KR102124257B1 - Burkholderia pseudomallei diagnostic detection kit using rapid immunochromatography, its specific antibody and antibody-producing cell lines - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유비저균 특이적인 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(2o 16-12, 2o 21-1) 및 이를 이용한 유비저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 유비저균에 대하여 우수한 민감도를 나타내고 다른 병원체 및 방해물질에 대하여 교차반응을 나타내지 않는다.The present invention relates to a ubiquitous specific monoclonal antibody, a novel cell line (2o 16-12, 2o 21-1) producing the antibody, and an immunochromatography kit for detecting ubiquitous bacteria using the same. The kit exhibits good sensitivity to Ubibacteria and does not show cross-reactivity to other pathogens and interfering substances.
Description
본 발명은 유비저균 인지항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(2o 16-1, 2o 21-1), 및 상기 항체를 포함하고 민감도와 특이도가 개선된 유비저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.The present invention is a ubiquitous cognitive antibody, a novel cell line (2o 16-1, 2o 21-1) producing the antibody, and an immunochromatography kit for detecting ubiquitous bacteria comprising the antibody and having improved sensitivity and specificity It is about.
pseudomallei를 병원체로 하는 질병으로 “메리오이드증” 이라고도 한다. A disease with pseudomallei as a pathogen, also called “merioidosis”.
유비저균(B. pseudomallei)은 열대성 기후, 특히 풍토병이 있는 동남아시아에서 두드러지게 나타나며 베트남, 캄보디아, 라오스, 태국, 말레이시아, 미얀마 등 동남아시아와 호주 북부 지역 등에서 주로 발생하는 풍토병인 유비저 원인균으로 토양 환경에 존재한다. 주로 호흡기와 상처 난 피부를 통해서 전파되고, 잠복기는 수일에서 수년까지 다양하나, 주로 1~21일이다. B. pseudomallei is prominent in tropical climates, especially in Southeast Asia with endemic diseases, and is a causative agent of endemic diseases in Southeast Asia and northern Australia such as Vietnam, Cambodia, Laos, Thailand, Malaysia, and Myanmar. exist. It mainly spreads through the respiratory system and wounded skin, and the incubation period varies from several days to several years, but it is mainly 1 to 21 days.
인체에 대한 위해도, 무기로서의 제조 가능성, 무기화되었을 경우의 위험도 등을 고려하여 미국 질병통제센터에 의해 생물테러에 사용이 가능한 병원체인 Category B로 지정된 바 있다. 국내에서도 2005년 전염병예방법 개정을 통해 B. mallei (마비저균) 및 B. pseudomallei를 32종의 ‘고위험병원체’ 중 하나로 지정, 고시하여 보존 및 관리를 강화하도록 하였다. It has been designated as Category B, a pathogen that can be used for bioterrorism by the US Centers for Disease Control and Prevention, considering the risk to the human body, the possibility of manufacturing as a weapon, and the risk of being weaponized. In Korea, B. mallei (paralysis bacteria) and B. pseudomallei were designated and announced as one of 32'high- risk pathogens' through the revision of the infectious disease prevention method in 2005 to strengthen conservation and management.
유비저균 및 마비저균은 1 및 2차 세계대전 등에서 실제로 생물무기로 사용되었다는 보고가 있다. 상기 감염을 빠르고 정확하게 진단하는 것은 실제로 생물테러 등 생물학적 위해가 발생했을 경우 환자 치료 및 감염 확산 방지 등의 신속한 대응을 할 수 있게 하는 중요한 요인일 뿐만 아니라 평상시 동남아시아 등 발생지역을 방문하는 여행객들에게 감염될 위험이 높은 전염병에 대한 기본적인 진단법 확립 측면에서도 반드시 필요하다.It has been reported that bacterial and paralytic bacteria were actually used as biological weapons in World Wars I and II. Diagnosing the infection quickly and accurately is not only an important factor that enables rapid response such as treatment of patients and prevention of the spread of infection in the event of a biological hazard such as bioterrorism. It is also essential in establishing basic diagnostic methods for high-risk infectious diseases.
