KR102123268B1 - Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Exosomes and Increasing Stemness comprising Hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 히알루론산을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 및 줄기세포능 증가용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting stem cell-derived exosome production including hyaluronic acid and increasing stem cell function.
미세소포체(Extracellular Vesicles)는 마이크로베지클(Microvesicles), 엑소좀(Exosome) 등을 포함하는 30~1000 nm 크기의 구형 지질이중층(lipid-bilayer)으로 구성된 소포체(vesicle)이다.Microcellular vesicles (Extracellular Vesicles) is a vesicle consisting of a spherical lipid bilayer (lipid-bilayer) of 30 ~ 1000 nm size, including microvesicles (Exosome).
엑소좀의 지질이중층은 기원 세포(공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등의 기능적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. The lipid bilayer of exosomes is composed of a phospholipid bilayer structure, such as a cell of origin (donor cell), and is a component of a substance secreted by cells outside the cell, which performs a functional role such as cell-cell communication and cellular immune intervention. It is known.
엑소좀은 기원 세포(공여세포) 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등을 포함한다. Exosomes contain cell-specific components that reflect the unique biological function of the originating cell (donor cell), and include phospholipids, mRNA, miRNA, and various water-soluble proteins, exogenous proteins, and transmembrane protein components.
이러한 엑소좀은 비만세포, 림프구, 성상세포, 혈소판, 신경세포, 내피세포, 상피세포 등 모든 동물 세포에서 배출되며 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌척수액 등의 다양한 체액에서 발견된다. 엑소좀은 뇌혈관 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)도 통과할 수 있으며, 표피 세포와 내피세포의 세포막 투과가 가능할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노캐리어(nanocarrier)인 DDS(drug delivery system) 개발에도 활용되고 있다.These exosomes are discharged from all animal cells such as mast cells, lymphocytes, astrocytes, platelets, nerve cells, endothelial cells and epithelial cells, and are found in various body fluids such as blood, urine, mucus, saliva, bile fluid, ascites fluid, and cerebrospinal fluid. do. Exosomes can also cross the blood-brain barrier (BBB), and the selective delivery is high enough to allow epidermal and endothelial cell membranes to penetrate, and the drug delivery system (DDS), a nanocarrier for specific drugs It is also used in development.
중간엽 줄기세포에서 분비하는 엑소좀 및 마이크로베지클(microvesicle)은 세포-세포간 커뮤니케이션(cell-to-cell communication)에 관여하며 줄기세포가 가지는 재생의학적인 치료 효능을 보인다고 알려져 있다.It is known that exosomes and microvesicles secreted from mesenchymal stem cells are involved in cell-to-cell communication and show the regenerative therapeutic efficacy of stem cells.
줄기세포를 체내에 이식한 후에 장기간의 생존 없이 세포에서 분비되는 파라크린 인자(paracrine factors)에 트로픽 효과(trophic effect)를 가져오는 것이 알려져 있고, 이러한 인자에는 성장인자(growth factor), 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine) 등과 같은 저분자가 엑소좀과 같은 세포외 소포체(extracellular vesicle)에 의하여 분비되며, 이러한 엑소좀은 줄기세포에서 유래한다. 따라서 엑소좀은 줄기세포의 특성을 규명하고 이의 치료적 효능을 평가하는데 활용되고 있다.After transplanting stem cells into the body, it is known to have a trophic effect on paracrine factors secreted from cells without long-term survival, and these factors include growth factors and chemokines. ), small molecules such as cytokines, etc. are secreted by extracellular vesicles such as exosomes, and these exosomes are derived from stem cells. Therefore, exosomes have been used to characterize stem cells and evaluate their therapeutic efficacy.
최근에는 중간엽 줄기세포 자체를 사용하지 않고 중간엽 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 학계 및 산업계에서는 이를 통해 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 대안이 될 수 있을 것으로 예상한다.Recently, research on the therapeutic effect of various diseases has been actively conducted using exosomes secreted by mesenchymal stem cells without using the mesenchymal stem cells themselves, and academia and industry have limited the limitations of existing stem cell treatment methods. It is expected to be a new alternative to overcome the problem.
이러한 엑소좀을 상업적으로 이용하기 위해서는 다량의, 그리고 양질의 엑소좀이 필요하다. 그러나 현재 줄기세포로부터 얻을 수 있는 엑소좀의 양은 매우 소량에 불과하고, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량을 증가시킬 수 있는 물질에 대한 개발도 아직까지 미비한 실정이다.In order to commercially use these exosomes, a large amount of high-quality exosomes are required. However, at present, the amount of exosomes that can be obtained from stem cells is very small, and the development of substances capable of increasing the production of stem cell-derived exosomes is still incomplete.
한편, 중간엽 줄기세포는 배양 기간이 길어지는 동시에, 여러 번의 계대배양을 거치면서 증식능력과 다양한 계통으로의 분화능력이 감소되는 것으로 알려져 있다. 또한, 초기 계대(passage)의 중간엽 줄기세포에 비해, 후기 계대의 중간엽 줄기세포에서 콜로니 형성 능력이 현저히 감소되는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포의 노화는 골수 공여자의 나이보다는 오랜 배양기간 동안의 약화된 증식능력과 관련이 있으며, 텔로머라아제 활성(telomerase activity)의 감소와도 연관이 있는 것으로 보인다.On the other hand, it is known that the mesenchymal stem cells are prolonged in culture, and at the same time, through multiple passages, the proliferation ability and the ability to differentiate into various lines are reduced. In addition, it is known that the colony-forming ability is significantly reduced in the mesenchymal stem cells of the late passage, compared to the mesenchymal stem cells of the early passage. Aging of mesenchymal stem cells seems to be associated with a weakened proliferative capacity over a long incubation period rather than the age of a bone marrow donor, and may also be associated with a decrease in telomerase activity.
