KR102101941B1 - 바이오 센서 제조방법 - Google Patents

바이오 센서 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예는, 기판 상에 버퍼층을 형성하는 단계와, 버퍼층 상에 금속층을 형성하는 단계와, 제1 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 금속층을 패터닝하여 원하는 전극을 형성하는 단계와, 상기 전극 상에 무기 절연층을 형성하는 단계와, 제2 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 전극의 일부 영역이 노출되도록 상기 무기 절연층에 복수의 나노웰(nanowells)을 형성하는 단계를 포함하며, 추가적으로 황산 용액을 이용한 세정 단계 후 페리시아나이드 에칭을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정하는 단계를 더 포함한다.

Description

바이오 센서 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF BIOSENSOR DEVICE}
본 발명은 바이오 센서 제조방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 고감도 및 고선택성을 갖는 바이오 센서의 제조방법에 관한 것이다.
바이오 센서는 단백질, 아미노산 (예를 들어, 특정 염기 서열을 함유하는 DNA 및/또는 RNA) 또는 다른 유기 분자와 같은 생물학적 분자의 존재를 검출하는데 사용된다.
바이오 센서의 예로는 임신 테스트 및 포도당 모니터링 센서가 있다. 이러한 바이오 센서는 혈액 또는 소변과 같이 체액에 존재하는, 사람의 만성 생식샘 자극 호르몬(hCG) 또는 포도당과 같은 생체 분자를 검출할 수 있다.
특정 분석 물질(예, 생체 분자)을 검출하기 위해, 바이오 센서는 분석물 결합 표면(analyte-binding surface)을 포함할 수 있으며, 분석물에 특정한 프로브(예, 단일 가닥 DNA 또는 표적 분자에 특이적인 항체)가 분석물 결합 표면에 고정된다.
특정 생체 분자의 존재를 검출할 수 있는 고유한 과학적 원리를 사용하는 다양한 종류의 바이오 센서가 개발되고 있다. 바이오 센서의 다른 유형의 예로는 전기화학적 바이오 센서, 나노 캔틸레버 바이오 센서, 마이크로 또는 나노 전기 기계 시스템(MEMS/NEMS)이 있다. 다른 유형의 바이오 센서와 마찬가지로, 전기화학적 바이오 센서는 특정 생체 분자(예를 들어, DNA의 특정 단백질 또는 특정 서열)와 상호 작용 및/또는 결합할 수 있는 분석물 결합 표면을 포함한다.
특히, 전기 화학적 바이오 센서는 전기 화학적 분석의 원리를 사용하여 특정 분석물을 검출하는데, 이때에 시스템에 인가된 전기적 여기(electrical excitation)에 대한 화학 반응을 측정 및 분석하여 분석물이 전극의 표면에 결합되어 있는지를 검출한다. 나노 캔틸레버 바이오 센서 및 MEMS/NEMS와는 달리, 전기 화학적 바이오 센서의 신호를 분석을 위해 전자 장치로 직접 검출하여 신속히 진단할 수 있다.
전기화학적 바이오 센서가 광범위한 응용 분야에 널리 적용되기 위해서는 바이오 센서가 매우 민감하고 선택성이 있어야 하며 이러한 센서의 제조 비용 측면에서도 경쟁력이 요구된다. 높은 감도와 높은 선택성이 보장되는 전기 화학적 바이오 센서의 제조는 기술적으로 어렵다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제 중 하나는 바이오 센서의 불순물에 의한 오염을 감소하거나 제거함으로써 전극 상에 천공된 절연층을 구비한 고감도 및 고선택도의 바이오 센서의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 실시예는, 기판 상에 버퍼층을 형성하는 단계와, 버퍼층 상에 금속층을 형성하는 단계와, 제1 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 금속층을 패터닝하여 원하는 전극을 형성하는 단계와, 상기 전극 상에 무기 절연층을 형성하는 단계와, 제2 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 전극의 일부 영역이 노출되도록 상기 무기 절연층에 복수의 나노웰(nanowells)을 형성하는 단계와, 상기 복수의 나노웰에 의해 노출된 전극 영역으로부터 불순물이 제거되도록 황산(H2SO4) 용액을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정하는 단계를 포함하는 바이오 센서 제조방법를 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 황산 용액을 이용한 세정 단계 후, 페리시아나이드 에칭을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 페리시아나이드 에칭은, 상기 바이오 센서를 K3Fe(CN)6과 KCl의 혼합 용액에 침지한 상태에서 1.0∼1.5 V 전압을 인가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 페리시아나이드 에칭은, 15∼25℃ 범위에서 1∼10초간 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 전극은 금(Au)을 포함할 수 있으며, 페리시아나이드 에칭 동안에 상기 전극의 표면이 평탄화될 수 있다. 상기 무기 절연층은 SiO2 또는 Si3N4를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 황산 용액을 이용한 세정 단계는 상기 바이오 센서를 황산 용액에 침지하여 1.5∼2.0 V 전압을 인가하여 1∼5분 동안 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 복수의 나노웰의 피치 비는 각 나노웰의 크기 대 인접한 나노웰의 최단 간격으로 정의되며, 1:3 이하, 바람직하게 1:1일 수 있다.
본 발명의 일 실시예는, 기판 상에 전극을 형성하는 단계와, 상기 전극 상에 무기 절연층을 형성하는 단계와, 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 전극의 일부 영역이 노출되도록 상기 절연층에 복수의 나노웰을 형성하는 단계와, 상기 나노웰이 형성된 결과물을 황산(H2SO4) 용액에 침지한 상태에서 1.5∼2.0 V 전압을 인가하는 1차 세정 단계와, 상기 1차 세정된 결과물을 K3Fe(CN)6과 KCl의 혼합 용액에 침지한 상태에서 1.0∼1.5 V 전압을 인가하는 2차 세정 단계를 포함하는 바이오 센서 제조방법을 제공한다.
