KR102115960B1 - A method of differentiating human mesenchymal stem cells to thyrotropic cells - Google Patents

A method of differentiating human mesenchymal stem cells to thyrotropic cells Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells. More specifically, Pit-1 and GATA2 genes are transfected into the human mesenchymal stem cells to be differentiated into cells which secrete thyroid-stimulating hormone.

Description

인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 호르몬 분비세포로 분화 방법{A METHOD OF DIFFERENTIATING HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS TO THYROTROPIC CELLS}A method of differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid hormone-secreting cells {A METHOD OF DIFFERENTIATING HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS TO THYROTROPIC CELLS}

본 발명은 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비 세포로 분화 시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 중간엽 세포에 전사인자 Pit1 과 GATA2를 트랜스펙션하여 갑상선 자극호르몬 분비하는 세포로 분화 시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone-secreting cells, and more specifically, transfecting transcription factors Pit1 and GATA2 into human mesenchymal cells to differentiate into cells secreting thyroid-stimulating hormone. It's about how.

뇌하수체는 시상하부와 신체 전반에서 분비되는 호르몬의 영향을 받아 전체 호르몬의 분비를 조절한다. 뇌하수체는 발생학적으로 전엽과 후엽으로 나뉘는데, 뇌하수체 전엽에서 분비되는 대표적인 호르몬은 성장호르몬, 성선자극호르몬, 갑상선자극호르몬, 부신피질자극호르몬과 유즙분비호르몬이며 뇌하수체 후엽에서는 항이뇨호르몬이 대표적인 호르몬이다. 뇌하수체기능저하증은 이러한 호르몬들의 분비가 감소되어 있는 상태의 질환을 의미한다. 뇌하수체기능저하증의 가장 흔한 원인은 뇌하수체 종양이며 (70~80%), 두개인두종 (12~13%), 특발성 (8~10%), 산후 다량 출혈로 인한 쉬한 증후군 (1~3%) 등도 뇌하수체기능저하증을 유발할 수 있다. 특히, 뇌손상으로 인한 뇌하수체기능저하는 진단되지 않아 더 많은 뇌하수체 기능저하증의 발생이 있을 수 있다. 뇌하수체기능저하 환자는 사망률이 높은데, 그 이유는 짧은 시간에도 부신피질 자극호르몬 (adrenocorticotropin hormone; ACTH)과 갑상선 자극호르몬 (thyroid-stimulating hormone; TSH)의 분비 저하는 생명에 위험하기 때문이다.The pituitary gland regulates the secretion of all hormones under the influence of hormones secreted by the hypothalamus and the whole body. The pituitary gland is genetically divided into the anterior and posterior lobes, and the typical hormones secreted from the anterior lobe of the pituitary gland are growth hormone, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, adrenal cortical stimulating hormone and milk secretion hormone, and anti-diuretic hormone is the major hormone in the posterior lobe of the pituitary gland. Pituitary hypoplasia refers to a condition in which secretion of these hormones is reduced. The most common causes of pituitary dysplasia are pituitary tumors (70-80%), parietal craniomas (12-13%), idiopathic (8-10%), and easy syndrome (1-3%) due to massive postpartum bleeding. It can cause dysfunction. In particular, the pituitary gland dysfunction due to brain damage is not diagnosed, so there may be more pituitary gland dysfunction. Patients with hypopituitary dysfunction have a high mortality rate because, even in a short time, the secretion of adrenocorticotropin hormone (ACTH) and thyroid-stimulating hormone (TSH) is dangerous to life.

현재 뇌하수체기능저하증의 치료는 분비능이 감소한 호르몬을 보충하는 것이다. 하지만, 이 호르몬 주입 치료법은 부작용이 있고, 치료가 비싸고, 또한 수십 년간 매일 주입 받아야 하는 단점이 있다. 따라서 손상된 뇌하수체 조직을 대신하는 뇌하수체 호르몬을 분비하는 세포 치료에 대한 연구가 늘어나고 있는 상황이다. 예를 들어, 세포 치료 방법 중의 하나로서 배아 줄기세포(embryonic stem cells)로부터 뇌하수체 호르몬 분비 세포로 분화 시켜 분화된 세포를 이식 하는 방법이 연구되었었다(Medical Hypotheses, 2011). 즉, 이전 연구에서는 마우스 배아 줄기세포를 뇌하수체 종양 세포주 (GH3)의 배양액으로 세포외 배양하여 성장호르몬 (growth hormone; GH)와 젖분비 호르몬 (prolactin; PRL)이 분비되는 세포로 분화됨을 보였다(Molecular and Cellular Endocrinology, 2007). 그리고, 구강 외배엽 (Oral ectoderm)으로부터 라트케 주머니 (Rathke’s pouch)로 분화되는 과정이 뇌하수체 발생에 중요함이 밝혀졌고, Rathke’s pouch의 세포에서는 Lim3의 발현이 알려졌으며, Pit-1 (Pou domain transcription factor 1) 발현이 되면, 뇌하수체 세포들로 분화가 되는 것이 밝혀졌다(Hormones, 2015). 최근에는 인간 배아 줄기세포와 인간 iPSC (induced pluripotent stem cells)를 fluorescence-activated cell sorting (FACS)로 분리한 SIX1::H2B-GFP+ Placode 세포를 이용해서 ACTH, GH 호르몬 분비 세포로 분화시킨 후, 분화된 세포를 뇌하수체 절제한 설치류 모델에 이식하여 3주후부터는 ACTH, GH 호르몬 등이 증가됨을 확인되었다(Stem Cell Reports, 2016). Currently, the treatment of hypo pituitary function is to supplement hormones with decreased secretion capacity. However, this hormone infusion therapy has side effects, is expensive, and has the disadvantage of having to be infused every day for decades. Therefore, research on cell therapy that secretes pituitary hormones that replace damaged pituitary tissue is increasing. For example, as one of cell treatment methods, a method of transplanting differentiated cells by differentiating them from embryonic stem cells into pituitary hormone-secreting cells has been studied (Medical Hypotheses, 2011). That is, previous studies showed that mouse embryonic stem cells were differentiated into cells that secrete growth hormone (GH) and prolactin (PRL) by extracellular culture with a culture medium of the pituitary tumor cell line (GH3) (Molecular) and Cellular Endocrinology, 2007). In addition, it was found that the process of differentiation from oral ectoderm into Ratke's pouch is important for pituitary development, and expression of Lim3 is known in cells of Rathke's pouch, Pit-1 (Pou domain transcription factor) 1) Upon expression, it was found that it differentiates into pituitary cells (Hormones, 2015). Recently, human embryonic stem cells and human iPSC (induced pluripotent stem cells) were differentiated into ACTH and GH hormone-secreting cells using SIX1 :: H2B-GFP + Placode cells separated by fluorescence-activated cell sorting (FACS), followed by differentiation. The implanted cells were transplanted into a pituitary resected rodent model, and it was confirmed that ACTH and GH hormones increased after 3 weeks (Stem Cell Reports, 2016).