B. pseudomallei에 감염된 환자들은 폐, 간, 비장(spleen), 신장에서 넓게 퍼진 고름을 가진 패혈증이 나타나는 특징을 보인다. 증상에 따라 급성 또는 국소적 감염(acute or localized infection), 급성 폐 감염(acute pulmonary infection), 급성 혈류감염(acute bloodstream infection), 만성 화농감염(chronic suppurative infection), 불현성 감염(inapparent infection) 등으로 분류된다. B. pseudomallei -infected patients are characterized by sepsis with widespread pus in the lungs, liver, spleen, and kidneys. Depending on the symptoms, acute or localized infection, acute pulmonary infection, acute bloodstream infection, chronic suppurative infection, inapparent infection, etc. Classified.
잠복 기간은 아직 분명히 알려지지는 않았지만, 2일 내지 수년까지로 범위가 매우 넓다. 20년간 잠복 감염(latent infection)으로 존재하다가 재발하는 경우도 있다. 급성 또는 국소적 감염의 형태는 피부와 부드러운 조직으로 세균이 침범하여 세균 침습부위에 고름이 형성되고 통증을 동반하며 대개의 경우, 결절(nodule)이 나타난다. 피부상처를 통해 침투하여 다른 장기, 주로 폐, 간, 비장 등에 영향을 줄 수 있다. 이러한 유비저의 급성 형태는 고열과 전신 근육통을 나타내며, 혈류를 통한 급속한 감염을 일으킬 수 있다.The incubation period is not yet known, but it ranges from 2 days to several years. In some cases, it may be present as a latent infection for 20 years and then recur. In the form of acute or local infection, the bacteria invade the skin and soft tissues, forming pus on the bacterial invasion site, accompanied by pain, and, in most cases, nodules. It can penetrate through skin wounds and affect other organs, mainly the lungs, liver and spleen. This acute form of the user exhibits high fever and generalized myalgia and can cause rapid infection through the bloodstream.
그러나 급성 폐감염의 형태는 가벼운 기관지염(mild bronchitis)이 심각한 폐렴(severe pneumonia)으로 진전될 수 있다. 발병 초기는 고열, 두통, 식욕부진, 전반적인 근육 통증(muscle soreness) 등이 수반되며, 가슴 통증이 일반적이고, 정상적인 가래가 섞인 습성기침(productive cough) 또는 비습성기침(nonproductive cough)이 나타난다. 급성 혈류감염은 가장 중증의 유형으로, 기저질환으로 HIV, 신부전(renal failure), 알코올중독, 백혈병, 임파종, 당뇨병을 앓고 있는 환자들에게서 빈번히 나타나며 패혈성 쇼크(septic shock)를 일으킬 수 있다. However, in the form of acute lung infection, mild bronchitis can develop into severe pneumonia (severe pneumonia). Early onset involves high fever, headache, loss of appetite, general muscle soreness, chest pain is common, and a productive cough or nonproductive cough with normal phlegm appears. Acute blood flow infection is the most severe type of underlying disease, frequently occurring in patients suffering from HIV, renal failure, alcoholism, leukemia, lymphoma, and diabetes, and can cause septic shock.
증상은 감염 부위에 따라 다양하지만 일반적으로는 호흡곤란(respiratory distress), 심각한 두통, 고열, 설사 및 피부에 농이 찬 병변이 나타나고, 근육 통증, 지각상실(disorientation) 등이 나타난다. 이러한 감염 형태는 일반적으로 짧은 시간 내에 감염되고, 때로는 농양이 전신에서 발견되기도 한다. 만성 화농감염은 몸 전체 기관을 포함하는 감염형태로서 전형적으로 관절(joint), 내장(viscera), 림프절(lymph node), 피부, 뇌, 간, 폐, 뼈, 비장에서 나타난다.Symptoms vary depending on the site of infection, but in general, there are respiratory distress, severe headache, high fever, diarrhea and skin-stained lesions, muscle pain, disorientation, and the like. This type of infection is usually infected in a short time, and sometimes abscesses are found throughout the body. Chronic purulent infections are infections involving the entire body, typically in the joints, viscera, lymph nodes, skin, brain, liver, lungs, bones and spleen.
