로 사용되며, 헤어핀 프라이머와 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위, 표적 유전자 결합 부위, 형광 검출을 위한 표지자 부위, 패드락 프로브의 덤벨 형태를 형성하기 위한 주형 내 상보적인 결합 부위를 포함하며, 부목(splint) DNA 없이도 T4 리가아제에 의해 미리 접합된다.In the present invention, the term "padlock probe" is used as a template for rotational amplification, primer binding sites complementarily binding to hairpin primers, target gene binding sites, marker sites for fluorescence detection, and padlock probe dumbbell forms. It contains complementary binding sites in the template to form and is pre-conjugated by T4 ligase without splint DNA.

본 발명에서 용어 "RCA 개시복합체"는 표적 핵산, 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브의 삼 성분 복합체로서 표적 핵산에 헤어핀 프라이머와 패드락 프로브가 함께 결합함으로써 긴 길이의 표적 핵산을 직접 검출할 수 있는 안정성을 부여한다.In the present invention, the term "RCA-initiated complex" is a three-component complex of a target nucleic acid, a hairpin primer, and a padlock probe, and a combination of a hairpin primer and a padlock probe coupled to the target nucleic acid provides stability to directly detect a long-length target nucleic acid. Grant.

즉, 본 발명에 따른 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 키트는 헤어핀 프라이머와 패드락 프로브를 포함함으로써, 표적 유전자 존재 시 안정한 RCA 개시복합체를 형성하여 긴 길이의 표적 유전자를 안정적으로 검출할 수 있고, 미량의 표적 핵산을 높은 감도로 신속하게 검출할 수 있다.In other words, the kit for detecting a target gene based on acyclic ring amplification according to the present invention includes a hairpin primer and a padlock probe, thereby stably detecting a long-length target gene by forming a stable RCA initiation complex in the presence of the target gene, Trace target nucleic acids can be detected quickly with high sensitivity.

본 발명에 따른 덤벨 형태의 패드락 프로브는 표적 핵산, 예컨대 동물, 식물, 바이러스, 세균, 병원균으로부터 유래되는 유전자의 길이, 유전 질환에 수반되는 돌연변이 된 유전자의 길이, 프라이머의 길이 등을 고려하여 다양하게 길이와 서열을 디자인할 수 있다. 예를 들어, 상기 패드락 프로브의 길이는 60 내지 90 머(mer)일 수 있다. 상기 패드락 프로브의 길이가 너무 짧으면 그 자체로서 불안정해지고, 너무 길면 RCA 효율이 감소할 수 있다.The padlock probe in the form of a dumbbell according to the present invention is various considering the length of a gene derived from a target nucleic acid, such as an animal, a plant, a virus, a bacterium, or a pathogen, a length of a mutated gene accompanying a genetic disease, and a length of a primer You can design length and sequence. For example, the padlock probe may have a length of 60 to 90 mer. If the length of the padlock probe is too short, it becomes unstable by itself, and if it is too long, the RCA efficiency may decrease.

본 발명에 따른 상기 패드락 프로브는 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다. 위 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위는 패드락 프로브의 양 말단에 분리되어 형성된다. 예를 들어, 패드락 프로브는 5 내지 50 mer, 바람직하게는 15 내지 25 mer 길이의 표적 유전자 결합부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 검출하고자 하는 표적 유전자는 동물, 식물, 세균, 바이러스, 진균 등에 존재하거나 이로부터 유래되는 것으로 바람직하게는 mRNA, dsDNA 및 cDNA를 포함한 유전자 물질, 유전 질환에 수반되는 돌연변이 된 유전자에 존재하거나 이로부터 유래되는 것일 수 있다.The padlock probe according to the present invention includes a binding site that complementarily binds a target gene. The binding sites complementarily binding to the target gene are formed separately at both ends of the padlock probe. For example, the padlock probe may include a target gene binding site of 5 to 50 mer, preferably 15 to 25 mer long. The target gene to be detected of the present invention is present in or derived from animals, plants, bacteria, viruses, fungi, and the like, and is preferably present in a genetic material including mRNA, dsDNA and cDNA, or a mutated gene accompanying genetic disease, or It may be derived from it.

상기 검출하고자 하는 표적 유전자는 예를 들어 병원균 유전자일 수 있고 핵산 서열을 아는 모든 병원균을 대상으로 할 수 있다. 예컨대, 상기 병원균은 조류독감, 지카 바이러스, 대장균, 사스(SARS), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 폐렴(Streptococcus pneumonia), 간염(Hepatitis A,B,C,D 및 E virus), 메르스 코로나 바이러스(MERS-Coronavirus) 또는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 일 수 있다.The target gene to be detected may be, for example, a pathogen gene and may target all pathogens that know the nucleic acid sequence. For example, the pathogens include avian influenza, Zika virus, E. coli, SARS, Mycobacterium tuberculosis, Pneumonia (Streptococcus pneumonia), Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D and E virus), MERS corona virus ( MERS-Coronavirus) or influenza virus.

본 발명에 따른 상기 패드락 프로브는 헤어핀 프라이머가 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위를 포함한다. 상기 프라이머 결합 부위는 5 내지 15 mer, 바람직하게는 10 내지 12 mer 길이일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 헤어핀 프라이머가 패드락 프로브에 잘 결합되지 않아 회전환 증폭 반응이 개시되지 않거나 검출 민감도가 떨어질 수 있다.The padlock probe according to the present invention includes a primer binding site to which the hairpin primer binds complementarily. The primer binding site may be 5 to 15 mer, preferably 10 to 12 mer long. If it is outside the above range, the hairpin primer is not well bound to the padlock probe, so that the rotation ring amplification reaction may not be initiated or detection sensitivity may be deteriorated.

본 발명에 따른 상기 패드락 프로브는 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위를 포함한다. 위 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위는 덤벨 형태 양 말단 즉, 원형 형태를 가지는 한쪽 말단 부위는 형광 검출을 위한 표지자 부위이고, 반대 쪽 말단은 헤어핀 프라이머와 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함할 수 있도록 서열 내에서 상보적 결합을 통해 덤벨 형태를 형성한다. 예를 들어, 패드락 프로브가 총 60 내지 90 mer 의 길이를 가질 때 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위는 총 10 내지 30 mer 길이를 가지며, 바람직하게는 덤벨 형태를 형성하기 위한 총 12 내지 20 mer 길이의 상보적인 결합 부위(자기조립 결합부위)를 포함할 수 있다.The padlock probe according to the present invention includes a complementary binding site in the probe to form a dumbbell shape. Complementary binding sites in the probe for forming the stomach dumbbell form are both ends of the dumbbell form, i.e., one end site having a circular form is a marker site for fluorescence detection, and the other end is a binding site complementarily binding to the hairpin primer. To form a dumbbell form through complementary binding within the sequence. For example, when the padlock probe has a total length of 60 to 90 mer, the complementary binding sites in the probe for forming a dumbbell shape have a total length of 10 to 30 mer, preferably a total for forming a dumbbell shape. It may include a complementary binding site (self-assembled binding site) 12 to 20 mer long.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 본 발명의 표적 핵산은 인플루엔자 A(H1N1, H3N2) 및 인플루엔자 B(야마가타 혈통) 바이러스 RNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the target nucleic acid of the present invention may include influenza A (H1N1, H3N2) and influenza B (Yamagata lineage) viral RNA or cDNA.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 패드락 프로브의 서열은 서열번호 4, 서열번호 9, 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바이러스를 포함한 검출하고자 하는 병원균의 이미 알려진 서열 정보를 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 프로브를 디자인할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the sequence of the padlock probe uses a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto. Based on the already known sequence information of pathogens to be detected, including viruses, those skilled in the art can design probes that specifically bind to specific regions of these genes.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 헤어핀 프라이머의 서열은 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 사용할 수 있으나, 상기 패드락 프로브와 마찬가지로 이에 제한되는 것이 아니며, 표적 핵산을 인식할 수 있고 패드락 프로브에 결합할 수 있는 특정 길이의 올리고뉴클레오티드라면 헤어핀 프라이머로 사용할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the sequence of the hairpin primer may use a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, but is not limited thereto, like the padlock probe. Oligonucleotides of a specific length capable of recognizing nucleic acids and binding to padlock probes can be used as hairpin primers.

하기 표 1은 인플루엔자 바이러스의 특정 부위를 RT-PCR에 의해 증폭하기 위해 사용한 정방향과 역방향 프라이머 서열, RT-PCR에 의해 증폭된 표적 유전자 서열, 패드락 프로브 서열 및 헤어핀 프라이머 서열을 나타낸 것이다.Table 1 below shows the forward and reverse primer sequences, target gene sequences amplified by RT-PCR, padlock probe sequences, and hairpin primer sequences used to amplify specific regions of the influenza virus by RT-PCR.

Figure 112018038036104-pat00001
Figure 112018038036104-pat00001

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 표적 유전자 증폭용 조성물을 추가적으로 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트를 제공할 수 있다.In another aspect of the present invention, the present invention is a kit for detecting a target gene based on rolling circle amplification (RCA) additionally comprising a composition for amplifying a target gene for polymerase chain reaction (PCR). Can provide.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 중합효소연쇄반응을 위한 표적 유전자 증폭용 조성물은 DNA 중합효소, 반응 완충용액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 람다 말단분해효소를 포함할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the composition for target gene amplification for the polymerase chain reaction includes DNA polymerase, reaction buffer solution, deoxynucleotides (dNTPs), a primer set for target gene amplification, and lambda terminal degrading enzyme Can.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 사용할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the primer set is a primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, a primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 One or more primer sets selected from the group consisting of primer sets consisting of nucleotide sequences may be used.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통하여 다양한 종류, 다양한 농도 및 다양한 크기의 표적 핵산을 검출하였으며, 100 내지 300 mer, 바람직하게는 120 내지 250 mer 정도의 긴 길이의 표적 핵산을 선택적으로 검출할 수 있고, 450 아토몰(aM)에 해당하는 극소량의 DNA 샘플에서도 표적 핵산을 검출할 수 있는 고감도의 키트를 제공할 수 있다.The present inventors have detected target nucleic acids of various types, concentrations, and sizes through specific examples, and can selectively detect target nucleic acids having a long length of about 100 to 300 mer, preferably about 120 to 250 mer, It is possible to provide a highly sensitive kit capable of detecting a target nucleic acid even in a very small amount of DNA sample corresponding to 450 atom (aM).

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 In another aspect of the invention, the invention

중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 표적 유전자를 증폭시키는 단계(S1);Amplifying the target gene by polymerase chain reaction (PCR) (S1);

상기 (S1) 단계에서 증폭된 이중 가닥의 표적 유전자로부터 단일 가닥의 표적 유전자를 수득하는 단계(S2);Obtaining a single-stranded target gene from the double-stranded target gene amplified in the step (S1) (S2);

상기 수득한 단일 가닥의 표적 유전자와 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브(Padlock probe)을 포함하는 반응용액을 반응시켜 RCA 개시복합체 형성과 함께 회전환 증폭(Rolling circle amplification, RCA)을 수행하는 단계(S3); 및Reacting the obtained single-stranded target gene with a reaction solution comprising a hairpin primer and a padlock probe to perform RCA starting complex formation and rolling circle amplification (RCA) (S3). ; And

상기 (S3) 단계에서 증폭된 유전자를 확인하는 단계(S4);를 포함하는, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법을 제공할 수 있다.The step (S4) of identifying the gene amplified in the step (S3); including, PCR-RCA can provide a method for detecting amplification-based target gene.

본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 (S1) 단계는 검출하고자 하는 시료와 PCR용 프라이머 세트를 혼합하여 표적 유전자를 증폭시키는 단계로서, 프라이머 쌍 중 한쪽에 인산기를 수식하여 이중가닥 증폭 산물 생성 시 한쪽 가닥 5'-말단에 인산기가 수식되도록 한다.In the detection method of the present invention, the step (S1) is a step of amplifying a target gene by mixing a sample to be detected with a primer set for PCR, and modifying a phosphate group on one of the primer pairs to generate a double-stranded amplification product. The phosphate group is modified at the 5'-end of the strand.