그러나 종래 연구에서는 뇌하수체에서 분비되는 모든 호르몬을 분비하는 세포로 분화를 시키는데 그 특징이 있었다. 뇌하수체 세포는 각기 다른 세포 종류의 세포들이 있고, 각기 다른 세포들은 각기 다른 호르몬을 분비하고 있으며, 각기 다른 뇌하수체 조직 손상에는 다른 호르몬 분비 세포가 필요하다. 이렇게 호르몬 특이적 분비세포로 분화시키는 연구는 아직 진행 중에 있으며 특히, 갑상선 자극 호르몬만을 분비하는 세포로 분화시키는 기술은 현재까지 나와있지 않다.However, in the previous studies, it differentiated into cells that secrete all hormones secreted from the pituitary gland, which was characteristic. There are different types of cells in the pituitary cells, different cells secrete different hormones, and different hormone-secreting cells are needed to damage different pituitary tissues. Research into differentiation into hormone-specific secretory cells is still underway, and in particular, a technique for differentiating into cells that secrete only thyroid-stimulating hormone has not been released.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬을 분비하는 세포로 분화 하는 방법을 제공하는 것이다.Technical problem to be achieved by the present invention is to provide a method for differentiating human mesenchymal stem cells into cells that secrete thyroid-stimulating hormone.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be achieved by the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description. There will be.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법은,In order to achieve the above technical problem, a method for differentiating human mesenchymal stem cells according to an aspect of the present invention into thyroid-stimulating hormone secreting cells,

인간 중간엽 줄기세포를 수득한 후 배양하는 단계;Obtaining and culturing the human mesenchymal stem cells;

상기 배양된 인간 중간엽 줄기세포에 Pit-1을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계;Transfecting the cultured human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding Pit-1;

상기 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포를 항생제가 포함된 배지에서 배양하는 단계;Culturing the human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 in a medium containing antibiotics;

상기 항생제가 포함된 배지에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포를 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3 내지 6중량%가 포함된 배지에서 안정화시키는 단계; 및Stabilizing human mesenchymal stem cells cultured in the medium containing the antibiotic in a medium containing 3 to 6% by weight of fetal bovine serum relative to 100% by weight of the entire medium; And

상기 안정화된 인간 중간엽 줄기세포에 GATA2를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계;Transfecting the stabilized human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding GATA2;

를 포함시킬 수 있다. It can include.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄 유래일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the human mesenchymal stem cells may be derived from human umbilical cord.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 수득된 인간 중간엽 줄기세포는 계대배양 passage 3 내지 5 상태일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the obtained human mesenchymal stem cells may be in passage 3 to 5 state.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항생제는 암피실린(ampicillin), 클로테트라사이클린(chlortetracycline), 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 틸로신(tylosin), G418 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.According to an embodiment of the invention, the antibiotic is ampicillin (ampicillin), clotetracycline (chlortetracycline), dihydrostreptomycin (dihydrostreptomycin), gentamicin (gentamycin), kanamycin (kanamycin), spectinomycin (spectinomycin), strepto It may be at least one selected from the group consisting of streptomycin, tetracycline, tylosin, G418 and neomycin.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 안정화시키는 단계는 인간 중간엽 줄기세포의 confluence가 50 내지 80%가 될 때까지 유지될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the stabilizing step may be maintained until the confluence of human mesenchymal stem cells is 50 to 80%.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 안정화시키는 단계는 3 내지 14일동안 이루어질 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the stabilizing step may be performed for 3 to 14 days.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 Pit-1 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the step of culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal bovine serum after the step of transfecting Pit-1 may be further included.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 GATA2 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the step of culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal bovine serum after the step of transfecting GATA2 may be further included.

본 발명의 실시 예에 따르면, 인간 중간엽 줄기세포에 전사인자 Pit1과 GATA2를 트랜스펙션하여 갑상선 자극호르몬을 분비하는 세포로 분화 유도 할 수 있다. 갑상선 자극호르몬 분비 되는 세포로 갑상선 자극호르몬 저하증 이나 갑상선 상실 환자에게 치료법으로 사용될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, human mesenchymal stem cells may be transfected with transcription factors Pit1 and GATA2 to induce differentiation into cells that secrete thyroid-stimulating hormone. Cells that secrete thyroid-stimulating hormone and can be used as a treatment for patients with hypothyroidism or hypothyroidism.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the above-described effects, and include all effects that can be deduced from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 Pit-1 트랜스펙션을 면역형광염색법으로 확인한 사진이다.
도2는 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션된 Pit-1의 발현여부를 전기영동법을 통해서 확인한 사진이다.
도3은 Pit1 유전자 주입한 인간 중간엽 세포에 GATA2 유전자를 주입한 후 이를 GFP(Green fluorescent protein)으로 확인한 사진이다.
도4는 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션된 Pit-1및 GATA2의 발현을 전기영동법을 통해서 확인한 사진이다.
도5는 갑상선 암 세포인 GH3 세포에서 THS β 발현 및 Pit-1/GATA2 유전자 트랜스펙션한 인간 중간엽 줄기세포에서 THS β 발현을 보여주는 사진이다.
도6은 Pit1/GATA2 유전자 트랜스펙션한 인간 중간엽 줄기세포에서 THS β 발현을 전기영동법을 통해 확인한 사진이다.
도7은 Pit1/GATA2 유전자 트랜스펙션한 인간 중간엽 줄기세포에서 THS β가 분비되는지를 ELISA를 통해 보여주는 도면이다.1 is a photograph confirming the Pit-1 transfection by immunofluorescence staining.
Figure 2 is a photograph confirming whether the expression of Pit-1 transfected in human mesenchymal stem cells through electrophoresis.
Figure 3 is a photograph confirming this with GFP (Green fluorescent protein) after injecting the GATA2 gene into human mesenchymal cells injected with Pit1 gene.
4 is a photograph confirming the expression of Pit-1 and GATA2 transfected into human mesenchymal stem cells through electrophoresis.
5 is a photograph showing THS β expression in GH3 cells, which are thyroid cancer cells, and THS β expression in human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 / GATA2 gene.
6 is a photograph confirming THS β expression in human mesenchymal stem cells transfected with Pit1 / GATA2 gene through electrophoresis.
7 is a diagram showing whether THS β is secreted from human mesenchymal stem cells transfected with Pit1 / GATA2 gene through ELISA.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. However, the present invention may be implemented in various different forms, and thus is not limited to the embodiments described herein. In addition, in order to clearly describe the present invention in the drawings, parts irrelevant to the description are omitted, and like reference numerals are assigned to similar parts throughout the specification.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is "connected (connected, contacted, coupled)" with another part, it is not only "directly connected" but also "indirectly connected" with another member in between. "It also includes the case where it is. Also, when a part “includes” a certain component, this means that other components may be further provided instead of excluding other components, unless otherwise stated.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used herein are only used to describe specific embodiments, and are not intended to limit the present invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In this specification, terms such as “include” or “have” are intended to indicate that a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification exists, and that one or more other features are present. It should be understood that the existence or addition possibilities of fields or numbers, steps, operations, components, parts or combinations thereof are not excluded in advance.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 일측에 따른 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법은 a) 인간 중간엽 줄기세포를 수득한 후 배양하는 단계; b) 상기 배양된 인간 중간엽 줄기세포에 Pit-1을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계; c) 상기 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포를 항생제가 포함된 배지에서 배양하는 단계; d) 상기 항생제가 포함된 배지에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포를 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3 내지 6중량%가 포함된 배지에서 안정화시키는 단계; 및 e) 상기 안정화된 인간 중간엽 줄기세포에 GATA2를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계를 포함할 수 있다.The method for differentiating human mesenchymal stem cells according to one aspect of the present invention into thyroid-stimulating hormone secreting cells comprises: a) obtaining and culturing human mesenchymal stem cells; b) transfecting the cultured human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding Pit-1; c) culturing the human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 in a medium containing antibiotics; d) stabilizing human mesenchymal stem cells cultured in the medium containing the antibiotic in a medium containing 3 to 6% by weight of fetal bovine serum relative to 100% by weight of the entire medium; And e) transfecting the stabilized human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding GATA2.

