KR102114203B1 - 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 바이러스 다중 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토마토에 발생하는 토마토 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 다중 진단용 조성물, 다중 진단용 키트, 및 다중 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 표시되는 프라이머들을 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
Description
본 발명은 토마토에 발생하는 토마토 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 다중 진단용 조성물, 다중 진단용 키트, 및 다중 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 토마토에 발생하는 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV) 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 4종의 토마토 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 다중 진단용 조성물, 다중 진단용 키트, 및 다중 진단 방법에 관한 것이다.
토마토는 대표적인 시설 원예 작물로서 웰빙 식품으로 지속적인 관심을 받고 있어 중요한 농가 소득작물이며, 일부 지역에서는 해외로 수출까지 하고 있어 대한민국 농업생산 소득의 큰 부분을 차지하고 있다. 대한민국에서는 토마토가 대부분 시설 내에서 재배되기 때문에 연중 생산이 가능한데 특히 5-8월까지 생산되는 여름 작형에 가장 많이 재배되고 있다. 그런데 토마토 시설재배지에서는 몇 년 전부터 바이러스에 의한 피해 증상이 발생하기 시작하였는데, 그 발생 지역과 면적이 점차 확대되면서 토마토 안정생산에 문제가 되고 있다.
그중에서도 지속적이고 광범위하게 토마토에 피해를 주는 바이러스인 TBSV(토마토덤불위축바이러스), TSWV(토마토반점위조바이러스), TYLCV(토마토황화잎말림바이러스)로 인한 농가피해가 확산되고 있으며 최근에는 ToCV(토마토퇴록바이러스)가 새로이 발생하여 국내 농가의 토마토 생산에 큰 피해를 주고 있다. TSWV와 TYLCV는 검역병해충으로 지정되어 국내 유입을 억제하고자 하였으나, 최초 발생 후에 전국에 만연하여 지속적인 피해를 유발하게 되자 국경검역 대상에서는 제외되었고 이로 인해 오히려 그 진단과 방제의 필요성이 날로 증대되고 있다. TBSV와 ToCV는 검역병해충으로 지정되어 국내 발생을 억제하고자 하는 노력을 기울이고 있어 이들 바이러스 또한 신속 정확한 진단의 필요성이 증가하고 있다. 최근에는 이들 바이러스가 복합(다중) 감염 형태로 발생하여 피해를 주고 있어, 동시 진단법을 통한 효율적인 바이러스 진단법 개발이 필요하다.
TBSV는 Tombusviride 과 Tombusvirus 속에 속하는 바이러스로, 직경이 30nm정도의 구형바이러스이다. 유전자는 약 4.3kb의 single stranded RNA로 구성되어 있다. TBSV는 종자(10-40%)와 토양오염에 의해 전염되는 것으로 알려져 있다. 국내에서는 2004년 사천 토마토에서 처음 발생이 확인되었고, 이후 부산, 충주 등 토마토 주산지를 중심으로 발생되고 있다 (도 1).
ToCV는 Closterviridae과 Crinivirus속에 속하는 바이러스이며 2013년에 최초 발생하여 문제가 되었으며 이후 발생이 증가하고 있다. ToCV는 담배가루이(Bemisia tabaci)와 온실가루이 (Trialeurodes vaporariorum)에 의해 전반되는 바이러스로 잎에 나타나는 퇴록이 주요한 병징이며, 영양결핍과 병징이 유상하여 농가의 비료 및 영양제의 오남용으로 인한 방제 실패와 경제적 손해를 유발할 수 있다. ToCV는 최초 발견 후에 감염시료를 빠르게 방제함으로써 대량 확산되지는 않았지만 TYLCV와 복합 감염되어 발생하는 사례가 지속적으로 보고되고 있어 계속해서 문제가 될 가능성이 있다 (도 2).
TSWV (토마토반점위조바이러스)는 Topsoviridae과 Orthotospovirus속에 속하는 바이러스로 종자나 토양에 의해 전염되지 않고, 총채벌레에 의해서만 영속 전염되는 바이러스이다. 이 바이러스에 감염된 작물체는 신초부위가 위축 또는 괴사되고 심하면 작물이 고사하게 되며, 이병된 과일은 원형반문이 나타나거나 기형이 되어 상품가치가 전혀 없는 치명적인 병이다. 대한민국에서 TSWV는 2003년 충남 예산에서 처음 발생이 확인되었으며, 2007년도 11개시군, 2008년도 28개 시군으로 급격히 확산되었으며 현재는 전국의 고추 재배지에 만연하게 발생되고 있다. TSWV는 특히 경제적으로 중요한 고추, 피망, 토마토 등 가지과 작물에 큰 피해를 주고 있는 실정이다 (도 3).