본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 (S2) 단계는 (S1) 단계에서 증폭된 이중가닥 DNA 중 인산기가 수식된 가닥이 람다 말단분해효소(lamda-exonuclease)에 의해 분해되어 표적 유전자를 포함하는 단일가닥 DNA를 생성하게 된다.In the detection method of the present invention, the (S2) step is a single strand containing a target gene by decomposing a phosphate group-modified strand of the double-stranded DNA amplified in the (S1) step by lambda-exonuclease Strand DNA is produced.

본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 (S3) 단계는 (S2) 단계에서 생성된 단일 가닥의 표적 유전자에 헤어핀 프라이머와 패드락 프로브가 결합하여 RCA 개시복합체가 형성되고 이어 회전환 증폭(Rolling circle amplification)을 수행하는 단계이다. 상기 헤어핀 프라이머는 생성된 단일 가닥 표적 유전자에 상보적인 부분과 패드락 프로브에 상보적인 부분을 모두 가지고 있어서, 평소에는 헤어핀 모양으로 자가 구조(self-structure)를 이루고 있어 패드락 프로브에 상보적인 부분이 노출되지 않아 결합할 수 없지만, 단일가닥 표적 유전자가 존재하는 경우, 헤어핀 프라이머가 단일 가닥 표적 유전자와 결합하면서 패드락 프로브에 상보적인 부분이 노출되고 표적 유전자와 패드락 프로브와 함께 안정적인 RCA 개시복합체가 유도된다. 이때 Phi29 중합효소를 넣어주면 긴 길이의 단일가닥 DNA가 합성되게 된다.In the detection method of the present invention, in step (S3), a hairpin primer and a padlock probe are bound to a single-stranded target gene generated in step (S2) to form an RCA-initiated complex, followed by rolling circle amplification. ). The hairpin primer has both a complementary part to the generated single-stranded target gene and a complementary part to a padlock probe, and usually forms a self-structure in the form of a hairpin, thereby complementary to the padlock probe. Although not exposed and unable to bind, when a single-stranded target gene is present, the hairpin primer binds to the single-stranded target gene, exposing the complementary part to the padlock probe, and the stable RCA initiation complex with the target gene and padlock probe Is induced. At this time, if Phi29 polymerase is added, long-stranded single-stranded DNA is synthesized.

본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 (S4) 단계는 (S3) 단계에서 증폭된 긴 길이의 단일가닥 유전자를 확인하는 단계이다.In the detection method of the present invention, step (S4) is a step of identifying a single-stranded gene of long length amplified in step (S3).

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 패드락 프로브에 C 리치서열을 삽입함으로써 회전환 증폭 결과 G-리치한 긴 길이의 단일가닥 DNA를 합성하였으며, 상기 G-리치한 서열이 DNA 사중나선 구조(G-quadruplex)를 형성하고 여기에 티오플라빈 T가 결합하게 되어 나타나는 형광을 관찰하였다. 표적 유전자가 존재하게 되면 회전환 증폭이 일어나 형광을 관찰할 수 있지만, 표적 유전자가 없는 경우 헤어핀 프라이머가 펼쳐지지 않아 회전환 증폭이 일어나지 않고 형광을 관찰할 수 없게 된다.In a specific embodiment of the present invention, G-rich long-stranded single-stranded DNA was synthesized as a result of rotational ring amplification by inserting a C-rich sequence into the padlock probe, and the G-rich sequence was a DNA quadruplex structure (G- quadruplex), and the fluorescence of thioflavin T binding thereto was observed. When the target gene is present, rotational ring amplification occurs and fluorescence can be observed, but in the absence of the target gene, the hairpin primer does not spread and rotational ring amplification does not occur and fluorescence cannot be observed.

본 발명의 일 실시예에서는 인플루엔자 A(H1N1, H3N2)와 인플루엔자 B(Yamagata lineage) 바이러스 RNA를 표적 핵산으로 하여 상기 검출방법으로 실험한 결과, 도 2와 같이 표적 특이적으로 형광을 검출할 수 있었으며, 자외선을 조사하여 이를 어레이 타입으로 한 눈에 관찰할 수 있었다. 형광 광도계를 이용하여 형광을 측정했을 때 표적 바이러스 RNA에서 높은 형광을 관찰할 수 있었으며, 비표적 바이러스 RNA 대비 평균적으로 11.2 배의 형광 차이를 확인하였다.In an embodiment of the present invention, influenza A (H1N1, H3N2) and influenza B (Yamagata lineage) virus RNA were tested as the target nucleic acid, and as a result of experimenting with the detection method, target specific fluorescence was detected as shown in FIG. 2. , Irradiated with ultraviolet rays, it could be observed at a glance as an array type. When fluorescence was measured using a fluorescence photometer, high fluorescence was observed in the target viral RNA, and on average, 11.2 times the fluorescence difference was confirmed compared to the non-target viral RNA.

또한, 인플루엔자 바이러스 RNA를 450 pM 부터 순차적으로 희석하여 검출한계를 비교한 결과, 기존의 SYBR green을 이용한 실시간 중합효소반응(Real-time PCR;450 fM) 보다 약 1000배 더 민감하게(4.9 aM) 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출할 수 있었다(도 7). 인플루엔자 바이러스를 직접 검출하는 혈구응집검사(hemagglutination assay)와 비교하였을 때에도 약 256 배 만큼 더 민감하게 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있었다.In addition, as a result of comparing the detection limits by sequentially diluting the influenza virus RNA from 450 pM, it is approximately 1000 times more sensitive than real-time PCR (450 fM) using conventional SYBR green (4.9 aM). Influenza virus RNA could be detected (FIG. 7 ). Even when compared with a hemagglutination assay that directly detects influenza virus, it was able to detect influenza virus more sensitively by about 256 times.

이하에서는 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments. However, these examples are intended to illustrate the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited thereby.

[실시예][Example]

1. 재료 및 실험방법1. Materials and Experiment Method

1-1.　바이러스 샘플 및 올리고뉴클레오티드의 준비1-1. Preparation of virus samples and oligonucleotides

바이러스의 RNA 및 바이러스 현탁액 (A형 인플루엔자/캘리포니아/2007/H1N1 형, A형 인플루엔자/텍사스/50/2012/H3N2 및 인플루엔자 B/매사추세츠/02/2012/야마가타 계통)은 배아 난(embryonated eggs)의 요막강액으로부터 얻었으며, 한국원자력의학원(Seoul, Korea)에서 제공한 것을 사용하였다.　DNA 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고(Bionics, Seoul, Korea), 폴리아크릴아미드겔 전기영동 (PAGE)으로 정제하였으며 그 염기서열을 상기 표 1에 나타내었다.　인플루엔자 헤마글루티닌 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머는 세계보건기구 글로벌 인플루엔자 감시 및 대응체계(Global Influenza Surveillance and Response System, GISRS)[4]에 의해 발표된 인플루엔자 바이러스에 대한 분자 진단 프로토콜에서 선택하였다.RNA and viral suspensions of the virus (type A influenza/California/2007/H1N1 type, type A influenza/Texas/50/2012/H3N2 and influenza B/Massachusetts/02/2012/Yamagata strains) are derived from embryonated eggs. It was obtained from allantoic fluid and provided by the Korea Atomic Energy Institute (Seoul, Korea). DNA oligonucleotides were chemically synthesized (Bionics, Seoul, Korea), purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and the base sequences are shown in Table 1 above. Primers for PCR amplification of the influenza hemagglutinin gene were selected from a molecular diagnostic protocol for influenza viruses published by the World Health Organization Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS) [4] .

1-2.　시약의 준비1-2. Preparation of reagents

바이러스 RNA 추출에 사용되는　TRIzol®　용액, Platinum® Taq DNA 중합효소 키트가 포함된 Super-Script® III 원스텝 RT-PCR 시스템 및 EtBr (ethidium bromide)은 인비트로젠(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하고,　패드락 DNA와 4개의　dNTP(dATP,　dGTP,　dCTP　및 dTTP)의 연결을 위한 T4 DNA 리가아제는 다카라코리아바이오메디칼(Seoul, Korea)로부터 구입하였다.　람다 핵산말단분해효소(lambda-exonuclease) 및 phi29 중합효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩(Ipswich, MA, USA), ThT는 시그마 알드리치(　Yongin　, Korea), 혈구 응집 분석을 위한 닭의 적혈구는 패츠제럴드(Acton, MA, USA)에서 구입하였다.　또한, Rotor Gene SYBR Green PCR 키트 및　PrimerScriptTM 정량적 실시간 PCR의　1st Strand　cDNA　합성 키트는 퀴아젠(Hilden, Germany)과 다카라코리아바이오메디칼에서 각각 구입하였다.The TRIzol® solution used for viral RNA extraction, the Super-Script® III one-step RT-PCR system with Platinum® Taq DNA polymerase kit and EtBr (ethidium bromide) are purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). , T4 DNA ligase for the connection of padlock DNA and 4 dNTPs (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) was purchased from Takara Korea Biomedical (Seoul, Korea). Lambda-exonuclease and phi29 polymerase are New England Biolabs (Ipswich, MA, USA), ThT is Sigma Aldrich (Yongin, Korea), and chicken red blood cells for analysis of hemagglutination are activated by Acton. , MA, USA). In addition, the Rotor Gene SYBR Green PCR kit and PrimerScript ™ quantitative real-time PCR 1st Strand cDNA synthesis kit were purchased from Qiagen (Hilden, Germany) and Takara Korea Biomedical, respectively.

1-3. 덤벨 패드락 프로브 제작1-3. Dumbbell padlock probe production

덤벨 패드락 DNA의 두 말단을 연결하기 위해 500 nM 5'-인산화 덤벨 패드락 DNA, 175 U의 T4 DNA 리가아제 및 1μL의 10ХT4 리가아제 반응 완충액(660 mM Tris-HCl, 66 mM의 MgCl2, 100 mM의 DTT, 1 mM의 ATP, pH 7.6)을 제조하였다. 혼합물을 95℃에서 3분 동안 열 변경시키고, T4 DNA 리가아제 및 라이게이션 완충액을 첨가하기 전에 10분 동안 실온으로 냉각시켰다. 그런 다음 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 연결된 생성물을 15% PAGE 변경시켜 분석하고 EtBr로 염색하였다.To connect the two ends of the dumbbell padlock DNA, 500 nM 5′-phosphorylated dumbbell padlock DNA, 175 U of T4 DNA ligase and 1 μL of 10ХT4 ligase reaction buffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 1 mM ATP, pH 7.6) was prepared. The mixture was heat-changed at 95°C for 3 minutes, and cooled to room temperature for 10 minutes before adding T4 DNA ligase and ligation buffer. Then the mixture was incubated at 25° C. for 1 hour. Linked products were analyzed by 15% PAGE change and stained with EtBr.

