KR102123539B1 - Composition for Enhancing Osteogenesis - Google Patents
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Abstract
혈관내피성장인자를 포획할 수 있는 골 형성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 인공 지지체로서의 기능을 수행할 뿐만 아니라 골모세포의 분화 및 혈관 신생을 증가시켜 골 재생을 촉진할 수 있다.Relates to a composition for promoting bone formation capable of capturing vascular endothelial growth factors, the composition not only performs a function as an artificial support, but also promotes bone regeneration by increasing differentiation and angiogenesis of osteoblasts.
Description
본 발명은 골 재생을 유도하는 혈관내피성장인자를 포획할 수 있는 골 형성 촉진용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting bone formation capable of capturing vascular endothelial growth factors that induce bone regeneration.
뼈는 일생동안 지속적으로 변화하는 활동적인 조직이다. 뼈는 육안으로 외부의 피질골(치밀골) 및 내부의 소주골(해면골, 스폰지뼈)로 구분되며, 피질골은 물리적인 강도가 강하여 신체를 보호하고 지지하는 역할을 하고, 소주골은 충격을 흡수하거나 칼슘의 변화를 일정하게 유지하는 역할을 한다.Bone is an active tissue that constantly changes throughout life. The bone is divided into the external cortical bone (density bone) and the internal small bone (spongy bone, sponge bone) with the naked eye, and the cortical bone has strong physical strength to protect and support the body, and the small bone absorbs shock or calcium It serves to keep the change of the constant.
골 조직은 인체의 골격을 유지시키는 중요한 조직으로 골 조직 재생을 위해서 다양한 재료와 형태의 골 조직 대체용, 재생용 골 이식재가 연구 개발되고 있다. 상기 골 이식재는 재료의 기원에 따라 환자의 공여 위치로부터 이식골을 채취하여 치료를 요하는 다른 부위로 이식하는 자가골 이식재, 다른 사람의 골에서 채취하여 이식하는 동종골 이식재, 사람 이외의 다른 종으로부터 채취된 이식골을 이용하는 이종골 이식재 및 인위적으로 합성하거나 자연에서 구할 수 있는 물질을 이용한 합성골 이식재로 분류할 수 있다. 상기 골 이식재는 치아의 임플란트 시에 식립 부위의 골밀도가 낮거나, 손상되거나 소실된 치주조직을 수복하기 위한 용도에도 이용될 수 있으나, 지금까지 인공 지지체로의 기능에 한정되어 있었다.Bone tissue is an important tissue that maintains the skeleton of the human body. In order to regenerate bone tissue, bone graft materials for replacement and regeneration of bone tissue in various materials and forms are being researched and developed. The bone graft material is an autologous bone graft material that is collected from a patient's donor location and transplanted to another site in need of treatment, an allogeneic bone graft material that is collected and transplanted from another person's bone, and is collected from other species other than human It can be classified into a heterogeneous bone graft material using a graft bone and a synthetic bone graft material artificially synthesized or using a material obtained from nature. The bone graft material may be used for the purpose of repairing periodontal tissue with low, damaged or lost bone density at the implant site during implantation of teeth, but has been limited to its function as an artificial support.
상기 문제를 해결하기 위하여 본 연구자들은 치주조직에 존재하는 혈관내피성장인자를 효과적으로 포획할 수 있는 골 이식용 조성물에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the present researchers completed the present invention by conducting a study on a composition for bone graft that can effectively capture vascular endothelial growth factors present in periodontal tissue.
본 발명의 일 목적은 혈관내피성장인자에 특이적으로 결합하는 압타머 및 고분자 혼합물을 포함하는 골 형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a composition for promoting bone formation comprising an aptamer and a polymer mixture that specifically binds to vascular endothelial growth factor.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은 혈관내피성장인자에 특이적으로 결합하는 압타머 및 고분자 혼합물을 포함하는 골 형성 촉진용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, an aspect of the present invention provides a composition for promoting bone formation comprising an aptamer and a polymer mixture that specifically binds to vascular endothelial growth factor.
본 명세서에서 사용된 용어, "골 형성 촉진"은 골감소로 인한 골다공증과 같은 질환의 치료 또는 예방, 및 골 조직 재생이 요구되는 부위에서의 골 형성(재생) 촉진을 모두 포함하는 개념이다.As used herein, the term "promoting bone formation" is a concept that includes both the treatment or prevention of diseases such as osteoporosis due to bone reduction, and the promotion of bone formation (regeneration) in areas where bone tissue regeneration is desired.
본 명세서에서 사용된 용어, "혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)"는 대식세포, 평활근세포 및 종양세포 등 여러 세포에서 생산되는 펩티드로서, 골 형성(osteogenesis)과 혈관 신생(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Leach JK, Kaigler D, Wang Z, Krebsbach PH, Mooney DJ. Biomaterials 2006;27:3249-3255).As used herein, the term "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)" is a peptide produced by various cells, such as macrophages, smooth muscle cells and tumor cells, which is called bone formation (angogenesis) and angiogenesis (angiogenesis). It is known to play an important role in (Leach JK, Kaigler D, Wang Z, Krebsbach PH, Mooney DJ.Biomaterials 2006;27:3249-3255).
