KR102121568B1 - 클로스트리듐 디피실에 대해 항균 활성을 갖는 신규 페디오코쿠스 에시디락티시 spm138 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
클로스트리듐 디피실에 대해 항균 활성을 갖는 신규 페디오코쿠스 에시디락티시 spm138 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) SPM138 균주; 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 대한 항균용 조성물; 프로바이오틱스 조성물; 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 대장염의 예방 또는 개선용 식품 조성물; 사료 첨가용 조성물, 사료 및 항염용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물은 클로스트리듐 디피실에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내는바, 이를 포함하는 항균용 조성물, 프로바이오틱스 조성물, 사료 첨가용 조성물 등에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물은 클로스트리듐 디피실에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내는바, 이를 포함하는 항균용 조성물, 프로바이오틱스 조성물, 사료 첨가용 조성물 등에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) SPM138 균주; 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 대한 항균용 조성물; 프로바이오틱스 조성물; 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 대장염의 예방 또는 개선용 식품 조성물; 사료 첨가용 조성물, 사료 및 항염용 조성물에 관한 것이다.
클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile, CD)은 포자를 생성하는 절대 혐기성 그람 양성 간균으로, 주요 서식지는 사람의 장관이며 장기간 항생제 투여로 정상 세균총이 파괴될 경우 과도하게 증식하여 염증성 장질환과 특히 위막성 대장염 등의 난치성 질병을 일으킨다. 클로스트리듐 디피실에 의한 염증성 장질환은 그 예후가 매우 나빠 결과적으로 사망에 이르게 하기도 한다.
클로스트리듐 디피실의 주요 발병인자는 클로스트리듐 디피실 균이 생성하는 외독소인데, 이 독소는 toxinA(TcdA)와 toxinB(TcdB)의 두 개의 단백질로 구성되어 있으며, 모두 독소 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 독소 생성 기전은 정확히 알려져 있지 않으나, 정족수 인식(Quorum sensing) 기전이 관여할 것으로 추측된다. 상기 두 독소는 대표적인 세포간 글리코실 전달효소(intercellular glycosyltransferase)로, 숙주 세포의 GTPase의 활성에 영향을 주어 F-actin의 응축, 장내 상피세포의 세포사멸(apoptosis)등을 통해 세포 내 염증반응과 장관 내 체액의 축적 등의 병변 상태를 초래한다. 클로스트리듐 디피실에 의한 질병의 치료에는 metronidazole, vancomycin, fidaxomicin 등의 투여가 선행되나, 항생제 사용에 따른 내성균 출현은 또 다른 문제로 대두되고 있다. 클로스트리듐 디피실 증식의 가장 큰 요인은 정상 세균총의 파괴이므로, 최근에는 건강한 사람의 분변이식이 클로스트리듐 디피실 감염증 치료의 새로운 대안으로 떠오르고 있다.
한편, 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)은 비병원성의 균으로서 적절히 투여되면 숙주의 건강에 유익한 효과를 나타내며, 대표적인 균으로는 락토바실러스(Lactobacillus)와 비피더스균(Bifidobacterium) 등이 알려져 있다. Pediococcus 속 유산균은 Lactobacillaceae과에 속하는 균으로, P. acidilactici와 P. pentosaceus등이 발효식품 제조에 사용되는 것으로 알려져 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 클로스트리듐 디피실에 대해 우수한 항균 활성을 나타내는 신규 균주를 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 분변 유래 미생물인 페디오코쿠스 에시디락티시(P. acidilactici) SPM138이 다른 균주 대비 클로스트리듐 디피실에 대한 in vitro 및 in vivo 항균 효과와 항염증 효과가 현저히 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 항균 활성을 갖는, 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) SPM138 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱스 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 상기 목적은 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 항염용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) SPM138 균주를 제공한다.