나노웰 형성 후에 황산 용액을 이용한 세정공정을 수행함으로써 제조 과정 중에 불순물에 의한 바이오 센서의 오염, 특히 나노웰의 바닥면에 위치한 전극의 오염으로 인해 바이오 센서의 감도 및 선택도에 미치는 악영향을 방지할 수 있다.
또한, 황산 용액을 이용한 세정공정과 함께, 페리시아나이드(ferricyanide) 에칭(또는 세정)을 추가적으로 수행함으로써 오염물을 더욱 효과적으로 제거할 뿐만 아니라 전극 표면의 평탄도를 개선할 수 있으며, 이로써 바이오 센서의 감도 및 선택도를 더욱 크게 개선할 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 전기화학적 바이오 센서는 높은 선택성으로 생물학적 샘플에서 fM 범위 내에 존재하는 분석물을 검출할 수 있다.
본 발명의 다양하면서도 유익한 장점과 효과는 상술한 내용에 한정되지 않으며, 본 발명의 구체적인 실시예를 설명하는 과정에서 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
도1a 내지 도1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 촬영한 사진과 SEM 이미지이다.
도2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 감지 전극을 나타내는 개략 단면도이다.
도3은 다른 분석물을 검출하도록 구성된 개별 감지 전극을 구비한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 나타내는 개략 사시도이다.
도4는 바이오 센서를 이용한 분석물 검출방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도5a 내지 도5c는 나노웰의 예시적인 피치 비(pitch ratio)에 따른 바이오 센서를 나타내는 개략 단면도들이다.
도6a 내지 도6c는 바이오 센서 민감도에 대한 다양한 피치 비의 영향을 설명하기 위해서 순환 전압 전류법(CV)에 의한 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도7은 본 발명의 일 실시예를 사용하여 용액에서 다양한 농도의 DNA 분석물의 검출을 나타내는 그래프이다.
도8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 공정 흐름도이다.
도9a 내지 도9h는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 주요 공정별 단면도이다.
도10a 내지 도10c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(절연층:Si3N4)를 촬영한 SEM 사진들이다.
도11a 내지 도11c는 각각 도10a 내지 도10c의 바이오 센서에 대한 순환 전압 전류법(CV) 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도12a 내지 도12c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(절연층:SiO2)를 촬영한 SEM 사진들이다.
도13a 내지 도13c는 각각 도12a 내지 도12c의 바이오 센서에 대한 순환 전압 전류법(CV) 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도14a 내지 도14c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(절연층:포토레지스트)를 촬영한 SEM 사진들이다.
도15는 도13a의 바이오 센서에 대한 순환 전압 전류법(CV) 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
첨부된 도면은 개시된 장치 및 방법의 설명에 치수가 반드시 비례하여 도시된 것이 아니며, 실제 사용되는 범위와 상이할 수 있다. 이러한 치수는 사용될 수 있는 형상 및 크기를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 장치 및 그 구성 요소의 크기 및 형상은 적어도 장치가 사용될 피검대상, 장치가 사용될 구성 요소의 크기 및 모양, 그리고 장치가 사용될 절차 및 방법에 따라 달라질 수 있다
또한, 여기에 제공되는 예시적인 실시예는 생체 분자(예를 들어, 단백질 및/또는 핵산 분자)를 검출하는데 있어서 장치의 사용을 기술하고 있지만, 당업자는 상기 장치가 생물학적 샘플이 아닌 비생체 분자(non-biological molecules) 및/또는 샘플의 존재를 검출하는데 사용되도록 채택될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 무기 물질의 존재는 수질 테스트, 환경 테스트 및/또는 다른 산업 환경에서의 품질 관리/품질 보증 테스트의 경우에도 본 발명에 따른 바이오 센서를 사용하여 검출될 수 있다.
도1a 내지 도1d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 촬영한 사진과 SEM 이미지이다.
도1a를 참조하면, 본 실시예에 따른 바이오 센서(100)을 제조하기 위한 글래스 또는 실리콘 기판(예, 웨이퍼)와 같은 단일 기판이 도시되어 있다. 도1b는 다수 감지 전극(sensing electrode)(120)을 포함하는 전기 화학적 바이오 센서(100)를 촬영한 사진이다.
도1c는 도 1b의 감지 전극의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다. 도1c를 참조하면, 상기 감지 전극은 복수의 나노웰(130)을 포함하며, 상기 복수의 나노웰(130)은 약 1:1의 피치비(나노웰 개구의 직경과 인접하는 나노웰 사이의 최단 간격의 비율)을 갖는다. 예를 들어, 나노웰(130)의 개구 직경과 나노웰 사이의 최단 간격은 각각 약 230 ㎚일 수 있다. 다른 실시예에서, 나노웰 피치비 및/또는 나노웰 개구 직경은 다른 값 일 수 있다.
도1d는 단일한 나노웰(130)을 촬영한 원자력 현미경 이미지이다. 도1d를 참조하면, 나노웰(130)은 전극의 상면으로 정의되는 바닥면(140)을 갖는 원통형상을 갖는 것으로 예시되어 있다.
도2는 도1b의 감지 전극으로서 도1d의 단일 나노웰 부분을 나타내는 측단면도로 이해될 수 있다.
일 실시예에서는, 도2에 도시된 바와 같이, 감지 전극(120)은 글래스 또는 실리콘과 같은 기판(210)과, 상기 기판(210) 상에 순차적으로 배치된 버퍼층(220)과 전극(230)과, 상기 전극(230) 상에 배치되며 상기 전극(230)의 일부 영역이 노출되도록 구멍(241)(또는 홀(holes))을 갖는 절연층(240)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 기판(210)은 글래스 또는 실리콘 외에도 반도체 제조에서 사용된 기판으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 기판(210)은 실리콘 산화물(예를 들면, 석영), 보로실리케이트 또는 다른 조성의 글래스를 포함할 수 있다. 상기 기판(210)은 복수의 전기 화학적 바이오 센서를 구현하기 위한 원형인 웨이퍼일 수 있다(도1a 참조).