TYLCV는 Geminiviridae과 Begomovirus속에 속하는 바이러스로 대한민국에서는 2008년 경상남도 통영에서 최초로 발견되었다. 이후 국내 전역으로 확산되어 지속적으로 발생하고 있다. TYLCV는 잎말림과 성장 위축 등을 유발하여 토마토 생산에 피해를 준다. 담배가루이 (Bemisia tabaci)에 의해 영속 전반되기 때문에 발생 포장에서는 지속적인 전파가 가능하다. 최근에는 종자전염이 가능한 사실이 확인되어 매개충 방제와 재배지 주변의 중간기주 관리 노력에도 불구하고 기발생 농가의 TYLCV 재발생 사례가 빈번히 발생하고 있다 (도 4).
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 토마토 바이러스를 다중으로 진단하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단 방법을 제공하고자 한다.
특히 본 발명은 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV) 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 동시에 진단하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 상기 4종의 토마토 바이러스를 동시에 진단하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 프라이머 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 프라이머 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
특히, 상기 토마토 바이러스는 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV를 동시에 진단하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 발명자들은 상기 4종의 토마토 바이러스를 각각 진단하기 위한 프라이머를 설계한 후, 설계된 각각의 프라이머들을 조합별로 실제적인 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 한 번의 RT-PCR로 상기 4종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단 방법을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction; multiplex RT-PCR), 및 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription Polymerase chain reaction; RT-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법에 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 방법에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 상기 토마토 바이러스에 대해서 종 특이적 RNA 증폭을 유발하기 위해 개발되었다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 ‘종 특이적’은 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스 유전체 서열로부터 특이적 증폭 산물을 합성할 수 있음을 나타내기 위해 사용되었다. 통상적으로 사용되는 프라이머는 바이러스의 특정 유전자를 증폭하기 위해 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 식물체 또는 다른 바이러스 핵산과의 비특이적 반응으로 특정 바이러스의 진단에 사용이 적합하지 않을 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 종 특이적 프라이머 세트라고 할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 설계되었다. (D1) 대상 바이러스의 유전자 중 대상이 되는 게놈을 선정; (D2) 현재까지 알려진 대상 바이러스의 계통 및 분리주의 게놈서열에서 공통 염기서열을 탐색; (D3) 유사 바이러스의 게놈과 동일 또는 유사한 서열을 배제; 및 (D4) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 설계했다. 설계된 프라이머 중 RT-PCR에 의해 종 특이적 증폭이 수행될 수 있고, 비특이적 반응이 일어나지 않는 프라이머 쌍을 선별하였다.
본 발명의 명세서에 있어서, ‘프라이머’는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3’ hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 행산 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 증폭을 개시할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은 특히 TBSV를 단독으로도 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍은 특히 ToCV를 단독으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6은 특히 TSWV를 단독으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, 그리고 상기 서열번호 7 및 서열번호 8은 특히 TYLCV를 단독으로 진단할 수 있는 프라이머 쌍이다. 특히, 상기 4쌍의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 TBSV, ToCV, TSWV, 및 TYLCV를 동시에 높은 효율로 진단할 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물은 바이러스 RNA 증폭 등 바이러스 진단에 필요한 통상적인 시약들을 더 포함할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단은 RT-PCR의 방법을 이용하여 수행되는 경우, RT-PCR을 수행하기에 필요한 시약, 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 또는 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는 토마토 바이러스 다중 진단용 키트(kit)를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 키트는 상기 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및/또는 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 프라이머 세트 및/또는 조성물 외에 토마토 바이러스 검출에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 상기 더 포함될 수 있는 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 토마토 바이러스를 다중 진단하는 토마토 바이러스 다중 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 토마토 바이러스 다중 진단 방법에 있어서, 상기 토마토 바이러스는 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV 중에서 선택된 하나 이상을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 상기 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV의 4종의 토마토 바이러스이다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단 방법에서 바이러스 RNA 증폭은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 등온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 들 수 있다. 바람직하게는 RT-PCR의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 4종의 토마토 바이러스를 각각 또는 동시에 진단하는 경우 높은 효율 및 정확성으로 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 다중 진단용 조성물, 이를 포함하는 다중 진단용 키트 또는 이들을 이용하여 토마토를 다중 진단하는 방법은 특히 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스를 진단하는 프라이머 세트, 조성물, 키트, 또는 방법에 관한 것이다. 상기 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV의 토마토 바이러스를 동시에 진단하는 것은 본 발명의 범위 내이며, 뿐만 아니라 본 발명을 이용하여 상기 TBSV, ToCV, TSWV 및 TYLCV의 토마토 바이러스를 각각 진단하는 것 또한 본 발명의 범위 내임을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 각각 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 상기 4종의 바이러스를 진단할 수 있다.