본 명세서에서 사용된 용어, "압타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미한다. 저분자 유기물, 펩티드, 막단백질 등 다양한 표적분자에 결합할 수 있으며, 실온에서 보관 또는 운반이 불가능한 단백질 또는 항체 의약품과 달리 안정성이 매우 높은 장점이 있다.As used herein, the term "aptamer" (aptamer) is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure in itself and a characteristic capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity. Means It can bind to various target molecules such as low-molecular organics, peptides, and membrane proteins, and has a very high stability, unlike protein or antibody pharmaceuticals that cannot be stored or transported at room temperature.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 압타머는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the invention, the aptamer may be one comprising the sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고분자 혼합물은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite) 분말 및 이의 다공성 블록, 트리칼슘인산(인산삼칼슘, Ca3(PO4)2) 분말 및 이의 다공성 블록, 이산화 규소(실리카, silicon dioxide, SiO2) 및 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.According to one embodiment of the invention, the polymer mixture is hydroxyapatite (Hydroxyapatite) powder and its porous block, tricalcium phosphate (tricalcium phosphate, Ca 3 (PO 4 ) 2 ) powder and its porous block, silicon dioxide ( It may be selected from the group consisting of silica, silicon dioxide, SiO 2 ) and a mixture of silica and polymer, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고분자 혼합물은 가교제(링커, linker)에 의하여 압타머에 연결된 것일 수 있으며, 상기 가교제는 (3'-aminopropyl)triethoxysilane (APTES), succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate](SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the polymer mixture may be linked to an aptamer by a crosslinking agent (linker, linker), and the crosslinking agent is (3'-aminopropyl)triethoxysilane (APTES), succinimidyl-4-[N- maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate] (SMCC) and its sulfonate flame (sulfo-SMCC).
본 발명의 일 일 구체예에 따르면, 가교제로 고분자 혼합물과 압타머를 연결함으로써 이온 결합에 의한 연결보다 압타머와 고분자 혼합물을 더 강하고, 오랜 시간 동안 연결시킬 수 있다.According to one embodiment of the present invention, by connecting the polymer mixture and the aptamer with a crosslinking agent, the aptamer and the polymer mixture are stronger than the connection by ionic bonding and can be connected for a long time.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 골 형성 촉진용 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition for promoting bone formation of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 아니한다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.When the composition of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition, it includes a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like, but is not limited thereto. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and is preferably applied by a parenteral administration method.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000 ㎎/kg 범위 내이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are variously prescribed by factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity. Can be. The general dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is in the range of 0.001 to 1000 mg/kg on an adult basis.
본 발명의 일 실시예에 따른 골 형성 촉진용 조성물은 인공 지지체로서의 기능을 수행하고, 골모세포의 분화 및 혈관 신생을 증가시켜 골 재생을 촉진할 수 있다.The composition for promoting bone formation according to an embodiment of the present invention performs a function as an artificial support, and can promote bone regeneration by increasing differentiation and angiogenesis of osteoblasts.
도 1은 압타머가 연결된 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)가 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor)를 포획하는 과정을 개략적으로 보여준다.
도 2는 공유결합으로 하이드록시아파타이트와 압타머를 연결시키는 과정을 보여준다.
도 3은 하이드록시아파타이트(HA), APTES를 코팅한 하이드록시아파타이트 (HA-APTES) 및 Sulfo-SMCC와 반응시킨 HA-APTES(HA-APTES-Sulfo-SMCC)의 FT-IR(Fourier transform-infrared spectroscopy) 스펙트럼 분석 결과를 보여준다: 도 3의 A는 파상수(Wavenumber) 500 내지 4000 ㎝-1 범위에서 측정한 결과이고, 도 3의 B는 파상수 1300 내지 4000 ㎝-1 에서 측정한 결과이며, 도 3의 C는 파상수 500 내지 800 ㎝-1 에서 측정한 결과이고, 도 3의 (A), (B) 및 (C)는 HA, HA-APTES 및 HA-APTES-Sulfo-SMCC 입자의 형태를 보여주는 것이다.
도 4는 서로 다른 농도의 압타머와 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 명시야 이미지(bright field), 형광 이미지 및 이의 병합 이미지를 보여준다: 도 4의 A에서 (a) 내지 (f)는 명시야 이미지이고, (g) 내지 (l)은 형광 이미지이며, (m) 내지 (r)은 명시야 이미지와 형광 이미지를 병합한 것이다. 또한, (a), (g) 및 (m)은 대조군; (b), (h) 및 (n)은 압타머 10 pmole; (c), (i) 및 (o)는 압타머 20 pmole; (d), (j) 및 (p)는 압타머 50 pmole; (e), (k) 및 (q)는 압타머 100 pmole; 및 (f), (l) 및 (r)은 압타머 200 pmole을 이용한 결과이다. 도 4의 B는 (g) 내지 (ㅣ)의 형광 이미지 상 형광 세기를 Image J를 이용해 측정한 결과이다.