감지 전극(120)의 버퍼층(220)은 전극(230)이 기판(210)으로부터 분리되지 않도록 전극(230)과 기판(210)의 향상된 본딩을 제공할 수 있다. 전극(230)과 기판(210)의 향상된 본딩은 전기 화학적 바이오센서의 신뢰성을 향상시키고(또는) 제조비용을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 버퍼층(220)은 티타늄, 크롬 그리고/또는 티타늄 또는 크롬의 합금을 포함할 수 있다.
감지 전극(120)의 절연층(240)은 천공되어 복수의 구멍(bores, 241)(즉 홀)을 포함할 수 있다. 절연층(240)에 형성된 복수의 홀(241)은 도1c에 나타나 있으며 나노웰(242)을 형성할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 홀(241)은 나노웰(242)의 내부 치수를 정의한다.
일부 실시예에서, 홀(241)은 원통형상을 가지며(도1d의 나노웰(130) 참조), 홀(241)에 의해 정의되는 크기를 갖는 나노웰(242)가 원형 개구를 가지고 절연층(240)은 원통형 나노웰(242)의 벽(243)을 형성한다. 천공된 절연층(240)이 전극(230) 상에 배치되므로, 2개의 층 사이의 상대 위치에 의해서 절연층(240)으로 커버되지 않는 전극(230)의 상단 표면(231)은 나노웰(231a)의 바닥 표면을 형성할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 실리콘 질화물이 유기 또는 무기 폴리머와 같은 특정한 대체물에 비해 더 탄력적이고 안정적이기 때문에, 감지 전극의 절연층(240)은 실리콘 질화물(Si3N4)을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 감지 전극의 절연층(240)은 실리콘 산화물(SiO2)을 포함할 수 있다. 실리콘 질화물의 복원성과 안정성과 같은 특징은 감지 전극의 신뢰성 및 안정적인 제조를 보장하게 하며, 제품 불량 및 제조비용의 감소를 실현할 수 있다.
일부 실시예에서, 나노웰(242)의 개구는 원형이며, 원형인 개구는 1000 ㎚ 이하일 수 있다. 다른 실시예에서, 나노웰(242)의 원형인 개구의 직경은 300 ㎚ 이하일 수 있다. 특정 실시예에서, 나노웰(242)의 원형인 개구의 직경은 거의 230㎚, 100㎚ 그리고/또는 50㎚ 일 수 있다. 앞선 실시예들에서 나노웰(242)이 원통형이며, 원형인 개구를 갖는 것으로 설명되어 있으나, 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자(이하, '당업자'라 함)라면 나노웰(242)이 직사각형, 타원형이 그리고/또는, 다각형과 같은 다양한 다른 개구 형상을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다양한 다른 개구 형상의 나노웰(242)을 갖는 실시예에서, 개구의 크기는 1000㎚ 또는 300㎚ 이하이거나, 거의 230㎚, 100㎚ 그리고/또는 50㎚ 일 수 있다. 게다가, 당업자는 각 구성요소의 상기한 조성물과 구조에 제한되지 않으며, 유사 특성 또는 개선된 특성을 가진 다른 조성물과 구조를 포함할 수도 있다는 것은 것을 인식할 것이다.
다른 실시예에서, 나노웰(242)의 바닥면(231a)(예, 절연층으로 커버되지 않는 전극의 상면)는 특정 분석물(analytes)과 결합(binding)할 수 있는 프로브 분자(245)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도2에 도시된 바와 같이, 분석물에 특정된 바이오티닐화 항체(biotinylated antibodies)(245)는 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)과 같은 중간 결합성 분자(intermediary binding molecule)(244)를 사용하여 나노웰의 바닥면(231a)에 고정(immobilize)될 수 있다. 당업자는 분석물 프로브(245)을 고정하는 다른 공지된 방법이 본 발명에 통합되거나 본 발명의 범위에서 있는 것으로 이해할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 복수의 홀(241)을 가진 절연층(240)은 절연층(240)에 분석물의 결합 및/또는 집합(aggregation)을 방지하면서, 나노웰(242)의 바닥면(231a)에 프로브(245)로의 분석물의 결합을 제한할 수 있다.
도3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서(100)를 나타내는 개략 사시도이다.
도3을 참조하면, 각각의 개별 감지 전극(310)은 특정 분석물 프로브(311-317)(예, 항체)로 코팅되어 다른 분석물(321-327)(예, 단백질)이 개별 감지 전극(310)에 고정화된 다른 프로브(311-317)(예, 단백질 - 단백질 상호 작용, DNA-DNA 하이브리드화 및/또는 다른 분자간 결합)에 결합할 수 있다.
본 명세서에서, "고정화(immobilized)"라는 용어는 감지 전극(310)의 표면에 특정 분석물 프로브(311)를 결합하는 것으로서, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합 및/또는 반데르발스(Van der Walls) 힘에 의해 전극 표면에 프로브를 결합하는 것을 의미한다. 바람직한 일 실시예에서, 전기 화학적 바이오 센서는 매우 적은 양의 분석물(예, 농도가 1000 fM 미만, 농도가 500 fM 미만, 농도가 100 fM 미만, 농도가 10 fM 미만 농도 및/또는 농도가 1fM 미만)을 감지할 수 있는 복수의 감지 전극(310)을 포함할 수 있다.
도4는 전기 화학적 바이오 센서(410)의 바람직한 일 실시예가 샘플 내의 분석물을 검출하기 위해 전위차계(potentiostat)(440) 및 전자 장치(450)와 함께 사용될 수 있는 방법을 설명하기 위한 개략도를 도시한다.
일 실시예에서, 사용자(예를 들어, 소비자, 실험실 요원, 간호사, 의사, 컴퓨터 시스템, 본 발명을 사용하는 기계 또는 로봇 장치)는 본 발명을 이용하여 아래의 단계를 수행하여 샘플 내의 분석물을 측정할 수 있다.