본 발명을 적용하는 경우, 상기 4종의 토마토 바이러스를 특히 동시에 진단할 수 있으며, 높은 효율 및 정확성으로 진단할 수 있게 되어, 토마토 바이러스에 의한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있다.
본 발명을 적용하여 토마토 바이러스를 정확하고 특이적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 다중 진단 방법을 통하여, 바이러스 진단에 소요되는 비용 및 시간을 줄일 수 있어 경제적이며, 토마토 바이러스 무병주 생산 개발 등에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 TBSV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 ToCV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 TSWV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 TYLCV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 실험예 5에 따라 4종 토마토 바이러스 동시 진단용 프라이머 세트를 선발하기 위해 실시한 RT-PCR을 수행한 후, RT-PCR 산물에 대한 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. 도 5는 표 5의 프라이머 세트를 이용한 결과를 나타낸 것이며, 도 6은 표 6의 프라이머 세트를 이용한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 5의 결과를 이용하여 최종 선발한 프라이머 세트를 이용하여 4종 토마토 바이러스 진단 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 ToCV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 TSWV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 TYLCV 감염의 피해를 보여주는 사진을 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 실험예 5에 따라 4종 토마토 바이러스 동시 진단용 프라이머 세트를 선발하기 위해 실시한 RT-PCR을 수행한 후, RT-PCR 산물에 대한 전기영동을 실시한 결과를 나타낸다. 도 5는 표 5의 프라이머 세트를 이용한 결과를 나타낸 것이며, 도 6은 표 6의 프라이머 세트를 이용한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 5의 결과를 이용하여 최종 선발한 프라이머 세트를 이용하여 4종 토마토 바이러스 진단 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 발명의 발명자들은 기존에 보고된 염기서열을 참조하여 TBSV, ToCV, TSWV, 및 TYLCV 진단용 프라이머를 설계하였으며 (실험예 1 내지 4), 합성된 프라이머들 중 대상 바이러스에 특이적으로 반응하는 프라이머만을 선별하여 하기 각각의 프라이머 쌍의 설계를 완성하였다 (실험예 5).
<실험예 1> TBSV 진단용 프라이머의 설계
본 발명의 발명자들은 TBSV 바이러스 게놈 중에서 유전정보의 보존성이 높은 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 유전자 영역을 대상으로 하기 표 1에 표시된 4쌍의 프라이머를 설계하였다.
| 프라이머 명 | 유전자 자리 |
서열(5'→3') | 예상크기 (bp) |
| TBSV 2-F | 939 | 5' AGGTATGTTGACAGGGATGTC 3' (21-mer) | 898 |
| TBSV 2-R | 1837 | 5' TTGCCAGGGTACATGGCCCTG 3' (21-mer) | |
| TBSV-M1F | 1611 | 5' TACGGCATATGGAATCCAAG 3' (20-mer) | 343 |
| TBSV-M1R | 1951 | 5' TTTATATCCCCACTCATGCG 3' (20-mer) | |
| TBSV-M2F | 1934 | 5' CGCATGAGTGGGGATATAAA 3' (20-mer) | 299 |
| TBSV-M2R | 2232 | 5' ACATTTCGAACCATCTTCCA 3' (20-mer) | |
| TBSV-M1F | 1611 | 5' TACGGCATATGGAATCCAAG 3' (20-mer) | 621 |
| TBSV-M2R | 2232 | 5' ACATTTCGAACCATCTTCCA 3' (20-mer) |
<실험예 2> ToCV 진단용 프라이머의 설계
본 발명의 발명자들은 ToCV의 2번 RNA 절편을 주형으로 하기 표 2에 표시된 4쌍의 프라이머를 설계하였다.