국내에서 확인된 유비저는 5번의 사례가 있었다. 해외 유입 건은 2003년과 2004년에 각각 한 건씩 한국인이 동남아시아 여행 중 감염되어 치료 받은 후 완쾌된 사례이며, 세 번째 사례는 2008년 태국인 근로자로서, 우리나라에서는 처음으로 발생한 유비저 사망 사례이다. 네 번째로 2009년 캄보디아 여행 후 발생한 치명적인 유비저 사망사례가 있었으며, 마지막으로 2010년에는 외국에 거주했던 한국인이 귀국하여 병원 응급실로 내원하였다가 7일간 입원 후 사망한 사례로 이는 내국인이 사망한 두 번째 사례이다. 사망자는 말레이시아에서 거주하던 중에 감염된 것으로 추정되는데, 증상 발현 후 2주 정도로 시간이 지난 후에 귀국하여 입원 치료를 시작함으로써, 조기 치료시기를 놓친 것으로 추정되고 있다.There have been five cases of confirmed ubiquitous in Korea. The inflow of foreign cases was completed in 2003 and 2004, respectively, after Koreans were infected and treated while traveling in Southeast Asia, and the third case was Thai workers in 2008, the first case of death in Korea. Fourth, there was a fatal death in the case of a fatal user after a trip to Cambodia in 2009. Lastly, in 2010, a Korean who had lived abroad returned to the hospital emergency room and died after being admitted for 7 days. This is the first example. It is estimated that the deceased was infected while living in Malaysia, and it was estimated that he missed the early treatment period by returning home after about two weeks after the onset of symptoms and starting treatment.
해외에서는 2004년 싱가포르에서는 57명이 집단 발생하여 21명이 사망하였으며, 2005년 대만에서 16명이 발생하여 6명이 사망한 바 있다.Overseas, 57 people died in Singapore in 2004, and 21 people died. In 2005, six people died in Taiwan.
진단에 사용되는 검체는 혈액, 객담, 고름 등이 가능하며 검체에 대한 혈액배양 등을 통해 B. pseudomallei를 분리 동정한다. 객담 등의 검체는 양 혈액 한천 배지(SBA)와 MacConkey agar에 직접 도말하여 1일 내지 2일 정도에는 작고 매끈한 집락이 나타나면 이들에 대한 확인 동정 및 생화학적 검사를 수행한다. 특히, Wayson 염색액에 의해 양극단염색이 가능하여 양 끝 부분이 짙고, 중앙부가 물 빠진 것처럼 엷게 염색되어 안전핀 모양의 형태학적 특성을 나타내게 된다. The sample used for diagnosis can be blood, sputum, pus, etc., and B. pseudomallei is separated and identified through blood culture for the sample. Samples such as sputum are smeared directly on sheep blood agar medium (SBA) and MacConkey agar, and when small and smooth colonies appear on the first or second day, confirmatory identification and biochemical tests are performed. Particularly, it is possible to dye the anodic end by wayson dyeing solution, so both ends are dark and the center part is dyed lightly like water is drained to show the shape of safety pin.
유전학적 감별 진단으로는 분리균이나 혈액검체를 이용한 multiplex PCR이 사용된다. B. mallei와 B. pseudomallei 같은 병원성 균을 다른 Burkholderia 속에 포함되는 비병원성 균과의 유전적으로 감별 진단하는데 B. pseudomallei와 B. thailandensis에 공통적 또는 특이적으로 존재하는 MprA 유전자와 DNA 반복서열 등을 활용한다.As a genetic differential diagnosis, multiplex PCR using isolated bacteria or blood samples is used. The genetically differentiated diagnosis of pathogenic bacteria such as B. mallei and B. pseudomallei from non-pathogenic bacteria contained in other Burkholderia utilizes the MprA gene and DNA repetition sequences that are common or specific to B. pseudomallei and B. thailandensis . .