본 발명에서 용어 "페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)"는 Lactobacillaceae 계열에 속하는 동종 발효성(homofermentative) 그람 양성균을 의미하며, 이는 변비, 설사, 스트레스 해소 및 면역 반응 향상 등에 있어 프로바이오틱 보충제로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 있어서 상기 페디오코쿠스 에시디락티시는 항균 활성을 갖는 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 동정한 결과, 상기 균주는 NCBI Reference Sequence: NR_042057.1과 99% 일치하는 결과를 나타내었다. 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 2019년 2월 13일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC13812BP를 부여받았다.
본 발명의 균주 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138은 우수한 항균 활성을 나타내는 것으로, 다른 균주와 비교하여 특히 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 대하여 현저히 우수한 항균 활성을 나타내는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)"은 포자를 생성하는 혐기성 그람 양성 간균으로, 인간의 장내에 상재균으로 존재한다. 장기간 항생제 투여로 정상 세균총이 파괴되면 클로스트리듐 디피실 균이 과도하게 증식할 수 있고, 염증성장질환과 특히 위막성 대장염(가막성 또는 거짓막 대장염, pseudomembranous colitis) 등의 난치성 질병을 일으킬 수 있다. 클로스트리듐 디피실 균의 주요 발병인자는 상기 균이 생성하는 외독소이며, 이 독소는 toxinA(TcdA)와 toxinB(TcdB)의 두개의 단백질로 구성되어 있다.
본 발명의 균주 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138은 상기 클로스트리듐 디피실에 의한 독소 생성을 억제하고, 항균물질의 생성에 의해 클로스트리듐 디피실의 성장을 억제할 수 있으며, 이에 따라 클로스트리듐 디피실에 의해 주로 유발되는 것으로 알려진 위막성 대장염의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, IL-8(interleukin-8) 및 PTGS2(prostaglandin endoperoxidase synthease 2) 등의 염증인자의 발현을 억제함으로써 우수한 항염 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138에 의한 클로스트리듐 디피실의 독소생성 억제능을 co-culture법으로 평가한 결과, 클로스트리듐 디피실 단독 배양한 경우 대비 상기 SPM138 균주와 함께 배양한 경우 클로스트리듐 디피실의 독소량이 현저히 감소함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 클로스트리듐 디피실 독소에 의한 염증반응 관련 인자 IL-8 및 PTGS의 유전자 발현 유도 및 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138에 의한 발현 억제능을 확인한 결과, IL-8 생성이 약 60% 가량 현저히 감소하고, PTGS2 유전자 발현은 약 79 내지 80% 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "배양물"은 본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 모두 포함한다. 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 항균활성, 특히 클로스트리듐 디피실에 대한 항균 활성을 가지는 균주이므로, 상기 SPM138 균주 또는 이의 배양물은 항균 조성물로서 이용될 수 있다. 보다 구체적으로 클로스트리듐 디피실에 대한 항균 조성물로 이용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"는 건강에 도움이 되는 장내 세균총, 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물(생균류)을 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균(lactic acid bacteria; LAB), 비피더스균(bifidobacteria), 일부 효모(yeast) 및 바실러스(bacillus) 등이 있다.
따라서, 본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 각각 인간의 분변으로부터 새로이 분리 및 동정된 균주로서, 그 자체로서 우수한 항균 활성을 나타내므로 프로바이오틱스 조성물로서 활용될 수 있다. 특히, 상기 SPM138 균주는 클로스트리듐 디피실에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내므로, 클로스트리듐 디피실에 의한 증상을 개선, 완화시키거나 클로스트리듐 디피실에 의해 유발되는 질환, 대표적으로는 위막성 대장염의 예방, 치료를 목적으로 하는 프로바이오틱스 조성물로서 활용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "대장염(colitis)"은 세균 감염이나 장 내용물의 병적 발효 등으로 인해 발생하는 대장의 염증 자체, 및 상기 염증에 의해 유발되는 각종 질환을 모두 포함하는 의미이다. 대장염은 원인에 따라 크게 감염성 장염과 비감염성 장염으로 분류될 수 있으며, 주요 증상으로 복통을 동반한 설사, 발열, 메스꺼움 및 구토 등을 수반할 수 있다.