이렇듯, 현재 사람에서 얻을 수 있는 중간엽 줄기세포의 양은 제한되어 있으며, 이렇게 얻은 세포를 특정 계통으로의 분화 유도를 위해선 계대배양에 따른 분화능력의 감소와 같은 문제점들이 따라올 수밖에 없다. 이러한 단점들은 정확한 타겟 세포로의 분화 유도와 그를 위해 적절한 줄기세포를 대량으로 확보해야 하는 임상적용에 있어서는 비현실적이다. 따라서, 오랜 기간 동안 증식률을 유지하고 여러 계통으로의 분화능력을 유지할 수 있는 방법의 필요성이 대두되고 있다.As such, the amount of mesenchymal stem cells that can be obtained from a human being is currently limited, and problems such as a decrease in differentiation ability according to passage are inevitable to induce differentiation of the obtained cells into a specific lineage. These shortcomings are unrealistic for the induction of differentiation into target cells and the clinical application in which large amounts of suitable stem cells are required for them. Therefore, there is a need for a method capable of maintaining the proliferation rate for a long period of time and maintaining the ability to differentiate into various strains.
이에 따라, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진할 뿐만 아니라, 오랜 기간 동안 줄기세포의 증식률 및 분화능력을 유지할 수 있는 신규한 방법 및 물질 개발에 대한 필요성이 제기되었다.Accordingly, there is a need to develop novel methods and materials that not only promote the production of stem cell-derived exosomes, but also maintain the proliferation rate and differentiation ability of stem cells for a long period of time.
본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진할 뿐만 아니라, 오랜 기간 동안 줄기세포의 증식률 및 분화능력을 유지할 수 있는 방법 및 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 히알루론산(Hyaluronic acid)을 줄기세포에 전처리하는 경우 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 및 증식능(Proliferation)이 증가할 뿐만 아니라, 줄기세포 유래 엑소좀의 수, 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량이 크게 증가하는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors tried to develop a method and a material that can not only promote the production of stem cell-derived exosomes, but also maintain the proliferation rate and differentiation ability of stem cells for a long period of time. As a result, when the hyaluronic acid is pretreated to stem cells, the stem cell's stem cell performance and proliferation are increased, as well as the number of stem cell-derived exosomes, proteins and RNA in exosomes. By clarifying that the content of is greatly increased, the present invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for promoting stem cell-derived exosome production including hyaluronic acid.
본 발명의 다른 목적은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 증가용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for increasing stem cell capability (Stemness) of stem cells containing hyaluronic acid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 또는 줄기세포의 줄기세포능 증가용 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a stem cell therapeutic agent comprising a composition for promoting stem cell-derived exosome production or increasing stem cell function of stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산(Hyaluronic acid)으로 전처리된, 줄기세포 유래 엑소좀을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a stem cell-derived exosome pretreated with hyaluronic acid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a stem cell therapeutic agent comprising the stem cell-derived exosome.
본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 세포배양 배지에 줄기세포를 배양하는 전처리 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing stem cell-derived exosomes comprising a pretreatment step of culturing stem cells in a cell culture medium containing hyaluronic acid.
본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 세포배양 배지에 줄기세포를 배양하는 전처리 단계를 포함하는 줄기세포의 줄기세포능(Stemness)을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of increasing stem cell capability (Stemness) of stem cells comprising a pretreatment step of culturing stem cells in a cell culture medium containing hyaluronic acid.
본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀의 생산을 촉진할 뿐만 아니라, 오랜 기간 동안 줄기세포의 증식률 및 분화능력을 유지할 수 있는 방법 및 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 히알루론산(Hyaluronic acid)을 줄기세포에 전처리하는 경우 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 및 증식능(Proliferation)이 증가할 뿐만 아니라, 줄기세포 유래 엑소좀의 수, 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량이 크게 증가하는 것을 규명하였다.The present inventors tried to develop a method and a material that can not only promote the production of stem cell-derived exosomes, but also maintain the proliferation rate and differentiation ability of stem cells for a long period of time. As a result, when the hyaluronic acid is pretreated to stem cells, the stem cell's stem cell performance and proliferation are increased, as well as the number of stem cell-derived exosomes, proteins and RNA in exosomes. It was found that the content of was greatly increased.
본 발명은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 또는 줄기세포의 줄기세포능 증가용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 줄기세포 치료제, 히알루론산으로 전처리된 줄기세포 유래 엑소좀, 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 줄기세포 치료제, 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법 및 줄기세포의 줄기세포능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.The present invention promotes the production of stem cell-derived exosomes containing hyaluronic acid (Hyaluronic acid) or a composition for increasing stem cell function of stem cells, a stem cell therapeutic agent comprising the composition, stem cell-derived exosomes pretreated with hyaluronic acid, The present invention relates to a stem cell therapeutic agent comprising the stem cell-derived exosome, a method for producing stem cell-derived exosome, and a method for increasing stem cell ability of the stem cell.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a composition for promoting stem cell-derived exosome production including hyaluronic acid.
본 발명의 히알루론산(Hyaluronic acid)은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 및 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)의 이당류 단위체들이 ß(1→4) 개체 내 글리코시드 결합(inter glycosidic linkage)에 의해 연결된 천연 선형 다당류이다. 히알루론산은 진피를 구성하는 성분 중 하나로 알려져 있으며, 생체 적합성과 생분해성이 우수하고 체내에서 면역 거부 반응 및 독성이 없는 우수한 생체 재료로 알려져 있다. 또한, 히알루론산은 고점도와 고탄성의 천연 글리코스아미노글리칸 거대분자로 다양한 기능과 물리화학적인 성질을 가지고 있어 관절염 치료, 안과수술, 필러, 상처치료, 약물전달체, 유착방지제, 조직공학 및 화장품 등의 용도로서 임상적으로 사용되어 왔다.The hyaluronic acid of the present invention is a disaccharide unit of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine in ß(1→4) individuals It is a natural linear polysaccharide linked by an glycosidic linkage. Hyaluronic acid is known as one of the components constituting the dermis, and is known as an excellent biomaterial with excellent biocompatibility and biodegradability and no immune rejection and toxicity in the body. In addition, hyaluronic acid is a high-viscosity and highly elastic natural glycosaminoglycan macromolecule that has various functions and physicochemical properties, such as arthritis treatment, ophthalmic surgery, filler, wound treatment, drug delivery system, anti-adhesion agent, tissue engineering, and cosmetics. It has been used clinically as a use.