상기 인간 중간엽 줄기세포를 수득한 후 배양하는 단계는 인간 중간엽 줄기세포를 기반으로 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키기 위해 준비하는 단계로서, 먼저 인간 중간엽 줄기세포를 수득하여 이를 배지에 배양시키는 단계이다. 상기 인간 중간엽 줄기세포는 다분화능을 가진 기질세포(가슴샘이나 골수 등의 기관에서 그 기능을 담당하는 세포나 조직(유조직)에 둘러싸고 지탱하는 세포)로 조골세포(뼈 세포), 연골세포, 근육세포, 지방세포(골수 지방 조직을 만드는 지방세포)를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있다. 그리고, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 인대, 골수기질 등 다양한 결합조직으로 분화할 수 있는 능력을 가질 수 있으며 이러한 구조적 지지 기능 이외에도 면역조절, 억제 기능을 가지고 있어서 염증 반응을 저해하고 조직 재생에 기여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄 유래일 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시킬 수 있으며 이를 위해서, 상기 인간 중간엽 줄기세포의 계대배양 passage상태가 3 내지 5인 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 인간 중간엽 줄기세포의 계대배양 passage상태가 4인 것을 사용할 수 있다. The step of culturing after obtaining the human mesenchymal stem cells is a step of preparing to differentiate into thyroid-stimulating hormone-secreting cells based on the human mesenchymal stem cells, first obtaining human mesenchymal stem cells and culturing them in the medium It is a step. The human mesenchymal stem cells are osteoblasts (bone cells), chondrocytes, and muscles that are multipotent stromal cells (cells that surround and support cells or tissues (milk tissues) that are responsible for their functions in organs such as the breast glands or bone marrow). It can differentiate into various cells, including cells and adipocytes (fat cells that make bone marrow adipose tissue). In addition, the human mesenchymal stem cells may have the ability to differentiate into various connective tissues such as cartilage, bone tissue, ligaments, bone marrow matrix, etc. In addition to these structural support functions, they also have immunomodulatory and inhibitory functions, thereby inhibiting the inflammatory response and inhibiting tissue. It can contribute to regeneration. According to an embodiment of the present invention, the human mesenchymal stem cells may be derived from human umbilical cord. In addition, according to another embodiment of the present invention, the human mesenchymal stem cells can be differentiated into thyroid-stimulating hormone-secreting cells, and for this purpose, passages of 3 to 5 passages of the human mesenchymal stem cells can be used. Can be. Preferably, a passage state of passage 4 of the human mesenchymal stem cells may be used.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 수득된 인간 중간엽 줄기세포는 우태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 인간 중간엽 줄기세포 배지에서 배양될 수 있다. 그리고, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인간 중간엽 줄기세포 배지는 DMEM 또는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 배양액 (Human Umbilical Cord derived MSC Growth Medium) 일 수 있다.Further, according to another embodiment of the present invention, the obtained human mesenchymal stem cells may be cultured in a human mesenchymal stem cell medium containing fetal bovine serum, penicillin and streptomycin. In addition, according to an embodiment of the present invention, the human mesenchymal stem cell medium may be DMEM or human umbilical cord stem cell culture medium (Human Umbilical Cord derived MSC Growth Medium).

상기 갑상선 자극호르몬(Thyroid-stimulating hormone, TSH)은 뇌하수체 전엽에서 분비되는 분자량이 약 28,000달톤인 당단백질 호르몬으로, 약 15%가 탄수화물이며, α-subunit와 β-subunit로 구성되어 있고. α-subunit는 LH, FSH, hCG 등의 성선 자극 호르몬(gonadotropin)과 거의 동일한 아미노산 배열을 갖고 있다. TSH의 특이적인 생리적 활성은 β-subunit 의 다양한 특징에 기인한 것이며 호르몬이 아단위(subtype)로 분리되면 생리적 활성은 나타나지 않을 수 있다. 상기 갑상선 자극호르몬은 갑상선 호르몬 T4와 T3의 생성과 분비를 자극할 수 있으며, 갑상선 자극호르몬 분비는 낮은 T3 및 T4 농도와 갑상선자극호르몬유리호르몬(TRH)에 의해 촉진될 수 있고, T3와 T4 농도 상승에 의해 억제될 수 있다. 갑상선기능의 변화에 상기 갑상선 자극호르몬이 가장 민감하게 변하고, 갑상선 질환을 배제하기 위한 음성 예측도가 가장 높기 때문에, 보행이 가능한 정상적인 사람에서 갑상선기능이상을 선별하는데 상기 갑상선 자극호르몬 농도가 가장 좋은 지표가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예 따르면, 본 발명에 따른 방법으로 인간 중간엽 줄기세포를 상기 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화시킬 수 있으며, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에 따라 분화된 세포는 갑상선 종양 세포에서 보다 많은 갑상선 자극 호르몬을 분비할 수 있다(도 7참조).The thyroid-stimulating hormone (TSH) is a glycoprotein hormone having a molecular weight of about 28,000 daltons secreted from the anterior pituitary gland, about 15% of which are carbohydrates, and are composed of α-subunit and β-subunit. α-subunit has almost the same amino acid sequence as gonadotropin, such as LH, FSH, and hCG. The specific physiological activity of TSH is due to various characteristics of β-subunits, and when hormones are separated into subtypes, physiological activity may not appear. The thyroid-stimulating hormone can stimulate the production and secretion of thyroid hormones T4 and T3, and thyroid-stimulating hormone secretion can be promoted by low T3 and T4 concentrations and thyroid-stimulating hormone free hormone (TRH), and T3 and T4 concentrations Can be suppressed by ascent. The thyroid-stimulating hormone is the most sensitive to changes in thyroid function, and since the negative predictive value for excluding thyroid disease is the highest, the thyroid-stimulating hormone concentration is the best indicator for screening abnormalities in thyroid function in normal people who can walk. Can be According to an embodiment of the present invention, the human mesenchymal stem cells can be differentiated into cells that secrete the thyroid-stimulating hormone by the method according to the present invention, and according to another embodiment of the present invention, differentiated according to the present invention Cells can secrete more thyroid-stimulating hormone from thyroid tumor cells (see Figure 7).

상기 배양된 인간 중간엽 줄기세포에 Pit-1을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계는 상기 인간 중간엽 줄기세포가 Pit-1발현할 수 있도록 Pit-1코딩 핵산을 벡터에 삽입한 후 상기 벡터를 상기 배양된 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션시키는 과정을 의미한다. 상기 벡터는 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있지만, 단백질을 코딩하는 핵산을 트랜스펙션시키기 위해 당업계에서 사용되는, 항생제 내성 유전자를 포함하는 벡터라면 제한 없이 사용이 가능하다. The step of transfecting the cultured human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding Pit-1 inserts a Pit-1 encoding nucleic acid into the vector so that the human mesenchymal stem cells can express Pit-1. Then, it means the process of transfecting the vector into the cultured human mesenchymal stem cells. The vector may be a plasmid containing an antibiotic resistance gene, but any vector containing an antibiotic resistance gene used in the art for transfection of a nucleic acid encoding a protein may be used without limitation.

상기 Pit-1 (Pou domain transcription factor 1)은 성장호르몬을 위한 전사인자를 의미하며, 구체적으로 포유동물에서 뇌하수체 발달 및 호르몬 발현에 영향을 주는 뇌하수체 특이적 전사인자이다. 특히, 상기 Pit-1은 프로락틴(prolactin) 및 갑상선 자극 호르몬 β-subunit를 코딩하는 유전자 제어를 할 수 있다.The Pit-1 (Pou domain transcription factor 1) refers to a transcription factor for growth hormone, and specifically, is a pituitary specific transcription factor that affects pituitary development and hormone expression in mammals. In particular, the Pit-1 can control genes encoding prolactin and thyroid stimulating hormone β-subunit.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 Pit-1 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 우태아혈청이 포함된 배지에서 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계는 Pit-1트랜스펙션 이후에 인간 중간엽 줄기세포내에서 Pit-1유전자가 제대로 삽입되도록 할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the step of culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal bovine serum after the step of transfecting Pit-1 may be further included. The step of culturing the human mesenchymal stem cells in the medium containing fetal bovine serum can ensure that the Pit-1 gene is properly inserted in the human mesenchymal stem cells after Pit-1 transfection.