감염성 대장염은 감염균의 종류에 따라 바이러스성 장염(노로 바이러스, 로타바이러스), 세균성 장염(콜레라, 대장균, 이질, 장티푸스, 예르시니아, 캠필로박터), 원충 대장염(아메바), 위막성 대장염 등이 있으며, 비감염성 대장염은 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염), 방사선성 대장염, 허혈성 대장염, 베체트 장염, 약제유발성 장염 등이 있다. 구체적으로, 본 발명에 있어서 상기 대장염은 크론병, 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 염증성 장질환, 급성 장염 및 세균성 대장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 보다 구체적으로는 위막성 대장염일 수 있으나, 본 발명의 목적성 클로스트리듐 디피실에 의해 유발될 수 있는 증상 및 질환에 속하는 한, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
위막성 대장염, 가막성 또는 거짓막 대장염(pseudomembranous colitis)은 클로스트리듐 디피실에 의해 생성된 독소에 의해 대장에 희거나 노란색의 얇은 막이 생기는 질환으로, 항생제 사용에 따른 정상세균총의 파괴 및 클로스트리듐 디피실 콜로니의 증가가 하나의 원인으로 제시된다. 시작이 완만하고 서서히 진행되며, 설사와 복통, 발열 등의 증상을 동반한다. 이와 관련하여, 본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 클로스트리듐 디피실에 의한 독소 생성을 억제하고, 항균물질의 생성에 의해 클로스트리듐 디피실의 성장을 억제할 수 있는바, 이러한 위막성 대장염의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주, 이의 배양물 또는 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 이외에, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 약학 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미하며, “약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있으며, 이들은 단독 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 약학 조성물의 투여로 대장염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물의 투여로 대장염의 증세가 호전되거나 이를 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 대장염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 균주, 배양물, 대장염 및 예방은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 "건강 기능(성) 식품(functional food)"은 특정 보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 대장염의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주, 이의 배양물 또는 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 용어 "개선"은 본 발명의 식품 조성물의 투여로 인해 대장염의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가용 조성물 및 사료를 제공한다. 상기 균주 및 배양물은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "사료 첨가용 조성물"은 사료 자체로 사용되거나 사료에 첨가하여 가축의 생산성 향상이나 건강을 증진시킬 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 클로스트리듐 디피실에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내므로, 클로스트리듐 디피실에 의해 나타나는 병증을 개선, 완화시키거나 클로스트리듐 디피실에 의해 유발되는 질환의 예방, 치료를 목적으로 하는 사료 첨가용 조성물 및 사료로서 활용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 항염용 조성물을 포함한다.
본 발명에서 용어 "항염"은 면역 반응에 의한 염증을 억제하거나 경감시키는 모든 행위를 의미하는 것으로, 본 발명의 항염용 조성물에 포함된 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 염증 유도 사이토카인 IL-8 및 염증을 자극하는 효소 PTGS2의 발현을 억제함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주가 클로스트리듐 디피실 독소에 의한 염증반응 관련 인자 IL-8 및 PTGS의 유전자 발현을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주 또는 이의 배양물은 클로스트리듐 디피실에 대해 현저히 우수한 항균 활성을 나타내는바, 이를 포함하는 항균용 조성물, 프로바이오틱스 조성물, 사료 첨가용 조성물 등에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 유산균 SPM138의 클로스트리듐 디피실 독소 생성 억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HT-29 세포에서 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액에서 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액에서 각각 염증관련 인자인 IL-8 및 PTGS2의 발현 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HT-29 세포에 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액 처리 후 생성된 IL-8의 양을 ELISA로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 마우스 모델의 동물실험을 개략하여 나타낸 것이다.
도 7은 CDI 동물질병 모델에서 SPM138의 클로스트리듐 디피실에 대한 항균 효과를 분변의 비교를 통해 나타낸 것이다.
도 2는 HT-29 세포에서 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액에서 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액에서 각각 염증관련 인자인 IL-8 및 PTGS2의 발현 억제 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HT-29 세포에 클로스트리듐 디피실 단독 배양액과 유산균 SPM138의 공동 배양액 처리 후 생성된 IL-8의 양을 ELISA로 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 클로스트리듐 디피실 감염(CDI) 마우스 모델의 동물실험을 개략하여 나타낸 것이다.