도 5는 형광표지가 부착된 압타머와 하이드록시아파타이트를 공유결합 또는 이온결합으로 연결시킨 후 세척 유무에 따른 형광신호의 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 첨가한 압타머의 농도에 따른 하이드록시아파타이트와 압타머의 공유결합 효율을 측정한 결과를 보여준다.
도 7은 표면을 서로 다른 물질로 코팅한 하이드록시아파타이트의 혈관내피성장인자 포획 능력을 측정한 결과를 보여준다.
도 8은 압타머를 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 세포 독성을 확인한 결과를 보여준다.
도 9는 압타머를 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 내피세포 생장 촉진 효과를 확인한 결과를 보여준다.1 schematically shows a process in which hydroxyapatite to which an aptamer is linked captures vascular endothelial growth factor.
2 shows a process of connecting hydroxyapatite and aptamer by covalent bond.
Figure 3 is FT-IR (Fourier transform-infrared) of hydroxyapatite (HA), hydroxyapatite coated with APTES (HA-APTES) and HA-APTES (HA-APTES-Sulfo-SMCC) reacted with Sulfo-SMCC spectroscopy) shows the results of spectral analysis: A in FIG. 3 is a result measured at a wavenumber of 500 to 4000 cm -1 , B in FIG. 3 is a result measured at a wave number of 1300 to 4000 cm -1 , C of FIG. 3 is a result measured at a wave number of 500 to 800 cm -1 , and (A), (B) and (C) of FIG. 3 are HA, HA-APTES and HA-APTES-Sulfo-SMCC particles Is to show
FIG. 4 shows bright field images of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) linked with different concentrations of aptamers, fluorescence images and combined images thereof: (a) to (a) in FIG. 4A f) is a bright field image, (g) to (l) are fluorescence images, and (m) to (r) are a combination of a bright field image and a fluorescence image. In addition, (a), (g) and (m) are control groups; (b), (h) and (n) are
Figure 5 shows the result of confirming the change in the fluorescence signal according to the presence or absence of washing after connecting the aptamer and hydroxyapatite to which the fluorescent label is attached by covalent or ionic bond.
Figure 6 shows the results of measuring the covalent binding efficiency of hydroxyapatite and aptamer according to the concentration of the added aptamer.
7 shows the results of measuring the ability of hydroxyapatite coated with different materials to capture vascular endothelial growth factors.
Figure 8 shows the results confirming the cytotoxicity of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) aptamer-linked.
Figure 9 shows the results confirming the effect of promoting the growth of endothelial cells of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) connected aptamer.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more specific examples will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate one or more embodiments by way of example, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor) 포획용 압타머(aptamer)가 연결된 1: aptamer for capturing vascular endothelial growth factor linked 하이드록시아파타이트Hydroxyapatite (( hydroxyapatitehydroxyapatite ) 제조) Produce
1-1. 혈관내피성장인자 포획용 1-1. For capturing vascular endothelial growth factors 압타머Aptamer 제작 making
혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF로 기재함)를 포획할 수 있는 압타머는 논문(ACS Anal. Chem., 2013, 85(2), pp1132-1137)에 기재된 서열을 참고하였다. 총 60개 뉴클레오티드 길이의 단일가닥 DNA(single strand DNA)를 바이오니아(Bioneer, Korea)에서 주문제작하였다. 이때 압타머의 3'에서 수산화(-OH)기를 티올(thiol)기로 치환시킨 것과 압타머의 5'에 FAM 형광 표지를 도입한 것을 별도로 제작하였다.For the aptamer capable of capturing vascular endothelial growth factor (hereinafter referred to as VEGF), the sequence described in the paper (ACS Anal. Chem., 2013, 85(2), pp1132-1137) was referred to. A single stranded DNA of 60 nucleotides in total was custom-made by Bioneer (Korea). At this time, 3'of the aptamer was substituted with a thiol group for a hydroxyl (-OH) group, and a separate FAM fluorescent label was introduced into the 5'of the aptamer.
서열번호 1: 5'-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACT GGGTGGGTACC-3'SEQ ID NO: 5'-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACT GGGTGGGTACC-3'
서열번호 1.1: 5'-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACT GGGTGGGTACC-C3-THIOL-3'SEQ ID NO: 1.1: 5'-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGACT GGGTGGGTACC-C3-THIOL-3'
서열번호 1.2: 5'-FAM-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGA CTGGGTGGGTACC-C3-THIOL-3'SEQ ID NO: 1.2: 5'-FAM-TGTGGGGGTGGACTGGGTGGGTACCTTTTTTTTTTTGTGGGGGTGGA CTGGGTGGGTACC-C3-THIOL-3'
1-2. 1-2. 하이드록시아파타이트Hydroxyapatite 표면에 On the surface APTESAPTES 코팅 coating
상기 실시예 1-1에서 제작한 압타머와 하이드록시아파타이트(hydroxy apatite, 이하 HA로 기재함; Purgo Biologics, The graftTM)를 하기와 같은 방법으로 연결하였다.The aptamer prepared in Example 1-1 and hydroxyapatite (hereinafter referred to as HA; Purgo Biologics, The graft TM ) were connected in the following manner.