1-4.　회전환 증폭(RCA) 및 형광검출1-4. Rotational ring amplification (RCA) and fluorescence detection

fluorogenic GQ-RCA(G-quadruplex-generating RCA) 반응을 위해 상기 1-3에서 제조된 연결된　덤벨 패드락 DNA(50nM)를 RCA 혼합물에 첨가했다(총 부피 25μL). 상기 RCA 혼합물은 부분 헤어핀 프라이머 50nM, phi29 중합효소 완충액(50　mM의　트리스-HCl, 10　mM의　MgCl2, 10mM의 (NH4)2SO4 및 4mM의 DTT, pH 7.5), 15μM의 ThT, 100 ㎍/mL BSA, 각각 0.6 mM의 농도의 dNTP 및 50 nM 표적 (H3N2) DNA를 포함한다.　연결된 덤벨 패드락 DNA가 첨가된 혼합물을 90℃에서 3분 동안 가열하고 7분 동안 실온으로 냉각시켰다.　RCA 반응은 phi29 중합효소(100 U)를 첨가하고 30℃ 또는 실온에서 다양한 시간(0 내지 20 분범위)동안 항온 처리하고 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 반응을 정지 시켰다.음성 대조군의 경우, 표적 핵산이 없는 상태에서 20분 동안 RCA를 수행하였다.　RCA에 의해 증폭된 DNA 분자는 1.5 % 아가로즈겔 전기영동을 사용하여 분석되었고 EtBr 염색법에 따라 자외선 조사 하에서 가시화되었다.　G-사중나선 인터카레이션에 의해 생성된 ThT 형광의 시각적 검출을 위해, 96-웰 플레이트 캐스트의 직립 위치에 유지된 PCR 튜브 내의 RCA 혼합물의 사진을 UV 조명하에 PowerShot　A640 디지털 카메라 (Canon Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 촬영하였다. G-사중나선로 복합화된 ThT의 형광 측정을 위해 표적 핵산이 있거나 없는 50 μL의 RCA 반응 혼합물을 Model Cary가 장착된 형광 분광 광도계 (모델 Cary Eclipse, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)의 석영 큐벳으로 이동시켰다. Eclipse 소프트웨어.　형광 강도에 대한 기구 설정은 다음과 같다:　λex　= 425 nm;　여기 슬릿 폭: 20 nm; λem　= 488 nm;　방출 슬릿 폭: 10nm;　PMT 전압: 600 V. 형광 분광 광도계의 Peltier 포켓에서 30℃에서 20분 동안 인큐베이션하는 동안, 형광은 425 nm의 여기 파장 및 488 nm의 방출 파장에서 30초마다 측정되었다.For the fluorogenic GQ-RCA (G-quadruplex-generating RCA) reaction, the linked dumbbell padlock DNA (50 nM) prepared in 1-3 above was added to the RCA mixture (total volume 25 μL). The RCA mixture is a partial hairpin primer 50nM, phi29 polymerase buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 and 4 mM DTT, pH 7.5), 15 μM ThT, 100 Μg/mL BSA, dNTP and 50 nM target (H3N2) DNA at a concentration of 0.6 mM, respectively. The mixture to which the linked dumbbell padlock DNA was added was heated at 90° C. for 3 minutes and cooled to room temperature for 7 minutes. The RCA reaction was stopped by adding phi29 polymerase (100 U) and incubating at 30° C. or room temperature for various times (range 0 to 20 minutes) and heating at 65° C. for 10 minutes. RCA was performed for 20 minutes without nucleic acid. DNA molecules amplified by RCA were analyzed using 1.5% agarose gel electrophoresis and visualized under UV irradiation according to the EtBr staining method. For visual detection of ThT fluorescence generated by G-quadruplex intercalation, photographs of the RCA mixture in PCR tubes maintained in an upright position in a 96-well plate cast were powered under UV illumination by a PowerShot A640 digital camera (Canon Inc., Tokyo, Japan). For fluorescence measurement of ThT complexed with G-quadron, 50 μL of RCA reaction mixture with or without target nucleic acid is quartz from a fluorescence spectrophotometer equipped with Model Cary (Model Cary Eclipse, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) Moved to cuvette. Eclipse software. The instrument settings for fluorescence intensity are as follows: λ ex = 425 nm; Excitation slit width: 20 nm; λ em =488 nm; Emission slit width: 10 nm; PMT voltage: 600 V. During incubation at 30° C. for 20 minutes in a Peltier pocket of a fluorescence spectrophotometer, fluorescence was measured every 30 seconds at an excitation wavelength of 425 nm and an emission wavelength of 488 nm.

1-5.　중합효소연쇄반응(PCR) 및 단일가닥의 표적 핵산 생성1-5. Polymerase chain reaction (PCR) and single-stranded target nucleic acid generation

제조사에서 제안한 프로토콜에 따라　TRIzol® 용액을　사용하여 인플루엔자 바이러스 샘플(H1N1, H3N2 및 Yamagata 균주)의 현탁액 200 μL에서 총 바이러스 RNA를 추출하고 최종 부피 50 μL의 증류수에 용해시켰다.　인플루엔자 바이러스 RNA의 헤마글루티닌 유전자의 원스텝 RT-PCR은 25 μL의 반응 혼합물에서 5 μL의 바이러스 RNA(50 ng, 450 pM에　해당)를 사용하여 SuperScriptTM Platinum® RT-PCR 키트로 수행하였다. 상기 25 μL의 반응 혼합물은 1Х버퍼(각각 0.2mM의 dNTP, 1.6mM MgSO4, pH 8.4); 200 nM 농도의 인플루엔자 A 바이러스 (H1N1 및 H3N2)에 대한 PCR 프라이머(표 1에 기재된 인산화 된 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머) 또는 400 nM의 농도에서 야마가타 균주에 대한 PCR 프라이머; 및 1 μL의 Platinum® Taq Mix를 포함한다. RT-PCR은 다음 조건 하에서 1 시간 이내에 수행되었다: 55℃에서 15분 동안 역전사; 94℃에서 2 분간 예비변성; [94℃에서 10초 인큐베이션, 59℃(H1N1 및 H3N2) 또는 53℃(야마가타 주)에서 10초 프라이머 어닐링 및 68℃에서 10초 인큐베이션]의 30 사이클; 68℃ 에서 5분간 최종 연장. PCR 산물을 아가로즈겔 전기영동으로 분석하고 EtBr로 염색 하였다. RT-PCR 후, RT-PCR 생성물의 10 μL 분취량 (25 μL 중)을 버퍼 용액 (67 mM 글리신 -KOH, 2.5 mM MgCl2, 5 mM MgCl2, 50 ㎍/mL BSA, pH 9.4) 중 5 U의 람다 핵산말단분해효소를 함유하는 혼합물 15 μL와 함께 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션 시킨 후 85 ℃에서 15 분간 열변성시켰다. 단일가닥의 PCR 산물을 1.5 % 아가로즈겔 전기영동으로 확인하고 EtBr로 염색한 후 UV를 조사하여 시각화하였다.Total viral RNA was extracted from 200 μL of a suspension of influenza virus samples (H1N1, H3N2 and Yamagata strains) using TRIzol ® solution according to the manufacturer's suggested protocol and dissolved in distilled water with a final volume of 50 μL. Influenza H. One-Step RT-PCR of mageul Ruti non-gene of the viral RNA was performed with SuperScript TM Platinum ® RT-PCR kit, in a reaction mixture of 25 μL using 5 μL of the viral RNA (corresponding to 50 ng, 450 pM). The reaction mixture of 25 μL was 1 Х buffer (0.2 mM dNTP, 1.6 mM MgSO 4, pH 8.4, respectively); PCR primers for 200 nM concentrations of influenza A virus (H1N1 and H3N2) (phosphorylated forward primers and reverse primers listed in Table 1) or PCR primers for Yamagata strains at a concentration of 400 nM; And 1 μL of Platinum ® Taq Mix. RT-PCR was performed within 1 hour under the following conditions: reverse transcription at 55° C. for 15 minutes; Preliminary denaturation at 94° C. for 2 minutes; 30 cycles of 10 second incubation at 94°C, 10 second primer annealing at 59°C (H1N1 and H3N2) or 53°C (Yamagata) and 10 second incubation at 68°C]; Final extension at 68°C for 5 minutes. PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis and stained with EtBr. After RT-PCR, an aliquot of 10 μL of RT-PCR product (in 25 μL) is 5 in buffer solution (67 mM glycine-KOH, 2.5 mM MgCl 2 , 5 mM MgCl 2, 50 μg/mL BSA, pH 9.4). The mixture was incubated at 37°C for 30 minutes with 15 μL of a mixture containing U lambda nucleic acid endonase, followed by heat denaturation at 85°C for 15 minutes. The single-stranded PCR product was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, stained with EtBr, and irradiated with UV to visualize it.

1-6.　표적 핵산 검출을 위한 GQ-RCA 분석1-6. GQ-RCA analysis for target nucleic acid detection

5' 말단이 인산화된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 각 인플루엔자 바이러스 RNA 샘플(50 ng)에서 합성된 혈구 응집소 DNA를 증폭하기 위해 총 25 μL의 RT-PCR을 수행했다.　상기 RT-PCR 산물의 인산염 프라이머 가닥을 상술한 바와 같이 5U의 람다 핵산말단분해효소로 분해시켰다.　RCA 혼합물은 단일가닥의 RT-PCR 산물의 7.5μL 분취량을 사용하여 상기 1-4에서 기술된 바와 같이 준비되었다.　30분 동안 30℃에서 RCA 혼합물을 인큐베이션 한 후 65℃에서 10분간 반응을 멈추게 한 후, ThT 형광 이미지를 자외선 조사 하에 촬영하고 형광 강도를 상기 형광분광 광도계로 측정 하였다.A total of 25 μL of RT-PCR was performed to amplify the hemagglutinin DNA synthesized from each influenza virus RNA sample (50 ng) using forward and reverse primers phosphorylated at the 5′ end. The phosphate primer strand of the RT-PCR product was digested with 5U of lambda nucleic acid terase as described above. The RCA mixture was prepared as described in 1-4 above using a 7.5 μL aliquot of single stranded RT-PCR product. After incubating the RCA mixture at 30°C for 30 minutes and stopping the reaction for 10 minutes at 65°C, a ThT fluorescence image was taken under ultraviolet irradiation and the fluorescence intensity was measured with the fluorescence spectrophotometer.

인플루엔자 바이러스 RNA 검출에 대한 PCR-GQ-RCA 시스템의 민감도를 평가하기 위해, H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA를 50 ng 부터 50 fg까지 감소시키면서 분석을 수행하였다(총 25 μL에서 각각 450 pM 및 450 aM 농도와 동등함).To assess the sensitivity of the PCR-GQ-RCA system to the detection of influenza virus RNA, analysis was performed with H3N2 influenza virus RNA reduction from 50 ng to 50 fg (equivalent to 450 pM and 450 aM concentrations, respectively, in 25 μL total). box).

검출 한계 (LOD)는 다음의 공식을 사용하여 계산 하였다: 블랭크 실험의 평균 신호 및 표준 편차의 평균 신호에 기초하여 LOD = 3.3Х(형광 강도의 표준 편차, SD/표준 곡선의 기울기, S) 3 회 측정. 데이터는 3 회 실험의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.The detection limit (LOD) was calculated using the following formula: LOD = 3.3Х (standard deviation of fluorescence intensity, slope of SD/standard curve, S) 3 based on the average signal of the blank experiment and the average signal of the standard deviation. Measure times. Data are presented as mean±standard deviation of 3 experiments.

1-7. 정량적 실시간 PCR (비교예)1-7. Quantitative real-time PCR (comparative example)

바이러스 RNA의 정량적 실시간 PCR을 위해 A형(H3N2) 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 유전자에 대한 DNA 프라이머는 PCR-GQ-RCA 분석 시스템에서 사용된 것과 동일한 것을 사용하였다. PrimerScriptTM 1st Strand cDNA 합성키트(Takara)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA 샘플의 10배 희석액 (50 ng ~ 50 fg)으로부터 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 Rotor Gene SYBR Green PCR Kit (Qiagen)을 사용하여 1Х Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix, 각각 400 nM 농도의 DNA 프라이머를 함유하는 총 부피 25 μL로 수행하고, 다음 조건 하에서 실시간 thermo cycler Rotor-gene Q 시스템 (Qiagen)에서 cDNA 5μL: 94 ℃에서 5분 동안 변성시킨 후, [94 ℃에서 10 초 인큐베이션, 59 ℃에서 10 배 인큐베이션, 68 ℃에서 10 배 인큐베이션]을 40 사이클 수행한 후 68℃에서 5 분간 최종 인큐베이션 하였다.For quantitative real-time PCR of viral RNA, DNA primers for the hemagglutinin gene of type A (H3N2) influenza virus were used as those used in the PCR-GQ-RCA analysis system. Complementary DNA (cDNA) was synthesized from a 10-fold dilution (50 ng to 50 fg) of H3N2 influenza virus RNA samples using PrimerScript ™ 1st Strand cDNA synthesis kit (Takara) according to the manufacturer's instructions. Quantitative real-time PCR was performed using a Rotor Gene SYBR Green PCR Kit (Qiagen) in a total volume of 25 μL containing 1 µK Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix, each 400 nM concentration DNA primer, and real-time thermo cycler under the following conditions: CDNA 5 μL in Rotor-gene Q system (Qiagen): denaturation at 94° C. for 5 minutes, followed by 40 cycles of [10 seconds incubation at 94° C., 10 times incubation at 59° C., 10 times incubation at 68° C.] The final incubation was performed at 68°C for 5 minutes.