(1) 분석물을 분석물 프로브에 결합할 수 있도록 테스트 샘플을 감지 전극들에 적용하는 단계;
(2) 감지 전극으로부터 비결합(unbound) 및/또는 비특정 결합 분자(분석물 및/또는 비분석물)를 제거하도록 감지 전극을 세척(rinsing)하는 단계; 및,
(3) 감지 전극에 대해 전기 화학적 측정 및 분석을 수행하는 단계.
본 발명의 바람직한 실시예는 도1에 도시된 바와 같이, 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry: CV)을 사용하여 용액 중의 분석물의 전기 화학적 특성을 측정한다.
도4는 바이오 센서를 이용한 분석물 검출방법을 설명하기 위한 개략도이다.
일 실시예에 따른 전기 화학적 바이오 센서(작동 전극)(410)는 전기 화학 챔버(400), 전위차계(440) 및 컴퓨팅 장치(예, 퍼스널 컴퓨터, 서버, 랩탑, 스마트폰, 전용 전자 장치 및/또는 본 발명으로부터의 전기적 신호를 수용하고 분석할 수 있는 임의의 다른 장치)를 포함할 수 있다.
도4를 참조하면, 전자 화학적 챔버(400)는, 저장부(405), 기준 전극(420), 상대 전극(counter elelctrode: 430) 및 작동 전극(410)(전기 화학적 바이오 센서의 구성 요소)을 포함한다. 기준 전극(420), 상대 전극(430) 및 작동 전극(410)은 전기 여기(electrical excitation)가 시스템 (400)에 인가될 때에 그 전기 여기가 전자 장치 (450)에 의해 검출/분석될 수 있는 화학 반응(예, 산화 및/또는 환원 반응)을 일으키도록 전해질 용액(460)에 잠길 수 있다.
구체적으로는, 작동 전극(410)과 상대 전극(430) 사이에 전류가 흐를 때, 기준 전극(420)에 대한 작동 전극(410)의 전위는 전위차계(440)에 의해 제어될 수 있다. 이 경우, 전극 반응에 기인하는 전류에 관계없이 작동 전극(410) 및 기준 극(420)을 정확하게 계측할 수 있다. 당업자는 다른 대체 전기 화학적 측정 방법이 또한 본 개시 물에 채택될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 있음을 알 수 있을 것이다. 가장 가까운 거리(535, 545,555)의 다른 예는 도1b에서 확인할 수 있다. 도1b에는 인접한 나노웰 사이의 가장 가까운 거리는 230 ㎚로 도시되어 있다.
도5a는 나노웰(520)의 피치 비(525)가 1:1인 바람직한 실시예를 도시한다.
본 실시예에서, 나노웰 (520) 개구는 230㎚의 직경(530)을 가지며 인접한 나노웰들(520) 사이의 최단 거리들(535)은 230㎚이다. 따라서, 나노웰의 개구 직경(530)과 이웃하는 나노웰 간의 최단 거리(535)의 비는 230㎚:230㎚ 또는 1:1이다.
도5b는 피치 비(525)가 1:3인 다른 실시 예를 도시한다.
본 실시예에서, 나노웰(520)의 개구는 230㎚의 직경(530)을 가지며, 이웃하는 나노웰(520) 사이의 최단 거리(545)는 690㎚이다. 따라서, 나노웰 개구 직경 (530)과 이웃하는 나노웰 사이의 최단 거리(545)의 비는 230㎚:690㎚ 또는 1:3이다.
도5c는 피치 비(525)가 1:5인 또 다른 실시예를 도시한다.
본 실시예에서, 나노웰(520) 개구는 230㎚의 직경(530)을 가지며 인접한 나노웰들(520) 사이의 최단 거리(550)는 1150㎚이다. 따라서, 나노웰 개구 직경(530)과 이웃하는 나노웰 사이의 최단 거리(550)의 비는 230㎚:1150㎚ 또는 1:5이다.
당업자는 이들이 예시적인 실시예들이고, 다른 크기의 나노웰 및/또는 피치 비도 또한 본 발명의 범위 내에 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 나노웰 개구 직경은 약 1000㎚, 약 500㎚, 약 100㎚, 약 50㎚, 약 20㎚ 또는 20㎚ 미만일 수 있다.
이와 유사하게, 피치 비는 50:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10을 포함하는 100:1 내지 1:1:50의 임의의 범위일 수 있다. 또한, 실시예에서의 나노웰 분포는 그리드형의 균일한 패턴이지만, 나노웰의 다른 유사한 패턴 또는 불균일한 분포 및/또는 다른 감도를 더 향상시킬 수 있는 배열에 대한 다른 유사, 균등 및/또는 변경예는 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
도6a 내지 6c는 다른 나노웰의 피치비(즉, 인접한 나노웰 사이의 거리)를 갖는 전기 화학적 바이오 센서의 감도의 차이를 나타낸다. 일반적으로, 나노웰 사이의 피치 비를 변화시키는 것은 검출 감도를 변화시킨다. 구체적으로, 본 발명의 순환 전압 전류(CV) 측정을 수행하였다. 도6a(음극 피크: 4.4×10-8nA, 나노웰 피치 비가 1:5인 바이오 센서) 또는 도6b(음극 피크: 7.9×10-8nA, 나노웰 피치 비가 1:3인 바이오 센서)의 결과와 비교하여, 나노웰 피치 비가 1:1인 바이오 센서(도6c 참조)의 경우 가장 높은 감도(음극 피크: 1.75×10-7nA)를 나타냈다.
당업자는 나노웰의 개구 크기, 피치 비 및/또는 다른 치수, 지형 및/또는 물리적 속성이 본 발명의 감도에 영향을 미칠 수 있으며, 나노웰의 가변적인 구성도 범위 내에 있음을 인식할 것이다.
도7은 다른 농도의 DNA 분석물을 검출하기 위해 본 발명의 실시예에 의해 측정된 산화 환원 전류의 비율을 나타내는 대표적인 데이터를 도시한다.