유비저 양성으로 진단을 받을 경우 약 2주간 입원하여 ceftazidime (3세대 세팔로스포린 β-lactam 항생제), meropenem 등의 항생제 정맥주사 치료를 받고, 다음 trimethoprism-sulfamethoxazole, deoxycycline 등으로 3~6개월간 더 치료를 받아야 한다.If you are diagnosed as being positive, you will be hospitalized for about 2 weeks to receive intravenous antibiotics such as ceftazidime (third-generation cephalosporin β-lactam antibiotic) and meropenem, and then treat for 3 to 6 months with trimethoprism-sulfamethoxazole, deoxycycline, etc. Should receive
현재까지는 특별한 예방백신이 없어 치사율이 40%에 달하며 각종 합병증을 유발할 수 있어 예방이 매우 중요하다. 동남아시아 및 호주 북부지역을 여행할 때는 흙을 만지거나 고인 물을 마시는 것을 피한다. 또한, 피부열상, 찰과상 또는 화상이 발생하면 감염의 위험이 있으므로 신속하게 치료해야 한다. So far, there is no special preventive vaccine, so the mortality rate reaches 40%, and it can cause various complications, so prevention is very important. When traveling in Southeast Asia and northern Australia, avoid touching the soil or drinking standing water. In addition, if skin lacerations, abrasions or burns occur, there is a risk of infection and treatment should be prompt.
따라서 유비저균에 의한 생물테러 의심상황 발생 시 현장에서 신속 탐지할 수 있는 기술의 개발은 테러상황 유무를 신속하게 판단하고 대응정책 결정을 위해 매우 중요하다. 이를 위하여 본 발명자는 유비저균의 현장 검출을 위한 면역크로마토그래피 기술 기반 신속 탐지키트를 개발하고자 하였다.Therefore, the development of a technology that can be quickly detected in the field in the event of a suspected bioterrorism caused by ubiquitous bacteria is very important for promptly determining the existence of a terrorist situation and determining a response policy. To this end, the present inventor has developed a rapid detection kit based on immunochromatography technology for on-site detection of ubiquitous bacteria.
본 발명의 목적은 생물테러 의심상황 등에서 신속한 대응을 위해, 유비저균 현장 검출을 위한 유비저균 탐지키트를 제공하는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 유비저균 인지항체, 및 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(2o 16-1, 2o 21-1) 및 이를 이용한 유비저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트를 제공한다.An object of the present invention is to provide a ubiquitous detection kit for on-site detection of ubiquitous bacteria for rapid response in a suspected situation of bioterrorism. To this end, the present invention provides a ubiquitous cognitive antibody, and a novel cell line (2o 16-1, 2o 21-1) producing the antibody, and an immunochromatography kit for detecting ubiquitous bacteria using the same.
본 발명은 유비저균을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 제공한다. The present invention provides a monoclonal antibody characterized by specifically recognizing ubiquitous bacteria.
상기 단일클론 항체는 기탁번호 KCLRF-BP-00452로 기탁된 세포주 2o 16-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00453으로 기탁된 세포주 2o 21-1에 의하여 생성되고, 유비저균을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 한다.The monoclonal antibody is produced by cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452 or cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453, and specifically recognizes ubiquitous bacteria It is characterized by.
본 발명은 또한 기탁번호 KCLRF-BP-00452로 기탁된 세포주 2o 16-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00453으로 기탁된 세포주 2o 21-1에 관한 것이다.The present invention also relates to cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452 or cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453.
구체적으로 본 발명은 (i) 유비저(B. pseudomallei) 불활화 균체를 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계; (ii) 상기 비장에서 수득한 B림프구와 Myeloma 세포를 융합하는 단계; 및 (iii) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 세포주에 관한 것이다.Specifically, the present invention comprises the steps of (i) injecting a ubiquitous ( B. pseudomallei ) inactivated cell into a mouse to progress immunity to obtain a mouse spleen; (ii) fusion of B lymphocytes and Myeloma cells obtained from the spleen; And (iii) relates to a cell line prepared by a method comprising the step of selecting the cells obtained above.
본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 유비저균 탐지키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅될 수 있다. The present invention relates to a ubiquitous bacteria detection kit comprising the monoclonal antibody. In the kit, the monoclonal antibody can be coated on the nitrocellulose membrane.
상기 키트는 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.The kit may further include at least one of a sample pad and a moisture absorption pad.