도 7은 CDI 동물질병 모델에서 SPM138의 클로스트리듐 디피실에 대한 항균 효과를 분변의 비교를 통해 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사용한 균주 및 배양 조건
본 발명에 사용한 유산균은 인체분변 유래 Pediococcus acidilactis SPM138 균주로, 상기 균주의 동정은 마크로젠(Macrogen, 서울)에 의뢰하여 16S rRNA sequencing을 통해 동정하였다. 그 결과, 상기 인체분변 유래 Pediococcus acidilactis SPM138 균주는 NCBI Reference Sequence: NR_042057.1(Pediococcus acidilactici DSM 20284 16S ribosomal RNA, partial sequence)과 99% 일치하는 결과를 나타내었다. 상기 페디오코쿠스 에시디락티시 SPM138 균주는 2019년 2월 13일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC13812BP를 부여받았다.
본 발명에 사용한 클로스트리듐 디피실(C. difficile)은 Clostridium difficile KCTC 5009는 생물자원센터(KCTC, 전라북도 정읍)에서 분양 받아 본 연구실에 보관하던 균주를 사용하였으며, 동물시험에는 Clostridium difficile PCR ribotype 027 균주를 오세정 교수(전남대학교) 연구실에서 분양 받아 사용하였다. 유산균의 배양은 MRS(Difco)배지를 사용하였고, Clostrdidium의 배양은 Reinforced Clostridia media(Oxoid)를 사용하여 혐기적 배양을 하였다.
실시예 2:
세포주 및 배양방법
사람 장상피 세포주(Human Intestinal epithelial cell, IEC) HT-29 (KCLB No. 30038)는 한국세포주은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포주의 배양은 RPMI1640 배지에 L-glutamine(300 mg/ml), 25mM HEPES, 25mM NaHCO3 10% FBS 및 penicillin/streptomycin를 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양 하였다.
실시예 3:
P. acidilactici
SPM138의 In vitro 항균력 측정
P.acidolactis SPM138의 C. difficile KCTC5009에 대한 항균력을 디스크 확산법으로 측정하였다. 구체적으로, 48시간 배양한 유산균(P.acidolactis SPM138) 배양 상등액을 0.2 μm 필터에 여과하고 종이디스크에 100 μl 점적 후 건조하여 사용하였으며, 대조물질로는 vancomycin(10 μg/disc)를 사용하였다. C. difficile KCTC5009를 액체배양하여 1x108 cell/ml 농도의 배양액 200 μl를 2 ml top agar에 혼합 후 clostridia 고체배지에 부어 균 plate를 만들었다. 배지가 건조된 후, 표준물질인 항생제 디스크와 유산균 디스크를 올려놓고 48시간 혐기배양 후 저지원의 크기를 측정하여 항균효과를 비교하였다.
그 결과, pH 4.5 MRS broth의 저지환 크기는 10±1 mm인 것에 반해, vancomycin (10 μg/disc)의 저지환의 크기는 약 22 mm, 본 발명의 SPM138 균주는 약 23 mm임을 확인하였다. 이로부터 본 발명의 SPM138 균주는 C. difficile에 대해 양성 대조물질인 vancomycin와 유사한 수준의 우수한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4:
P. acidilactici
SPM138에 의한 클로스트리듐 디피실의 독소생성 억제능 시험
유산균(P.acidilactis SPM138)에 의한 Clostridium difficile(CD균)의 독소생성 억제능을 co-culture 법으로 확인하였다. 구체적으로, 106 cells/ml 농도의 C. difficile KCTC5009과 P. acidilactis SPM138 또는 대조군 P. acidilactici KCTC 13734를 각각 1:1 로 접종 후, 37 ℃, 48시간 혐기배양하였다. 이후 배양액을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 그 상등액을 독소 정량에 사용하였다. 독소의 정량은 ELISA kit(tgcBIOMICS, Bingen, Germnay)를 사용하였으며, kit에 포함된 positive control을 기준으로 흡광도 측정을 하여 상대 정량하였다.