상기 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포를 항생제가 포함된 배지에서 배양하는 단계는 세포 배양시에 무균 상태 유지를 위해서 항생제가 포함된 배지에서 상기 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포만을 배양하는 과정을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 항생제가 포함된 배지에 배양하는 단계는 Pit-1을 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션시킨 후에 수행될 수 있다. 만약 Pit-1이 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션 된 후에 상기 항생제가 포함된 배지에서 배양 시키지 않으면, Pit-1 이 트랜스펙션 된 인간 중간엽 줄기 세포만 배양되지 않고, 이후 상기 인간 중간엽 줄기세포가 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화되지 못할 수 있다. The step of culturing the human mesenchymal stem cells transfected with the Pit-1 in a medium containing antibiotics is a human transfected with the Pit-1 in a medium containing antibiotics to maintain sterility during cell culture. It means the process of culturing only mesenchymal stem cells. According to an embodiment of the present invention, the step of culturing the medium containing the antibiotic may be performed after transfection of Pit-1 into human mesenchymal stem cells. If Pit-1 is not cultured in the medium containing the antibiotic after being transfected into human mesenchymal stem cells, only human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 are not cultured, and then the human mesenchymal Stem cells may not differentiate into cells that secrete thyroid-stimulating hormone.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 항생제는 암피실린(ampicillin), 클로테트라사이클린(chlortetracycline), 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 틸로신(tylosin), G418 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 바람직하게는 G418 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 G418 및 네오마이신(neomycin)일 수 있다.According to another embodiment of the invention, the antibiotic is ampicillin (ampicillin), clotetracycline (chlortetracycline), dihydrostreptomycin (dihydrostreptomycin), gentamicin (gentamycin), kanamycin (kanamycin), spectinomycin (spectinomycin) , Streptomycin, tetracycline, tylosin, G418, and neomycin. Preferably, it may be at least one selected from the group consisting of G418 and neomycin, and more preferably G418 and neomycin.

상기 항생제가 포함된 배지에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포를 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3 내지 6중량%가 포함된 배지에서 안정화시키는 단계는 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포가 항생제가 포함된 배지에서 배양되는 동안 받은 스트레스를 경감시키고 또한 이후에 수행될 GATA2트랜스펙션이 가능 하도록 상기 인간 중간엽 줄기세포를 준비시키는 과정을 의미한다. 특히, 상기 안정화시키는 단계는 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3 내지 6중량%가 포함된 배지를 사용할 수 있는데, 이는 당업계에서 널리 사용되는10중량%의 우태아혈청이 포함된 배지를 사용하는 것과는 차이가 있으며, 또한 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것과도 차이가 있다. Stabilizing the human mesenchymal stem cells cultured in the medium containing the antibiotic in a medium containing 3 to 6% by weight of fetal bovine serum relative to 100% by weight of the total medium is human mesenchymal transfected with Pit-1. It refers to a process of preparing the human mesenchymal stem cells so that the stem cells can reduce the stress received while being cultured in a medium containing antibiotics, and further enable GATA2 transfection to be performed later. In particular, the stabilizing step may use a medium containing 3 to 6% by weight of fetal bovine serum relative to 100% by weight of the total medium, which is a medium containing 10% by weight of fetal bovine serum widely used in the art. There is a difference from using it, and it is also different from using a medium that does not contain serum.

당업계에서 인간 유래 세포를 포함해서 동물세포를 배양할 때 혈청이 포함된 배지를 사용할 수 있는데 이는 혈청이 호르몬, 생장인자, 비타민을 공급해 줌으로써 동물세포의 생장과 활성을 촉진시킬 수 있기 때문이다. 혈청은 이외에도 단백질 분해효소 (protease)의 활성을 억제하고, pH 조절용 완충제 역할을 할 수 있다. 그러나 혈청을 멸균하기 위하여 가열법을 사용하지 못하고 여과 (filtration)해야 하기 때문에 마이코플라즈마 (mycoplasma) 또는 바이러스 등에 의한 오염의 가능성을 증가시킬 수 있고, 또한 혈청을 함유한 배지는 거품이 잘 생길 수 있다. 그러나 혈청 사용의 가장 큰 문제점은 배치 (batch) 마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 혈청을 사용한 실험은 재현성을 얻기 어렵다는 점이다. 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다 하더라도 그 배양의 결과가 항상 다르게 나타날 수 있다. 본 발명은 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화시키는데 그 목적이 있고, 이를 위한 하나의 단계로서 상기 안정화시키는 단계가 수행되는데, 당업계에서 사용되는 10중량%의 우태아혈청을 사용하게 되면 본 발명이 이루고자 하는 목적을 달성할 수 없을 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면, 만약 상기 안정화시키는 단계에서 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 6중량%를 초과하여 포함하는 배지를 사용하게 되면, 이후에 수행될 GATA2형질이 상기 인간 중간엽 줄기세포에 도입 안될 수 있고 또한 항생제 처리에 대한 효과를 반감시킬 수 있다. When culturing animal cells including human-derived cells in the art, it is possible to use a medium containing serum, since serum can promote the growth and activity of animal cells by supplying hormones, growth factors, and vitamins. Serum may also inhibit protease activity and act as a buffer for pH control. However, since the heating method cannot be used to sterilize the serum and must be filtered, it is possible to increase the possibility of contamination by mycoplasma or viruses, and the medium containing the serum may well foam. . However, the biggest problem with the use of serum is that it is difficult to obtain reproducibility in experiments with serum because the composition of serum varies from batch to batch. Even if the same cell is cultured in the medium of the same component, the result of the culture may always be different. The present invention has the purpose of differentiating human mesenchymal stem cells into cells that secrete thyroid-stimulating hormone, and the stabilizing step is performed as one step for this, 10% by weight fetal bovine serum used in the art. If it is used, it may not be able to achieve the object to be achieved by the present invention. More specifically, according to an embodiment of the present invention, if using a medium containing more than 6% by weight of fetal bovine serum relative to 100% by weight of the total medium in the stabilizing step, the GATA2 trait to be performed later It may not be introduced into the human mesenchymal stem cells, and may also halve the effect on antibiotic treatment.