본 발명은 기존의 유비저균 탐지키트에 사용되는 항체보다 감도와 특이도가 우수한 항체를 제공함으로써 보다 신속하고 정확하게 유비저균을 탐지 및 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체를 이용한 탐지키트는 종래의 제품과 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 가지며, 타 병원체 및 독소 등에 대한 교차반응이 없어 매우 우수한 특이도를 갖는다.The present invention can detect and detect ubiquitous bacteria more quickly and accurately by providing antibodies with superior sensitivity and specificity than the antibodies used in the conventional ubiquitous detection kit. Specifically, the detection kit using the antibody of the present invention has superior sensitivity compared to conventional products, and has very good specificity since there is no cross reaction to other pathogens and toxins.
도 1은 기존 상용화된 탐지키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 본 발명의 신규 항체를 적용한 탐지 키트의 감도를 비교평가한 결과이다.
도 2는 특이도 평가를 위하여 균체 및 독소 9종에 대한 교차반응 유무를 비교 평가한 결과이다.
도 3은 탐지키트가 방해물질에 대한 영향을 받는지 여부를 시험한 결과이다.
도 4는 탐지키트의 재현성을 평가하기 위해 각 항목별 20회의 감도 및 특이도 시험을 실시한 결과이다.1 is a result of comparing and evaluating the sensitivity of a detection kit to which the novel antibody of the present invention is applied with an existing commercially available detection kit (product name: bioterrorism pathogen and toxin
2 is a result of comparing and evaluating the presence or absence of a cross-reaction for 9 types of cells and toxins for specificity evaluation.
3 is a result of testing whether the detection kit is affected by the interference.
FIG. 4 shows the results of 20 sensitivity and specificity tests for each item to evaluate the reproducibility of the detection kit.
본 발명에서 사용되는 모든 용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료 등이 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. All terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the sense as commonly understood by a person skilled in the art. In addition, a preferred method or sample is described in the present specification, but similar or equivalent ones are included in the scope of the present invention.
본 발명에서 용어, "항체(antibody)"란 항원과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 본 발명의 목적상 유비저균에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. In the present invention, the term, "antibody (antibody)" is a protein that specifically binds to an antigen, and for the purposes of the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds ubiquitous bacteria.
본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00452로 기탁된 세포주 2o 16-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00453으로 기탁된 세포주 2o 21-1에 의해 생산되는, 유비저균에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.The present invention is produced by cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452 or cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453, a monoclonal antibody specifically binding to ubiquitous bacteria It is about.
기탁번호 KCLRF-BP-00452로 기탁된 세포주 2o 16-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00453으로 기탁된 세포주 2o 21-1에서 생산되는 항체는 기존의 유비저균 검출키트에 사용된 항체보다 항원에 대한 친화도가 높은 신규한 항체이다. 항원에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주는 표준 기술에 따라 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.Antibodies produced in cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452 or cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453 are more resistant to antigens than antibodies used in conventional ubiquitous detection kits. It is a novel antibody with high affinity. Hybridoma cell lines capable of producing antibodies specific for the antigen can be cultured in large quantities according to standard techniques. The monoclonal antibody produced by the above hybridoma cell line may be used without purification, but it is preferred to use it after purification in high purity according to methods well known in the art.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 항체를 포함하는 유비저균 탐지 키트에 관한 것이다. 상기의 항체를 포함하는 키트를 이용하여 생물테러 의심상황에서 유비저균의 현장 검출을 신속하게 할 수 있다. In another aspect, the present invention relates to a ubiquitous detection kit comprising the above-described antibody. By using the kit containing the above antibody, it is possible to rapidly detect on-site detection of ubiquitous bacteria in a suspected bioterrorism situation.
이러한 탐지키트에는 본 발명의 단일클론 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구 및 시약은 적합한 담체(carrier), 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제 및 안정화제 등을 포함되나 이에 제한되지 않는다. Such a detection kit may include the monoclonal antibody of the present invention, as well as tools, reagents, and the like commonly used in the art for immunological analysis. Such tools and reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers and stabilizers, and the like.
적합한 담체(carrier)로는, 가용성 담체, 예를 들어 당해 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리 에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. Suitable carriers include soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile , Fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof, but are not limited thereto.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip)에 의해 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. Formation of antigen-antibody complexes include tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunoassay, western blotting, immunoprecipitation assay, immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay ), Complement Fixation Assay, FACS, and protein chip (protein chip).