본 발명에 따른 상기 조성물은 상술한 성분 이외에 공지된 엑소좀 생성 촉진 물질을 더 포함할 수 있다.The composition according to the present invention may further include a known exosome production promoting material in addition to the above-described components.
본 명세서에서 "엑소좀(Exosome)"은 세포 유래성 소포체로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재한다. 엑소좀의 직경은 30-100nm 정도이며, 이는 LDL 단백질보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작다.As used herein, "Exosome" is a cell-derived endoplasmic reticulum that is present in the body fluid of almost all eukaryotic organisms. The diameter of the exosomes is about 30-100 nm, which is larger than the LDL protein, but much smaller than the red blood cells.
상기 엑소좀은 다중소포체(multivesicular bodies)가 세포막과 융합될 때 세포로부터 방출되거나, 세포막으로부터 곧바로 방출될 수 있다.The exosomes can be released from the cell when the multivesicular bodies are fused with the cell membrane, or directly from the cell membrane.
이러한 엑소좀이 응고, 세포간 신호전달 등과 같은 중요하면서도 특화된 기능을 수행한다는 점은 잘 알려져 있다.It is well known that these exosomes perform important and specialized functions such as coagulation and intercellular signaling.
본 명세서에서 "줄기세포(Stem cell)"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다."Stem cell" as used herein refers to a cell that has the ability to self-replicate and differentiates into two or more different types of cells as undifferentiated cells.
상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.The stem cells may be autologous or allogeneic stem cells, and may be from any type of animal, including human and non-human mammals, and the stem cells are not limited to those derived from adults or embryos.
구체적으로, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the stem cells may be embryonic stem cells, adult stem cells or induced pluripotent stem cells, but are not limited thereto.
본 명세서에서 "배아 줄기세포(embryonic stem cell)"는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 의미한다.As used herein, "embryonic stem cell" is a cell extracted during embryonic development, and extracts an inner cell mass from a blastocyst embryo just before the fertilized egg implants into the mother's uterus and cultured in vitro. Means
상기 배아 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생능(selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다.The embryonic stem cells refer to cells having pluripotent or totipotent self-renewal capable of differentiating into cells of all tissues of an individual, and have a broad meaning Furnace also includes embryoid bodies derived from embryonic stem cells.
상기 배아 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The embryonic stem cells may include, but are not limited to, human, monkey, pig, horse, cow, sheep, dog, cat, mouse, rabbit, and all other derived embryonic stem cells.
본 명세서에서 "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다.As used herein, "adult stem cell" refers to a cell that is extracted from umbilical cord blood, bone marrow of mature adults, blood, etc., and immediately before being differentiated into cells of a specific organ, and is developed into tissues in the body when necessary. Refers to cells in an undifferentiated state that possess the ability to.
상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell), 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The adult stem cells are adult stem cells of various tissue origins from humans or animals, mesenchymal stromal cells derived from human or animal tissues, and mesenchymal stems derived from induced pluripotent stem cells of various tissue origins from humans or animals. Cells and multipotent stem cells, but is not limited thereto.
상기 인간 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및/또는 태반일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The human or animal tissue may be umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, and/or placenta, but is not limited thereto.
상기 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포는 예를 들어, 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및/또는 정소 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The stem cells of various tissue origins of the human or animal may be, for example, hematopoietic stem cells, mammary stem cells, intestinal stem cells, vascular endothelial stem cells, neural stem cells, olfactory nerve stem cells and/or testicular stem cells, It is not limited thereto.
본 명세서에서 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다."Induced pluripotent stem cell (iPSC)" as used herein refers to cells induced to have pluripotent differentiation ability through artificial dedifferentiation processes from differentiated cells, and is identical to "reverse differentiated stem cell". Can be used as a meaning.
상기 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다.The artificial dedifferentiation process is carried out by introduction of a non-viral-mediated dedifferentiation factor using a virus-mediated or non-viral vector using retrovirus, lentivirus and sendivirus, protein and cell extract, or stem cell extract , It may include a process of reverse differentiation by a compound or the like.
상기 유도만능줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지며, 구체적으로는, 유사한 세포 모양을 가지고, 유전자, 단백질 발현이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마(teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. The induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically, have a similar cell shape, have similar gene and protein expression, have starch ability in vitro and in vivo , and have teratoma. It forms, and when inserted into the blastocyst of mice, it forms chimera mice, and germline transmission of genes is possible.
상기 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The induced pluripotent stem cells may include human, monkey, pig, horse, cow, sheep, dog, cat, mouse, rabbit, and all other derived pluripotent stem cells, but are not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "생성 촉진"이란 대조군에 비하여 특정물질의 생산, 생성, 방출 등이 동일한 시간 내에서 증가되는 것을 의미한다.The term "promotion of production" in the present specification means that the production, production, release, etc. of a specific substance is increased within the same time as compared to the control group.
구체적으로는, 줄기세포로부터 엑소좀이 생산되는 수량과, 엑소좀 내 단백질, RNA 등의 함량이 증가되는 것을 의미한다.Specifically, it means that the quantity of exosomes produced from stem cells and the content of protein, RNA, etc. in the exosomes are increased.
본 발명의 다른 일 양태는 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 증가용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a composition for increasing stem cell function (Stemness) of stem cells containing hyaluronic acid.
본 명세서에서 용어 "줄기세포능"이란 모든 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 만능성(pluripotency) 및 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들어 낼 수 있는 자기재생능(self-renewal)을 총칭하는 의미로 당업계에서 통용된다.As used herein, the term "stem cell function" refers to a pluripotency capable of producing all cells and a self-renewal capable of infinitely generating cells resembling self. It is used in the industry.