1-8. 혈구응집분석 (비교예)1-8. Blood cell aggregation analysis (comparative example)

H3N2 바이러스 시료 현탁액은　50μL의 총 부피에서 인산염 완충 식염수 (PBS)로 2　배 연속 희석(2　1　~ 2　11)한 다음 50μL의 부피로 닭 적혈구(1 %, v/v)를 96-웰 마이크로 플레이트에 첨가하였다.　실온에서 30 분간 인큐베이션 한 후, 디지털 카메라(COOLPIX P9500, Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하여 마이크로 플레이트를 촬영 하였다.H3N2 virus sample suspension is diluted 2 fold serially (2 1 to 2 11 ) with phosphate buffered saline (PBS) in a total volume of 50 μL, followed by 96-well microplates of chicken red blood cells (1%, v/v) in a volume of 50 μL. Was added to. After incubation at room temperature for 30 minutes, microplates were taken using a digital camera (COOLPIX P9500, Nikon, Tokyo, Japan).

1-9. PCR-GQ-RCA에 의한 표적 핵산 검출1-9. Target nucleic acid detection by PCR-GQ-RCA

1-8의 혈구응집분석 시험과 동일한 방법을 사용하여 2 배 연속 희석(21 ~ 216)한 H3N2 바이러스 샘플 현탁액을 제조하였다. 총 바이러스 RNA를 TRIzol® 용액으로 연속 희석한 시료 200 μL에서 추출하고 최종 부피 20 μL에 용해시켰다. 추출 RNA (바이러스 샘플 현탁액 50 μL에 해당)의 5 μL 분량을 상술한 방법으로 PCR-GQ-RCA 시스템으로 분석했다. ThT 형광 강도는 방출 슬릿 폭 20 nm 및 여기 파장 20 nm의 여기 파장 425 nm에서 450-650 nm의 방출 파장 범위에서 분광 광도계로 측정되었다.Using the same method as the hemagglutination assay of 1-8, H3N2 virus sample suspensions were prepared by serial dilution (2 1 to 2 16 ) 2 fold. Total viral RNA was extracted from 200 μL of serially diluted samples with TRIzol ® solution and dissolved in a final volume of 20 μL. A 5 μL aliquot of extracted RNA (corresponding to 50 μL of virus sample suspension) was analyzed with the PCR-GQ-RCA system in the manner described above. The ThT fluorescence intensity was measured with a spectrophotometer in the emission wavelength range of 425 nm to 450-650 nm with an excitation wavelength of 20 nm and an excitation wavelength of 20 nm.

1-10. 표적 핵산의 농도 변화에 따른 형광 측정1-10. Fluorescence measurement according to concentration change of target nucleic acid

합성된 표적 핵산에 대한 GQ-RCA 분석의 민감도를 확인하기 위해, H3N2 DNA를 다양한 농도(0 ~ 75 nM)로 전술한 GQ-RCA 반응 혼합물 (25 ㎕)에서 인큐베이션 하였다. 30℃에서 30분간 인큐베이션 한 후, 증류수 25 ㎕를 첨가하고, 여기 파장 425 nm 및 방출 파장 450 nm 내지 650 nm에서 형광 분광기로 ThT 형광을 스캐닝 하였다.To confirm the sensitivity of the GQ-RCA assay to the synthesized target nucleic acid, H3N2 DNA was incubated in the above-described GQ-RCA reaction mixture (25 μl) at various concentrations (0-75 nM). After incubation at 30°C for 30 minutes, 25 µl of distilled water was added, and ThT fluorescence was scanned with a fluorescence spectrometer at excitation wavelength 425 nm and emission wavelength 450 nm to 650 nm.

GQ-RCA 분석의 표적 선택성을 확인하기 위해 각각의 합성된 DNA(H3N2, H1N1, 및 Yamagata DNA)를 사용하여 접합된 덤벨 패드락 DNA 및 부분적 헤어핀 프라이머의 존재 하에 동일한 GQ-RCA 반응(총 부피 25 μL에서)을 수행하였다. 음성 대조군으로서, 어떠한 표적 핵산도 갖지 않는 GQ-RCA도 수행 하였다. 30℃에서 30 분간 GQ-RCA 반응을 한 후, 96-웰 플레이트 주형의 직립 위치에 놓인 PCR 튜브에서의 ThT 형광이 UV 조사 하에서 검출되었다. 석영 큐벳(quartz cuvette)으로 옮겨진 동일한 GQ-RCA 반응 혼합물의 형광을 425 nm의 여기 파장 및 488 nm의 방출 파장에서 형광 분광 광도계 (Model Cary Eclipse)로 측정 하였다.Identical GQ-RCA reaction (total volume 25) in the presence of dumbbell padlock DNA and partial hairpin primers conjugated using respective synthesized DNA (H3N2, H1N1, and Yamagata DNA) to confirm target selectivity of GQ-RCA analysis (in μL). As a negative control, GQ-RCA without any target nucleic acid was also performed. After 30 minutes of GQ-RCA reaction at 30° C., ThT fluorescence in a PCR tube placed upright in a 96-well plate template was detected under UV irradiation. Fluorescence of the same GQ-RCA reaction mixture transferred to a quartz cuvette was measured with a fluorescence spectrophotometer (Model Cary Eclipse) at an excitation wavelength of 425 nm and an emission wavelength of 488 nm.

2. 실험결과2. Experimental results

2-1.　PCR-GQ-RCA 분석 시스템의 특성2-1. Characteristics of PCR-GQ-RCA analysis system

인플루엔자 바이러스 RNA를 민감도 높게 검출할 수 있는 PCR-GQ-RCA 시스템의 원리는 도 1에 나타낸 바와 같다. 이 시스템은 i) 바이러스 RNA를 RT-PCR로 역전사하는 단계, ii) 람다 핵산말단분해효소에 의한 단일가닥 DNA 생성 단계; 및 iii) 회전환 증폭(RCA)에 의한 G-DNA 사중나선구조(G-quadruplex) 생성 단계의 3 단계로 구성된다. RT-PCR에 사용된 DNA 프라이머 중 하나는 5'- 말단에서 인산화되어 인산기가 수식된 가닥이 람다 핵산말단분해효소에 의해 분해되어 단일가닥의 DNA를 형성할 수 있게 한다. 제 1 단계에서 바이러스 RNA을 RT-PCR로 증폭한 뒤, 증폭된 이중가닥 DNA는 람다 핵산말단분해효소로 분해시킨다.　람다 핵산말단분해효소는 5'에서 3'방향으로 5'-인산화 된 가닥을 선택적으로 분해시켜 헤어핀 프라이머 및 패드락 DNA에 의한 후속 어닐링에 적합한 단일가닥 DNA를 생성한다. 제 2 단계 동안 원하지 않는 가닥을 제거한 후, 생성된 단일가닥 DNA가 제 3단계인 G-사중나선 생성 RCA의 표적 핵산으로 사용된다. 덤벨 패드락 DNA는 C-리치서열(녹색선, 22개의 뉴클레오티드), 프라이머 부위(갈색선, 12개의 뉴클레오티드) 및 표적 유전자 접합 부위(주황색선, 20개의 뉴클레오티드)를 포함하며, 부목 DNA(splint DNA) 없이도 T4 DNA 리가아제에 의해 미리 접합된다(도 1).The principle of the PCR-GQ-RCA system capable of detecting influenza virus RNA with high sensitivity is shown in FIG. 1. The system comprises: i) reverse transcription of viral RNA into RT-PCR, ii) single-stranded DNA production by lambda nucleic acid endonase; And iii) G-DNA quadruplex structure generation by rotation ring amplification (RCA). One of the DNA primers used in RT-PCR is phosphorylated at the 5'-end, so that the phosphate-modified strand is degraded by lambda nucleic acid endonase to form single-stranded DNA. After the viral RNA is amplified by RT-PCR in the first step, the amplified double-stranded DNA is degraded by lambda nucleic acid protease. Lambda nucleic acid endases selectively degrade 5'-phosphorylated strands in the 5'to 3'direction to generate single-stranded DNA suitable for subsequent annealing with hairpin primers and padlock DNA. After removing the unwanted strands during the second step, the resulting single-stranded DNA is used as the target nucleic acid for the third step, the G-quadrine producing RCA. Dumbbell padlock DNA includes C-rich sequence (green line, 22 nucleotides), primer site (brown line, 12 nucleotides) and target gene junction site (orange line, 20 nucleotides), splint DNA (splint DNA) Pre-conjugation by T4 DNA ligase without () (Fig. 1).

스템-루프 구조를 형성하는 부분 헤어핀 프라이머는 앞서 생성된 단일가닥 DNA와 패드락 프로브에 상보적인 부분을 모두 가지고 있는데, 평소에는 헤어핀 모양으로 자가 구조를 이루고 있으며 패드락 프로브에 상보적인 부분이 노출되지 않아 결합할 수 없다. 표적 핵산이 존재하는 경우, 헤어핀 개시자가 단일가닥의 표적 핵산(옥색, 42개의 뉴클레오티드)과 5'-말단 혼성화에 의해 패드락 DNA 프로브에 상보적인 부분이 노출되고, 노출된 헤어핀 프라이머의 3'-말단(갈색, 12개 뉴클레오티드)은 패드락 DNA에 어닐링되어 표적 유전자, 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브의 삼 성분 복합체가 유도된다(도 1). RCA는 삼 성분 복합체에서 작동하는 phi29 중합효소에 의해 개시되며, 다수의 G-사중나선 복사본을 갖는 긴 스트레치의 단일가닥 DNA가 합성된다. DNA에서 G-사중나선 구조가 생성되면 형광체 ThT가 우선적으로 G-사중나선 구조로 삽입되어 강한 형광을 내게 된다. 그러나 표적 핵산이 없는 경우 덤벨 패드락 DNA에 결합할 수 있는 헤어핀 개시자의 3'- 말단은 스템-루프 구조에 고정되어 있게 되고, 헤어핀 프라이머, 덤벨 패드락 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 삼원 복합체가 형성되지 않으며, 그 결과 phi29 중합효소에 의한 회전환 증폭이 일어나지 않고 형광을 관찰할 수 없게 된다.The partial hairpin primer forming the stem-loop structure has both complementary parts to the previously generated single-stranded DNA and padlock probes. Usually, it forms a self-structure in the form of a hairpin, and complementary parts to the padlock probe are not exposed. Can not be combined. When the target nucleic acid is present, the complementary part of the padlock DNA probe is exposed by 5'-terminal hybridization with a single stranded target nucleic acid (orange, 42 nucleotides), and 3'- of the exposed hairpin primer. The terminal (brown, 12 nucleotides) is annealed to the padlock DNA to induce a three-component complex of the target gene, hairpin primer and padlock probe (FIG. 1). RCA is initiated by a phi29 polymerase operating in a three-component complex, and a long stretch of single stranded DNA with multiple G-quadrine copies is synthesized. When a G-quartet structure is generated from DNA, the phosphor ThT is preferentially inserted into the G-quartile structure to emit strong fluorescence. However, in the absence of the target nucleic acid, the 3'-end of the hairpin initiator capable of binding to the dumbbell padlock DNA is fixed to the stem-loop structure, and a ternary complex comprising a hairpin primer, a dumbbell padlock probe and a target nucleic acid is formed. As a result, the rotational ring amplification by phi29 polymerase does not occur and fluorescence cannot be observed.