당업계에서는 상기 혈청을 포함한 배지의 문제점을 극복하기 위해 무혈청(serum-free) 배지를 사용하기도 하는데, 무혈청 배지 내에는 포도당, 글루타민, 다른 아미노산, 염들 이외에도 혈청 대체 물질로서 인슐린, 트렌스페린 (transferrin), 셀레늄 (selenium)을 포함할 수 있다. 무혈청 배지는 그 구성 물질의 조성을 분명히 알 수 있어 배지 조성이 표준화되며 실험의 재현성을 높힐 수 있고 멸균이 용이하며, 생성물의 정제가 쉽다. 하지만, 용도에 따라 맞춤 생산이 되어야 하는 점, 세포의 생장속도가 혈청이 함유된 배지보다 느린 점, 세포 계통마다 서로 다른 무혈청 배지 조성을 요구하는 점과 무혈청 배지에 적응되지 않는 세포 계통이 있다는 점이다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 만약 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3중량%미만을 포함하는 배지를 사용하게 되면, 무혈청배지를 사용하게 되는 것과 유사한 효과를 지니게 되는데, 이는 인간 중간엽 줄기세포를 항생제 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 상기 안정화시키는 단계 전에 포함하는 본 발명에서 상기 항생제의 효과를 지속하여 하여 지나치게 높게 유지시켜서 인간 중간엽 줄기세포에 유해할 수 있다. 이는 다시 이후에 수행될 GATA2 트랜스펙션을 방해하여 인간 중간엽 줄기세포가 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화되지 못하게 할 수 있다.In the art, a serum-free medium is sometimes used to overcome the problem of the medium containing the serum. In addition, glucose, glutamine, other amino acids, salts, and insulin, transferrin, as a serum substitute, are included in the serum-free medium. transferrin), selenium. The serum-free medium can clearly know the composition of its constituent materials, thereby standardizing the medium composition, increasing the reproducibility of the experiment, and being easy to sterilize, and easy to purify the product. However, there must be customized production according to the application, the growth rate of cells is slower than the medium containing serum, the different cell lineages require different serum-free medium composition, and there are cell lines that do not adapt to the serum-free medium. It is a point. According to an embodiment of the present invention, if a medium containing less than 3% by weight of fetal bovine serum is used for 100% by weight of the total medium, it has a similar effect to that of using a serum-free medium, which is human medium. In the present invention including the step of culturing the mesenchymal stem cells in a medium containing antibiotics before the stabilizing step, the effect of the antibiotics may be maintained to maintain an excessively high level, which may be harmful to human mesenchymal stem cells. This may again prevent GATA2 transfection to be performed later, thereby preventing human mesenchymal stem cells from differentiating into cells that secrete thyroid-stimulating hormone.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 우태아혈청은 전체 배지 100중량%에 대해 3 내지 6중량%을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 4 내지 6중량%일 수 있다. 가장 바람직하게는 전체 배지 100중량%에 대해 5중량%일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the fetal calf serum may contain 3 to 6% by weight, more preferably 4 to 6% by weight relative to 100% by weight of the total medium. Most preferably, it may be 5% by weight relative to 100% by weight of the total medium.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 안정화시키는 단계는 인간 중간엽 줄기세포의 confluence가 50 내지 80%가 될 때까지 유지될 수 있다. 상기 confluence는 세포 배양 플레이트의 전체 면적에서 성장하는 세포들의 면적이 차지하는 비율을 의미한다. 구체적으로, 만약 상기 confluence가 50%미만이면 상기 인간 중간엽 줄기세포가 안정화되지 않아서 이후 단계에서 수행될 GATA2트랜스펙션이 제대로 이루어지지 않을 수 있고, GATA2 트렌스펙션 이후에 인간 중간엽 줄기세포의 상태가 저하 될 수 있다. 이렇게 상태가 저하된 인간 중간엽 줄기세포들은 갑상선 자극 호르몬으로 분화 되기 전에 일찍 사멸 할 수 있다. 만약 상기 confluence가 80%를 초과_하면 인간 중간엽 줄기세포가 과잉증식하여 안정화된 세포들이 세포과밀화로 인해 GATA2트랜스펙션이 제대로 이루어지지 않을 수 있어 인간 중간엽 줄기세포들은 갑상선 자극 호르몬 분비세포로 분화되기 어려울 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the stabilizing step may be maintained until the confluence of human mesenchymal stem cells is 50 to 80%. The confluence means the proportion of the area of cells growing in the total area of the cell culture plate. Specifically, if the confluence is less than 50%, the human mesenchymal stem cells are not stabilized, so that GATA2 transfection to be performed in a later step may not be properly performed, and the state of human mesenchymal stem cells after GATA2 transfection May degrade. Human mesenchymal stem cells in this reduced state can die early before they differentiate into thyroid-stimulating hormone. If the confluence exceeds 80%, the human mesenchymal stem cells are overproliferated, and the stabilized cells may not be properly transfected due to cell overcrowding. It can be difficult to differentiate.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 안정화시키는 단계는 3 내지 14일동안 이루어질 수 있다. 구체적으로, 3 내지 10일동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 7일동안 이루어질 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the stabilizing step may be performed for 3 to 14 days. Specifically, it may be performed for 3 to 10 days, and preferably 3 to 7 days.

상기 안정화된 인간 중간엽 줄기세포에 GATA2를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계는 상기 인간 중간엽 줄기세포가 GATA2를 발현할 수 있도록 GATA2코딩 핵산을 벡터에 삽입한 후 상기 벡터를 상기 안정화된 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션 시키는 과정을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드일 수 있으나, 단백질을 코딩하는 핵산을 트랜스펙션 시키기 위해 당업계에서 사용되는 벡터라면 제한없이 사용이 가능하다. The step of transfecting a vector containing a nucleic acid encoding GATA2 in the stabilized human mesenchymal stem cells is performed by inserting a GATA2 encoding nucleic acid into the vector so that the human mesenchymal stem cells express GATA2, and then inserting the vector. It means the process of transfecting the stabilized human mesenchymal stem cells. The vector may be a plasmid, but any vector used in the art for transfecting a nucleic acid encoding a protein can be used without limitation.

상기 GATA2(GATA-binding factor 2)는 유전자의 발현을 제어할 수 있는 전사인자로서, 세포핵 단백질의 하나이다. 상기 GATA2는 배아발달, 혈액 형성 줄기세포, 림프계 형성 줄기세포 및 다른 조직형성 줄기세포의 자기재생, 유지 및 기능성과 관련된 유전자들을 제어할 수 있다. 또한 상기 GATA2는 Pit-1과 상호작용하여 기능을 할 수 있고, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 GATA2는 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션되어 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화하는데 작용할 수 있다. 도6 및 도7을 참조해서 보면, Pit-1만으로는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 세포로 분화시킬 수 없었고, Pit-1이외에 GATA2를 인간 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션시킴으로써 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극 호르몬 분비세포로 분화시킬 수 있었다.The GATA2 (GATA-binding factor 2) is a transcription factor capable of controlling gene expression, and is one of cell nucleus proteins. The GATA2 can control genes related to self-renewal, maintenance and functionality of embryonic development, blood forming stem cells, lymphoid forming stem cells and other tissue forming stem cells. In addition, the GATA2 may function by interacting with Pit-1, and according to an embodiment of the present invention, the GATA2 is transfected into human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 to produce thyroid stimulating hormone. May act to differentiate into secreting cells. Referring to FIGS. 6 and 7, Pit-1 alone could not differentiate human mesenchymal stem cells into cells that secrete thyroid-stimulating hormone, and transfected GATA2 into human mesenchymal stem cells other than Pit-1. Mesenchymal stem cells could be differentiated into thyroid-stimulating hormone-secreting cells.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 GATA2 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 우태아혈청이 포함된 배지에서 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계는 GATA2트랜스펙션 이후에 인간 중간엽 줄기세포내에서 GATA2유전자가 제대로 삽입되도록 할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the step of culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal bovine serum after the step of transfecting GATA2 may be further included. The step of culturing the human mesenchymal stem cells in the medium containing fetal bovine serum can ensure that the GATA2 gene is properly inserted in the human mesenchymal stem cells after GATA2 transfection.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art to which the present invention pertains can easily practice. However, the present invention can be implemented in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.

실시예1. 플라스미드 DNA제조(Pit-1 및 GATA2)Example 1. Plasmid DNA production (Pit-1 and GATA2)

Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free, Cat. No. PIE25) Geneaid Biotech Ltd. 를 사용하여 Pit-1유전자 및 GATA2 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 제조하였다. 사용된 Pit-1유전자는 POU1F1 (Myc-DDK-tagged)-Human POU class1 homeobox 1 (POU1F1), transcript variant alpha. (OriGene Technologies Inc., Cat. No. RC216387, Accession No,: NM_000306, Vector : pCMV6-Entry (Cat# PS100001), Antibiotic Resistance: Kanamycin (25 ug/ml), Restriction site: Sgfl-Mlul)이고, GATA2유전자는 GATA2(GFP-tagged)-Human GATA binding protein 2 (GATA2), transcript variant 1, (OriGene Technologies Inc., Cat. No. RG227363, Accession No.: NM_001145661, Vector: pCMV6-AC-GFP, Antibiotic Resistance: Ampicillin (100 ug/ml), Restriction site: Sgfl-Mlul) 이다. Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free, Cat.No.PIE25) Geneaid Biotech Ltd. Plasmid DNA containing the Pit-1 gene and GATA2 gene was prepared using. The Pit-1 gene used was POU1F1 (Myc-DDK-tagged) -Human POU class1 homeobox 1 (POU1F1), transcript variant alpha. (OriGene Technologies Inc., Cat.No.RC216387, Accession No ,: NM_000306, Vector: pCMV6-Entry (Cat # PS100001), Antibiotic Resistance: Kanamycin (25 ug / ml), Restriction site: Sgfl-Mlul), GATA2 Genes are GATA2 (GFP-tagged) -Human GATA binding protein 2 (GATA2), transcript variant 1, (OriGene Technologies Inc., Cat.No.RG227363, Accession No .: NM_001145661, Vector: pCMV6-AC-GFP, Antibiotic Resistance : Ampicillin (100 ug / ml), Restriction site: Sgfl-Mlul).