구체적으로는, 미분화 세포를 미분화 상태를 유지하면서 줄기세포의 증식능(Proliferation)을 증가시키거나, 텔로머라제 활성을 증가시키거나, 줄기세포성 인자(stemness acting signals)의 발현을 증가시키거나 세포 이동 활성을 증가시키는 것을 말하며, 이들 특징 중 하나 이상이 나타나는 것을 포함할 수 있다.Specifically, while maintaining an undifferentiated cell, the proliferation capacity of the stem cell is increased, the telomerase activity is increased, the expression of stem acting signals is increased, or cell migration is performed. Refers to an increase in activity, and may include the appearance of one or more of these characteristics.
본 발명의 상기 각 조성물은 배지조성물로서 줄기세포 배양에 사용될 수 있고, 생체 내(in vivo) 엑소좀 생성 촉진용도의 약제학적 조성물로서 줄기세포와 함께 생체 내로 병행 투여되거나, 선행 또는 후행적으로 투여되어 줄기세포의 in vivo 효능을 강화할 수 있다.Each of the compositions of the present invention may be used for culturing stem cells as a medium composition, and as a pharmaceutical composition for promoting exosome production in vivo , administered in parallel with stem cells in vivo, or prior or subsequent administration It can enhance the efficacy of stem cells in vivo .
상기 줄기세포의 in vivo 효능 강화란, 관절염이나 신경병증 등 특정 질환에 대한 치료목적(in vivo 효능)을 가진 줄기세포의 효능이 줄기세포가 방출하는 엑소좀에 의해 매개됨을 전제로, 본 발명의 상기 조성물을 줄기세포 투여와 함께 투여시 줄기세포로부터 엑소좀의 생성이 촉진되는 결과 줄기세포의 질환 치료 효과(in vivo 효능)를 강화시키는 용도를 의미한다.Enhancing the in vivo efficacy of the stem cells is based on the premise that the efficacy of stem cells with a therapeutic purpose ( in vivo efficacy) for certain diseases such as arthritis or neuropathy is mediated by exosomes released by the stem cells. When the composition is administered together with the administration of stem cells, it means the use of enhancing the effect of stem cell disease treatment ( in vivo efficacy) as a result of promoting the production of exosomes from stem cells.
본 발명의 상기 각 조성물이 배지조성물인 경우, 상기 "배지조성물"은 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 생존 및 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, E8(Essential 8 Medium) 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.When each of the compositions of the present invention is a medium composition, the "medium composition" refers to a composition containing essential components necessary for cell growth, survival, and proliferation in vitro . Contains all of the medium used for stem cell culture, for example Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) : Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Commercially prepared media such as Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, and Essential 8 Medium (E8) or artificially synthesized media may be used, but is not limited thereto.
상기 배지조성물은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.The medium composition generally includes a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component, and may further include an amino acid, an antibiotic, and the like.
또한, 상기 배지조성물은 본 발명의 구성성분[히알루론산(Hyaluronic acid)]을 종래의 줄기세포 배양용 배지 내에 첨가하여 제조될 수 있다.In addition, the medium composition may be prepared by adding the components (Hyaluronic acid) of the present invention into a conventional culture medium for stem cells.
상기 본 발명의 구성성분[히알루론산(Hyaluronic acid)]은 배지 내에 1~1000ug/mL, 1~500ug/mL, 1~100ug/mL, 1~90ug/mL, 1~80ug/mL, 1~70ug/mL, 1~60ug/mL, 1~50ug/mL, 1~40ug/mL, 1~30ug/mL, 1~20ug/mL 또는 10ug/mL의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The components of the present invention [hyaluronic acid (Hyaluronic acid)] 1 to 1000ug/mL, 1 to 500ug/mL, 1 to 100ug/mL, 1 to 90ug/mL, 1 to 80ug/mL, 1 to 70ug in the medium /mL, 1~60ug/mL, 1~50ug/mL, 1~40ug/mL, 1~30ug/mL, 1~20ug/mL or 10ug/mL may be added, but is not limited thereto.
본 발명의 상기 각 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.When each of the compositions of the present invention is a pharmaceutical composition, a pharmaceutically acceptable carrier that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention is commonly used in preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol , Starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc , Magnesium stearate and mineral oil, but is not limited thereto. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally and parenterally, such as intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, intrathecal administration, ocular administration , Can be administered by skin administration and transdermal administration.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary by factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity, Usually, a skilled physician can easily determine and prescribe a dose effective for the desired treatment or prevention. According to a specific embodiment of the invention, the daily dose of the pharmaceutical composition of the invention is 0.0001-1000 mg/kg.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person skilled in the art to which the present invention pertains. Or it can be manufactured by incorporating into a multi-dose container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of ex-agent, powder, suppository, powder, granule, tablet or capsule, and may further include a dispersant or stabilizer.
본 발명의 또 다른 일 양태는 히알루론산(Hyaluronic acid)으로 전처리된, 줄기세포 유래 엑소좀에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to exosomes derived from stem cells, pretreated with hyaluronic acid.
상기 본 발명의 각 조성물 및 상기 줄기세포 유래 엑소좀 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.The contents common to each composition of the present invention and the stem cell-derived exosomes are omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상술한 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 조성물, 히알루론산(Hyaluronic acid)으로 전처리된 줄기세포 또는 히알루론산(Hyaluronic acid)으로 전처리된 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 줄기세포 치료제에 관한 것이다.Another aspect of the present invention comprises a composition comprising the above-mentioned hyaluronic acid (Hyaluronic acid), stem cells pre-treated with hyaluronic acid (Hyaluronic acid) or stem cell-derived exosomes with hyaluronic acid (Hyaluronic acid) Stem cell treatment.
본 발명에서 "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.In the present invention, "cell therapy" refers to the proliferation and selection of autologous, allogenic, and xenogenic cells in vitro to restore the functions of cells and tissues, or changes of biological properties of cells by other methods. It means a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as prescribing.
이러한 세포치료제는 크게 두 가지로 분류할 수 있으며, 그 첫 번째는 조직 재생, 장기기능 회복 또는 면역세포의 기능조절을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 "면역세포 치료제"이다. These cell therapy products can be broadly classified into two types, the first being "stem cell therapy" for tissue regeneration, organ function recovery, or immune cell function control, and the second is the suppression or immune response in vivo. It is a "immune cell therapy" for the regulation of immune response such as hyperactivity.