2-2.　회전환 증폭 반응(GQ-RCA) 결과 분석2-2. Rotating amplification reaction (GQ-RCA) results analysis

올리고 DNA를 표적 핵산(즉, H3N2 DNA 합성)으로 사용하여 G-사중나선 생성 RCA 후 증폭된 DNA를 검사했다.　아가로즈겔 전기영동을 사용하여 RCA 반응 생성물을 분석하였다(도 2의 A, B).　30분간의 RCA 반응 후 합성된 표적 H3N2 DNA의 농도(0 ~ 75 nM)가 증가함에 따라 번짐 모양을 가진 고 분자량 DNA 밴드의 축적이 관찰되었다(도 2의 A).　이 결과는 표적 H3N2 DNA가 RCA 시스템을 개시할 수 있고, 증폭된 DNA의 양은 초기 H3N2 DNA 농도에 비례함을 나타낸다.　또한 DNA 밴드 강도는 표적 H3N2 DNA의 존재 하에서 RCA 반응 시간과 양의 상관관계가 있었으며, H3N2 DNA가 없는 경우 DNA 밴드는 관찰되지 않았다(도2의 B).The oligo DNA was used as a target nucleic acid (ie, H3N2 DNA synthesis) to examine the amplified DNA after G-quadron production RCA. RCA reaction products were analyzed using agarose gel electrophoresis (A and B in FIG. 2). After 30 minutes of RCA reaction, as the concentration of synthesized target H3N2 DNA (0 to 75 nM) increased, accumulation of a high molecular weight DNA band with a smear was observed (A in FIG. 2). These results indicate that the target H3N2 DNA can initiate the RCA system, and the amount of amplified DNA is proportional to the initial H3N2 DNA concentration. In addition, the DNA band intensity was positively correlated with the RCA reaction time in the presence of the target H3N2 DNA, and in the absence of H3N2 DNA, the DNA band was not observed (Fig. 2B).

RCA에 의해 증폭된 DNA의 G-사중나선 생성을 검증하기 위해 RCA 증폭 DNA의 ThT 형광 염색을 연구했다.　향상된 ThT 형광은 RCA 반응시간 의존적으로 자외선 하에서 나타났다(도 2의 C).　형광 강도는 RCA 반응 시간에 비례하고 10분 후에 포화에 이르렀으며 (도 2의 D, 빨간색 선) 형광 이미지와 일치한다.　이 결과는 긴 단일가닥 DNA인 RCA 생성물이 사중나선 구조를 형성하고 인터칼레이션(intercalation)에 의해 ThT 형광을 강화시키는 G-사중나선을 포함함을 시사한다.　그러나, 표적 핵산이 없는 경우에는 형광 신호는 증가되지 않았다(도 2의 D, 검은선).　이러한 결과는 G-사중나선 서열을 포함하는 GQ-RCA 생성물이 ThT 형광을 유의적으로 향상시킬 수 있음을 나타낸다.To verify G-quadron production of DNA amplified by RCA, ThT fluorescence staining of RCA amplified DNA was studied. The enhanced ThT fluorescence appeared under UV light depending on the RCA reaction time (FIG. 2C ). The fluorescence intensity is proportional to the RCA reaction time and reaches saturation after 10 minutes (D in FIG. 2, red line) and is consistent with the fluorescence image. These results suggest that the RCA product, which is a long single-stranded DNA, contains a G-quartet that forms a quadruplex structure and enhances ThT fluorescence by intercalation. However, in the absence of the target nucleic acid, the fluorescence signal was not increased (D in FIG. 2, black line). These results indicate that the GQ-RCA product comprising the G-quadrine sequence can significantly improve ThT fluorescence.

GQ-RCA 분석 시스템의 정량적인 민감도를 평가하기 위해 표적 핵산(H3N2 DNA)의 농도가 감소하는 조건에서 염색된 GQ-RCA 생성물의 ThT 형광 변화를 모니터링했다(도 3의 A,B).　형광 강도는 1.2nM의 검출 한계 (LOD) 값으로 표적 핵산(H3N2 DNA)의 농도와 선형 상관관계를 보인다. 또한, 각각의 표적 핵산은 증가된 형광 신호에 의해 검출되었으며, 이는 덤벨 패드락 프로브 및 헤어핀 프라이머의 상응하는 세트로 GQ-RCA에 의해 달성되었다(도 3의 C).　강하게 밝은 청색 형광 신호는 표적 특이적 RCA 반응 후에 선택적으로 관찰되었다.　그러나, 표적 핵산을 함유하지 않는 GQ-RCA 반응 혼합물에서는 형광이 관찰되지 않았다.　따라서, 합성된 표적 핵산을 검출하기 위한 GQ-RCA 시스템은 ~ 25의 S/B 비를 갖는 비표적 핵산으로부터 각각의 표적 핵산을 구별할 수 있었다(도 3의 D).In order to evaluate the quantitative sensitivity of the GQ-RCA analysis system, ThT fluorescence change of the stained GQ-RCA product was monitored under the condition that the concentration of the target nucleic acid (H3N2 DNA) was decreased (A, B in Fig. 3). The fluorescence intensity is linearly correlated with the concentration of the target nucleic acid (H3N2 DNA) with a detection limit (LOD) value of 1.2 nM. In addition, each target nucleic acid was detected by an increased fluorescence signal, which was achieved by GQ-RCA with a corresponding set of dumbbell padlock probes and hairpin primers (FIG. 3C ). A strongly bright blue fluorescence signal was selectively observed after the target specific RCA reaction. However, no fluorescence was observed in the GQ-RCA reaction mixture containing no target nucleic acid. Therefore, the GQ-RCA system for detecting the synthesized target nucleic acid was able to distinguish each target nucleic acid from the non-target nucleic acid having an S/B ratio of ˜25 (FIG. 3D ).

2-3.　PCR-GQ-RCA 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 RNA 결과 확인2-3. Confirmation of influenza virus RNA results using PCR-GQ-RCA system

PCR 앰플리콘 및 ssDNA 생성 확인Confirmation of PCR amplicon and ssDNA generation

표적 핵산-프라이밍 된 GQ-RCA 기반 형광 염색의 선택성 및 민감성을 입증한 후, RT-PCR을 후속 단일가닥 DNA 생성 프로세스와 접합시킴으로써 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출하기 위해 상기 시스템을 적용하였다.　먼저, 10 배 희석 H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA 샘플을 RT-PCR에 적용 하였다.　RT-PCR 앰플리콘 DNA의 인산염 프라이머 가닥은 람다 핵산말단분해효소에 의해 30분 동안 분해되었으며, 그 결과 얻어지는 ssDNA는 후속 GQ-RCA 분석에 사용되었다.　RT-PCR 앰플리콘 DNA 분자와 그 ssDNA 생성물을 아가로즈겔 전기영동을 사용하여 분석하였다(도 4).　RT-PCR DNA amplicon 밴드는 저농도(<4.5 fM)의 H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA 샘플에서 희미하게 보였다. 단일가닥 RT-PCR 생성물은 그 DNA 밴드가 RT-PCR amplicon DNA 분자보다 높게 나타났으므로 서로 다른 겔 이동도를 나타내어 단일가닥 생성물이 인산염 표지된 DNA 가닥의 람다 핵산말단분해효소의 분해에 의해 달성되었음을 나타냈다.　After demonstrating the selectivity and sensitivity of target nucleic acid-primed GQ-RCA based fluorescence staining, the system was applied to detect influenza virus RNA by conjugating RT-PCR with a subsequent single-stranded DNA production process. First, a 10-fold diluted H3N2 influenza virus RNA sample was applied to RT-PCR. The phosphate primer strand of RT-PCR amplicon DNA was digested for 30 minutes by lambda nuclease, and the resulting ssDNA was used for subsequent GQ-RCA analysis. The RT-PCR amplicon DNA molecule and its ssDNA product were analyzed using agarose gel electrophoresis (FIG. 4). The RT-PCR DNA amplicon band was faint in low concentration (<4.5 fM) H3N2 influenza virus RNA samples. The single-stranded RT-PCR product showed a different gel mobility because its DNA band was higher than that of the RT-PCR amplicon DNA molecule, so that the single-stranded product was achieved by the decomposition of the lambda nucleic acid protease of the phosphate-labeled DNA strand. Showed.

민감도 확인Sensitivity check

다음으로 ThT가 있는 상태에서 GQ-RCA를 수행하고 GQ-RCA 생성물의 형광 방출을 검사했다.　형광 강도는 H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA의 농도가 450　aM　에서 450　pM　으로 증가함에 따라 점진적으로 증가했다(도 5).　스펙트럼으로부터 얻어진 488 nm에서의 형광 강도의 적정 곡선은 450 aM 내지 450 fM 범위의 H3N2 인플루엔자 바이러스 RNA 농도와 형광 강도 사이의 선형 관계를 보여주었으며 계산된 LOD 값은 4.9 aM이었다(도 5의 B).Next, GQ-RCA was performed in the presence of ThT and fluorescence emission of the GQ-RCA product was examined. The fluorescence intensity gradually increased as the concentration of H3N2 influenza virus RNA increased from 450 mAm to 450 mPm (Fig. 5). The titration curve of fluorescence intensity at 488 nm obtained from the spectrum showed a linear relationship between H3N2 influenza virus RNA concentration and fluorescence intensity ranging from 450 aM to 450 fM and the calculated LOD value was 4.9 aM (Fig. 5B).

검출 특이도 확인Detection specificity check

PCR-GQ-RCA 분석 시스템의 특이성을 평가하기 위해 여러 바이러스 (H3N2, H1N1 및 Yamagata)의 RNA를 표적 핵산으로 사용하여 실험하였다. 상기 바이러스로부터의 RNA의 증폭 및 검출을 위해 덤벨 패드락 프로브 및 이에 상보적인 부분적 헤어핀 프라이머 세트를 제조하였다.　각각의 패드락 프로브 및 상응하는 프라이머 세트를 각 바이러스 RNA의 RT-PCR로부터 유도된 상응하는 표적 ssDNA와 함께 인큐베이션 할 때, 96 웰 플레이트 주조에서 UV 조사 하에서 강한 밝은 청색 형광이 관찰되었고, 이로부터 인플루엔자 바이러스 RNA의 각 아형을 동정할 수 있었다(도 5의 C).　그러나, 표적 핵산이 없으면 형광은 관찰되지 않았다.　96- 웰 플레이트 캐스트에서 관찰된 각각의 GQ-RCA 혼합물의 형광을 정량 할 때, "RNA 없음"에 대한 S/B 비는 12.1 내지 28.7 범위였고,　각각의 바이러스 RNA 샘플에 대한 표적 특이 S/B 비는 6.4에서 15.6 사이였다(도 5의 D).　따라서, PCR-GQ-RCA 분석 시스템은 단일 형광 측정으로부터 다른 인플루엔자 바이러스의 다중 RNA 검출에 적용될 수 있다. 다음으로, H3N2 특이적으로 설계된 패드락 프로브 및 헤어핀 프라이머를 함유하는 키트에 각각의 바이러스 RNA 샘플을 혼합한 후 형광 증강을 GQ-RCA 반응에서 모니터링 하였다(도 6). 밝은 파란색 형광 신호는 표적 H3N2 유전자를 포함하는 반응에서만 독점적으로 관찰되었으며 형광은 GQ-RCA 반응 지속 시간에 비례한다.To evaluate the specificity of the PCR-GQ-RCA assay system, RNAs from several viruses (H3N2, H1N1 and Yamagata) were used as target nucleic acids. For the amplification and detection of RNA from the virus, a dumbbell padlock probe and a partial hairpin primer set complementary thereto were prepared. When incubating each padlock probe and corresponding primer set with the corresponding target ssDNA derived from RT-PCR of each viral RNA, strong bright blue fluorescence was observed under UV irradiation in a 96 well plate casting from which influenza Each subtype of viral RNA could be identified (FIG. 5C ). However, no fluorescence was observed without the target nucleic acid. When quantifying the fluorescence of each GQ-RCA mixture observed in the 96-well plate cast, the S/B ratio for "no RNA" ranged from 12.1 to 28.7, and target specific S/B for each viral RNA sample. The ratio was between 6.4 and 15.6 (D in FIG. 5). Thus, the PCR-GQ-RCA analysis system can be applied to multiple RNA detection of different influenza viruses from a single fluorescence measurement. Next, fluorescence enhancement was monitored in the GQ-RCA reaction after mixing each viral RNA sample in a kit containing H3N2 specifically designed padlock probe and hairpin primer (FIG. 6). The bright blue fluorescence signal was observed exclusively in reactions involving the target H3N2 gene, and fluorescence was proportional to the duration of the GQ-RCA response.