제조사의 매뉴얼에 따라서, 세포 펠렛(pellet)을 만들기 위해 원심분리를 통해 배양된 박테리아를 수득한 뒤 재부유(resuspension)시켰다. 그런 다음, 박테리아 세포를 용해시킨 뒤 부유물을 중화시켰다. PIE02 및 PIE25를 사용할때, 중립화 처리 이후에 엔도톡신(endotoxin)을 제거하기 위해 PER 버퍼처리를 하였다. 오염물들이 부유상태로 남아있는 상태에서 DNA를 실리카 레진(silica resin)에 결합시킨 후 세척하였다. 순수한 플라스미드 DNA를 용리 시킨 후 침전시켰다. According to the manufacturer's manual, bacteria cultured through centrifugation to obtain cell pellets were obtained and then resuspended. Then, the bacterial cells were lysed and the suspension was neutralized. When using PIE02 and PIE25, PER buffer treatment was performed to remove endotoxins after neutralization treatment. After the contaminants remained suspended, the DNA was bound to a silica resin and washed. The pure plasmid DNA was eluted and then precipitated.

실시예2. 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포 배양Example 2. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell culture

계대배양 passage 4인 상태의 인간탯줄(umbilical cord blood) 유래 중간엽 줄기세포를 CFBIO(한국)으로부터 수득하였다. 수득한 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 5일동안 confluence가 70%가 될 때까지 10 % FBS, 1% Penicillin 및 streptomycin을 포함하는 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 배지 (Human Umbilical Cord derived MSC Growth Medium, CB-UCMSC-GM; 세포바이오)에서 배양하였다.Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood in the passage 4 passage were obtained from CFBIO (Korea). Human Umbilical Cord derived MSC Growth Medium, containing 10% FBS, 1% Penicillin and streptomycin until the confluence of the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells was 70% for 5 days. CB-UCMSC-GM; Cell Bio).

실시예3. 트랜스펙션(Pit-1 및 GATA2) 및 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포 안정화Example 3. Transfection (Pit-1 and GATA2) and human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell stabilization

실시예2에서 배양된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 24 well플레이트에서 5x104 세포수/500ul 분주하여 24시간동안 인큐베이션시켰다. 이후 배양배지를 제거하고 나서 실시예1에서 준비된 Pit-1 유전자를 가진 플라스미드 DNA(배지 50 ul 당 0.8 ug) 및 Lipofectamin (배지50 ul에 2 ul)(Life TechnologiesTM , CAT. No. 15338-100)을 OPTI-MEM배지 하에서 6시간동안 트랜스펙션 시켰다. 이후에 배지를 10%의 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM배지로 바꿔준 뒤 2일동안 인큐베이션시켰다. 그리고 나서, 기존 배지를 100 μg/ml의 Neomycin 및 100 μg/ml의 G418 이 포함된 DMEM 선택성 배지로 바꿔 배양 시켜 Pit-1유전자를 가진 플라스미드 DNA가 트랜스펙션된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포만을 수득하였다. 그런 다음 Pit-1유전자가 트랜스펙션된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 5%의 우태아혈청을 포함하는 DMEM Reduced Serum Medium에서 5일동안 안정화시키는 과정을 거쳤고, confluence가 70%가 되었을 때, GATA2유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 및 Lipofectamin (배지50 ul에 2 ul)(Life TechnologiesTM , CAT. No. 15338-100)을 OPTI-MEM배지 하에서 6시간동안 트랜스펙션 시켰다. GATA2가 트랜스펙션된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 10%의 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지에서 2일동안 배양시켰다.The human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in Example 2 were incubated for 24 hours by dispensing 5 × 10 4 cells / 500ul in a 24 well plate. After removal of the culture medium, the plasmid DNA having the Pit-1 gene prepared in Example 1 (0.8 ug per 50 ul of medium) and Lipofectamin (2 ul in 50 ul of medium) (Life TechnologiesTM, CAT. No. 15338-100) Was transfected under OPTI-MEM medium for 6 hours. Thereafter, the medium was changed to a DMEM medium containing 10% fetal calf serum (FBS) and incubated for 2 days. Then, the existing medium was cultured by replacing the medium with a DMEM selective medium containing 100 μg / ml Neomycin and 100 μg / ml G418 to transfect human umbilical cord stem cells derived from plasmid DNA with the Pit-1 gene. Obtained. Then, the human umbilical cord stem cell transfected with the Pit-1 gene was stabilized for 5 days in DMEM Reduced Serum Medium containing 5% fetal bovine serum, and when the confluence reached 70%, Plasmid DNA containing the GATA2 gene and Lipofectamin (2 ul in 50 ul medium) (Life TechnologiesTM, CAT. No. 15338-100) were transfected for 6 hours under OPTI-MEM medium. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transfected with GATA2 were cultured for 2 days in DMEM medium containing 10% fetal calf serum.

실시예4. 면역화학염색Example 4. Immunochemical staining

면역화학염색법을 통해서 실시예3에서 트랜스펙션된 Pit-1 및 GATA2가 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포에 유전형질주입이 제대로 되었는지 확인하였다. 먼저 커버 슬라이드 코팅을 위해서 24 well culture 플레이트에 라운드 커버슬라이드를 넣고, well에 1%의 젤라틴 1ml을 넣고 1일동안 36도 인큐베이터에서 인큐베이션 시켰다. 이후 젤라틴을 제거하고 PBS로 3번 세척하였다. 그리고 나서 Pit-1 및 GATA2가 트랜스펙션된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포를 분주했다. 분주된 세포들을 1일 동안 배양한 후, 천천히 세포가 떨어지지 않게 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 4% 의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고 나서 PBS로 3번 세척하였다. 그리고 나서, blocking buffer(3% BSA, 5%NDS, 5% NHS, 0.1% Triton X-100 in PBS)로 30분동안 인큐베이션시켰다. 이후에, Myc (rabbit, 1:500; abcam, ab32072), Pit-1 (mouse, abcam, ab10545) 및 TSH beta (R&D systems, monoclonal mouse lgG1, Clone#512908 Cat # MAB57941)에 대한 1차 항체를 넣고 4℃에서 3시간동안 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션이 끝난 후 PBS로 5분동안 3회 세척하였고, 2차 항체(anti-mouse Alexa-Cy3 (1:400) 및 anti-rabbit Alexa488 (1:400))를 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 이후에 PBS로 5분동안 3회 세척을 한 후, DAPI 를 포함하는VECTASHIELD Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories) 를 30분동안 상온에서 빛 차단 상태에서 반응시켰다. 도 1을 참고하면, 인간 중간엽 줄기세포에 Myc-DDK-Pit1 트랜스펙션 주입한 후, 세포 내에 유전자 형질 주입이 되었는지 면역형광염색을 통해 확인한 사진이며 Myc-DDK-Pit1 트랜스펙션 주입한 세포는 Myc 와 Pit1 모두 양성으로 염색되었다. Control은 세포내 유전자를 형질 주입하지 않은 세포이고, pCMV-Myc-N을 세포에 트랜스펙션 주입한 세포는 Myc 만 양성으로 염색되었다. 또한, 도5를 참고하면, 설치류 갑상선 암 세포인 GH3 세포를 THS β 염색의 positive control로 사용하여 염색하였고, Pit-1/GATA2 유전자 트랜스펙션 주입한 인간 중간엽 줄기세포에서 THS β 양성으로 염색되는 것을 확인 하였다. It was confirmed through the immunochemical staining method that Pit-1 and GATA2 transfected in Example 3 were properly genotyped into human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. First, for the cover slide coating, a round cover slide was placed in a 24 well culture plate, 1 ml of 1% gelatin was added to the well, and incubated in a 36 degree incubator for 1 day. The gelatin was then removed and washed 3 times with PBS. The human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 and GATA2 were then dispensed. After the cultured cells were cultured for 1 day, the culture solution was slowly removed so that the cells did not fall off, washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and then washed 3 times with PBS. Then, it was incubated with blocking buffer (3% BSA, 5% NDS, 5% NHS, 0.1% Triton X-100 in PBS) for 30 minutes. Subsequently, primary antibodies against Myc (rabbit, 1: 500; abcam, ab32072), Pit-1 (mouse, abcam, ab10545) and TSH beta (R & D systems, monoclonal mouse lgG1, Clone # 512908 Cat # MAB57941) Put in and incubated for 3 hours at 4 ℃. After the incubation, the cells were washed three times with PBS for 5 minutes, and secondary antibodies (anti-mouse Alexa-Cy3 (1: 400) and anti-rabbit Alexa488 (1: 400)) were reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBS for 5 minutes, VECTASHIELD Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories) containing DAPI was reacted at room temperature for 30 minutes under light blocking. Referring to FIG. 1, after injecting Myc-DDK-Pit1 transfection into human mesenchymal stem cells, it is a photograph confirming whether the gene has been transfected into cells through immunofluorescence staining, and the cells injected with Myc-DDK-Pit1 transfection Was stained positive with both Myc and Pit1. Control is a cell that has not been transfected with an intracellular gene, and cells transfected with pCMV-Myc-N have been stained with only Myc positive. In addition, referring to Figure 5, rodent thyroid cancer cells GH3 cells were stained using positive control of THS β staining, and stained with THS β positive in human mesenchymal stem cells injected with Pit-1 / GATA2 gene transfection. It was confirmed that.