상기 본 발명의 각 조성물 및 이의 구성성분[히알루론산(Hyaluronic acid)]은 줄기세포의 줄기세포능을 증가시키고 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진하며, 이를 통해 줄기세포의 치료적 효능을 강화시키는 효과를 가지므로, 본 명세서 내에서 "세포치료제"는 "줄기세포 치료제"를 의미한다.Each composition of the present invention and its components [Hyaluronic acid] increases the stem cell ability of stem cells and promotes the production of stem cell-derived exosomes, thereby enhancing the therapeutic efficacy of stem cells As it has an effect, “cell therapy agent” in this specification means “stem cell therapy agent”.
상기 줄기세포 치료제는 심근경색, 심부전 등의 심혈관 질환, 간암, 위암, 대장암, 전립선암, 방광암, 폐암 등의 암 질환, 아토피성 피부염, 관절염, 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 대장염 및 다발성 경화증과 같은 염증성 질환, 또는 자가면역성 질환 등의 치료대상 질병을 치료하는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The stem cell therapeutics include cardiovascular diseases such as myocardial infarction, heart failure, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, prostate cancer, bladder cancer, lung cancer, and other cancer diseases, atopic dermatitis, arthritis, autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, colitis and multiple It can be used for the purpose of treating inflammatory diseases such as sclerosis, or diseases to be treated, such as autoimmune diseases, but is not limited thereto.
상기 줄기세포 치료제는 상술한 본 발명의 각 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the stem cell therapeutic agent has the composition and components of the present invention as described above in common, a common description between the two is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for producing stem cell-derived exosomes comprising the following steps.
a) 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계.a) culturing the stem cells in a cell culture medium containing hyaluronic acid.
상기 방법은 다음 단계를 더 포함할 수 있다.The method may further include the following steps.
b) 배양된 줄기세포를 세척한 후 세포배양 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및b) washing the cultured stem cells and further culturing them in a cell culture medium; And
c) 엑소좀을 분리하는 단계.c) isolating exosomes.
이하, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, a method for producing exosomes derived from stem cells of the present invention will be described in detail.
a) 단계a) step
본 단계는 줄기세포를 히알루론산(Hyaluronic acid)으로 전처리하여 줄기세포에 자극을 가하는 과정이다. 본 과정에 의해 줄기세포는 상기 물질로 전처리 되지 않은 줄기세포에 비하여 더 많은 수의 엑소좀을 생산하고, 엑소좀 내 단백질 및 RNA의 함량도 증가된다.In this step, the stem cells are pre-treated with hyaluronic acid to apply stimulation to the stem cells. By this process, stem cells produce a larger number of exosomes than stem cells that have not been pretreated with the above substances, and the content of proteins and RNAs in the exosomes is also increased.
b) 단계b) step
본 단계는 본 발명에 따른 상기 물질로 전처리 된 줄기세포를 세척하여 상기 전처리 물질을 제거하고, 새로운 세포배양 배지에서 배양함으로써 줄기세포로부터 엑소좀의 분비 또는 생산을 유도하는 과정이다. 상기 a) 단계의 줄기세포 전처리 물질(히알루론산)은 상기 b) 단계의 세척 과정에 의해 제거되고, 세척 이후의 줄기세포, 줄기세포에서 생산된 엑소좀 또는 배양배지 내에 잔류하지 않는다. 따라서 상기 a) 단계에서 본 발명의 줄기세포 전처리 물질(히알루론산)로 처리된 줄기세포와 줄기세포에서 생산된 엑소좀 및 배양배지는 상술한 전처리 물질의 잔류에 의한 영향 없이 후속적 연구 또는 질병의 치료 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.This step is a process of inducing secretion or production of exosomes from stem cells by washing the pre-treated stem cells with the substance according to the present invention, removing the pre-treated substances, and culturing in a new cell culture medium. The stem cell pretreatment material (hyaluronic acid) in step a) is removed by the washing process in step b), and does not remain in the stem cells, exosomes produced from the stem cells, or culture medium after washing. Therefore, in step a), the stem cells treated with the stem cell pretreatment material (hyaluronic acid) of the present invention and the exosomes and culture medium produced from the stem cells are subject to subsequent studies or diseases without being influenced by the residual of the aforementioned pretreatment materials. It can be useful for therapeutic purposes.
본 단계의 세포배양 배지는 엑소좀이 제거된 우태아혈청(Fetal bovine serum)을 추가적으로 포함한다. 상기 세포배양 배지에 엑소좀을 제거한 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 줄기세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS에서 유래된 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다.The cell culture medium of this step additionally includes fetal bovine serum from which exosomes have been removed. The reason for using the FBS with exosomes removed from the cell culture medium is that the FBS generally used contains a lot of bovine serum-derived exosomes, and thus exosomes derived from FBS in addition to exosomes secreted by stem cells. This is to prevent mixing.
본 단계의 추가 배양은 12시간 내지 120 시간, 24시간 내지 96시간, 48시간 내지 96시간, 또는 60시간 내지 84시간, 가장 구체적으로는 72시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The additional culture of this step may be cultured for 12 hours to 120 hours, 24 hours to 96 hours, 48 hours to 96 hours, or 60 hours to 84 hours, most specifically 72 hours, but is not limited thereto.
c) 단계c) step
본 단계는 상기 b) 단계에서 추가 배양한 줄기세포의 배양 배지를 200-400xg에서 5 내지 20분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포 잔여물을 제거한 뒤, 상층액을 취하여 9,000-12,000xg로 60-80분간 고속원심분리한 후, 다시 상층액을 취하여 90,000-120,000xg로 80-100분간 원심분리하고 상층액을 제거함으로써 하층에 남아 있는 엑소좀을 얻을 수 있다.In this step, the culture medium of the stem cells cultured in step b) is centrifuged at 200-400xg for 5 to 20 minutes to remove the remaining cells and cell residues, and then the supernatant is taken to 9,000-12,000xg for 60- After 80 minutes of high-speed centrifugation, the supernatant can be taken again, centrifuged at 90,000-120,000xg for 80-100 minutes, and the supernatant removed to obtain exosomes remaining in the lower layer.