그 결과, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, CD균 단독 배양한 것과 비교시 SPM138 균주를 함께 배양한 CD균의 독소량이 현저히 감소함을 확인하였다. 구체적으로, 사용된 키트는 상대정량이 가능한 것으로, 제조사에서 제공한 positive control을 기준으로 흡광도 값을 통해 상대 정량한 결과, CD균만 배양한 경우(CDT)와 LAB 배양 배지만을 LAB대신 첨가한 경우(CDT+MRS) 독소량이 positive control의 1.1배인 것으로 확인하였다. 한편, CD균과 표준균주인 KCTC13734를 1:1 동량으로 함께 배양한 경우(CDT+ KCTC13734), CD단독 배양한 배양액(CDT)의 독소량에 비해 독소량이 약 4.5배 감소하였으나, 본 발명의 SPM138 균주를 1:1 동량으로 함께 배양한 경우(CDT+SPM138)에는 CD단독 배양한 배양액(CDT)의 독소량에 비해 무려 약 6.7배 감소하였는바, 본 발명의 SPM138 균주는 KCTC13734에 비해 약 1.5배 이상의 클로스트리듐 디피실의 독소생성 억제능을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: HT-29 세포에서 CD 단독 배양액 및 CD+LAB 배양액의 세포독성 측정
CD 단독 배양액 및 CD와 유산균의 공동 배양액 처리시 세포독성이 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 예비 실험을 통해 1x106 CFU/ml 농도의 C. difficile을 37 ℃, 48시간 혐기배양 후, 배양 상등액을 세포 배양액의 25% 농도로 2 x 106 cell/well의 HT-29세포에 처리하였을 때 세포 생존률이 20% 이하로 나와 이후 모든 실험을 이 조건에서 실시하였다.
HT-29 세포를 6 well plate에 1x 106 cell/well 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 PBS로 3회 세척 후 배지에 CD 배양 상등액, CD + P.acidilactici SPM138 co-culture 및 CD + P. acidilactici KCTC 13734 배양 상등액을 각각 25% 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 상등액 제거 후 PBS로 3회 세척 후 5 mg/mL 농도의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-terazolium bromide(MTT)(Sigma Co. St. Louis, USA) 시약을 FBS 넣지 않은 RPMI 1640 배지에 10배 희석 후 1000 μL/well로 가하고 37℃, 5% CO2에서 4시간 더 배양하였다. 상등액을 제거 후 PBS로 3번 세척한 후, DMSO를 처리하여 37℃, 15분 shaking incubation 후 생성된 formazan을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, HT-29 세포만을 배양한 군(control)의 생존률을 100%로 하였을 때 CD 단독 배양액(CDT)을 25% 농도로 처리한 경우 생존률이 약 18%였으며, LAB(SPM138)대신 CD균 동량과 같은 부피의 MRS 배지를 첨가하여 배양한 CD균 배양액을 첨가한 경우(CDT+MRS)에도 생존률은 20% 정도에 불과하였다. 한편, 동량의 CD균와 KCTC13734 균주를 co-culture한 배양액을 25% 농도로 처리한 경우에도(CDT+ KCTC13734) 생존율은 약 78% 정도에 불과하였으나, 본 발명 SPM138 균주의 co-culture 배양액(CDT+SPM138)의 생존률은 약 92%로 현저히 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(도 2).