HA 180 ㎎을 탈이온수(deionized water, 이하 DIW로 기재함)로 3회 세척하고, 에탄올 200 ㎖을 첨가한 후 99% 3'-aminopropyl triethoxysilane (이하, APTES로 기재함) 5 ㎖을 추가로 첨가하였다. DIW 1 ㎖을 첨가한 후 12시간 동안 오비탈 쉐이커에서 반응시켜 APTES의 알콕시실란(alkoxysilane) 가수분해에 의한 실라놀(silanol)기 형성을 촉진하였다. 반응이 종료한 후 상등액은 모두 버리고, DIW로 2회 세척하였다. 이후 남은 반응 잔여물을 제거하기 위해 99% 메탄올로 5회 세척하여 APTES로 코팅된 HA(이하, HA-APTES로 기재함)를 수득하였다. FT-IR(Fourier transform-infrared spectroscopy) 분광기로 HA 표면에 코팅된 APTES를 분석하였다.After washing 180 mg of HA three times with deionized water (hereinafter referred to as DIW), 200 ml of ethanol is added, and 5 ml of 99% 3'-aminopropyl triethoxysilane (hereinafter referred to as APTES) is additionally added. Did. After adding 1 ml of DIW, the mixture was reacted in an orbital shaker for 12 hours to promote the formation of a silanol group by hydrolysis of alkoxysilane of APTES. After the reaction was completed, all the supernatant was discarded and washed twice with DIW. Then, to remove the remaining reaction residue, washing was performed 5 times with 99% methanol to obtain HA coated with APTES (hereinafter referred to as HA-APTES). APTES coated on the HA surface was analyzed with a FT-IR (Fourier transform-infrared spectroscopy) spectroscopy.
1-3. 1-3. APTES가APTES 코팅된 Coated 하이드록시아파타이트에To hydroxyapatite 압타머Aptamer 결합 Combination
동결건조(lyophilized)된 상태의 압타머 파우더에 DIW를 첨가하여 10 pmole/㎕ 농도로 용해시켰다. 상기 압타머 용액을 1x TBS 버퍼로 1:10 (v/v)으로 희석하고, 95℃에서 5분 동안 열처리한 후 15분 동안 서서히 냉각시켜 VEGF를 포획할 수 있도록 압타머의 재접힘(refolding)을 유도하였다.DIW was added to the lyophilized aptamer powder to dissolve at a concentration of 10 pmole/µl. The aptamer solution was diluted 1:10 (v/v) with 1x TBS buffer, heat-treated at 95°C for 5 minutes, and then cooled slowly for 15 minutes to refold the aptamer to capture VEGF. Induced.
HA-APTES 10 ㎎에 1x PBS 버퍼 340 ㎕를 첨가하고, DIW에 용해시킨 Sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 60 ㎕(4.8 ㎎/㎖)를 첨가하여 총 부피 400 ㎕로 만든 후, 30분 동안 교반(stirring)하였다. 반응이 끝나면 상등액은 모두 버리고 1x PBS 버퍼로 3회 세척한 후, 입자 성분(particle)만 남긴 상태에서 1x TBS 버퍼를 첨가하였다. 이후 형광 표지자가 붙은 압타머를 각각 10, 20, 50, 100 및 200 pmole 농도로 첨가하고, 총 부피 400 ㎕가 되도록 1x TBS 버퍼를 첨가하여 30분 동안 반응시켰다. 반응이 종료한 후 HA-APTES 표면에 압타머가 연결(conjugation) 되었는지 형광현미경으로 확인하였다. 또한, FT-IR 분광기로 Sulfo-SMCC와 반응시킨 HA-APTES를 분석하였다. 이하에서는, 압타머가 연결된 HA-APTES는 HA-APTES-Aptamer로 기재한다.340 μl of 1x PBS buffer was added to 10 mg of HA-APTES, and 60 μl (4.8 mg/ml) of Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) dissolved in DIW was added to total volume After making 400 µl, it was stirred for 30 minutes. After the reaction was completed, all the supernatant was discarded, washed 3 times with 1x PBS buffer, and 1x TBS buffer was added while leaving only the particle components. Thereafter, aptamers with fluorescent markers were added at concentrations of 10, 20, 50, 100, and 200 pmole, respectively, and reacted for 30 minutes by adding 1x TBS buffer to a total volume of 400 µl. After the reaction was completed, it was confirmed by a fluorescence microscope that the aptamer was conjugated to the surface of HA-APTES. In addition, HA-APTES reacted with Sulfo-SMCC was analyzed with an FT-IR spectrometer. Hereinafter, HA-APTES to which the aptamer is linked is described as HA-APTES-Aptamer.