항원-항체 복합체 형성을 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있도록 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. Labels that enable qualitative or quantitative measurement of antigen-antibody complex formation include, but are not limited to, enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules, and radioactive isotopes.
검출 라벨로 이용가능한 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포 프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트, 데카복실라제, β-라타마제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. Enzymes available as detection labels include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxy Multidose, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phospho fructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphenol pyruvate, decarboxylase, β- Ratamases, and the like, but is not limited thereto.
형광물은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. Fluorescent materials include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoerytherin, phycocyanin, allopicocyanine, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
리간드는 바이오틴 유도체 등을 포함하고, 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. Ligands include biotin derivatives and the like, and emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like.
미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. The microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
본 발명의 키트에서, 상기 단일클론 항체는 통상의 탐지키트의 재료로 사용되는 멤브레인에 코팅된 것일 수 있으며, 멤브레인은 나이트로 셀룰로스, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다. In the kit of the present invention, the monoclonal antibody may be coated on a membrane used as a material for a conventional detection kit, and the membrane may contain various synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, and polyethylene. Can be used.
본 발명자는, 멤브레인 종류별(제조사별, pore size 별) 및 검사선용 항체 농도별 시험을 실시하여 감도 및 특이도가 높은 멤브레인 및 항체 농도를 선별하였다. 그 결과 본 발명품 키트는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 검사선과 대조선 위치 부위에 항원 특이적 단일클론 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다.The present inventors conducted tests by membrane type (by manufacturer, by pore size) and by antibody concentration for test vessels to select membrane and antibody concentrations with high sensitivity and specificity. As a result, the kit of the present invention was coated with an antigen-specific monoclonal antibody and an antibody for the control line, respectively, on the nitrocellulose membrane at the site of the test line and the control line.
본 발명은 검체 패드 시험을 통해 소, 마우스 혈청과 같은 동물 혈청 처리를 통해 비특이 반응을 제거하며 BSA, Casein등과 같은 안정제 등으로 전처리하여 선별 조건에 최적화된 패드 조성을 선별하였다.The present invention removes non-specific reactions through treatment of animal serum such as cow and mouse serum through a sample pad test, and pre-treatment with a stabilizer such as BSA, Casein, etc. to select a pad composition optimized for selection conditions.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention and the scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] - 단일클론 항체 제조[Example 1]-Preparation of monoclonal antibodies
1. 면역 및 세포 융합1. Immunity and cell fusion
단일클론 항체 제조를 위해 질병관리본부로부터 분양 받은 유비저균을 영양배지 배양을 통해 증균하고, 4% Formaldehyde 용액으로 불활화한 균체를 Freund's adjuvant로 emulsion을 만든 후 마우스에 면역하였다. 마우스 면역량은 유비저균 불활화 균체 1X108~1X109cfu/dose의 농도로 1~2주 간격으로 4~8회 복강면역을 진행하였고, 세포 융합 1~3일 전에 항원을 미정맥으로 접종하였다. For the production of monoclonal antibodies, ubiquitous bacteria pre-sold from the disease management headquarters were cultivated through nutrient medium culture, and cells inactivated with 4% Formaldehyde solution were emulsified with Freund's adjuvant and immunized with mice. The mouse immunity was intraperitoneally immunized 4 to 8 times at intervals of 1 to 2 weeks at a concentration of ubiquitous inactivated cells 1X10 8 to 1X10 9 cfu/dose, and the cells were inoculated with the
세포 융합 하루 전에 미정맥으로 전채혈을 실시하여 단일클론 항체의 ELISA 검사시 사용하였다. 세포 융합에 사용할 비장은 무균조건 하에서 채취하여 폴리에틸렌글리콜(PEG 1500 시약)을 이용하여, 골수종(myeloma) 세포와의 세포 융합을 유도한 후 HAT 배지 및 HT 배지에서 세포 배양하였다.One day before cell fusion, whole blood was collected through the vein and used for ELISA of the monoclonal antibody. Spleens to be used for cell fusion were collected under sterile conditions and induced cell fusion with myeloma cells using polyethylene glycol (PEG 1500 reagent), followed by cell culture in HAT medium and HT medium.