| 프라이머 명 | 유전자 자리 |
서열(5'→3') | 예상크기 (bp) |
| ToCV-R2-3811fw | 3811 | 5' TGAGGCCCTAAAAATGAAGA 3' (22mer) | 743 |
| ToCV-R2-4554rv | 4554 | 5' GTGAGGTCTTTGGTTATGAAAAG 3' (22mer) | |
| ToCV-M-4F | 3235 | 5' AGAAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' (22mer) | 478 |
| ToCV-M-4R | 3713 | 5' GGTCATCTTCCCAAACACGA 3' (20mer) | |
| ToCV-RNA2-1F | 2783 | 5' ACCTTGGCAGGTTGTGAAAC 3' (22mer) | 826 |
| ToCV-RNA2-1R | 3609 | 5' CGATATCTGGTGGGAGGCTA 3' (22mer) | |
| ToCV-RNA2-2F | 904 | 5' GCTTCCGAAACTCCGTCTTG 3' (22mer) | 439 |
| ToCV-RNA2-2R | 1342 | 5' TGTCGAAAGTACCGCCACC 3' (22mer) |
<실험예 3> TSWV 진단용 프라이머의 설계
본 발명의 발명자들은 TSWV 게놈의 S 단편을 대상으로 TSWV 진단용 프라이머를 제작하였다. 특히 4종의 정방향 프라이머와 3종의 역방향 프라이머를 조합하여 하기 표 3에 표시된 6종의 진단용 프라이머 쌍들을 설계하였다.
| 프라이머 명 | 유전자 자리 |
서열(5'→3') | 예상크기 (bp) |
| TSWV 2065F | 2065 | 5' CACTGTAATGTTCCATAGCA 3' (20-mer) | 443 |
| TSWV 2508R | 2508 | 5' CTGACATGACCTTCAGAAGGCT 3' (22-mer) | |
| TSWV 2170F | 2170 | 5' ATGCTTTGCTTTTCAGCACA 3' (20-mer) | 338 |
| TSWV 2508R | 2508 | 5' CTGACATGACCTTCAGAAGGCT 3' (22-mer) | |
| TSWV 2065F | 2065 | 5' CACTGTAATGTTCCATAGCA 3' (20-mer) | 811 |
| TSWV 2876R | 2876 | 5' GCGGAATACAGAGTTGCA 3' (18-mer) | |
| TSWV 2170F | 2170 | 5' ATGCTTTGCTTTTCAGCACA 3' (20-mer) | 706 |
| TSWV 2876R | 2876 | 5' GCGGAATACAGAGTTGCA 3' (18-mer) | |
| TSWV 2587F | 2587 | 5' ACACAACMAAGTGAATTGCAAAR 3' (23-mer) | 289 |
| TSWV 2876R | 2876 | 5' GCGGAATACAGAGTTGCA 3' (18-mer) | |
| TSWV 6F | 2422 | 5' GAGATTCTCAGAATTCCCAGT 3' (21-mer) | 495 |
| TSWV 6R | 2916 | 5' AGAGCAATCGTGTCAATTTTATTC 3' (24-mer) |
<실험예 4> TYLCV 진단용 프라이머의 설계
본 발명의 발명자들은 TYLCV의 V1 단백질 (이동단백질) 영역과 V2 단백질 (외피단백질) 영역을 대상으로 3쌍의 프라이머를 설계하였고, C1 단백질 영역에서 시작하여 IR 영역을 포함하여 V1 단백질 영역을 포함하는 2쌍의 프라이머를 설계하였으며, 이들을 하기 표 4에 나타내었다.
| 프라이머 명 | 유전자 자리 |
서열(5'→3') | 예상크기 (bp) |
| TYLCV-M-1F | 262 | 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' (28-mer) | 238 |
| TYLCV-M-1R | 499 | 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3' (20-mer) | |
| TYLCV-M-2F | 262 | 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' (28-mer) | 179 |
| TYLCV-M-2R | 440 | 5' ATGATCGTCGCTTGTTTGTGCC 3' (22-mer) | |
| tylcv 1f | 61 | 5' GTCAACCAATCAAATTGCATCCTCAA 3' (26-mer) | 712 |
| tylcv 1-2r | 773 | 5' GTCCAAAATCCATTGGGC 3' (18-mer) | |
| TYLCV-met-1F | 2561 | 5' AATTGGGATATGTTAGGAAATAAT 3' (24-mer) | 434 |
| TYLCV-met-1R | 222 | 5' CAAATATTTAATAGCTAACATACA 3' (24-mer) | |
| TYLCV-met-5F | 2051 | 5' GATTAAAAGAAGAAGAAAGAAAATG 3' (25-mer) | 968 |
| TYLCV-met-5R | 245 | 5' AAATTATTTCCTAACATATCCCAAA 3' (25-mer) |
<실험예 5> 토마토 바이러스 진단용 프라이머 선발을 위한 실험
본 발명의 발명자들은 상기 실험예 1 내지 4에서 설계 및 제작한 프라이머 쌍들 중에서 대상 바이러스에 특이적으로 반응하는 프라이머만을 선발하였다.
선발을 위한 실험에는 RT-PCR 검정 방법을 이용하였으며, 상기 RT-PCR 검정 방법은 Virulence Differentiation of Eight Turnip mosaic virus Isolates Infecting Cruciferous Crops. Plant Pathol. J. 2005;21:369-376. Published online December 31, 2005에 개시된 방법을 참고하여 수행하였다.
하기 표 5에 표시된 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.
하기 표 5에서 ‘열’은 도 5에 나타난 띠(band)의 번호 (1~13)의 표기이다.
| 열 | 바이러스 | 프라이머-F | 프라이머-R |
| 1 | ToCV | ToCV-R1-3811fw | ToCV-R1-4554rv |
| 2 | ToCV-M-4F | ToCV-M-4R | |
| 3 | ToCV-RNA2-1F | ToCV-RNA2-1R | |
| 4 | TSWV | TSWV 2065F | TSWV 2508R |
| 5 | TSWV 2170F | TSWV 2508R | |
| 6 | TSWV 2065F | TSWV 2876R | |
| 7 | TSWV 2170F | TSWV 2876R | |
| 8 | TSWV 2587F | TSWV 2876R | |
| 9 | TBSV | TBSV-M1F | TBSV-M1R |
| 10 | TBSV 2-F | TBSV 2-R | |
| 11 | TYLCV | tylcv 1f | tylcv1-2r |
| 12 | TYLCV met 1F | TYLCV met 1R | |
| 13 | TYLCV met 5F | TYLCV met 5R |
하기 표 6에 표시된 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다.
| 열 | 바이러스 | 프라이머-F | 프라이머-R |
| 1 | TBSV | TBSV-M1F | TBSV-M1R |
| 2 | TBSV-M2F | TBSV-M2R | |
| 3 | TBSV-M1F | TBSV-M2R | |
| 4 | TSWV | TSWV 2170F | TSWV 2876R |
| 5 | TSWV 2587F | TSWV 2876R | |
| 6 | TSWV 6F | TSWV 6R | |
| 7 | TSWV 2065F | TSWV 2508R | |
| 8 | TYLCV | TYLCV-M1F | TYLCV-M1R |
| 9 | TYLCV-M2F | TYLCV-M2R | |
| 10 | TYLCV met 1F | TYLCV met 5R | |
| 11 | tylcv 1f | tylcv1-2r | |
| 12 | ToCV | ToCV-M-4F | ToCV-M-4R |
| 13 | ToCV-RNA2-2F | ToCV-RNA2-2R |
<실시예> 4종 토마토 바이러스의 동시 진단
본 발명의 발명자들은 상기 실험예 5의 결과를 이용하여 4종 토마토 바이러스(TBSV, ToCV, TSWV, RYLCV)를 동시에 진단하기 위한 프라이머 세트를 선발하였다. 선발된 프라이머 세트는 하기 표 7에 나타내었다.
선발된 프라이머 세트를 이용하여 동시 진단 효과를 확인하였으며, 실험에 사용한 토마토 시료는 병징이 있는 잎을 액체질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트(Viral gene spin kit, Intron Co.)를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다. 추출된 게놈을 주형으로 다음과 같은 방법으로 one-step RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에 사용한 혼합물 성분은 하기 표 8에 나타내었으며, RT-PCR 수행 조건은 하기 표 9에 나타내었다.
다음으로, RT-PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔, 100 mV, 1시간 30분의 조건을 갖는 전기영동을 수행하여 확인하였다 (도 7).
| 프라이머 명 | 유전자 자리 |
서열 | 예상크기 (bp) |
| TBSV-M1F | 1611 | 5' TACGGCATATGGAATCCAAG 3' (20-mer) | 621 |
| TBSV-M2R | 2232 | 5' ACATTTCGAACCATCTTCCA 3' (20-mer) | |
| ToCV-M-4F | 3235 | 5' AGAAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' (22mer) | 478 |
| ToCV-M-4R | 3713 | 5' GGTCATCTTCCCAAACACGA 3' (20mer) | |
| TSWV 2170F | 2170 | 5' ATGCTTTGCTTTTCAGCACA 3' (20-mer) | 338 |
| TSWV 2508R | 2508 | 5' CTGACATGACCTTCAGAAGGCT 3' (22-mer) | |
| TYLCV-M-1F | 262 | 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' (28-mer) | 238 |
| TYLCV-M-1R | 499 | 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3' (20-mer) |
| 혼합물 성분 | |
| 주형 | 1 ul |
| 정방향 프라이머 (32pmolX4프라이머) | 1 ul |
| 역방향 프라이머 (32pmolX4프라이머) | 1 ul |
| 증류수 | 7 ul |
| RT-PCR premix | 10 ul |
| 총합 | 20 ul |
| 온도 | 시간 | |
| 1단계 | 50 °C | 30 분 |
| 2단계 | 95 °C | 5 분 |
| 3단계 | 95 °C | 30 초 |
| 4단계 | 55 °C | 45 초 |
| 5단계 | 72 °C | 1분 30초 |
| 3단계~5단계 35 순환 | ||
| 6단계 | 72 °C | 10 분 |
도 7의 각 열(lane)이 나타내는 바는 하기 표 10에 나타내었다.
| 열 | 검출 바이러스 | 열 | 검출 바이러스 |
| M | 100bp ladder | 8 | TSWV+ToCV |
| 1 | TYLCV | 9 | TSWV+TBSV |
| 2 | TSWV | 10 | ToCV+TBSV |
| 3 | ToCV | 11 | TYLCV+TSWV+ToCV |
| 4 | TBSV | 12 | TYLCV+TSWV+TBSV |
| 5 | TYLCV+TSWV | 13 | TYLCV+ToCV+TBSV |
| 6 | TYLCV+ToCV | 14 | TSWV+ToCV+TBSV |
| 7 | TYLCV+TBSV | 15 | TYLCV+TSWV+ToCV+TBSV |
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하는 경우 TBSV, ToCV, TSWV, 및 TYLCV를 각각 또는 이들의 조합을 진단할 수 있음을 확인하였으며, 특히 상기 4종 바이러스 모두를 진단할 수 있음을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Primer set for multiple detection tomato viruses, and method for
detect multiple detection tomato viruses
<130> P17-252
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBSV-M1F primer
<400> 1
tacggcatat ggaatccaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBSV-M2R primer
<400> 2
acatttcgaa ccatcttcca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ToCV-M-4F primer
<400> 3
agaagatccg cgctaatgct aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ToCV-M-4R primer
<400> 4
ggtcatcttc ccaaacacga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TSWV 2170F primer
<400> 5
atgctttgct tttcagcaca 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TSWV 2508R primer
<400> 6
ctgacatgac cttcagaagg ct 22
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV-M-1F primer
<400> 7
cacgatttaa ttagggatct tatatctg 28
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV-M-1R primer
<400> 8
atcagggctt cgatacattc 20
Claims (9)
- 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트. - 제1항에 있어서, 상기 토마토 바이러스는 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 또는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)인 것을 특징으로 하는 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 토마토덤불위축바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 및 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 감염여부를 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 토마토 바이러스 다중 진단 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction; multiplex RT-PCR), 및 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 토마토 바이러스 진단 방법에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물.
- 제1항에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 제5항에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 조성물 중 어느 하나 이상을 포함하는 토마토 바이러스 다중 진단용 키트.
- 제1항에 따른 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여, 토마토 바이러스를 다중 진단하는 토마토 바이러스 다중 진단 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 토마토 바이러스는 토마토덤불위축 바이러스(TBSV), 토마토퇴록바이러스(ToCV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 또는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)인 것을 특징으로 하는 토마토 바이러스 다중 진단 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 토마토 바이러스 다중 진단 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction; multiplex RT-PCR), 및 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 진단하는 것을 특징으로 하는 토마토 바이러스 다중 진단 방법.
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