백분율로 나타낸 산화 환원 전류의 변화를 측정하여 mM (10-4M) 범위에서 fM (10-15M) 범위의 분석물 농도를 갖는 샘플에서 분석물의 존재를 검출하였다. 본 실시예는 본 실시예가 산화 환원 전류의 통계적으로 중요한 비율을 검출함으로써 DNA 분석물의 fM 범위를 검출할 수 있음을 예시한다
이하, 본 발명의 일 실시예로서, 불순물에 의한 바이오 센서(특히, 감지 전극)의 오염을 저감시킬 수 있는 전기 화학적 바이오 센서의 제조방법을 도8 및 도9를 참조하여 설명한다.
도8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 공정 흐름도이며, 도9a 내지 도9h는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 주요 공정별 단면도이다.
본 실시예에 따른 바이오 센서 제조방법은 기판 상에 버퍼층을 형성하는 단계(S610)로 시작되며, 상기 버퍼층 상에 금속층을 형성한다(S620).
구체적으로, 도9a에 도시된 바와 같이, 기판(210) 상에 버퍼층(220) 및 금속층(230')이 순차적으로 형성된다.
상기 기판(210)은 글래스, 실리콘, 실리콘 산화물(예를 들면, 석영) 또는 보로실리케이트와 같은 반도체 공정이 적용될 수 있는 기판을 사용할 수 있다. 상기 버퍼층(220)은 금속층(230')과 기판(210)의 향상된 본딩을 제공한다. 예를 들어, 버퍼층(220)은 티타늄(Ti), 크롬(Cr) 및/또는 그 합금을 포함할 수 있다. 특정 예에서는 Cr/Ti를 사용할 수 있다. 금속층(230')은 전극을 위해 제공되며, 예를 들어 금(Au)을 포함할 수 있다. 본 증착 공정으로는 스퍼터링, 전자빔 증착과 같은 다양한 증착공정이 사용될 수 있다.
이어, 제1 포토리소그래피 공정을 이용한 금속층(230')을 패터닝하여 원하는 패턴의 전극(230)을 형성할 수 있다(S630).
구체적으로, 본 공정은 도9b 및 도9c에 도시된 과정으로 수행될 수 있다.
도9b를 참조하면, 금속층(230') 상에 포토레지스트 물질을 도포한 후, KrF 스텝퍼와 같은 노광 장비와 원하는 패턴을 갖는 레티클(M1)을 이용하여 선택적 노광을 실시하고, 현상을 통해서 원하는 제1 포토레지스트 패턴(PR1)을 형성한다. 이어, 도9c에 도시된 바와 같이, 제1 포토레지스트 패턴(PR1)을 마스크로 이용하여 금속층(230')을 선택적으로 제거함으로써 원하는 패턴을 갖는 전극(230)을 형성할 수 있다.
다음으로, 도9b에 도시된 바와 같이, 전극(230) 상에 절연층(240)을 형성할 수 있다(S640).
본 공정에서 형성되는 절연층(240)은 나노웰을 형성하는 구조물로 제공된다. 본 실시예에서는 복원성과 안정성이 있는 무기 절연층(240)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무기 절연층(240)으로는 실리콘 질화물(Si3N4) 또는 실리콘 산화물(SiO2)이 사용될 수 있다. 특히, 후속 공정에서 황산용액 및/또는 페리시아나이드(ferricyanide) 에칭과 같은 세정공정이 적용되므로, 포토레지스트와 같은 폴리머 재질보다는 실리콘 질화물(Si3N4) 또는 실리콘 산화물(SiO2)이 바람직하게 사용될 수 있다.
이어, 제2 포토리소그래피 공정을 이용하여 절연층에 복수의 홀을 형성할 수 있다(S650).
본 공정에서 형성되는 복수의 홀은 나노웰로 제공되며, 나노웰의 바닥면에 노출되는 전극 영역은 감지영역으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 공정은 도9e 및 도9f에 도시된 과정으로 수행될 수 있다.
도9e를 참조하면, 절연층(240) 상에 포토레지스트 물질을 도포한 후, 앞선 공정과 유사하게 노광 장비와 나노사이즈의 홀 패턴을 갖는 레티클(M2)을 이용하여 선택적 노광을 실시하고, 현상을 통해서 원하는 제2 포토레지스트 패턴(PR2)을 형성한다. 다음으로, 도9f에 도시된 바와 같이, 제2 포토레지스트 패턴(PR2)을 마스크로 이용하여 절연층(240)을 선택적으로 제거함으로써 원하는 홀(h1)을 형성하고, 이들은 나노웰(241) 구조로 제공될 수 있다.
하지만, 일련의 공정에서, 특히, 절연층(240)에 전극(230)의 일부 영역을 노출시키는 나노웰(241) 형성과정에서 불순물(CP)이 발생되고, 이러한 불순물(CP)이 전극 표면에 잔류하여 바이오 센서의 신뢰성을 크게 저하시킬 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해서, 도9g에 도시된 바와 같이, 나노웰 형성 후에 다양하면서 효과적인 세정공정을 도입할 수 있다. 황산용액을 이용한 세정공정과 함께, 페리시아나이드 에칭 공정이 이용될 수 있다. 각 공정은 단독으로도 수행될 수 있으나, 병행될 수 있다. 특히, 황산용액을 이용한 세정공정(S660) 후에 페리시아나이드 에칭(S670)을 수행함으로써 가장 바람직한 효과를 기대할 수 있다.
구체적으로, 상기 복수의 나노웰에 의해 노출된 전극 영역으로부터 불순물이 제거되도록 황산(H2SO4) 용액을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정할 수 있다(S660).
본 실시예에 채용되는 황산 용액을 이용한 세정은 나노웰이 형성된 바이오 센서를 황산 용액에 침지하고 소정의 시간 동안 전압을 인가하는 방식으로 수행될 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 인가 전압은 1.5∼2.0 V 범위이며, 1∼5분 동안 수행될 수 있다.