　

2-4.　검출 민감도의 비교2-4. Comparison of detection sensitivity

정량적 실시간 PCR과의 비교Comparison with quantitative real-time PCR

검출 시스템의 민감도를 평가하기 위해 PCR-GQ-RCA 시스템과 정량적 실시간 PCR 및 혈구응집분석과 같은 기존의 인플루엔자 바이러스 검출 방법을　비교했다.　도 7A에 도시된 바와 같이, 10 배 희석된 바이러스 RNA 샘플을 이용한 실험에서,　RT-PCR과 연계된 GQ-RCA　로부터의 형광 신호는　인플루엔자 바이러스 표적 RNA의　농도가　450　aM　정도로　명확하게 구별할 수 있었다.　연속적으로 희석된 H3N2 바이러스 RNA 샘플을 정량적 실시간 PCR에 적용하였다.　도 7B에 도시된 바와 같이, 3회의 측정(도 8, 형광 곡선) 및 사이클 임계치 (Ct) 값의 분석은 450　fM　만큼 낮은 검출 한계를 제공하였다.　이러한 결과는 본 발명의 시스템이 바이러스 샘플에서 RNA를 검출하기 위해 기존의 정량적 실시간 PCR보다 1,000 배 더 높은 감도를 가지고 있음을 보여준다.In order to evaluate the sensitivity of the detection system, we compared the existing influenza virus detection methods such as PCR-GQ-RCA system with quantitative real-time PCR and hemagglutination analysis. As shown in FIG. 7A, in an experiment using a 10-fold diluted viral RNA sample, the fluorescence signal from GQ-RCA　 linked to RT-PCR was able to clearly distinguish the concentration of “influenza virus target RNA” to about 450　aM　. . Serially diluted H3N2 viral RNA samples were subjected to quantitative real-time PCR. As shown in FIG. 7B, three measurements (FIG. 8, fluorescence curve) and analysis of cycle threshold (Ct) values provided detection limits as low as 450 mFmM. These results show that the system of the present invention has 1,000 times higher sensitivity than conventional quantitative real-time PCR to detect RNA in virus samples.

혈구응집분석법과의 비교Comparison with hemagglutination assay

다음으로 기존의 인플루엔자 바이러스 혈구응집분석법과 비교했다.　PBS　에서 2배 연속 희석된 인플루엔자 바이러스 샘플 (2　1 ~ 2　11)의　현탁액을 이중에서 응집 적 응집분석에 적용하고, 검정의 값은 128 개의 응집체 단위 (HAU) (2　7　배의 희석 (도 7C)와 비교하여, 응집된 웰 (well)의 관측에 의해 관찰되었다.　2 배 연속 희석 바이러스 샘플 (2 1　~ 2　16)의 동일한 현탁액에서 추출한 인플루엔자 RNA를　본 발명의 시스템으로 분석하였다(도 7D).　통계적으로 유의한(P<0.05) 형광 신호가 215　배 희석된 샘플에서 관찰되었는데,　이는 본 발명의 시스템이　인플루엔자 바이러스 검출에 대한 적혈구응집분석방법 보다　약 256 (2 8) 배 더 민감함을 나타낸다.Next, it was compared with the existing influenza virus hemagglutination assay. Suspensions of influenza virus samples (2 1 to 2 11 ) serially diluted 2-fold in PBS were subjected to agglutinative aggregation assay in duplicate, and the value of the assay was 128 aggregate units (HAU) (2 7- fold dilution (Fig. 7C) ), observed by observation of aggregated wells Influenza RNA extracted from the same suspension of 2-fold serially diluted virus samples (2 1 to 2 16 ) was analyzed with the system of the present invention (FIG. 7D ). A statistically significant (P<0.05) fluorescence signal was observed in samples diluted 2 to 15 times, indicating that the system of the present invention is about 256 (2 8 ) times more sensitive than the erythrocyte aggregation assay method for influenza virus detection. Shows.

하기 표 2에 요약된 바와 같이, 표적 핵산으로서 바이러스 ssRNA의 검출과 관련하여, 본 발명의 분석 방법은 바이러스 유전자를 검출하는 다른 방법보다 우수하다. 본 발명의 PCR-GQ-RCA 분석 시스템은　다른 방법과 비교하여 몇 가지 장점 가진다:　 i) 2 가지 증폭 방법의 적절한 조합에 의해, 긴 길이의 바이러스 RNA는 4.9 aM의 낮은 농도에서 직접 검출될 수 있다; ii) 인플루엔자 바이러스의 3 가지 아형의 RNA는 다중 형광 분석에 의해 동시에 분석 될 수 있다;　iii) 부분적 헤어핀 프라이머의 사용은 표적 핵산의 존재 또는 부존재에 따라 그 구조가 개폐되도록 하는 우수한 S/B 비를 갖는 검출에서의 엄격성을 제공한다;　iv) 판독 결과는 UV 광 하에서 시각화 될 수 있고 다른 비색 분석법의 산출물보다 더 명암이 있다.As summarized in Table 2 below, with regard to detection of viral ssRNA as a target nucleic acid, the analytical method of the invention is superior to other methods of detecting viral genes. The PCR-GQ-RCA analysis system of the present invention has several advantages over other methods: i) By appropriate combination of two amplification methods, long length viral RNA can be detected directly at a low concentration of 4.9 aM. ; ii) RNA of the three subtypes of influenza virus can be analyzed simultaneously by multiple fluorescence analysis; iii) the use of a partial hairpin primer provides stringency in detection with a good S/B ratio that allows its structure to open and close depending on the presence or absence of a target nucleic acid; iv) The readings can be visualized under UV light and more bright than the output of other colorimetric assays.

Figure 112018038036104-pat00002
Figure 112018038036104-pat00002

2-5. 형광검출 효과의 비교2-5. Comparison of fluorescence detection effects

"헤어핀을 형성하지 않는 프라이머 및 선형 패드락 프로브 세트"와 본 발명의"헤어핀 형성 프라이머 및 덤벨 패드락 프로브 세트" 사용에 따른 표적 H3N2 형광 검출 효과의 차이를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.The following experiment was conducted to confirm the difference between the target H3N2 fluorescence detection effect according to the use of the "hairpin-free primer and linear padlock probe set" and the present invention "hairpin-forming primer and dumbbell padlock probe set". .

본 발명의 "헤어핀 형성 프라이머 및 덤벨 패드락 프로브 세트"의 경우 1-3, 1-4에서 기술한 방법대로 덤벨 패드락 프로브를 제작하고 표적 H3N2를 형광 검출하였다. 선형 패드락 프로브 DNA의 두 말단을 연결하여 원형 패드락을 만들기 위해, 500 nM 5'-인산화 선형 패드락 DNA, 500 nM 스플린트 DNA, 175 U의 T4 DNA 리가아제 및 1μL의 10ХT4 리가아제 반응 완충액(660 mM Tris-HCl, 66 mM의 MgCl2, 100 mM의 DTT, 1 mM의 ATP, pH 7.6)을 제조하였다. 혼합물을 95℃에서 3분 동안 열 변경시키고, T4 DNA 리가아제 및 라이게이션 완충액을 첨가하기 전에 10분 동안 실온으로 냉각시켰다. 그런 다음 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 5U의 말단분해효소 I, III을 1.5 μL의 10Х말단분해효소 I 반응 완충액 (670 mM Glycine-KOH, 67 mM MgCl2, 100 mM beta-mercapto ethanol, pH 9.5)을 첨가한 15 μL의 반응 용액을 제조하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하고 85℃에서 20분 동안 열 변형시켜 반응을 종료하였다.In the case of the "hairpin forming primer and dumbbell padlock probe set" of the present invention, dumbbell padlock probes were prepared according to the methods described in 1-3 and 1-4, and the target H3N2 was fluorescently detected. 500 nM 5'-phosphorylated linear padlock DNA, 500 nM splint DNA, 175 U T4 DNA ligase and 1 μL of 10 ХT4 ligase reaction buffer to link the two ends of the linear padlock probe DNA to form a circular padlock ( 660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 1 mM ATP, pH 7.6) was prepared. The mixture was heat-changed at 95°C for 3 minutes, and cooled to room temperature for 10 minutes before adding T4 DNA ligase and ligation buffer. Then the mixture was incubated at 25° C. for 1 hour. Subsequently, 5 U of terminal degrading enzymes I and III were added with 1.5 μL of 10Х terminal enzyme I reaction buffer (670 mM Glycine-KOH, 67 mM MgCl 2 , 100 mM beta-mercapto ethanol, pH 9.5) and 15 μL of reaction solution Was prepared. The mixture was incubated at 37°C for 1 hour and the reaction was terminated by thermal deformation at 85°C for 20 minutes.

H3N2 DNA를 검출하기 위해, 50 nM의 연결된 원형 패드락, 50 nM의 ternary 프라이머 (TP)가 포함된 25 μL의 반응액을 제조하였다. TP의 3'말단 부분은 원형 패드락에 결합할 수 있으며 결합하는 길이에 따라 TP5 (원형 패드락과 5 mer 결합), TP10, TP15을 각각 사용하였다. 연결된 원형 패드락과 TP를 제외한 나머지 반응액 조성과 반응 조건은 1-4에서 기술한 것과 동일하다.To detect H3N2 DNA, a reaction solution of 25 μL containing 50 nM linked circular padlock and 50 nM ternary primer (TP) was prepared. The 3'end portion of TP can be bound to a circular padlock, and TP5 (5 mer bond with a circular padlock), TP10, and TP15 were used depending on the length of bonding. The composition and reaction conditions of the reaction solution except for the connected circular padlock and TP are the same as described in 1-4.

표적 핵산(H3N2 DNA)의 존재 하에서 회전환 증폭의 주형과의 어닐링을 위한 다양한 길이(5-15 뉴클레오티드)의 DNA 프라이머에 의해 형성된 삼성분-개시복합체로 G-사중나선 생성 RCA를 수행하였을 때, G-사중나선 형성 및 후속 ThT 형광 염색이 관찰되었다(도 9).　그러나, ThT 형광 증대는 표적 핵산이 없는 경우에도 나타났으므로 배경 신호가 높다.　비교해 보면,　"덤벨 패드락 프로브 및 부분 헤어핀 프라이머"를 포함하는 삼성분-개시복합체의 형성에 의해 표적 핵산이 있거나 없는 실험 사이의 ThT 형광 레벨의 명확한 차이를 검출할 수 있으므로 덤벨 패드락 프로브 및 헤어핀 프라이머가 사용되었을 때, S/B 비는　"회전환 증폭 주형과 삼성분-DNA 프라이머"를 사용하는　실험에서보다 높았다(도 9). When G-quadron production RCA was performed with a sambun-initiation complex formed by DNA primers of various lengths (5-15 nucleotides) for annealing with a template of a rotating ring amplification in the presence of a target nucleic acid (H3N2 DNA), G-quadrant formation and subsequent ThT fluorescence staining were observed (Figure 9). However, the increase in ThT fluorescence appeared even in the absence of the target nucleic acid, so the background signal is high. By comparison, the formation of the samsung-initiation complex containing "dumbbell padlock probe and partial hairpin primer" can detect a clear difference in ThT fluorescence levels between experiments with or without target nucleic acids, so the dumbbell padlock probe and hairpin When the primers were used, the S/B ratio was higher than in the experiment using the "reversion amplification template and Samsung-DNA primer" (Fig. 9).