실시예5. RT-PCRExample 5. RT-PCR

실시예 3에서 트랜스펙션시킨 Pit-1 및 GATA2의 발현여부를 확인하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. 이를 위한 준비단계로서, Total RNA추출을 위해 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다. Pit-1 및 GATA2이 트랜스펙션된 인간 탯줄유래 중간엽 줄기세포에 1ml 트리졸을 처리하여 4분 있다가 세포를 걷었다. 그리고 200ul의 클로로포름(chloroform)을 넣고 잘 섞어주고 나서, 원심분리기에 넣고 4º13000 rpm으로 15동안 원심분리하였다. 투명한 상등액과 중간층의 찌꺼기, 핑크색의 하등액으로 나뉘는데, 3가지 층으로 나뉜 sample에서 투명한 상등액 400ul을 따서 준비된 새 EP tube에 옮겼다. 투명한 상등액이 들어있는 EP tube에 상등액과 동량으로 이소프로필 알코올(isopropyl alchol)을 넣고 vortex를 이용하여 잘 섞어주었다. 실온에서 10분 반응시킨 후 sup(액체부분)을 버렸다. RNA pellet을 75% 에탄올 1ml을 넣고, Tapping후 원심분리기로 4º에서 13000 rpm으로 10분동안 원심분리시켰다. 그리고 DEPC water를 30~50ul를 넣어 RNA pellet을 녹여주고 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC )로 정량 하였다. RT-PCR was performed to confirm the expression of the transfected Pit-1 and GATA2 in Example 3. As a preparation step for this, it was separated using Tri-reagent (TR118, MRC co.) Extraction method for total RNA extraction. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 and GATA2 were treated with 1 ml trizol for 4 minutes before walking. Then, 200ul of chloroform was added and mixed well, and then placed in a centrifuge and centrifuged at 4º13000 rpm for 15 minutes. It is divided into a transparent supernatant, a residue in the middle layer, and a pink lower solution. 400ul of the transparent supernatant was taken from a sample divided into three layers and transferred to a new prepared EP tube. In the EP tube containing the transparent supernatant, isopropyl alcohol was added in the same amount as the supernatant and mixed well using vortex. After reacting for 10 minutes at room temperature, the sup (liquid part) was discarded. The RNA pellet was added with 1 ml of 75% ethanol, and after tapping, it was centrifuged for 10 minutes at 13,000 rpm at 4º with a centrifuge. Then, 30-50 ul of DEPC water was added to dissolve the RNA pellet and quantified with NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC).

이후, cDNA를 제조하기 위해서 정량 값에 따라 RNA sample (농도 1ug) (max: 9ul), DEPC 물 (9-RNA sample 양) 및 Oligo dT 1ul (Bioneer, 냉동실)을 PCR tube에 넣어 total 10ul를 만들었다. 그리고 Vortex후 10초간 spin down 해주고 난뒤, PCR 기계에 넣고 cycle 1 (70°C for 5 min and place it on ice. )을 돌려주었다. Cycle 1 진행이 끝나면 AccuPower®RT PreMix 튜브 (Bioneer)로 옮겨서 DEPC 물을 넣어 vortexing하여 섞고 spin down 한 뒤, cycle 2 (42°C, 60 분 (cDNA synthesis) 및; 94°C, 5 분(RTase inactivation))을 진행하여 cDNA를 얻었다. Then, in order to prepare cDNA, RNA samples (concentration 1 ug) (max: 9 ul), DEPC water (9-RNA sample quantum) and Oligo dT 1 ul (Bioneer, freezer) were added to PCR tubes according to the quantitative values to make total 10 ul. . Then, spin down for 10 seconds after vortex, put it in the PCR machine, and return cycle 1 (70 ° C for 5 min and place it on ice.). After the completion of Cycle 1, transfer to the AccuPower®RT PreMix tube (Bioneer), add DEPC water, vortex, mix and spin down, cycle 2 (42 ° C, 60 minutes (cDNA synthesis) and; 94 ° C, 5 minutes (RTase inactivation)) to obtain cDNA.

얻은 cDNA로 AccuPower®PCR PreMix (Bioneer)을 사용하여 RT-PCR 을 진행하였고, PCR 산물은 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동방법으로 분석하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열을 표1에 나타내었다. 그리고, 전기영동분석 결과값은 도2, 도4 및 도6으로 나타냈었고, 도2를 참고하여 보면, Myc-DDK-Pit1 형질 주입한 인간 중간엽 줄기세포(Pit1-hM)내에서 Pit1의 발현을 확인하였다(hM : 인간 중간엽 줄기세포에 유전자 형질을 주입하지 않은 세포에서의 Pit1의 발현; cM: 인간 중간엽 줄기세포에 pCMV-Myc-N 를 형질 주입한 세포에서의 Pit1의 발현). 도 6은 TSH β발현을 보여주며, Pit-1 유전자 트랜스펙션 주입한 인간 중간엽 줄기세포는 TSH β발현이 없고, Pit-1 유전자 주입후 GATA2 유전자 주입한 Pit1/GATA2 유전자 주입한 인간 중간엽 줄기세포는 모두 TSH β 유전자 발현을 보였다. RT-PCR was performed using AccuPower®PCR PreMix (Bioneer) as the obtained cDNA, and PCR products were analyzed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel. Table 1 shows the primer sequences used for PCR. And, the results of the electrophoresis analysis are shown in FIGS. 2, 4, and 6, and referring to FIG. 2, Pit1 in human mesenchymal stem cells (Pit1-hM) transfected with Myc-DDK-Pit1 is transfected. Expression was confirmed (hM: expression of Pit1 in cells not transfected with human mesenchymal stem cells; cM: expression of Pit1 in cells transfected with human mesenchymal stem cells with pCMV-Myc-N) . Figure 6 shows TSH β expression, human mesenchymal stem cells injected with Pit-1 gene transfection have no TSH β expression, and human mesenchymal injected with Pit1 / GATA2 gene injected with GATA2 gene after Pit-1 gene injection All of the stem cells showed TSH β gene expression.