본 발명의 구현예에 따르면, 중간엽 줄기세포 배양 배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하고, 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리한다. 원심분리된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 하층에 남아있는 엑소좀을 분리하였다.According to an embodiment of the present invention, the mesenchymal stem cell culture medium is collected and centrifuged at 300xg for 10 minutes to remove the remaining cells and cell residue, and the supernatant is filtered using a 0.22 μm filter, and then subjected to high speed. Centrifuge using a high speed centrifuge at 10,000xg and 4℃ for 70 minutes. The centrifuged supernatant was taken again and centrifuged at 100,000xg and 4°C for 90 minutes using an ultracentrifuge to remove the supernatant remaining in the lower layer.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 줄기세포의 줄기세포능(Stemness)을 증가시키는 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method of increasing stem cell capability (Stemness) of a stem cell comprising the following steps.
a) 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계.a) culturing the stem cells in a cell culture medium containing hyaluronic acid.
상기 줄기세포의 줄기세포능을 증가시키는 방법은 상술한 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 생산방법과 각 단계를 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method for increasing the stem cell ability of the stem cells is in common with each step of the method for producing the stem cell-derived exosome of the present invention described above, the common content between the two is to avoid excessive complexity of the present specification. The description is omitted.
본 발명은 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 또는 줄기세포의 줄기세포능 증가용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 줄기세포 배양에 이용하는 경우, 줄기세포의 줄기세포능 및 줄기세포 유래 엑소좀의 생산량이 증가되므로, 보다 효율적으로 양질의 줄기세포 및 줄기세포 유래 엑소좀을 생산할 수 있는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a composition for promoting stem cell-derived exosome production including hyaluronic acid or increasing stem cell function of stem cells. When the composition of the present invention is used for stem cell culture, the stem cell ability of stem cells and the production of stem cell-derived exosomes are increased, so that high-quality stem cells and stem cell-derived exosomes can be produced more efficiently. It can be useful for related R&D and commercialization.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 줄기세포 증식률(Proliferation) 증가를 확인한 도이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 증가를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 엑소좀의 크기에 따른 분포를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 엑소좀 수 증가를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 엑소좀 유래 단백질 양 증가를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 줄기세포 전처리 물질[히알루론산(Hyaluronic acid)] 처리에 따른 엑소좀 유래 RNA 양 증가를 확인한 도이다.1 is a view confirming an increase in stem cell proliferation according to a stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) treatment according to an embodiment of the present invention.
2A and 2B are diagrams for confirming an increase in stem cell function (Stemness) of stem cells according to the treatment of a stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing distribution according to the size of exosomes according to the treatment of a stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to an embodiment of the present invention.
4 is a view confirming an increase in the number of exosomes according to the treatment of a stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to an embodiment of the present invention.
5 is a view confirming an increase in the amount of protein derived from exosomes according to the treatment of a stem cell pretreatment material (hyaluronic acid) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a diagram illustrating an increase in the amount of RNA derived from exosomes according to the treatment of a stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only intended to illustrate the present invention more specifically, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예. Hyaluronic acid 처리에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 분리Example. Isolation of stem cell-derived exosomes according to hyaluronic acid treatment
Hyaluronic acid 전처리Hyaluronic acid pretreatment
Hyaluronic acid 10ug/mL이 포함된 배양배지[high glucose DMEM(Gibco, Cat no.11995-065); 10% Fetal bovine Serum(HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco, Cat no.11140-050)]에서 제대조직 유래 중간엽 줄기세포(Primary Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells, ATCC No. PCS-500-010; Lot No. 63822428)를 1주일간 배양하였다.Hyaluronic acid 10ug/mL Culture medium included [high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065); 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)], Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells, ATCC No. PCS-500-010; Lot No. 63822428) was cultured for 1 week.
추가 배양Additional culture
배양을 완료한 후 Hyaluronic acid이 전처리 된 중간엽 줄기세포를 세척하고 엑소좀이 제거된 우태아혈청(FBS)을 10% 첨가한 배양배지에서 추가적으로 72시간 배양하였다. 엑소좀이 제거된 FBS를 사용하는 이유는 일반적으로 사용하는 FBS에는 소 혈청유래의 엑소좀이 매우 많이 포함되어 있기 때문에, 세포가 분비하는 엑소좀 외에 FBS 유래 엑소좀이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다.After the culture was completed, the mesenchymal stem cells pretreated with hyaluronic acid were washed and cultured for an additional 72 hours in a culture medium to which 10% of exosome-removed fetal bovine serum (FBS) was added. The reason why the exosome-removed FBS is used is to prevent the incorporation of FBS-derived exosomes in addition to the exosomes secreted by cells, since the commonly used FBS contains very many exosomes derived from bovine serum. .
엑소좀 분리Exosome separation
72시간 배양 후 전처리 물질이 처리된 중간엽 줄기세포 배양배지를 수거하여 300xg에서 10분간 원심분리하여 남아있는 세포와 세포잔여물을 제거하였다. 상층액을 취하여 0.22μm 필터를 이용하여 여과한 다음, 고속원심분리기(high speed centrifuge)를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 70분간 원심분리하였다. 원심분리 된 상층액을 다시 취하여 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 100,000xg, 4℃에서 90분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 하층에 남아있는 엑소좀을 PBS(phosphate bufferd salin)에 희석하여 이하의 실험에 사용하였다.After incubation for 72 hours, the mesenchymal stem cell culture medium treated with the pretreatment material was collected and centrifuged at 300xg for 10 minutes to remove the remaining cells and cell residues. The supernatant was taken and filtered using a 0.22 μm filter, and then centrifuged at 10,000×g, 4° C. for 70 minutes using a high speed centrifuge. The supernatant was centrifuged again and centrifuged at 100,000xg and 4°C for 90 minutes using an ultracentrifuge to remove the supernatant. Exosome remaining in the lower layer was diluted in PBS (phosphate buffered salin) and used in the following experiment.