결론적으로, 본 발명에서는　표적 핵산의　민감한　검출을　위해 최초로 PCR을 회전환 등온 증폭과 결합하여 이중증폭 표적 핵산의 생산에 기반한 라벨 없는 형광측정 시스템을 개발했다.　증폭된 표적 핵산은　ThT　와 RCA 반응성 G-　quadruplex　사이의　형광 생성　상호작용에　의해 검출된다. 민감도와 표적 핵산 검출 특이성을 얻기 위해 PCR을 RCA와 결합하여 이중증폭 시스템을 사용했다.　이 시스템은 PCR에 의해 생성되고 인산염 프라이머 DNA 가닥의 후속 분해를 수반하는 단일가닥의 amplicon DNA에 의해 시작된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 인플루엔자 바이러스 RNA의 존재 하에서, 단일가닥 증폭된 표적 핵산은 부분적 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브 모두에 어닐링함으로써 삼원 RCA 개시 복합체를 형성한다.　그런 다음 G-사중나선 생성 RCA는 Th-3 염료가 인터칼레이션되고 강화된 형광을 방출 할 수 있는 G-사중나선 서열의 반복된 복사본을 포함하는 긴 ssDNA를 증폭하는 삼원 복합체 및 phi29 중합 효소에 의해 개시된다.　표적 핵산과 비 표적 핵산 사이의 형광 강도 차이는 ~ 15.7의 표적 특이 S/B 비율에서 분명했다. RT-PCR(1 시간)과 RCA(40 분)를 조합에 의한 표적 핵산의 이중 증폭 및 RCA 반응성 G-사중나선(10 분)의 선택적 형광 염색에 의해 2.5 시간 동안 4.9 aM (450 aM에서 450 fM 사이의 선형 범위)의 인플루엔자 바이러스 RNA를 직접 검출할 수 있었다. 표적 핵산의 검출을 위한 PCR-GQ-RCA 시스템은 여러 바이러스 샘플의 시각적 플레이트 기반의 편리한 검출을 통해 실시간 형광 분석을 특징으로 한다.　ThT 염색과 병용된 PCR-GQ-RCA 시스템은 인플루엔자 바이러스 아형뿐만 아니라 다른 바이러스의 핵산을 검출하는 민감하고 정확한 방법임을 확인할 수 있었다.In conclusion, the present invention developed a label-free fluorescence measurement system based on the production of a double-amplified target nucleic acid by combining PCR with rotating ring isothermal amplification for the first time to detect “sensitive” of the target nucleic acid. The amplified target nucleic acid is detected by “fluorescence generation” interaction between “ThT” and RCA-reactive G-“quadruplex”. To obtain sensitivity and specificity for target nucleic acid detection, a double amplification system was used by combining PCR with RCA. The system is generated by PCR and is initiated by a single strand of amplicon DNA that involves subsequent digestion of the phosphate primer DNA strand. In the specific embodiment of the present invention, in the presence of influenza virus RNA, the single-stranded amplified target nucleic acid anneals to both the partial hairpin primer and the padlock probe to form a ternary RCA initiation complex. The G-quadrine producing RCA is then linked to a ternary complex and phi29 polymerase that amplifies long ssDNA containing repeated copies of the G-quadrine sequence where the Th-3 dye is intercalated and can emit enhanced fluorescence. It is initiated by. The difference in fluorescence intensity between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid was evident at a target specific S/B ratio of ~15.7. 4.9 aM (450 aM to 450 fM) for 2.5 hours by double amplification of the target nucleic acid by combination of RT-PCR (1 hour) and RCA (40 minutes) and selective fluorescence staining of RCA-reactive G-quadron (10 minutes) Between linear ranges of influenza virus RNA. The PCR-GQ-RCA system for detection of target nucleic acids is characterized by real-time fluorescence analysis through convenient detection based on visual plates of several viral samples. The PCR-GQ-RCA system in combination with ThT staining was confirmed to be a sensitive and accurate method for detecting nucleic acids of influenza virus subtypes as well as other viruses.

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[3] J.J. Petrozzino, C. Smith, M.J. Atkinson, Rapid Diagnostic Testing for Seasonal Influenza: An Evidence-Based Review and Comparison with Unaided Clinical Diagnosis, J. Emerg. Med. 39 (2010) 476-490[3] J.J. Petrozzino, C. Smith, M.J. Atkinson, Rapid Diagnostic Testing for Seasonal Influenza: An Evidence-Based Review and Comparison with Unaided Clinical Diagnosis, J. Emerg. Med. 39 (2010) 476-490

[4] World Health Organization, WHO information for molecular diagnosis of influenza virus

Figure 112018038036104-pat00003
update. [4] World Health Organization, WHO information for molecular diagnosis of influenza virus
Figure 112018038036104-pat00003
update.

http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/molecular_diagnosis_influenza_virus_humans_update_201403rev201505.pdf?ua=1 (assessed Mar 2014).http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/molecular_diagnosis_influenza_virus_humans_update_201403rev201505.pdf?ua=1 (assessed Mar 2014).

[5] R.S. Lanciotti, A.J. Kerst, R.S. Nasci, M.S. Godsey, C.J. Mitchell, H.M. Savage, et al., Rapid detection of West Nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay, J. Clin. Microbiol. 38 (2000) 4066-4071.[5] R.S. Lanciotti, A.J. Kerst, R.S. Nasci, M.S. Godsey, C.J. Mitchell, H.M. Savage, et al., Rapid detection of West Nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay, J. Clin. Microbiol. 38 (2000) 4066-4071.

[6] J. Kuypers, N. Wright, J. Ferrenberg, M.L. Huang, A. Cent, L. Corey, et al., Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children, J. Clin. Microbiol. 44 (2006) 2382-2388.[6] J. Kuypers, N. Wright, J. Ferrenberg, M.L. Huang, A. Cent, L. Corey, et al., Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children, J. Clin. Microbiol. 44 (2006) 2382-2388.

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[8] Y.K. Choi, S.M. Goyal, S.W. Kang, M.W. Farnham, H.S. Joo, Detection and subtyping of swine influenza H1N1, H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays, J. Virol. Methods. 102 (2002) 53-59.[8] Y.K. Choi, S.M. Goyal, S.W. Kang, M.W. Farnham, H.S. Joo, Detection and subtyping of swine influenza H1N1, H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays, J. Virol. Methods. 102 (2002) 53-59.

[9] L. Blanco, A. Bernad, J.M. Lazaro, G. Martin, C. Garmendia, M. Salas, Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol. Chem. 264 (1989) 8935-8940.[9] L. Blanco, A. Bernad, J.M. Lazaro, G. Martin, C. Garmendia, M. Salas, Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol. Chem. 264 (1989) 8935-8940.

[10] A. Fire, S.Q. Xu, Rolling replication of short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995) 4641-4645.[10] A. Fire, S.Q. Xu, Rolling replication of short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995) 4641-4645.

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[21] C. Hong, A. Baek, S.S. Hah, W. Jung, D.E. Kim, Fluorometric Detection of MicroRNA Using Isothermal Gene Amplification and Graphene Oxide, Anal. Chem. 88 (2016) 2999-3003.[21] C. Hong, A. Baek, S.S. Hah, W. Jung, D.E. Kim, Fluorometric Detection of MicroRNA Using Isothermal Gene Amplification and Graphene Oxide, Anal. Chem. 88 (2016) 2999-3003.

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[23] J. Huang, X.Y. Li, Y.C. Du, L.N. Zhang, K.K. Liu, L.N. Zhu, et al., Sensitive fluorescent detection of DNA methyltransferase using nicking endonuclease-mediated multiple primers-like rolling circle amplification, Biosens. Bioelectron. 91 (2017) 417-423.[23] J. Huang, X.Y. Li, Y.C. Du, L.N. Zhang, K.K. Liu, L.N. Zhu, et al., Sensitive fluorescent detection of DNA methyltransferase using nicking endonuclease-mediated multiple primers-like rolling circle amplification, Biosens. Bioelectron. 91 (2017) 417-423.

[24] J. Mohanty, N. Barooah, V. Dhamodharan, S. Harikrishna, P.I. Pradeepkumar, A.C. Bhasikuttan, Thioflavin T as an Efficient Inducer and Selective Fluorescent Sensor for the Human Telomeric G-사중나선 DNA, J. Am. Chem. Soc. 135 (2013) 367-376.[24] J. Mohanty, N. Barooah, V. Dhamodharan, S. Harikrishna, P.I. Pradeepkumar, A.C. Bhasikuttan, Thioflavin T as an Efficient Inducer and Selective Fluorescent Sensor for the Human Telomeric G-quartet DNA, J. Am. Chem. Soc. 135 (2013) 367-376.

[25] T. Murakami, J. Sumaoka, M. Komiyama, Sensitive RNA detection by combining three-way junction formation and primer generation-rolling circle amplification, Nucleic Acids Res. 40 (2012) e22.[25] T. Murakami, J. Sumaoka, M. Komiyama, Sensitive RNA detection by combining three-way junction formation and primer generation-rolling circle amplification, Nucleic Acids Res. 40 (2012) e22.

[26] Z. Cheglakov, Y. Weizmann, B. Basnar, I. Willner, Diagnosing viruses by the rolling circle amplified synthesis of DNAzymes, Org. Biomol. Chem. 5 (2007) 223-225.[26] Z. Cheglakov, Y. Weizmann, B. Basnar, I. Willner, Diagnosing viruses by the rolling circle amplified synthesis of DNAzymes, Org. Biomol. Chem. 5 (2007) 223-225.

[27] Y. Li, L. Liang, C.Y. Zhang, Isothermally Sensitive Detection of Serum Circulating miRNAs for Lung Cancer Diagnosis, Anal. Chem. 85 (2013) 11174-11179.[27] Y. Li, L. Liang, C.Y. Zhang, Isothermally Sensitive Detection of Serum Circulating miRNAs for Lung Cancer Diagnosis, Anal. Chem. 85 (2013) 11174-11179.