유전자gene 정방향 프라이머(5'->3')Forward primer (5 '-> 3') 역방향 프라이머(5'->3')Reverse primer (5 '-> 3') Pit-1Pit-1 GTGATGTCTACAGCAACAGGACTGTGATGTCTACAGCAACAGGACT GGCCTCCCCAACATTTGTCTGGCCTCCCCAACATTTGTCT GATA2GATA2 GCGTCAAGTACCAGGTGTCAGCGTCAAGTACCAGGTGTCA AATTTGCACAACAGGTGCCGAATTTGCACAACAGGTGCCG GAPDHGAPDH CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGACAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC TSH betaTSH beta CCACAGCATCTGCTCACCAATCCACAGCATCTGCTCACCAAT AGCAACATGGAGTGGGCATCAGCAACATGGAGTGGGCATC

실시예6. ELISA(TSH beta)Example 6. ELISA (TSH beta)

ELISA를 통해서 본 발명에 따른 인간 중간엽 줄기세포가 갑상선 자극 호르몬(TSH)를 분비하는지 확인하였다. 사용된 Kit는 Human Thyroid Stimulating Hormone ELISA Kit (RAB0502, Sigma Aldrich (Lot # 0329D0291, RAB 0502-1KT)로서, 제조사의 매뉴얼에 따라서, 표준용액 및 세포를 배양한 배양액 샘플을 각각100 ul씩 플레이트의 well에 담고 실온에서 2.5시간동안 인큐베이션시켰다. 이후 용액들을 버리고 나서 1x 세척용액으로 4번 세척하였고, 이후 모든 세척용액을 버렸다. 그리고 나서 각 well에 100ul의 1x biotunylated Detection 항체를 넣어주고 실온에서 1시간동안 약간의 shaking을 유지하면서 인큐베이션시켰다. 용액을 버린 후 상기 세척과정을 3번 반복하였다. 세척후, 100ul의 HRP-Streptavidin 용액을 각 well에 넣어주고 실온에서 45분동안 약간의 shaking을 유지하면서 인큐베이션시켰다. 다시 용액을 버린 후 상기 세척과정을 3번 반복하였다. 세척후, 100ul의 ELISA Colorimetric TMB 시약을 각 well에 넣어준 뒤, 실온에서 30분동안 약간의 shaking을 유지하면서 인큐베이션시켰다. 이후, 각 well에 50ul의 Stop 용액을 넣어준 뒤 450 nm 파장대에서 결과값을 측정하였다. 그 결과값은 도7로 나타내었으며, 도7을 참고하여 보면, TSH β가 세포에서 분비되는지 ELISA로 양을 측정한 결과를 나타내었다. Pit-1 유전자 트랜스펙션 주입한 인간 중간엽 줄기세포는 TSH β 분비가 없었고, Pit-1 유전자 주입후 GATA2 유전자 주입한 인간 중간엽 줄기세포는 모두 TSH β가 분비되는 것을 확인하였다. 세포 수에 따른 분비양의 그래프는 설치류의 갑상선 종양 세포보다 분비양이 높았다. It was confirmed through ELISA that the human mesenchymal stem cells according to the present invention secrete thyroid stimulating hormone (TSH). The kit used is the Human Thyroid Stimulating Hormone ELISA Kit (RAB0502, Sigma Aldrich (Lot # 0329D0291, RAB 0502-1KT)). And incubated for 2.5 hours at room temperature, then the solutions were discarded and washed 4 times with 1x wash solution, then all wash solutions were discarded, and then 100 ul of 1x biotunylated Detection antibody was added to each well and allowed to stand for 1 hour at room temperature. The solution was discarded and the washing process was repeated 3 times.After washing, 100 ul of HRP-Streptavidin solution was added to each well and incubated while maintaining slight shaking at room temperature for 45 minutes. After the solution was discarded again, the above washing process was repeated 3. After washing, 100 ul of ELISA Colorimetric TMB reagent was added to each well, followed by incubation while maintaining slight shaking for 30 minutes at room temperature. After putting 50ul of Stop solution, the result was measured in the wavelength range of 450 nm, and the result is shown in Fig. 7. Referring to Fig. 7, the amount of TSH β is secreted from the cells and measured by ELISA. Human mesenchymal stem cells injected with Pit-1 gene transfection had no TSH β secretion, and all human mesenchymal stem cells injected with GATA2 gene after Pit-1 gene injection were confirmed to have TSH β secretion. The graph of the amount of secretion according to the number of cells was higher than that of rodent thyroid tumor cells.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The above description of the present invention is for illustration only, and those skilled in the art to which the present invention pertains can understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. For example, each component described as a single type may be implemented in a distributed manner, and similarly, components described as distributed may be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all modifications or variations derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be interpreted to be included in the scope of the present invention.

Claims (8)

인간 중간엽 줄기세포를 수득한 후 배양하는 단계;
상기 배양된 인간 중간엽 줄기세포에 Pit-1을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계;
상기 Pit-1이 트랜스펙션된 인간 중간엽 줄기세포를 항생제가 포함된 배지에서 배양하는 단계;
상기 항생제가 포함된 배지에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포를 전체 배지 100중량%에 대해 우태아혈청 3 내지 6중량%가 포함된 배지에서 안정화시키는 단계; 및
상기 안정화된 인간 중간엽 줄기세포에 GATA2를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 트랜스펙션시키는 단계;
를 포함하고,
상기 인간 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄 유래인 것을 특징으로 하며,
상기 수득된 인간 중간엽 줄기세포는 계대배양 passage 3 내지 5 상태인 것을 특징으로 하고,
상기 안정화시키는 단계는 인간 중간엽 줄기세포의 confluence가 50 내지 80%가 될 때까지 유지되는 것을 특징으로 하는,
인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법.Obtaining and culturing the human mesenchymal stem cells;
Transfecting the cultured human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding Pit-1;
Culturing the human mesenchymal stem cells transfected with Pit-1 in a medium containing antibiotics;
Stabilizing the human mesenchymal stem cells cultured in the medium containing the antibiotic in a medium containing 3 to 6% by weight of fetal calf serum relative to 100% by weight of the entire medium; And
Transfecting the stabilized human mesenchymal stem cells with a vector containing a nucleic acid encoding GATA2;
Including,
The human mesenchymal stem cells are characterized by being derived from human umbilical cord,
The obtained human mesenchymal stem cells are characterized by being in a passage 3 to 5 state,
The stabilizing step is characterized in that the confluence of human mesenchymal stem cells is maintained until 50 to 80%,
A method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 항생제는 암피실린(ampicillin), 클로테트라사이클린(chlortetracycline), 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 틸로신(tylosin), G418 및 네오마이신(neomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법.According to claim 1,
The antibiotics include ampicillin, chlortetracycline, dihydrostreptomycin, gentamicin, kanamycin, spectinomycin, streptomycin, tetracycline Method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells, characterized in that they are at least one selected from the group consisting of Tetracycline, tylosin, G418, and neomycin. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 안정화시키는 단계는 3 내지 14일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법.According to claim 1,
The stabilizing step is a method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells, characterized in that it is performed for 3 to 14 days. 제1항에 있어서,
상기 Pit-1 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법.According to claim 1,
Differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells further comprising culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal bovine serum after the step of transfecting Pit-1. How to order. 제1항에 있어서,
상기 GATA2 트랜스펙션시키는 단계 이후에 우태아혈청이 포함된 배지에서 상기 인간 중간엽 줄기세포를 배양시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 중간엽 줄기세포를 갑상선 자극호르몬 분비세포로 분화시키는 방법.According to claim 1,
A method for differentiating human mesenchymal stem cells into thyroid-stimulating hormone secreting cells, further comprising culturing the human mesenchymal stem cells in a medium containing fetal calf serum after the step of transfecting GATA2. .
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