실험예 1. Hyaluronic acid 처리에 따른 줄기세포 기능 강화Experimental Example 1. Strengthening stem cell function by treatment with hyaluronic acid
1-1. Hyaluronic acid 처리에 따른 줄기세포 증식률(Proliferation) 증가1-1. Increased stem cell proliferation following treatment with hyaluronic acid
100uL 배양배지[high glucose DMEM(Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum(HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco, Cat no.11140-050)]가 포함된 96-웰 플레이트에 중간엽 줄기세포 및 상기 실시예의 Hyaluronic acid가 전처리 된 중간엽 줄기세포를 각각 웰당 3000 세포씩 접종(seeding)한 후, 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 그 다음, CCK 용액(10 uL/웰)을 첨가하고 CO2 배양기(incubator)에서 4시간 동안 배양한 후, 450nm(420~480nm) 파장에서 흡광도를 측정하여 증식률을 확인하였다.100uL culture medium [high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)] Mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells pretreated with Hyaluronic acid of the above Example were seeded at 3000 cells per well, respectively, and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. Then, after adding CCK solution (10 uL/well) and incubating for 4 hours in a CO 2 incubator, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm (420 to 480 nm) to confirm the proliferation rate.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[Hyaluronic acid]을 전처리한 중간엽 줄기세포의 세포 증식률이 1에서 3.64로 약 364% 증가하였다.As can be seen in Figure 1, compared to the mesenchymal stem cells without any treatment, the cell proliferation rate of mesenchymal stem cells pretreated with the stem cell pretreatment material [Hyaluronic acid] increased from 1 to 3.64 by about 364%.
1-2. Hyaluronic acid 처리에 따른 줄기세포의 줄기세포능(Stemness) 증가1-2. Stem cell stem cells increased by hyaluronic acid treatment
10mL 배양배지[high glucose DMEM(Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum(HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100X)(Gibco, Cat no.11140-050)]가 포함된 100mm 세포배양 디쉬(dish)에 중간엽 줄기세포 및 상기 실시예의 Hyaluronic acid가 전처리 된 중간엽 줄기세포를 각각 디쉬당 1000 세포씩 접종하고 21일 동안 배양하였다. 배양된 세포가 부착된 디쉬를 PBS로 2회 세척하고 상온에서 약 2분간 95% 메탄올로 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액[crystal violet(sigma, C-3886, USA) 5g, 메탄올 100ml]을 첨가한 후 5분 동안 염색하고 물로 세척 후 실온에서 건조하였다. 각 디쉬에서 50개 이상의 세포로 구성된 콜로니의 수를 계수하여 비교하였다.10 mL culture medium [high glucose DMEM (Gibco, Cat no.11995-065), 10% Fetal bovine Serum (HyClone), 1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) (Gibco, Cat no.11140-050)] Mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells pretreated with the hyaluronic acid of the above embodiment were inoculated with 1000 cells per dish and cultured for 21 days. The dish to which the cultured cells were attached was washed twice with PBS and fixed with 95% methanol at room temperature for about 2 minutes. After washing the fixed cells three times with PBS, 0.5% crystal violet solution [crystal violet (sigma, C-3886, USA) 5 g,
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포(28.6개)에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[PMA]을 전처리한 중간엽 줄기세포의 세포(167.6개)의 CFU-F 콜로니 수가 약 586% 증가하였다.As can be seen in Figures 2a and 2b, CFU-F of mesenchymal stem cells (167.6) of mesenchymal stem cells pretreated with stem cell pretreatment material [PMA], compared to mesenchymal stem cells (28.6 cells), which were not treated with any substance. The number of colonies increased by about 586%.
실험예 2. Hyaluronic acid 처리에 따른 엑소좀 생산 효율 증가Experimental Example 2. Hyaluronic acid treatment increases exosome production efficiency
2-1. Hyaluronic acid 처리에 따른 엑소좀 수 증가2-1. Hyaluronic acid treatment increases the number of exosomes
나노파티클 트래킹 어세이(NanoSight NS300, Malvern)를 통하여, 상기 실시예에서 분리된 엑소좀 수를 확인하였다. 이때, 비교를 위하여, 아무 전처리 물질도 처리하지 않은 것을 제외하고 실시예와 동일한 방법으로 분리된 엑소좀의 수를 확인하였다. 결과를 하기 표 1, 도 3 및 도 4에 나타내었다.Through the nanoparticle tracking assay (NanoSight NS300, Malvern), the number of exosomes isolated in the above examples was confirmed. At this time, for comparison, the number of exosomes separated in the same manner as in Example was confirmed except that no pretreatment material was treated. The results are shown in Table 1, Figures 3 and 4 below.
(MSC: 미처리 중간엽 줄기세포, HA MSC: Hyaluronic acid-처리 중간엽 줄기세포)(MSC: untreated mesenchymal stem cells, HA MSC: Hyaluronic acid-treated mesenchymal stem cells)
상기 표 1 및 도 4에서 확인할 수 있듯이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[Hyaluronic acid]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 약 5.2배 많은 수의 엑소좀이 생산되었다.As can be seen in Table 1 and Figure 4, compared to mesenchymal stem cells without any treatment, about 5.2 times more exosomes are produced from mesenchymal stem cells pretreated with stem cell pretreatment material [Hyaluronic acid]. Became.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 상기 줄기세포 전처리 물질을 중간엽 줄기세포에 처리시, 중간엽 줄기세포가 생산하는 엑소좀의 수가 증가함을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the number of exosomes produced by the mesenchymal stem cells increases when the stem cell pretreatment material according to the present invention is treated with the mesenchymal stem cells.