도 2는 APTES 및 Sulfo-SMCC를 이용하여 하이드록시아파타이트와 압타머를 공유결합으로 연결시키는 과정을 보여주는 것이다.Figure 2 shows the process of connecting a hydroxyapatite and an aptamer with a covalent bond using APTES and Sulfo-SMCC.
도 3은 하이드록시아파타이트(HA), APTES를 코팅한 하이드록시아파타이트 (HA-APTES) 및 Sulfo-SMCC와 반응시킨 HA-APTES(HA-APTES-Sulfo-SMCC)의 FT-IR 스펙트럼을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 3의 A는 파상수(Wavenumber) 500 내지 4000 ㎝-1 범위에서 측정한 결과이고, 도 3의 B는 파상수 1300 내지 4000 ㎝-1 에서 측정한 결과이며, 도 3의 C는 파상수 500 내지 800 ㎝-1 에서 측정한 결과이다. 도 3의 (A), (B) 및 (C)는 HA, HA-APTES 및 HA-APTES-Sulfo-SMCC 입자의 형태를 보여주는 것이다. HA에서 -OH기에 대한 피크(3300 ㎝- 1)가 HA-APTES에서는 3374 ㎝-1, 3200 ㎝-1의 아민기(-NH2)에 대한 피크로 변한 것을 확인할 수 있다. 또한, Sulfo-SMCC와 반응시킴으로써 생성되는 아마이드 결합에 대하여 531 ㎝-1의 피크를 확인하여 HA-APTES와 Sulfo-SMCC가 연결된 것을 확인할 수 있다.3 is a result of analyzing the FT-IR spectrum of hydroxyapatite (HA), hydroxyapatite coated with APTES (HA-APTES) and HA-APTES (HA-APTES-Sulfo-SMCC) reacted with Sulfo-SMCC It is a graph showing. A in FIG. 3 is a result measured in a wavenumber of 500 to 4000 cm -1 , B in FIG. 3 is a result measured in a wave number of 1300 to 4000 cm -1 , and C in FIG. 3 is a
도 4에서 A는 서로 다른 농도의 압타머와 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 명시야 이미지(bright field), 형광 이미지 및 이의 병합 이미지를 보여주는 것으로, 하이드록시아파타이트의 이미지와 압타머의 형광 이미지가 일치하는 것을 확인할 수 있다.In FIG. 4, A is a bright field image of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) linked with different concentrations of aptamer, a fluorescence image, and a combined image thereof, showing the image and the pressure of hydroxyapatite. It can be confirmed that the fluorescence images of the timers match.
도 4에서 B는 형광이미지 내의 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer) 표면에 연결된 압타머의 형광 세기를 측정한 결과이며, 표면에 연결된 압타머의 농도가 증가할수록 형광 세기 또한 증가하는 것을 확인할 수 있다.B in FIG. 4 is a result of measuring the fluorescence intensity of the aptamer connected to the surface of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) in the fluorescence image, and it can be seen that the fluorescence intensity also increases as the concentration of the aptamer connected to the surface increases. have.
실시예Example 2: 2: 압타머가Aptamer 결합된Combined HA(HA- HA(HA- APTESAPTES -- AptamerAptamer )의 특성 확인)
2-1. 2-1. 압타머의Aptamer 부착력 비교 Adhesion comparison
상기 실시예 1의 방법으로 HA와 연결시킨 압타머(HA-APTES-Aptamer)의 결합력과 종래의 이온결합 상호작용을 이용하여 부착시킨 압타머의 결합력을 비교하였다.The binding power of the aptamer (HA-APTES-Aptamer) linked with HA in the method of Example 1 was compared with the binding power of the aptamer attached using a conventional ion-binding interaction.
먼저, HA 30 ㎎ 또는 APTES와 Sulfo-SMCC를 코팅한 HA 30 ㎎을 각각 튜브에 분주한 후 1x TBS 버퍼 400 ㎕를 첨가하였다. 이후 FAM 형광 표지가 결합된 압타머(10 pmole/㎕) 6 ㎕를 각각 튜브에 첨가하여 45분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 입자의 형광세기를 측정하고, 1x TBS 버퍼로 3회 세척한 후 입자를 수거하여 거름종이가 부착된 깔대기에 놓아 두었다. 0.5 M EDTA 용액을 깔대기에 흘려 보내 입자를 세척하고, 입자를 다시 수거하여 형광 세기를 재측정하였다.First,
측정 결과, 이온결합으로 압타머를 연결시킨 HA는 0.5 M EDTA 용액으로 세척하는 경우 상등액의 형광이 증가하여 HA와 압타머의 결합이 약한 것을 알 수 있었다. 반면 HA-APTES-Aptamer는 0.5 M EDTA 용액으로 세척하더라도 HA와 비교하여 현저하게 강한 형광 세기를 나타내는 것을 확인하여 압타머와의 결합력이 강한 것을 확인할 수 있었다.As a result of the measurement, it was found that when the HA connected with the aptamer by ion bonding was washed with a 0.5 M EDTA solution, the fluorescence of the supernatant was increased and the binding between HA and the aptamer was weak. On the other hand, HA-APTES-Aptamer was confirmed to show a significantly stronger fluorescence intensity compared to HA even when washed with 0.5 M EDTA solution, thereby confirming that the binding force with aptamer was strong.