실시예 6: CD 단독 배양액 및 CD+LAB 배양액의 IL-8 및 PTGS-2 mRNA 발현에 미치는 영향 확인
CD 독소에 의한 염증반응 관련 인자 IL-8 및 PTGS의 유전자 발현 유도 및 CD+LAB 배양액에 의한 발현 억제능을 확인하였다. HT-29 cell을 6 well에 1x106 cells/well로 접종 후 37 ℃, 5% CO2 조건으로 24 시간 배양하였다. 상층액 제거 후, PBS로 3회 세척하여 RPMI1640 배지에 CD 배양액 또는 CD+LAB배양액을 25% 농도로 처리하고 37 ℃, 5% CO2에서 6시간 배양 후 상등액을 제거하였다. HT-29 cell을 PBS로 3번 세척 후 mRNA 분리는 GeneAll Hybrid-RTMreagent(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하였다. 분리한 total RNA 200 ng을 AccuPower® CycleScript RT PreMix (dT20) (Bioneer, Taejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 사용하여 IL-8 및 PTGS2 mRNA 양을 β-actin을 housekeeping gene으로 하여 ddCt 분석을 통한 상대 정량하였다. PCR 시약은 PowerSYBR Green PCR Mastermix(Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 사용하였고, StepOne realtime PCR system(Life Technologies Pty Ltd, NY, USA)을 사용하여 하였으며, 프라이머는 제노텍(Genotech, 대전)에서 합성하였고, 그 서열은 아래 표 1에 나타내었다.
[표 1]
그 결과, 도 3에서 알 수 있듯이, HT-29 세포에 CD 단독 배양액(CDT), 또는 CD균 배양액에 MRS 배지를 첨가한 경우(CDT+MRS) IL-8 mRNA 발현양이 대조군에 비해 약 16배 정도 증가함을 확인하였다. 한편, CD균과 동량의 LAB을 co-culture 한 배양액을 HT-29에 처리한 경우(CDT+SPM138), SPM138 처리시 IL-8 mRNA는 대조군의 약 7.5배만 증가하여 IL-8 생성이 약 60% 가량 현저히 감소함을 확인하였다. 한편, cyclooxygenase의 하나인 prostaglandin endoperoxidase synthease 2(PTGS2)의 발현을 비교한 결과, CD 배양액(CD Toxin) 및 CD+MRS를 처리한 군은 PTGS2 유전자 발현이 약 1.5배 증가한 반면, SPM138 균주를 처리한 군은 대조군에 비해 PTGS2 유전자 발현이 약 79% 수준으로 감소함을 확인하였다(도 4). 즉, 이는 본 발명의 SPM138 균주가 CD 독소에 의한 염증반응 관련 인자 IL-8 및 PTGS의 유전자 발현을 억제시킴에 따라 우수한 항염 효과를 가짐을 나타내는 결과이다.
실시예 7: ELISA를 이용한 IL-8 농도 측정
HT-29 cell을 1x106 cells/well 농도로 6 well plate에 접종한 후 24시간 배양하였다. PBS로 세포를 세척하고 CD 배양액 또는 CD+LAB 배양액을 25% 농도로 처리 후 24 시간 배양하여 상등액을 모아 2,000 rpm에서 10분간 원심분리시킨 후, 잔해를 제거하였다. 상등액중 IL-8 농도는 ab214030-Human IL-8 SimpleStep ELISA®Kit(abcam)를 사용하여 분석하였다. CD 배양액을 처리한 HT-29 cell을 양성대조군으로 사용하였으며 표준품 IL-8을 250 pg/mL을 최고농도로 하여 계열 희석하여 검량선 작성을 하였다. Sample diluent에 5배 희석한 상등액과 standard를 plate(human IL-8 specific mouse monoclonal antibody coating)에 50 μL씩 넣고 antibody cocktail 50 μL를 넣어 1 시간 동안 실온에 방치하였다. 3번 세척하고 TMB solution 100 μL 넣고 10분간 빛을 차단하고 반응시킨 후 stop solution 100 μL를 넣고 1분간 섞어주고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 대조군에서 생성된 IL-8 농도는 약 268±32 pg/ml이었으며, CD균 배양액 단독(CDT) 또는 CD균 +MRS 배양액을 처리한 군(CDT+MRS)의 경우 2818.814±135 pg/ml으로 전염증인자인 IL-8의 양이 크게 증가함을 확인하였다. 반면, CD+LAB 배양액을 처리한 경우(CDT+SPM138), IL-8 농도는 1124.231 ± 56.2 pg/ml로, LAB SPM138 균주에 의해 염증인자인 IL-8의 생성이 약 60% 이상 현저히 감소함을 확인하였다(도 5). 즉, 이는 본 발명의 SPM138 균주가 CD 독소에 의한 염증반응 관련 인자 IL-8의 발현을 억제시킴에 따라 우수한 항염 효과를 가짐을 나타내는 결과이다.