상기 황산 용액을 이용한 세정 단계 후, 페리시아나이드 에칭을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정할 수 있다. 본 페리시아나이드 에칭은, 상기 바이오 센서를 K3Fe(CN)6과 KCl의 혼합 용액에 침지한 상태에서 1.0∼1.5 V 전압을 인가함으로써 수행될 수 있다.
통상적으로 페리시아나이드 용액에서는, 1V 이상 전압을 인가할 때에, 금으로 이루어진 전극은 반응이 일어나 불이익한 것으로 알려져 있으나, 본 발명에서는 의도적으로 1.0∼1.5 V 범위의 전압을 인가하여, 나노웰의 바닥면에 노출된 전극 표면을 빠르게 처리하여 잔류한 불순물도 효과적으로 제거하고, 전극 표면의 평탄도를 크게 향상시킬 수 있다.
이에 한정되지는 않으나, 페리시아나이드 에칭은, 15∼25℃ 범위에서 1∼10초간 수행될 수 있다.
본 실시예에 따른 세정공정을 수행함으로써, 도9h에 도시된 바와 같이, 나노웰(241)의 바닥면에 위치한 전극 영역으로부터 불순물(CP)이 제거되고, 상기 전극 영역이 평탄화되어 고감도 및 고선택도의 센싱을 보장할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 작용과 효과를 더 상세히 설명하기로 한다.
실시예1 : Si 3 N 4 절연층을 채용한 바이오 센서
실리콘 기판을 마련하고, 실리콘 기판 상에 버퍼층으로서 300㎚ 두께의 Cr 막과 10㎚ 두께의 Ti 막을 증착하였다. Cr 막과 Ti 막은 각각 스퍼터링(sputtering) 장비 및 전자빔 증발 장비를 이용하여 형성되었다. 이어, 전극을 위한 금속층으로서, 전자빔 증발 장비를 이용하여 200㎚ 두께의 Au층을 증착하였다. 다음으로, Au 층 상에 포토레지스트를 도포한 후, KrF 스텝퍼 노광장비와 레티클를 사용하여, 원하는 전극 패턴(도1b 참조)에 대응되는 포토레지스트 패턴에 형성하였다.
이어, 포토레지스트 패턴을 마스크로 사용하여, 유도결합 플라즈마(ICP) 식각 장비 내에서 Au 을 선택적으로 제거하였으며, 동일한 패턴으로 Ti막도 선택적으로 제거하였다. 아세톤을 이용하여 초음파 비커에서 3∼4분간 침지시켜 포토레지스트 패턴를 제거하였다.
다음으로, 나노웰 어레이를 위한 절연층을 형성하기 위해서, 플라즈마 화학기상증착(PECVD) 장비를 이용하여 150㎚ 두께의 실리콘 질화물(Si3N4)층을 증착하고, 앞선 포토리소그래피 공정과 유사하게 각각 230㎚ 직경의 홀을 피치 비 1:1이 되되록 실리콘 질화물(Si3N4)층을 선택적으로 제거하였다. 실리콘 질화물(Si3N4)인 절연층을 구비한 나노웰 어레이 바이오센서를 제조하였다.
다만, 본 실시예에 따라 제조된 바이오 센서는 아래의 표1과 같이 다른 세정조건을 적용하였다.
구분 황산 용액(H2SO4) 세정 페리시아나이드 에칭
실시예1A X X
실시예1B ○ X
실시예1C ○ ○
황산 용액 세정은 CV 분석 전에 H2SO4 용액에 침지하여 + 1.8V에서 3분 동안 전처리하였으며, 페리시아나이드 에칭은 바이오 센서를 페리시아나이드 용액에 침지하여 실온에서 K3Fe(CN)6을 100 mV/s의 스캔 속도(Scan Rate)로 처리하였다. 페리시아나이드 용액은 5mM K3Fe(CN)6와 0.1M KCl의 혼합 용액을 사용하였다. 또한, 고체 Ag/AgCl 바(3M KCl을 가짐) 및 백금 와이어를 기준 전극 및 상대 전극으로 사용한다.
구체적으로, CV 분석, 황산 용액 세정 및 페리시아나이드 에칭을 위한 조건을 아래의 표2와 같이 설정하여 수행하였다.
구분 CV 분석 황산 용액 세정 페리시아나이드 에칭
Init E(V) -0.6 0 -1.2
High E(V) 0.4 1.8 1.2
Low E(V) -0.6 0 -1.2
Init P/N P P P
Scan Rate(V/s) 0.1 0.1 0.1
Segment 5 4 3
Sample interval(V) 0.01 0.01 0.01
Quiet time(sec) 2 2 2
Sensitivity(A/V) 1e-5 1e-4 0.001
예를 들어, CV 분석은, 100mM 인산 완충 염수(phosphate-buffered saline)(pH7.4)를 함유하는 용액 중에서, 스캔 속도 100mV/초로 행하되, 초기 전위(Init E)는 -0.6V, 최고 전위(High E)는 +0.4V로 설정하였다.
그 결과로 얻어진 바이오 센서, 즉 실시예1A 내지 실시예1C에 따른 바이오 센서의 나노웰 어레이를 SEM으로 촬영하였으며, 각 바이오 센서에 대해서 CV 측정을 실시하였다.
도10a 내지 도10c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(실시예1A 내지 실시예1C)를 촬영한 SEM 사진들이며, 도11a 내지 도11c는 각각 도10a 내지 도10c의 바이오 센서에 대한 CV 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도10a 내지 도10c를 참조하면, 모든 실시예에 따른 바이오 센서에서 나노웰 어레이는 매우 균일하게 배열된 것으로 확인할 수 있다. 특히, 하단 이미지와 같이, 각 나노웰의 개구 직경이 약 230㎚이고, 나노웰은 1:1의 피치 비가 되도록 간격을 갖는 것으로 나타났다(SEM 사진 중 스케일바: 200㎚).
본 실시예와 같이, 실리콘 질화물(Si3N4)인 질연층을 이용함으로써 균일하고 안정적인 나노웰 어레이를 형성할 수 있으며, 이러한 나노웰에 노출된 전극으로부터 얻어진 전기신호는 정밀한 정량화가 가능하므로 바이오 센서의 감도와 선택성을 크게 향상시킬 수 있다.
한편, 도11a 내지 도11c을 참조하면, 실시예1A의 경우에는 산화환원 전류 피크(redox peak)가 거의 나타나지 않는데 반하여, 실시예1B에서는 상대적으로 선명한 산화환원 전류 피크가 관찰되었다. 특히, 황산용액의 세정 후에 페리시아나이드 에칭을 추가한 실시예1C의 경우에는 가장 선명한 산화환원 전류 피크가 관찰되었다.
이와 같이, 세정공정을 적용하지 않은 실시예1A의 경우에, 전극 표면이 잘 노출되지 않을 정도로 전극 표면에 불순물들의 잔재가 남아있는데 반하여, 세정 공정을 적용한 실시예1B 및 실시예1C의 경우에는 나노웰의 바닥면에 위치한 불순물이 제거되어 전극 표면이 정상적으로 노출된 상태인 것으로 이해될 수 있다.
실시예2 : SiO 2 절연층을 채용한 바이오 센서
본 실시예에서는 실시예2와 동일한 공정을 적용하여 바이오 센서를 제조하되, 나노웰을 위한 절연층을 실리콘 질화물(Si3N4)을 대신하여 실리콘 산화물(SiO2)로 형성하였다. 또한, 본 실시예에 따라 제조된 바이오 센서는 아래의 표3과 같이 다른 세정조건을 적용하였다. 각 세정 조건은 실시예1에 채용된 세정조건들과 동일한 조건으로 수행되었다.
구분 황산 용액(H2SO4) 세정 페리시아나이드 에칭
실시예2A X X
실시예2B ○ X
실시예2C ○ ○
그 결과로 얻어진 바이오 센서, 즉 실시예2A 내지 실시예2C에 따른 바이오 센서의 나노웰 어레이를 SEM으로 촬영하였으며, 각 바이오 센서에 대해서 CV 측정을 실시하였다.
도12a 내지 도12c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(실시예2A 내지 실시예2C)를 촬영한 SEM 사진들이며, 도13a 내지 도13c는 각각 도12a 내지 도12c의 바이오 센서에 대한 CV 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
우선, 도12a 내지 도12c를 참조하면, 모든 실시예에 따른 바이오 센서에서 나노웰 어레이는 매우 균일하게 배열된 것으로 확인할 수 있다. 특히, 하단 이미지와 같이, 각 나노웰의 개구 직경이 약 230㎚이고, 나노웰은 1:1의 피치 비가 되도록 간격을 갖는 것으로 나타났다.
이와 같이, Si3N4 절연층(실시예1)과 유사하게. SiO2를 이용하여도 균일하고 안정적인 나노웰 어레이를 형성할 수 있다. 또한, 이러한 나노웰에 노출된 전극으로부터 얻어진 전기신호는 정밀한 정량화가 가능하므로 바이오 센서의 감도와 선택성을 크게 향상시킬 수 있다.
도13a 내지 도13c을 참조하면, 실시예2A의 경우에 산화 전류 피크는 비교적 정상적이나 환원 전류 피크는 잘 나타나지 않았으나, 황산 용액 세정이 적용된 실시예2B에서는 상대적으로 선명한 환원 전류 피크도 관찰되었다. 특히, 황산용액의 세정 후에 페리시아나이드 에칭을 추가한 실시예2C의 경우에는 가장 선명한 산화 환원반응 피크가 관찰되었다.
이와 같이, 세정공정을 통해서 나노웰의 바닥면에 위치한 불순물이 효과적으로 제거되어 전극 표면이 정상적으로 노출된 것으로 이해될 수 있다.
비교예 : 포토레지스트로 구성된 절연층을 채용한 바이오 센서
본 비교예에서는 실시예1 및 실시예2와 동일한 공정을 적용하여 바이오 센서를 제조하되, 나노웰을 위한 절연층을 Si3N4 또는 SiO2와 같은 무기 절연층이 아닌 포토레지스트 물질을 이용하여 형성하였다. 또한, 본 비교예에 따라 제조된 바이오 센서는 아래의 표4과 같이 다른 세정조건을 적용하였다. 각 세정 조건은 실시예1 및 2에 채용된 세정조건들과 동일한 조건으로 수행되었다.
구분 황산 용액(H2SO4) 세정 페리시아나이드 에칭
비교예A X X
비교예B ○ X
비교예C ○ ○
그 결과로 얻어진 바이오 센서, 즉 비교예A 내지 비교예C에 따른 바이오 센서의 나노웰 어레이를 SEM으로 촬영하였으며, 각 바이오 센서에 대해서 CV 측정을 실시하였다.
도14a 내지 도14c는 세정 공정 조건을 달리하여 제조된 바이오 센서(비교예A 내지 비교예C)를 촬영한 SEM 사진들이며, 도15는 도13a의 바이오 센서에 대한 순환 전압 전류법(CV) 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
우선, 도14a 내지 도14c를 참조하면, 비교예A에 따른 바이오 센서는 다른 실시예들과 유사하게 나노웰 어레이는 매우 균일하게 배열되고, 각 나노웰의 개구 직경이 약 230㎚이고, 나노웰은 1:1의 피치 비가 되도록 간격으로 나타나고 있으나, 세정공정이 적용된 비교예B 및 비교예C에서 포토레지스트 절연층의 나노웰이 무너지거나 훼손된 것으로 확인할 수 있다. 이와 같이, 포토레지스트와 같은 유기 절연층은 세정 공정에 적용되는 용액과 화학반응을 일으키므로, 본 발명에 따른 세정 공정을 도입하기에는 적절치 않다고 볼 수 있다.