도 5는 형광표지가 부착된 압타머와 하이드록시아파타이트를 공유결합 또는 이온결합으로 연결시킨 후 세척 유무에 따른 형광신호의 변화를 확인한 결과를 보여준다. 도 5의 A는 FAM 형광 표지가 연결된 압타머를 HA 단독, 또는 APTES와 Sulfo-SMCC를 코팅한 HA(HA-APTES-Sulfo-SMCC)와 결합시킨 후 EDTA 용액 세척 유무에 따른 형광 세기를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 5의 B는 5-FAM 형광 표지자가 결합된 압타머의 몰수-형광 세기 표준 곡선(standard curve)을 보여준다.Figure 5 shows the result of confirming the change in the fluorescence signal according to the presence or absence of washing after connecting the aptamer and hydroxyapatite to which the fluorescent label is attached by covalent or ionic bond. 5A shows the fluorescence intensity according to the presence or absence of washing the EDTA solution after combining the aptamer linked to the FAM fluorescent label with HA alone or HA coated with APTES and Sulfo-SMCC (HA-APTES-Sulfo-SMCC). It is a graph showing the results. 5B shows the mole number-fluorescence intensity standard curve of the aptamer bound to the 5-FAM fluorescent marker.
2-2. HA-2-2. HA- APTESAPTES -- SulfoSulfo -- SMCC와SMCC and 압타머의Aptamer 결합 비율 Coupling rate
HA-APTES-Sulfo-SMCC 10 ㎎을 정량하여 10, 25, 50, 100 및 200 pmole 농도의 압타머와 각각 반응시킨 후, 상등액(supernatant)을 분리하여 형광 세기를 측정하였다. 상기 측정한 형광 세기를 형광 표지자가 결합된 압타머 자체의 몰수-형광 세기 표준 곡선에 대입하여 첨가한 압타머의 몰수 대비 결합하지 않은 압타머의 몰수를 산출하였다. HA-APTES-Sulfo-SMCC와 결합한 압타머의 몰수는 하기 수학식 1에 따라 산출하였다.HA-APTES-Sulfo-
그 결과, 25 pmole 이하 농도의 압타머를 이용한 경우에는 결합 효율이 떨어지고, 25 내지 100 pmole 농도의 압타머를 이용하였을 때 HA-APTES-Sulfo-SMCC와의 결합 효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that when an aptamer having a concentration of 25 pmole or less was used, the binding efficiency was poor, and when using an aptamer having a concentration of 25 to 100 pmole, the binding efficiency with HA-APTES-Sulfo-SMCC was the best.
도 6에서 A는 첨가한 압타머의 농도에 따른 HA-APTES-Sulfo-SMCC와의 결합 효율을 측정한 결과를 보여주는 그래프이고, B는 5-FAM 형광 표지자가 결합된 압타머의 농도-형광 세기 표준 곡선을 의미한다.In Figure 6 A is a graph showing the results of measuring the binding efficiency with HA-APTES-Sulfo-SMCC according to the concentration of the added aptamer, B is the concentration of the 5-FAM fluorescent marker aptamer-fluorescence intensity standard It means curve.
2-3. 2-3. 압타머가Aptamer 결합된Combined HA(HA- HA(HA- APTESAPTES -- AptamerAptamer )의 )of VEGFVEGF 포획 능력 Capture ability
서로 다른 결합분자가 연결된 HA에 대하여 VEGF 포획 능력을 측정하였다.The VEGF capture ability was measured for HA to which different binding molecules were linked.
튜브에 형광(Alexa Fluor 594)이 표지된 VEGF 단백질을 첨가(10 및 60 pg/㎖)하고, 여기에 HA-APTES-Aptamer(HA-APTES-Sulfo-SMCC 10 mg + 압타머 25 pmole; HA-APTES-Aptamer+BSA), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA로 기재함)으로 표면을 코팅한 HA (HA+BSA), 및 VEGF 단일클론항체를 표면에 부착한 HA(mAB-HA+BSA)를 각각 첨가하여 2시간 30분 동안 반응시켰다. HA는 이온결합에 의하여 VEGF를 포획할 수 있으므로 이온결합에 의한 VEGF 포획을 배제하기 위하여 HA, HA-APTES-Aptamer 및 HA-mAb는 BSA로 표면을 코팅하였다. 반응이 종료된 후 상등액을 분리하여 형광 세기를 측정하고, 형광이 라벨링된 VEGF에 대한 질량-형광 세기 표준 곡선에 대입하여 상등액에 남아있는 VEGF의 양을 산출하였다. HA-Aptamer, HA 단독, HA-BSA 및 HA-mAb와 결합한 VEGF의 양은 전체 VEGF의 양과 상등액에 남아있는 VEGF 양의 차이로 계산하였다.Fluorescent (Alexa Fluor 594) labeled VEGF protein was added (10 and 60 pg/ml) to the tube, and HA-APTES-Aptamer (HA-APTES-Sulfo-
그 결과, HA-APTES-Aptamer는 HA+BSA와 비교하여 인체 내 정상 조건에서 혈류에 존재하는 평균 VEGF 농도인 10 pg/㎖에서는 유의미한 포획능력을 확인할 수 없었으나, 인체 내에서 상처가 발생할 경우 상처 주변 조직에서 측정되는 평균 VEGF 농도인 60 pg/㎖ 조건에서 첨가한 VEGF에 대한 포획능력은 HA-APTES-Aptamer가 HA+BSA와 비교하여 높은 수준의 포획능력을 보이는 것을 확인할 수 있었다.As a result, HA-APTES-Aptamer was not able to confirm a significant capture ability at 10 pg/ml, which is the average VEGF concentration present in the bloodstream under normal conditions in the human body, compared to HA+BSA. It was confirmed that HA-APTES-Aptamer exhibits a higher level of capture ability compared to HA+BSA in the capture ability for VEGF added under the condition of 60 pg/ml, which is the average VEGF concentration measured in surrounding tissue.