2. 스크리닝, 복수생산 및 항체 정제2. Screening, multiple production and antibody purification
96 well에 배양된 융합 세포는 ELISA에 의한 1차 및 2차 스크리닝을 통하여 교차반응이 없는 양성 클론을 선별하였다. 그 결과 얻어진 세포주를 2018.08.01.자로 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁번호 KCLRF-BP-00452, KCLRF-BP-00453). 이들 세포주를 마우스 복강 접종하여 복수 생산을 하였다. 복강 접종 10~20일 후 복강 내 복수가 생산되면 마우스 당 약 2~4㎖의 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 원심분리로 혈구 및 피브린 등을 제거하고 이를 정제에 사용하였다. 마우스 복수 정제는 Protein G chromatography gel을 이용하여 protein G에 특이적인 항체인 마우스 IgG를 정제하였다. 마우스 IgM은 특이적인 gel affinity chromatography 방법을 사용하지 않고, 투석 및 DEAE gel 정제 방법으로 IgM을 정제하여 제제화에 사용하였다. 정제된 단일클론 항체 후보군은 골드(gold)를 이용한 스크리닝으로 선별하였다.Fusion cells cultured in 96 wells were screened for positive clones without cross-reactivity through primary and secondary screening by ELISA. The resulting cell line was deposited with the Korea Cell Line Bank as of August 1, 2018 (Accession Nos. KCLRF-BP-00452, KCLRF-BP-00453). These cell lines were inoculated intraperitoneally into mice to produce ascites. When intraperitoneal ascites were produced 10-20 days after intraperitoneal inoculation, ascites of about 2-4 ml per mouse were collected. The collected ascites were centrifuged to remove blood cells, fibrin, etc. and used for purification. For the mouse multiple purification, mouse IgG, an antibody specific for protein G, was purified using Protein G chromatography gel. The mouse IgM was used for formulation by purifying IgM by dialysis and DEAE gel purification without using a specific gel affinity chromatography method. The purified monoclonal antibody candidate group was selected by screening using gold.
[실시예 2] - 유비저균 탐지키트의 제조[Example 2]-Preparation of ubiquitous bacteria detection kit
나이트로셀룰로스 멤브레인의 검사선과 대조선 위치에 선별된 항원 특이적 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다. 선별된 항체를 접합한 금접합체를 패드에 분주하여 건조한 후 절단하여 골드패드를 제조하였다. 라미네이터를 이용하여 플라스틱 카드에 멤브레인, 골드패드, 검체패드, 흡습패드를 부착하여 키트를 제조하였다.Antigen-specific antibodies and control antibodies selected at the test and control positions of the nitrocellulose membrane were coated, respectively. The gold conjugate to which the selected antibody was conjugated was dispensed on the pad, dried and cut to prepare a gold pad. A kit was prepared by attaching a membrane, a gold pad, a sample pad, and a moisture absorption pad to a plastic card using a laminator.
[시험예 1] - 감도(검출한계) 시험[Test Example 1]-Sensitivity (detection limit) test
유비저균의 검출 한계를 시험하기 위하여, 유비저균의 농도를 희석하면서 실시예 2에서 제조된 탐지키트의 감도 비교평가를 실시하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.In order to test the detection limit of ubiquitous bacteria, the sensitivity of the detection kit prepared in Example 2 was diluted while diluting the concentration of ubiquitous bacteria, and the results are shown in FIG. 1.
도 1에 나타낸 바와 같이, 총 10회 반복 시험한 결과 유비저균의 검출한계가 1.5x105 cfu/ml로 측정되는 새로운 탐지키트를 제작하였다.As shown in FIG. 1, a new detection kit was prepared in which the detection limit of ubiquitous bacteria was measured to be 1.5 ×10 5 cfu/ml as a result of 10 repeated tests.
[시험예 2] - 특이도 시험[Test Example 2]-Specificity test
특이도 평가를 위하여 페스트, 리신, 브루셀라 등 균주 및 독소 10종에 대한 교차 반응(cross reactivity)을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다. For specificity evaluation, cross reactivity of 10 strains and strains such as fest, lysine and brucella was evaluated, and the results are shown in Tables 1 and 2 below.