도15를 참조하면, 전체적으로 산화환원 전류 피크(redox peak)가 잘 나타나질 않는 것으로 볼 수 있으며, 전극 표면이 잔류 불순물에 의해 노출되지 않는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 센서의 제조 방법은 개선된 전기 화학적 성질을 갖는 바이오 센서의 전극을 제공한다. 이러한 전기 화학적 특성은 순환 전압 전류(CV) 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
특정 예에서, 페리시아나이드(Fe(CN)6) 세정의 스캔 사이클은 1 사이클 또는 2 사이클을 포함할 수 있다. 다른 특정 예에서, Fe(CN)6 세정 단계의 스캔 주기 2회 이상의 사이클을 포함할 수도 있다.
통상적으로, 1V보다 큰 전압으로 전류를 인가하는 Fe(CN)6 세정 조건은 전극의 표면 완전성에 악영향을 미칠 가능성이 있다고 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서 도입된 페리시아나이드 에칭(또는 세정)의 경우에는, 1V보다 큰 전압을 갖는 전류는 단시간 동안 인가되어 불순물의 제거 및 바이오 센서의 전극의 향상된 전기 화학적 특성과 같은 예상치 못한 유리한 결과를 얻을 수 있다. 임의의 다른 예에서, 0.9∼1.5 V, 1.0∼1.4 V, 1.1∼1.3 V 또는 1.15∼1.25 V의 전압으로 전류를 인가하는 것을 포함하는 Fe(CN)6 세정 조건에서도 앞선 예와 유사한 예상치 못한 유리한 결과가 발생할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 나노웰을 제공하는 절연층은 황산(H2SO4) 용액을 이용한 세정공정 및 K3Fe(CN)6 용액을 이용한 세정공정에서 반응하지 않는 물질로 구성될 수 있다. 예를 들어, 포토레지스트와 같은 유기물보다는 무기물로 형성될 수 있다. 특히, 본 발명의 일부 실시예들은 Si3N4 및/또는 SiO2로 형성된 절연층을 포함하는 전기 화학적 바이오 센서에 적합할 수 있다. 또한, 나노웰을 제공하는 절연층을 포토레지스트로 형성하는 것은 전극(예, 금)과의 약한 결합 측면에서도 적합하지 않다.
또한, 일부 실시예에서, 페리시아나이드 에칭 단계에서 상술된 용액에 추가하여 인산염 완충 염수(phosphate-buffered saline) 용액이 사용될 수도 있다
본 발명은 상술한 실시형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
당업자는 본 발명의 대상을 "바이오 센서"라고 부르지만, 그 응용이 생물학적 분자의 검출에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 다시 말해, 본 발명은 다른 작은 비생물학적 (예를 들어, 무기, 금속, 용질, 전해질 및/또는 원소) 분자의 검출에 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 제공된 예는 유체 및/또는 액체 환경에서의 검출로 이루어 지지만, 당업자라면 오일, 용매, 기체 및 / 또는 콜로이드 용액과 같은 다른 유체 환경에서 작은 분자를 검출하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
전기 화학적 바이오 센서가 광범위한 응용 분야에 널리 적용되기 위해서는 바이오 센서가 매우 민감하고 높은 선택성이 요구되며 이러한 센서의 제조 비용은 경쟁력이 있을 필요가 있다. 현저하게 개선된 감도 및 선택도를 갖는 전기 화학적 바이오 센서는 이러한 장치의 소형화를 가능하게 할 수 있으며, 제조비용을 감소시킬 수 있고, 광범위한 응용 분야에 대한 전기 화학적 바이오 센서의 채택에 기여할 수 있다.

Claims (9)

  1. 기판 상에 버퍼층을 형성하는 단계;
    버퍼층 상에 금속층을 형성하는 단계;
    제1 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 금속층을 패터닝하여 원하는 전극을 형성하는 단계;
    상기 전극 상에 무기 절연층을 형성하는 단계;
    제2 포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 전극의 일부 영역이 노출되도록 상기 무기 절연층에 복수의 나노웰(nanowells)을 형성하는 단계; 및
    상기 복수의 나노웰에 의해 노출된 전극 영역으로부터 불순물이 제거되도록 황산(H2SO4) 용액을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정하는 단계를 포함하며,
    상기 황산 용액을 이용한 세정 단계 후, 페리시아나이드 에칭을 이용하여 상기 복수의 나노웰을 세정하는 단계를 더 포함하며,
    상기 페리시아나이드 에칭은, 바이오 센서를 K3Fe(CN)6과 KCl의 혼합 용액에 침지한 상태에서 0.9∼1.5 V 전압을 인가함으로써 수행되는 바이오 센서 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 페리시아나이드 에칭은, 15∼25℃ 범위에서 1∼10초간 수행되는 바이오 센서 제조방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 전극은 금(Au)을 포함하는 바이오 센서 제조방법.
  6. 제1항에 있어서
    상기 무기 절연층은 SiO2 또는 Si3N4를 포함하는 바이오 센서 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 황산 용액을 이용한 세정 단계는 상기 바이오 센서를 황산 용액에 침지하여 1.5∼2.0 V 전압을 인가하여 1∼5분 동안 수행되는 바이오 센서 제조방법.

  8. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 나노웰의 피치 비는 각 나노웰의 크기 대 인접한 나노웰의 최단 간격으로 정의되며, 1:3 이하인 바이오 센서 제조방법.
  9. 기판 상에 전극을 형성하는 단계;
    상기 전극 상에 무기 절연층을 형성하는 단계;
    포토리소그래피 공정을 이용하여 상기 전극의 일부 영역이 노출되도록 상기 절연층에 복수의 나노웰을 형성하는 단계; 및
    상기 나노웰이 형성된 결과물을 황산(H2SO4) 용액에 침지한 상태에서 1.5∼2.0 V 전압을 인가하는 1차 세정 단계; 및
    상기 1차 세정된 결과물을 K3Fe(CN)6과 KCl의 혼합 용액에 침지한 상태에서 0.9∼1.5 V 전압을 인가하여, 페리시아나이드 에칭을 이용하는 2차 세정 단계를 포함하는 바이오 센서 제조방법.
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