도 7에서 A는 표면을 서로 다른 물질로 코팅한 하이드록시아파타이트의 혈관내피성장인자 포획 능력을 측정한 결과를 보여주는 그래프이며, B는 형광(Alexa Fluor 594)이 표지된된 VEGF 단백질의 농도-형광 세기 표준 곡선이다.In Figure 7 A is a graph showing the results of measuring the ability to capture vascular endothelial growth factor of hydroxyapatite coated with different materials, and B is the concentration-fluorescence of VEGF protein labeled with fluorescence (Alexa Fluor 594). It is a century standard curve.
실시예Example 3: 3: 압타머가Aptamer 결합된Combined HA(HA- HA(HA- APTESAPTES -- AptamerAptamer )의 세포 생장 촉진 효과) Cell growth promoting effect
3-1. HA-3-1. HA- APTESAPTES -- Aptamer의Aptamer's 세포 독성 확인 Cytotoxicity check
국제표준화기구 ISO 10993-12 조항에 따라 HA-APTES-Aptamer의 세포 독성 여부를 실험하였다.The cytotoxicity of HA-APTES-Aptamer was tested according to the provisions of ISO 10993-12.
HA 또는 HA-APTES-Aptamer 60 ㎎을 인간 조골세포 기본 배지(human osteoblast basal medium; Sigma-Aldrich) 400 ㎕에 첨가하고, 37℃ 가습 배양기(humid incubator)에서 72시간 동안 용출을 수행하였다. 이후, 용출액을 0.2 ㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 침출액(leaching extract)을 수득하였다.60 mg of HA or HA-APTES-Aptamer was added to 400 μl of human osteoblast basal medium (Sigma-Aldrich), and elution was performed in a humidified incubator at 37° C. for 72 hours. Thereafter, the eluate was filtered with a 0.2 μm syringe filter to obtain a leaching extract.
96-웰 플레이트에 인간 조골세포를 4x104 세포/웰 농도로 접종하여 24시간 동안 배양하고, 상등액을 버린 후 1x HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 2번 세척하였다. 상기 침출액을 인간 조골세포 기본배지로 희석(100%, 75%, 50% 및 25%)하여 100 ㎕씩 웰에 첨가하고, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 1x HBSS로 세포를 2번 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 CCK-8(cell counting kit-8; Dojindo, 일본) 실험을 진행하였다.Human osteoblasts were inoculated in a 96-well plate at a concentration of 4x10 4 cells/well for 24 hours, the supernatant was discarded, and washed twice with 1x HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). The leachate was diluted with human osteoblast basic medium (100%, 75%, 50% and 25%) and added to the wells in 100 µl increments and further cultured for 24 hours. After that, the cells were washed twice with 1x HBSS, and CCK-8 (cell counting kit-8; Dojindo, Japan) experiment was performed according to the manufacturer's protocol.
실험 결과, 100% 침출액에 대한 인간 조골세포의 생존율은 평균 70.8%이고, 50% 침출액에 대한 세포 생존율은 평균 85%로 나타나 100% 침출액에 대한 생존율보다 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 ISO 10993-12 조항에 근거할 때 HA-APTES-Aptamer는 잠재적인 세포 독성을 보이지 않음을 확인할 수 있다.As a result of the experiment, the survival rate of human osteoblasts to 100% leachate was 70.8% on average, and the cell survival rate to 50% leachate was 85% on average, indicating that the survival rate was higher than that of 100% leachate. Therefore, it can be confirmed that HA-APTES-Aptamer shows no potential cytotoxicity based on the provisions of ISO 10993-12.
도 8은 압타머를 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 세포 독성을 평가한 결과를 보여주는 것이다. Negative는 음성 대조군으로 침출액을 무처리한 상태를 의미하며 Positive는 양성대조군으로 세포에 DMSO 50%를 처리한 조건이다.Figure 8 shows the results of evaluating the cytotoxicity of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) linked aptamer. Negative is a negative control, which means that the leachate is not treated, and Positive is a positive control that is treated with 50% DMSO in cells.