상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 다른 검체와의 교차 반응이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.As shown in Table 1 and FIG. 2, it was confirmed that no cross reaction with other samples occurred.
[시험예 3] - 방해물질 시험 [Test Example 3]-Interference test
탐지키트의 성능에 영향을 미칠 수 있는 소 혈청, 사람 혈청, 설탕, 밀가루, 토양 등을 포함한 10종의 예상 방해물질을 선정하여 특이도 테스트를 진행하여, 방해물질의 영향 유무를 확인하였다.Ten predicted interferers, including bovine serum, human serum, sugar, wheat flour, soil, etc., which can affect the performance of the detection kit, were selected and specificity tests were conducted to confirm the presence or absence of interference.
상기 실험결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다. The experimental results are shown in Table 2 and FIG. 3 below.
상기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 10종의 방해물질로부터 방해 작용을 받지 않음을 확인하였다.As shown in Table 2 and Fig. 3, it was confirmed that 10 kinds of interfering substances were not affected.
[시험예 4] - 재현성 시험[Test Example 4]-Reproducibility test
실시예 2에서 제조된 탐지키트가 재현성이 있는지 확인하기 위해 총 20회의 감도 및 특이도 시험을 진행하였다. 감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성검체로 하여 실험하였다.A total of 20 sensitivity and specificity tests were conducted to confirm that the detection kit prepared in Example 2 was reproducible. The sensitivity was tested at the positive detection limit concentration, and for the specificity test, the sample dilution was tested as a negative sample.
상기 실험결과를 도 4에 나타냈으며, 모두 재현성이 있는 것으로 확인되었다.The experimental results are shown in FIG. 4, and it was confirmed that all of them were reproducible.
[시험예 5] - 가속 안정성 시험[Test Example 5]-accelerated stability test
실시예 2에서 제조된 탐지키트의 유효기간 설정을 위해, 스트립을 55℃, 7주간 보관한 후 1주차 간격으로 꺼내 실온 보관한 스트립과의 감도 및 특이도 비교시험을 실시하였다. In order to set the expiration date of the detection kit prepared in Example 2, the strip was stored at 55°C for 7 weeks, and then taken out at intervals of 1 week, and a sensitivity and specificity comparison test was performed with the strip stored at room temperature.
감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성 검체로 하여 실험을 진행하였다. 실험결과 7주간의 가속 안정성 시험 이후에도 감도와 특이도 모두 이상 없음을 확인하였다.The experiment was conducted with a limit of positive detection for the sensitivity test and a negative sample for the specificity test. As a result of the experiment, it was confirmed that there was no abnormality in both sensitivity and specificity after the 7-week accelerated stability test.
[시험예 6] - 추가 교차반응 시험[Test Example 6]-Additional cross-reaction test
탐지 키트가 다른 균주 혹은 독소와의 교차반응이 있는지 확인하기 위해 24종의 균주 혹은 독소와의 교차 테스트를 진행하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 교차반응 시험 균주 및 물질 24종에 대하여 교차가 없음을 확인 할 수 있었다. In order to confirm that the detection kit has a cross-reaction with other strains or toxins, a cross-test with 24 strains or toxins was performed. As shown in Table 3 below, it was confirmed that there was no crossing for the cross-reaction test strain and 24 kinds of substances.
Claims (7)
It is produced by cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452 or cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453. Monoclonal antibody characterized by not specifically recognizing.
Cell line 2o 16-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00452.
Cell line 2o 21-1 deposited with accession number KCLRF-BP-00453.
(i) 유비저균 불활화 균체를 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계;
(ii) 상기 비장에서 수득한 B 림프구와 마이엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및
(iii) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계.
The cell line according to claim 2 or 3, which is produced by the following steps:
(i) obtaining a spleen of a mouse after immunization by injecting ubiquitous inactivating cells into a mouse;
(ii) fusing B lymphocytes and Myeloma cells obtained from the spleen; And
(iii) selecting the cells obtained above.
A ubiquitous detection kit comprising the monoclonal antibody of claim 1.
The ubiquitous detection kit according to claim 5, wherein the monoclonal antibody is coated on a nitrocellulose membrane.
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