2-2. Hyaluronic acid 처리에 따른 엑소좀 유래 단백질 양 증가2-2. Increased amount of exosome-derived protein according to hyaluronic acid treatment
엑소좀 단백질 분리 키트(Total exosome RNA and protein isolation kit, Invitrogen)를 이용하여 상기 실시예에서 분리된 엑소좀으로부터 단백질을 분리하고, 브래드포드 분석(bradford analysis)을 통하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. 이때, 비교를 위하여, 아무 전처리 물질도 처리하지 않은 것을 제외하고 실시예와 동일한 방법으로 분리된 엑소좀으로부터 단백질을 분리하여 정량하였다. 결과를 하기 표 2 및 도 5에 나타내었다.The protein was separated from the exosomes isolated in the above example using a total exosome RNA and protein isolation kit (Invitrogen), and the protein was measured by measuring absorbance at 595 nm through Bradford analysis. It was quantified. At this time, for comparison, the protein was separated and quantified from the separated exosomes in the same manner as in Example except that no pretreatment material was treated. The results are shown in Table 2 and Figure 5 below.
(MSC: 미처리 중간엽 줄기세포, HA MSC: Hyaluronic acid-처리 중간엽 줄기세포)(MSC: untreated mesenchymal stem cells, HA MSC: Hyaluronic acid-treated mesenchymal stem cells)
상기 표 2 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[Hyaluronic acid]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 약 5.35배 많은 양의 엑소좀 유래 단백질이 생산되었다.As can be seen in Table 2 and Figure 5, compared to the mesenchymal stem cells not treated with any substance, the stem cell pre-treatment material [Hyaluronic acid] pre-treated mesenchymal stem cells of about 5.35 times greater amount of exosome-derived protein It was produced.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 상기 줄기세포 전처리 물질을 중간엽 줄기세포에 처리시, 엑소좀의 수뿐만 아니라 엑소좀 유래 단백질(exosomal protein)의 함량 또한 증가함을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the stem cell pretreatment material according to the present invention is treated with mesenchymal stem cells, the number of exosomes as well as the content of exosomeal proteins increases.
2-3. Hyaluronic acid 처리에 따른 엑소좀 유래 RNA 양 증가2-3. Increased amount of RNA derived from exosomes by treatment with hyaluronic acid
RNA 분리용 키트(Total exosome RNA and protein isolation kit, Invitrogen)를 이용하여 상기 실시예에서 분리된 엑소좀으로부터 전체 엑소좀 RNA를 분리하고, 나노드롭(nanodrop)을 이용하여 RNA의 농도를 측정하였다. 이때, 비교를 위하여, 아무 전처리 물질도 처리하지 않은 것을 제외하고 실시예와 동일한 방법으로 분리된 엑소좀으로부터 전체 엑소좀 RNA를 분리하여 농도를 측정하였다. 결과를 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.Total exosome RNA was separated from the exosomes isolated in the above example using a total exosome RNA and protein isolation kit (Invitrogen), and the concentration of RNA was measured using a nanodrop. At this time, for comparison, total exosome RNA was separated from the separated exosomes in the same manner as in Example, except that no pretreatment material was treated, and the concentration was measured. The results are shown in Table 3 and Figure 6 below.
(MSC: 미처리 중간엽 줄기세포, HA MSC: Hyaluronic acid-처리 중간엽 줄기세포)(MSC: untreated mesenchymal stem cells, HA MSC: Hyaluronic acid-treated mesenchymal stem cells)
상기 표 3 및 도 도 6에서 확인할 수 있듯이, 아무 물질도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포에 비하여, 줄기세포 전처리 물질[Hyaluronic acid]을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 약 5.3배 많은 양의 엑소좀 유래 RNA가 생산되었다.As can be seen in Table 3 and Figure 6, compared to mesenchymal stem cells without any treatment, stem cell pre-treatment material [Hyaluronic acid] pre-treated mesenchymal stem cells derived from a large amount of exo about 5.3 times RNA was produced.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 상기 줄기세포 전처리 물질을 중간엽 줄기세포에 처리시, 엑소좀의 수뿐만 아니라 엑소좀 유래 RNA(exosomal RNA)의 함량 또한 증가함을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the stem cell pretreatment material according to the present invention is treated with mesenchymal stem cells, not only the number of exosomes but also the content of exosome-derived RNA (exosomal RNA) increases.
소결Sintering
본 발명에 따른 줄기세포 전처리 물질(Hyaluronic acid)을 중간엽 줄기세포에 처리시 줄기세포의 줄기세포능(Stemness)이 증가함을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포 전처리 물질(Hyaluronic acid)을 중간엽 줄기세포에 처리시 엑소좀의 수뿐만 아니라 엑소좀 유래 단백질(exosomal protein)의 생산량 또한 증가하며, 엑소좀 유래 RNA(exosomal RNA)의 함량도 증가함을 알 수 있다.It can be seen that when the stem cell pre-treatment material (Hyaluronic acid) according to the present invention is treated in the mesenchymal stem cells, the stem cell capability of the stem cells increases. In addition, when the stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to the present invention is processed into mesenchymal stem cells, the number of exosomes is increased, as well as the production of exosomeal proteins, and exosome-derived RNA (exosomal RNA) It can be seen that the content of is also increased.
따라서, 본 발명에 따른 줄기세포 전처리 물질(Hyaluronic acid)은 줄기세포의 줄기세포능을 증가시킬 뿐만 아니라, 줄기세포 유래 엑소좀 생성을 촉진시키므로, 우수한 기능성을 가진 줄기세포의 생산 및 엑소좀의 대량 생산 용도로의 사용이 기대된다.Therefore, the stem cell pretreatment material (Hyaluronic acid) according to the present invention not only increases the stem cell ability of the stem cells, but also promotes the production of stem cell-derived exosomes, thus producing stem cells with excellent functionality and mass of exosomes It is expected to be used for production purposes.
Claims (15)
a) 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함하는 세포배양 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계.Method of producing stem cell-derived exosomes comprising the following steps:
a) culturing the stem cells in a cell culture medium containing hyaluronic acid.
b) 배양된 줄기세포를 세척한 후 세포배양 배지에서 추가로 배양하는 단계; 및
c) 엑소좀을 분리하는 단계.The method of claim 12, wherein the method further comprises the following steps:
b) washing the cultured stem cells and further culturing them in a cell culture medium; And
c) isolating exosomes.
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