3-2. HA-3-2. HA- APTESAPTES -- Aptamer의Aptamer's 세포 생장 촉진 효과 Cell growth promoting effect
HA-APTES-Aptamer의 세포 생장 촉진 효과를 하기와 같이 실험하였다.The effect of promoting cell growth of HA-APTES-Aptamer was tested as follows.
96-웰 플레이트에 HA 또는 HA-APTES-Aptamer를 각각 15 ㎎씩 채우고, 인간 제대정맥 내피세포(Human Umbilical Vascular Endothelial Cell, HUVEC)를 4x104 세포/웰 농도로 접종하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후 상등액은 버리고, 1x DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 3번 세척하였다. 이후, 20 ng/㎖ 농도의 rhVEGF(recombinant human vascular endothelial growth factor)를 포함하는 내피세포 기본 배지(endothelial basal medium; Sigma-Aldrich) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 상등액을 제거하고, 새로운 내피세포 기본 배지를 첨가하여 제조사의 프로토콜에 따라 CCK-8(cell counting kit-8; Dojindo, 일본) 실험을 진행하였다.A 96-well plate was filled with 15 mg each of HA or HA-APTES-Aptamer, and human Umbilical Vascular Endothelial Cell (HUVEC) was inoculated at a concentration of 4x10 4 cells/well. After incubating the cells for 24 hours, the supernatant was discarded and washed 3 times with 1x DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline). Thereafter, 100 µl of endothelial basal medium (Sigma-Aldrich) containing 20 ng/ml concentration of rhVEGF (recombinant human vascular endothelial growth factor) was added to each well and reacted for 3 hours. After the reaction was completed, the supernatant was removed, and a new endothelial cell base medium was added to perform a CCK-8 (cell counting kit-8; Dojindo, Japan) experiment according to the manufacturer's protocol.
실험 결과, HA를 이용한 대조군의 경우 rhVEGF 처리에 의하여 HUVEC이 성장하지 않았으나, HA-APTES-Aptamer를 이용한 경우 rhVEGF 처리에 의하여 HUVEC이 유의미한 수준으로 생장한 것을 확인할 수 있었다. 이는 HA-Aptamer에 의하여 VEGF가 포획되어 HUVEC의 생장이 촉진된 것을 의미한다.As a result of the experiment, it was confirmed that in the control group using HA, HUVEC did not grow by rhVEGF treatment, but when using HA-APTES-Aptamer, HUVEC growth was significantly increased by rhVEGF treatment. This means that VEGF was captured by HA-Aptamer and HUVEC growth was promoted.
도 9는 압타머를 연결시킨 하이드록시아파타이트(HA-APTES-Aptamer)의 내피세포 생장 촉진 효과를 확인한 결과를 보여주는 것으로, ns(not significant)는 실험 결과에 유의미한 변화가 없음을 의미한다.Figure 9 shows the results confirming the endothelial cell growth promoting effect of hydroxyapatite (HA-APTES-Aptamer) linked aptamer, ns (not significant) means that there is no significant change in the experimental results.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been focused on the preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in terms of explanation, not limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent range should be interpreted as being included in the present invention.
<110> CHUNGANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Enhancing Osteogenesis <130> PN160319 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 1 tgtgggggtg gactgggtgg gtaccttttt ttttttgtgg gggtggactg ggtgggtacc 60 60 <110> CHUNGANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Enhancing Osteogenesis <130> PN160319 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 1 tgtgggggtg gactgggtgg gtaccttttt ttttttgtgg gggtggactg ggtgggtacc 60 60
Claims (5)
(3'-aminopropyl)triethoxysilane (APTES);
succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate]의 설폰화염(sulfo-SMCC); 및
하이드록시아파타이트를 포함하고,
상기 APTES는 상기 하이드록시아파타이트에 공유결합된 것이고,
상기 sulfo-SMCC는 상기 APETS에 공유결합된 것이고,
상기 압타머는 상기 sulfo-SMCC에 공유결합된 것인
골 형성 촉진용 조성물.
An aptamer that specifically binds to vascular endothelial growth factor;
(3'-aminopropyl)triethoxysilane (APTES);
a sulfonated salt of succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate] (sulfo-SMCC); And
Hydroxyapatite,
The APTES is a covalent bond to the hydroxyapatite,
The sulfo-SMCC is covalently bound to the APETS,
The aptamer is covalently bonded to the sulfo-SMCC
Composition for promoting bone formation.
The composition for promoting bone formation according to claim 1, wherein the aptamer comprises the sequence of SEQ ID NO: 1.
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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|---|---|---|---|---|
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2018
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Nonaka, Y. et al, Analystical Chemistry(2013) Vol.85, pp.1132-1137. 1부.* |
| 국내등록특허공보 제10-0739528호(2007.7.13.자 공고) 1부.* |
| 손재우 및 최종훈, 화학공학의 이론과 응용(2017) 제23권, 제1호, 431쪽. 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20190090658A (en) | 2019-08-02 |
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