[28] H. Fujita, Y. Kataoka, S. Tobita, M. Kuwahara, N. Sugimoto, Novel One-Tube-One-Step Real-Time Methodology for Rapid Transcriptomic Biomarker Detection: Signal Amplification by Ternary Initiation Complexes, Anal. Chem. 88 (2016) 7137-7144.[28] H. Fujita, Y. Kataoka, S. Tobita, M. Kuwahara, N. Sugimoto, Novel One-Tube-One-Step Real-Time Methodology for Rapid Transcriptomic Biomarker Detection: Signal Amplification by Ternary Initiation Complexes, Anal. Chem. 88 (2016) 7137-7144.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Since the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear that for those skilled in the art, this specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PCR-coupled Rolling Circle Amplification <130> 1063726 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 forward primer <400> 1 ttcagacaat ggaacgtgtt accc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 reverse primer <400> 2 ttcagacaat ggaacgtgtt accc 24 <210> 3 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 DNA <400> 3 gaatgatgat tgggccatga acttgttttg ggaatatctc aaacctttca aatgatgaca 60 ctgagctcaa t 71 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 Dumbbell padlock <400> 4 gcccaatcat ccctaaccct aaccctaacc ctttgggcca tgaatgaaag gtccgacaag 60 ttcatg 66 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 hairpin primer <400> 5 attgagctca gtgtcatcat ttgaaaggtt tgagatattc cctcggacct ttca 54 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 forward primer <400> 6 gcacagggaa tctaattgct ccta 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 reverse primer <400> 7 gcacagggaa tctaattgct ccta 24 <210> 8 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 DNA <400> 8 gaatgcttcc atttggagtg atgcatttta cttgcatttg ccaatgggtg catctgatct 60 cattattgag c 71 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 Dumbbell padlock <400> 9 caaatggaag ccctaaccct aaccctaacc ctcatttgga gtgagcaccc aatccttgca 60 tcactc 66 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 hairpin primer <400> 10 gctcaataat gagatcagat gcacccattg gcaaatgcaa gtaggattgg gtgc 54 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata forward primer <400> 11 gaagtaccat acatttgtgc ag 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata reverse primer <400> 12 acttttgagg atttgagtct cca 23 <210> 13 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata DNA <400> 13 gaatggaggt tcttcatttg ggtttttttc atctgaatgg aacccccaaa cagtaatttg 60 gtcttcccct t 71 <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata Dumbbell padlock <400> 14 gaagaacctc ccctaaccct aaccctaacc ctttcttcat ttggattact gtttgaaaac 60 ccaaat 66 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata hairpin primer <400> 15 aaggggaaga ccaaattact gtttgggggt tccattcaga tgcccccaaa cagtaat 57 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 circle padlock <400> 16 caaatggaag aaaccctaac cctaacccta accctaaaaa gggctgccag atactcttcg 60 caatttttgc atcactc 77 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (15) <400> 17 gatcagatgc acccattggc aaatgcaagt ttttttgcga agagtatctg 50 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (10) <400> 18 gatcagatgc acccattggc aaatgcaagt ttttttgcga agagt 45 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (5) <400> 19 cagatgcacc cattggcaaa tgcaagtttt tttgcga 37 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PCR-coupled Rolling Circle Amplification <130> 1063726 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 forward primer <400> 1 ttcagacaat ggaacgtgtt accc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 reverse primer <400> 2 ttcagacaat ggaacgtgtt accc 24 <210> 3 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 DNA <400> 3 gaatgatgat tgggccatga acttgttttg ggaatatctc aaacctttca aatgatgaca 60 ctgagctcaa t 71 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 Dumbbell padlock <400> 4 gcccaatcat ccctaaccct aaccctaacc ctttgggcca tgaatgaaag gtccgacaag 60 ttcatg 66 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1N1 hairpin primer <400> 5 attgagctca gtgtcatcat ttgaaaggtt tgagatattc cctcggacct ttca 54 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 forward primer <400> 6 gcacagggaa tctaattgct ccta 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 reverse primer <400> 7 gcacagggaa tctaattgct ccta 24 <210> 8 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 DNA <400> 8 gaatgcttcc atttggagtg atgcatttta cttgcatttg ccaatgggtg catctgatct 60 cattattgag c 71 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 Dumbbell padlock <400> 9 caaatggaag ccctaaccct aaccctaacc ctcatttgga gtgagcaccc aatccttgca 60 tcactc 66 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 hairpin primer <400> 10 gctcaataat gagatcagat gcacccattg gcaaatgcaa gtaggattgg gtgc 54 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata forward primer <400> 11 gaagtaccat acatttgtgc ag 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata reverse primer <400> 12 acttttgagg atttgagtct cca 23 <210> 13 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata DNA <400> 13 gaatggaggt tcttcatttg ggtttttttc atctgaatgg aacccccaaa cagtaatttg 60 gtcttcccct t 71 <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata Dumbbell padlock <400> 14 gaagaacctc ccctaaccct aaccctaacc ctttcttcat ttggattact gtttgaaaac 60 ccaaat 66 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yamagata hairpin primer <400> 15 aaggggaaga ccaaattact gtttgggggt tccattcaga tgcccccaaa cagtaat 57 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 circle padlock <400> 16 caaatggaag aaaccctaac cctaacccta accctaaaaa gggctgccag atactcttcg 60 caatttttgc atcactc 77 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (15) <400> 17 gatcagatgc acccattggc aaatgcaagt ttttttgcga agagtatctg 50 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (10) <400> 18 gatcagatgc acccattggc aaatgcaagt ttttttgcga agagt 45 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3N2 ternary primer (5) <400> 19 cagatgcacc cattggcaaa tgcaagtttt tttgcga 37

Claims (18)

표적 유전자 결합 부위와 패드락 프로브(Padlock probe)에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 헤어핀 프라이머; 및
상기 헤어핀 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위, 표적 유전자 결합 부위, 형광 검출을 위한 표지자 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 패드락 프로브;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.A hairpin primer comprising a binding site complementarily binding to a target gene binding site and a padlock probe; And
Rotating ring amplification comprising; a padlock probe comprising a primer binding site complementarily binding to the hairpin primer, a target gene binding site, a marker site for fluorescence detection, and a complementary binding site in a probe to form a dumbbell shape. (Rolling Circle Amplification, RCA) based target gene detection kit. 제1항에 있어서, 상기 헤어핀 프라이머가 표적 유전자에 결합하면 패드락 프로브에 상보적인 결합부위가 노출되고, 노출된 헤어핀 프라이머의 말단이 패드락 프로브에 결합되어 표적 유전자 - 헤어핀 프라이머 - 패드락 프로브로 이루어지는 삼성분 개시복합체(ternary components initiation complex)가 형성되는 것인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.According to claim 1, When the hairpin primer is bound to the target gene, a binding region complementary to the padlock probe is exposed, and the end of the exposed hairpin primer is bound to the padlock probe to the target gene-hairpin primer-padlock probe. A kit for detecting a target gene based on rolling circle amplification (RCA) in which a ternary components initiation complex is formed. 제1항에 있어서, 상기 패드락 프로브의 표적 유전자 결합 부위는 15 내지 25 mer 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The kit for detecting a target gene based on rolling circle amplification (RCA) according to claim 1, wherein the target gene binding site of the padlock probe has a length of 15 to 25 mer. 제1항에 있어서, 상기 패드락 프로브의 프라이머 결합 부위는 10 내지 12 mer 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The kit for detecting a target gene based on rolling circle amplification (RCA) according to claim 1, wherein a primer binding site of the padlock probe has a length of 10 to 12 mer. 제1항에 있어서, 상기 패드락 프로브의 덤벨 형태를 형성하기 위한 주형 내 상보적인 결합 부위는 총 12 내지 20 mer 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The method of claim 1, wherein the complementary binding site in the template for forming the dumbbell shape of the padlock probe has a total of 12 to 20 mer in length, based on rolling circle amplification (RCA)-based target gene detection. Dragon kit. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자는 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.According to claim 1, The target gene is derived from influenza virus, rolling circle amplification (Rolling Circle Amplification, RCA)-based target gene detection kit. 제1항에 있어서, 상기 패드락 프로브의 서열은 서열번호 4, 서열번호 9 및 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.According to claim 1, The sequence of the padlock probe is any one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 14, Rolling Circle Amplification (RCA)-based target gene Detection kit. 제1항에 있어서, 상기 헤어핀 프라이머의 서열은 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.According to claim 1, The sequence of the hairpin primer is any one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 15, Rolling Circle Amplification (RCA)-based target gene detection Dragon kit. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자는 120 내지 250 mer의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The kit of claim 1, wherein the target gene has a length of 120 to 250 mer. 제1항에 있어서,
상기 표적 유전자는 A형 인플루엔자 바이러스 H1N1, A형 인플루엔자 바이러스 H3N2 및 B형 인플루엔자 바이러스 야마가타 리니지(yamagata lineage)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 바이러스로부터 유래된 유전자이며,
상기 표적 유전자의 검출신호의 세기는 비표적 바이러스 유전자의 검출신호 대비 평균 11.2배이고, 상기 표적 유전자의 검출 한계는 4.9 아토몰(aM)인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.According to claim 1,
The target gene is a gene derived from any one virus selected from the group consisting of type A influenza virus H1N1, type A influenza virus H3N2 and type B influenza virus Yamagata lineage,
The intensity of the detection signal of the target gene is 11.2 times on average compared to the detection signal of the non-target virus gene, and the detection limit of the target gene is 4.9 atom (aM), a rolling circle amplification (RCA)-based target gene detection Dragon kit. 제1항에 있어서, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 표적 유전자 증폭용 조성물을 추가적으로 포함하는, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The kit of claim 1, further comprising a composition for target gene amplification for polymerase chain reaction (PCR), based on rolling circle amplification (RCA). 제11항에 있어서, 상기 표적 유전자 증폭용 조성물은 DNA 중합효소, 반응 완충용액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 람다 핵산말단분해효소(lambda-exonuclease)를 포함하는 것인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The composition of claim 11, wherein the composition for amplifying the target gene comprises DNA polymerase, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), a primer set for amplifying the target gene, and a lambda-exonuclease. , Rolling Circle Amplification (RCA)-based target gene detection kit. 제12항에 있어서, 상기 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인, 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA) 기반 표적 유전자 검출용 키트.The primer set for amplifying a target gene according to claim 12, wherein the primer set comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, the primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: A kit for detecting a target gene based on Rolling Circle Amplification (RCA), which is a set of one or more primers selected from a primer set consisting of 12 nucleotide sequences. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 표적 유전자를 증폭시키는 단계(S1);
상기 (S1) 단계에서 증폭된 이중가닥의 표적 유전자로부터 단일가닥의 표적 유전자를 수득하는 단계(S2);
상기 (S2) 단계에서 수득한 단일가닥의 표적 유전자와 헤어핀 프라이머 및 패드락 프로브(Padlock probe)을 포함하는 반응용액을 반응시켜 삼성분 개시복합체(ternary components initiation complex) 형성과 함께 회전환 증폭(Rolling circle amplification, RCA)을 수행하여 단일가닥의 유전자를 얻는 단계(S3); 및
상기 (S3) 단계에서 증폭된 단일가닥의 유전자를 확인하는 단계(S4);를 포함하고,
상기 헤어핀 프라이머는 표적 유전자 결합 부위와 패드락프로브(Padlock probe)에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함하며,
상기 패드락 프로브(Padlock probe)는 상기 헤어핀 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합 부위, 표적 유전자 결합 부위, 형광 검출을 위한 표지자 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 프로브 내 상보적인 결합 부위를 포함하는, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법.Amplifying the target gene by polymerase chain reaction (PCR) (S1);
Obtaining a single-stranded target gene from the double-stranded target gene amplified in the step (S1) (S2);
The single-stranded target gene obtained in step (S2) is reacted with a reaction solution containing a hairpin primer and a padlock probe to form a ternary components initiation complex and amplify a rolling ring. circle amplification (RCA) to obtain a single-stranded gene (S3); And
Including (S4) to identify the single-stranded gene amplified in the step (S3);
The hairpin primer includes a target gene binding site and a binding site that complementarily binds to a padlock probe,
The padlock probe includes a primer binding site that complementarily binds to the hairpin primer, a target gene binding site, a marker site for fluorescence detection, and a complementary binding site in a probe to form a dumbbell shape. PCR-RCA double amplification based target gene detection method. 제14항에 있어서, 상기 (S1) 단계는 프라이머 쌍 중 어느 하나에만 말단에 인산기가 결합된 것을 사용하여 표적 유전자를 증폭시키는 것인, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법.15. The method of claim 14, wherein the step (S1) is to amplify the target gene using a phosphate group bound to either end of the primer pair, PCR-RCA double amplification-based target gene detection method. 제14항에 있어서, 상기 (S2) 단계는 이중가닥 표적 유전자 중 인산기가 결합된 가닥이 람다-핵산말단분해효소에 의해 분해되어 단일가닥의 표적 유전자를 생성하는 것을 특징으로 하는, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법.15. The method of claim 14, wherein the step (S2) is characterized in that the strand of the double-stranded target gene is bound by a lambda-nucleic acid terase to generate a single-stranded target gene, PCR-RCA double Amplification-based target gene detection method. 제14항에 있어서, 상기 (S3) 단계의 회전환 증폭에 phi29 DNA 중합효소를 사용하는 것인, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법.The method for detecting a target gene based on PCR-RCA double amplification according to claim 14, wherein phi29 DNA polymerase is used for the amplification of the ring in step (S3). 제14항에 있어서, 상기(S4) 단계의 증폭된 유전자 확인은 티오플라빈 T가 (S3)단계에서 증폭된 단일가닥 DNA의 G-사중나선 구조에 삽입되어 나타나는 형광을 검출하는 것인, PCR-RCA 이중증폭 기반 표적 유전자의 검출방법.15. The method of claim 14, wherein the amplified gene identification in the step (S4) is to detect the fluorescence appearing is inserted into the G-quadron structure of the single-stranded DNA amplified in step (S3) thioflavin T -RCA double amplification based target gene detection method.
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