실시예 8: CDI 동물 질병 모델에서 SPM138의 항 클로스트리듐 디피실 활성 확인
실험동물은 5주령된 C57BL/6 암컷 마우스를 코사바이오(KOSA BIO, 분당)에서 구입하여 사용하였다. 25마리의 마우스를 5마리씩 5개 군으로 나누어 대조군(A), 감염군(B), 항생제 처리군(C), LAB SPM138 처리군(D), LAB W402 처리군(E)으로 나누어 실험하였다. 동물실험은 삼육대학교 동물실험윤리위원회(SYUIACUC 2018-009)의 승인 후 진행하였으며, 실험의 전반적인 과정은 도 6에 개략하여 나타내었다.
실험동물은 구입 후 일정시간 적응 후 음용수에 kanamycin (0.4 mg/ml), gentamicin (0.035 mg/ml), metronidazole (0.215 mg/ml), vancomycin (0.045 mg/ml)를 넣어 항생제 cocktail을 만들어 CD 감염전 4일간 경구투여 하였으며, CD 감염 하루전 clindamycin (10 mg/kg)을 복강 주사하였다. 그 후 CD균(PCR ribotyep 027)을 1x107 CFU/mouse 농도로 경구 투여하여 감염시켰다. 감염 후 24시간 후부터 5일간 항생제 투여군은 위의 항생제 cocktail 을 음용수로 하였고, LAB 투여군은 마우스당 1x108 CFU이 되도록 SPM138을 경구 투여하였다. 실험 기간 중 설사, 행동이상, 체중감소, 사망 등의 증상을 매일 관찰하였다. 감염여부는 분변중의 독소량을 ELISA법으로 정량하였다. 실험 기간 동안 감염군 중 한 마리가 감염 4일째에 사망하였으며, 분변의 상태, 분변의 냄새, 독소 정량등을 통해 볼 때 감염 3일째, LAB 처리 2일째에 감염군과 치료군의 차이가 가장 유의하게 나타나 이하 상기 시점을 중심으로 결과를 나타내었다.
구체적으로, 도 7에서 알 수 있듯이, 대조군(A) 및 항생제 투여군(C)은 정상 분변이었으며 SPM138 투여군(D)은 항생제 투여군 보다는 약간 더 무른듯 하였으나 색, 굳기 등이 정상에 가까웠다. 한편, 감염군(B)의 분변은 색이 노랗고, 수분함량이 많아 형태를 제대로 갖춘 것이 드물었다.
독소량은 LAB(SPM138) 투여 2일째 및 5일째의 값으로 비교하였다. 감염군(B)의 흡광도 값은 0.7∼3.5/0.32∼1.57 (day2/day5)였으며, SPM138 투여군(D)은 0.43∼1.34 / 0.24∼0.74 (day2/day5)로, 이로부터 SPM138 투여군이 감염군에 비해 독소량이 약 60% 정도 현저히 감소한 것을 확인하였다(표 2).
[표 2]
음성: OD450-620 < 0.1
Cut off 값: 테스트 반응(test reaction) > 음성 값 + 0.100 (본 실시예에서 cut off 값은 0.138)
ND: 결정되지 않음(not determined), 심각한 감염으로 인해 마우스가 사망함
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (13)
- 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 대해 항균 활성을 갖는, 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) SPM138 균주(수탁번호 KCTC13812BP).
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 클로스트리듐 디피실에 의한 독소 생성을 억제하거나 염증인자의 발현을 억제시키는 것인, 균주.
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 클로스트리듐 디피실에 대한 항균용 조성물.
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱스 조성물.
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 위막성 대장염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 위막성 대장염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
- 제10항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료.
- 제1항 또는 제3항의 균주, 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 항염용 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 조성물은, 클로스트리듐 디피실 독소에 의해 발현이 증가한 IL-8(Interleukin 8) 및 PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide synthase2)의 발현을 억제하는 것인, 조성물.
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|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |