KR102096100B1 - Ask1의 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ASK1의 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, ASK1의 인산화 저해제는 LRRK2에 의한 ASK1 Thr832의 인산화를 억제하여 신경세포의 사멸을 억제할 수 있으므로 파킨슨병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ASK1의 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Parkinson's Disease comprising apoptosis signal-regulating kinase 1 Phosphorylation Inhibitor}
본 발명은 ASK1 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson's disease)은 알츠하이머 치매와 더불어 노년기에 나타나는 대표적인 퇴행성 신경질환의 하나이며, 65세 인구에서 1% 정도가 발병하며 나이가 들수록 그 발병율이 증가한다(Gasser 2007; Thomas and Beal 2007). 파킨슨병은 운동성 장애를 나타내며, 안정시 떨림, 경직, 느린 동작, 자세의 불안정이 대표적인 증후이다. 파킨슨병은 병리학적으로는 중뇌의 흑뇌에 있는 도파민성 신경세포가 점진적으로 사멸하여 도파민의 분비 감소로 인하여 생기는 질병이다(Olanow and Tatton 1999).
파킨슨병은 대부분 산발적으로 발생하지만, 일부는 유전자 돌연변이에 의하여 발생된다(Lewthwaite and Nicholl 2005; Gasser 2007). 돌연변이에 의해 파킨슨병을 일으키는 원인 유전자로는 PARK2(parkin), PINK1(PTEN-induced putative kinase 1), DJ-1, α-시누클레인(α-synuclein), LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2) 등이 알려져 있다(Moore, West et al. 2005; Gasser 2007; Thomas and Beal 2007). 이중에서 LRRK2는 세포 신호 전달에 관여하는 GTPase, 인산화효소의 기능적 도메인, 단백질 상호결합에 관여하는 WD40 및 LRR(leucine-rich repeat) 도메인을 포함한다(Paisan-Ruiz, Jain et al. 2004; Zimprich, Biskup et al. 2004).
파킨슨병을 유발하는 LRRK2 돌연변이는 GTPase 부분에 있는 R1441G, R1441C, 인산화효소 부분에 있는 G2019S, I2020T 및 GTPase와 인산화효소 도메인 사이에 있는 Y1699C가 보고된 바 있다(Paisan-Ruiz, Jain et al. 2004; Zimprich, Biskup et al. 2004). 특히 G2019S 돌연변이를 갖는 파킨슨병 환자들은 다른 MAPK(mitogen-activated protein kinase)보다 p38 MAPK의 활성이 상대적으로 높은 편이다. 또한, LRRK2 G2019S 돌연변이 단백질은 과발현되는 경우 인산화효소 활성을 증가시키며, 세포 독성을 유발하고, 신경축삭의 길이를 감소시키는 것으로 알려져 있다(Smith, Pei et al. 2005; Smith, Pei et al. 2006; West, Moore et al. 2007; MacLeod et al. 2006).
따라서, 파킨슨병의 발병에 관여하는 LRRK2 기작을 밝힘으로써 파킨슨병의 치료제 개발에 활용할 수 있다. 본 발명자들은 LRRK2가 신경세포의 사멸에 관여하는 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)의 인산화효소 활성을 조절할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1793552호
본 발명의 일 목적은 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)의 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 ASK1 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및 상기 세포에서 ASK1의 인산화 여부를 확인하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 ASK1의 인산화 저해제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '파킨슨병(Parkinson's disease)'은 안정시 떨림, 경직, 느린 동작, 자세의 불안정을 특징으로 하는 퇴행성 신경계 질환이다. 중뇌의 흑뇌에 있는 도파민성 신경세포가 점진적으로 사멸하여 도파민의 분비 감소로 인하여 발생한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 인산화 저해제는 ASK1의 인산화를 억제하며, 예를 들어 서열번호 9로 기재되는 ASK1 아미노산 서열에서 832번째 아미노산인 트레오닌(threonine)의 인산화를 저해할 수 있다. 상기 ASK1 T832의 인산화가 저해되면 ASK1의 자가인산화(autophosphorylation)이 억제되고, 하위 p38-MAPK 신호전달 경로의 활성화 또한 억제되므로 결과적으로 신경세포의 사멸을 방지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 인산화 저해제에는 ASK1에 특이적인 항체가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 신경세포의 사멸을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 ⒜ ASK1 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및 ⒝ 상기 세포에서 ASK1의 인산화 여부를 확인하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 ASK1의 인산화 여부를 확인하는 단계는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열에서 832번째 아미노산인 트레오닌의 인산화 여부를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 ASK1의 인산화 수준을 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있는 통상적인 방법, 예를 들어 항체를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 스크리닝 방법은 ⒝ 단계 이후 ASK1의 인산화 수준이 증가한 경우 피검물질을 파킨슨병의 예방 또는 치료에 유효한 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
ASK1 인산화 저해제는 ASK1 T832의 인산화 및 ASK1의 자가인산화를 억제하여 신경세포의 사멸을 억제할 수 있으므로 파킨슨병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 LRRK2에 의하여 ASK1-p38 MAPK 신호전달경로에 관여하는 인산화효소가 인산화되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다: 도 1의 A는 ASK1 결과; B는 MKK6 결과; 및 C는 p38 MAPK 에 대한 결과이다.
도 2의 A는 ASK1의 이량체화에 대한 LRRK2 G2019S 및 K1906M의 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2의 B는 다양한 LRRK2 돌연변이 단백질에 의한 ASK1의 인산화 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 ASK1의 발현 억제가 LRRK2에 의한 MKK6(A) 및 p38 MAPK(B)의 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 ASK1의 발현 억제가 LRRK2에 의한 ATF2의 전사 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다: 도 4의 A는 ASK1을 녹다운(knockdown)시킨 HEK293 세포 결과; 및 B는 Ask1이 결실된 MEF(MEF(Ask1-/-)) 결과이다.
도 5는 ASK1의 발현이 저해된 마우스 배아 섬유아세포에서 LRRK2에 의한 p38 MAPK의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 산화 스트레스에 의한 ASK1의 활성화에 LRRK2가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7의 A는 LRRK2와 ASK1의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7의 B는 산화 스트레스 조건에서 LRRK2와 ASK1의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 LRRK2, LRRK2 G2019S 및 LRRK2 K1906M과 ASK1의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 ASK1과 LRRK2의 단백질 복합체 형성 여부를 수크로스 농도구배 침강으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 ASK1-p38 MAPK 신호전달경로에 관여하는 인산화효소와 LRRK2의 단백질 복합체 형성 여부를 마우스의 뇌에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 ASK1의 발현이 저해된 마우스 배아 섬유아세포에서 ASK1 신호전달경로의 하위 인산화효소와 LRRK2의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 MAPK 신호전달경로에 관여하는 인산화효소와 LRRK2의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 JIP의 발현이 저해된 마우스 배아 섬유아세포에서 MLK3와 LRRK2의 결합에 미치는 영향을 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 LRRK2와 p38 MAPK 또는 JNK 신호전달경로의 구성 요소 사이의 결합에 JIP1이 필수인지 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 15는 LRRK2, LRRK2 G2019S 및 LRRK2 K1906M에 의한 ASK1의 인산화 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 다양한 생물종의 ASK1 서열에서 LRRK2가 인식하는 인산화 공통 서열의 존재 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 ASK1의 돌연변이 단백질인 ASK1 T832A에 대한 LRRK2의 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 ASK1 야생형(WT), ASK1 T832A(인산화-결핍 ASK1) 및 ASK1 인산화 모방체(ASK1 T832E 및 ASK1 T832D)의 활성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 19의 A는 ASK1 T832의 인산화 여부가 ASK1 T845의 인산화를 조절하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 19의 B는 산화 스트레스 조건에서 ASK1 T832A와 ASK1 T845A가 T832의 인산화를 조절하는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 20의 A는 ASK1 WT, ASK1 T832E/T845A(EA), ASK1 T832A/T845E(AE) 및 ASK1 T832E/T845E(EE)의 활성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 20의 B는 ASK1 WT, ASK1 T832E/T845A(EA), ASK1 T832A/T845E(AE) 및 ASK1 T832E/T845E(EE)가 ATF2의 전사 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 21은 ASK1의 발현 억제가 LRRK2에 의한 단백질 응집체(inclusion body) 형성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 22는 ASK1 T832A가 LRRK2에 의한 단백질 응집체 형성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 23은 ASK1의 발현 억제(A) 또는 ASK1 T832A(B)가 LRRK2에 의한 세포 내 활성 산소종 생성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 24는 ASK1의 발현 억제(A) 또는 ASK1 T832A(B)가 LRRK2에 의한 신경세포의 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 25는 노화 관련 세포사멸을 유도한 신경줄기세포에서 LRRK2 GC 또는 LRRK2 G2019S 발현에 따른 콜로니 형성능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 26은 프로테아좀 저해제 MG132, LRRK2 저해제 IN-1 또는 ASK1 저해제 PFTA-1 처리에 따른 ASK1의 인산화를 확인한 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 세포 배양
HEK293(human embryonic kidney 293) 세포, Ask1 +/+ 및 Ask1 -/- 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblasts; 이하, MEF로 기재함)는 10%(v/v) 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. SH-SY5Y 세포는 10%(v/v) FBS 및 Nutrient Mixture F-12가 보충된 DMEM을 사용하였다. 모든 배양 배지에는 페니실린/스트렙토마이신을 1%(v/v) 추가하고, 세포 배양은 37℃, 5% CO2 조건으로 가습 배양기에서 수행하였다. 세포 내 플라스미드 DNA 형질주입(transfection)에는 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000; Invitrogen)을 사용하였다.
2. 줄기세포 배양 및 분화(Differentiation)
LRRK2 G2019S 돌연변이를 나타내는 파킨슨병 환자로부터 당업계에 알려진 방법에 따라 사람 유도만능 줄기세포(human induced pluripotent stem, human iPS cell; 이하, iPS로 기재함)를 제작하였다. 제작한 iPS는 mTeSRTM1 배지(STEMCELL Technologies)를 사용하여 매트리겔(Matrigel; BD Biosciences)이 코팅된 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양은 지지세포 비의존적 조건(feeder-free condition)에서 수행하고, 배양 배지는 매일 교체하였다.
사람 iPS 세포를 AggreWell™800 플레이트(STEMCELL Technologies)에서 5일 동안 현탁 배양(suspension culture)하여 배양체(embryoid bodies; 이하, EB로 기재함) 형성을 유도하였다. 형성된 EB는 폴리-L-오르니틴/라민(poly-L-ornithine/laminin; Sigma)이 코팅된 플레이트로 옮기고, 부착능을 회복시키기 위하여 STEMdiff™ Neural Induction Medium(STEMCELL Technologies)에서 5일 동안 추가로 배양하였다.
분화된 신경줄기세포(differentiated neuronal stem cell)는 STEMdiff™ Neuron Differentiation Kit(STEMCELL Technologies)로 제작하였다. 먼저 제조사의 프로토콜에 따라 상기 키트를 사용하여 사람 iPS 세포를 7일 동안 배양하였다. 이후, 증식 배지(proliferation medium)를 STEMdiff™ Neuron Maturation Kit로 교체하여 21일 동안 추가로 배양하였다.
3. 재조합 플라스미드 제작
Myc 또는 GST 태그(tags)를 갖는 야생형 LRRK2(Leucine-rich repeat kinase 2)와 변이 LRRK2는 당업계에 알려진 방법에 따라 pcDNA3.1 플라스미드에 클로닝하였다. 사람 ASK1 유전자를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; 이하, shRNA로 기재함) 서열(5′-GCACTCCTTCATCGAGCTA-3′'; 서열번호 1)은 pSuper retro vector(Oligoengine)에 삽입하였다. pGPU6-기반 LRRK2 shRNA를 포함하는 플라스미드는 GenePharma(상하이, 중국)에서 수득하였다. 사람 LRRK2를 표적으로 하는 shRNA 서열은 5′-CAATGTCAGGTGTTATAATAT-3′'(서열번호 2)이다. 서열 특이성은 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색으로 확인하고, 어떠한 알려진 포유류 서열과도 일치하지 않는 스크램블 shRNA 서열을 사용하여 GenBank에서 검증하였다. 스크램블 shRNA, LRRK2 shRNA 또는 ASK1 shRNA는 리포펙타민 2000을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포에 각각 형질주입하였다.
4. 위치-특이적 돌연변이 유도(site-Directed Mutagenesis)
QuikChange kit(Stratagene)로 ASK1을 코딩하는 cDNA에 위치-특이적 돌연변이를 유도하고, 서열분석으로 돌연변이 유무를 확인하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같으며, 소문자로 표시된 서열은 ASK1의 cDNA 주형과 일치하지 않는 서열을 나타낸다.
T832A: 5'-AGATCTCTGACTTCGGAgcaTCAAAGAGGCTTGCT-3' (서열번호 3)
T832D: 5'-TTCTCAAGATCTCTGACTTCGGAgatTCAAAGAGGCTTGCTGGCA-3' (서열번호 4)
T832E: 5'-TTCTCAAGATCTCTGACTTCGGAgagTCAAAGAGGCTTGCTGGCA-3' (서열번호 5)
T845A: 5'-ATAAACCCCTGTACTGAAgctTTTACTGGTACCCTCC-3' (서열번호 6)
T845D: 5'-GCATAAACCCCTGTACTGAAgatTTTACTGGTACCCTCCAGT-3' (서열번호 7)
T845E: 5'-CTGGCATAAACCCCTGTACTGAAgagTTTACTGGTACCCTCCAGTATAT-3' (서열번호 8)
5. 웨스턴 블롯(Western blot)
형질주입 48시간 후 세포를 회수하여 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1 mM dithiothreitol(DTT) 및 leupeptin과 aprotinin 각각 2 ㎍/㎖)로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000xg, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 수용성 분획을 분리하였다. 상기 수용성 분획에 램리 버퍼(Laemmli buffer)를 첨가하여 끓인 후, 황산 도데실 나트륨-폴리아크릴아미드 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; 이하, SDS-PAGE로 기재함)을 수행하였다.
전기영동이 끝난 후 단백질을 PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 이동시키고, PVDF 막을 0.1% 트윈-20 및 5% 탈지유(non-fat milk)를 포함하는 PBS(pH 7.4)로 블록킹하였다. 이후 PVDF 막을 1차 항체와 반응시키고, HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 2차 항체와 추가로 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 항-Myc(9E10), 항-HA(12CA5), 항-Flag M2(Sigma-Aldrich), 항-p38, 항-MKK3, 항-MKK6, 항-phosphorylated ASK1 Thr845, 항-SOX2(Cell Signaling Technology), 항-LRRK2 (Novus Biologicals), 항-ASK1, 항-β-actin, 항-lamin, 항-nestin, 항-Ki67(Santa Cruz Biotechnology) 및 항-phosphorylated ASK1 Thr832(GL Biochem, China) 항체이다. 단백질 밴드는 ECL(enhanced chemiluminescence)로 확인하였다.
6. 공동 면역 침전(co-immunoprecipitation, Co-IP)
형질주입 48시간 후 세포를 차가운 PBS로 세척하고, RIPA 버퍼로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000xg, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하고, 상기 1차 항체와 반응시킨 후 단백질 A-아가로스 비드(protein A-agarose beads)와 추가로 반응시켰다. 차가운 PBS로 비드를 3회 세척한 후 램리 버퍼를 첨가하여 끓이고, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 이후 상기 5와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
7. 인 비트로( in vitro ) 단백질 결합
GST-LRRK2 야생형 및 이의 변이 단백질을 pGEX 벡터를 사용하여 대장균(Escherichia coli, E.coli) BL21 균주에서 발현시키고, 글루타치온-아가로스 비드(glutathione(GSH)-agarose beads; Sigma)를 사용하여 분리 및 정제하였다. 서로 다른 발현 플라스미드로 형질주입된 HEK293 세포의 용해물과 동일한 양의 GST 또는 GST-LRRK2를 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 차가운 PBS로 비드를 3회 세척한 후 램리 버퍼를 첨가하여 끓이고, 상기 5와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
8. 인산화효소 활성 확인
배양한 세포를 회수한 후 버퍼 A[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, leupeptin 2 ㎍/㎖, aprotinin 2 ㎍/㎖, 25 mM glycerophosphate, 0.1 mM sodium orthovanadate, 1 mM sodium fluoride, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate 및 0.1% SDS]로 4℃에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000xg, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 수용성 분획을 인산화효소 1차 항체와 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 반응물과 단백질 A-아가로스 비드를 4℃에서 1시간 동안 추가로 반응시켰다. 면역침전물(immunopellet)을 용해 버퍼 A로 3회 세척하고, 20 mM HEPES로 2회 세척하였다.
상기 면역침전물을 기질 단백질 2 ㎍을 포함하는 반응 버퍼 20 ㎕와 30℃에서 30분 동안 반응시켜 기질 단백질의 인산화를 유도하였다. 반응 버퍼는 0.2 mM sodium orthovanadate, 10 mM MgCl2, 2 μCi [32P]ATP 및 20 mM HEPES(pH 7.4)를 포함한다. 인산화된 기질 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, Fuji FLA-7000 phosphorImager로 인산화 수준을 정량하였다. 기질로 사용한 GST 융합 단백질은 pGEX 벡터를 사용하여 E.coli BL21 균주에서 발현시켰으며, GSH-세파로스(GSH-sepharose)로 분리 및 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법(Bradford method; Shimadzu)으로 확인하였다.
9. 루시퍼레이스 리포터(luciferase reporter) 활성 확인
ATF2(activating transcription factor 2)의 전사 활성은 ATF2-GAL4B 융합 단백질을 사용하여 측정하였다. 상기 ATF2-GAL4B 융합 단백질은 ATF2의 인산화-의존성 활성 도메인(phosphorylation-dependent activation domain; 아미노산 1-96)과 효모 전사 인자인 GAL4의 DNA-결합 도메인을 포함한다. GAL4는 포유류 유전자의 프로모터 엘리먼트(promoter element)에 결합하지 않는 것으로 알려져 있으므로, 다른 전사 조절 단백질에 의한 간섭을 회피할 수 있다.
HEK293 세포에 pFA-ATF2-GAL4B 플라스미드, pFR-Luc 플라스미드(GAL4 및 GAL4-Luc 발현) 및 β-갈락토시데이스(β-galactosidase)를 형질주입하였다. 48시간 후 세포를 회수하여 화학형광(chemiluminescence) 용해 버퍼(1 M K2HPO4 18.3%, 1 M KH2PO4 1.7%, 1 mM PMSF 및 1 mM DTT)로 세포를 용해시키고, 형광측정기 (luminometer; Berthold)로 분석하였다. 루시퍼레이스 리포터 유전자의 활성은 β-갈락토시데이스 활성으로 보정하였다.
10. 면역형광(immunofluorescence)
커버슬립(coverslip; Fisher) 위에서 배양한 세포를 PBS로 희석한 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고, PBS로 희석한 0.1% Triton X-100으로 세포의 투과성을 회복시켰다. 이후 세포를 1% 소 혈청 알부빈(bovine serum albumin, BSA)으로 블록킹하고, 1:100으로 희석한 1차 항체와 반응시켰다. PBS로 세포를 3회 세척하고, 1:100으로 희석한 Alexa Fluor® 488 또는 Alexa Fluor® 532 (Molecular Probes) 2차 항체와 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세포를 3회 세척하고, TO-PRO®-3 Iodide(Molecular Probes)로 핵을 교차염색(counterstain)하였다. PBS로 세포를 세척하고, ProLong® Gold antifade reagent(Molecular Probes)를 사용하여 커버 슬립을 슬라이드 위에 고정(mount)시켰다. 염색된 세포를 공초점 현미경(Leica TCS SPE)으로 관찰하고, 동일 세포에서 단일 Z 섹션의 이미지를 획득하였다. 최종 이미지는 LAS AF software(Leica)로 제작하였다. 도면 내 스케일 바(scale bar)는 25 ㎚를 나타낸다.
11. 수크로스 농도 구배 침전(sucrose gradient sedimentation)
플레이트에 가득 찰 때까지 배양한 세포에서 배지를 제거하고, 1 mM Tris-HCl(pH 7.4) 및 1 mM EDTA를 첨가하였다. 세포 용해물을 3,000xg에서 5분 동안 원심분리하고, 투명한 분획물을 14x89 ㎜ 튜브 내의 10%-50% 수크로스 상층부에 로딩하였다. 벡크만(Beckman) SW-41 로터를 사용하여 상기 튜브를 72,000xg, 4℃에서 18시간 동안 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면 튜브의 상층부에서 800 ㎕를 회수하고, 6% 및 10% 젤을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 웨스턴 블롯은 상기 5와 동일한 방법으로 진행하였다.
12. 계면활성제-용해성 분획(detergent-solubility fractionation)
총 세포 용해물에 Triton X-100을 최종 농도 1%가 되도록 첨가하여 얼음 위에서 1시간 동안 반응시킨 후 15,000xg, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 Triton X-100 용해성 분획인 상등액을 분리하고, 펠렛(pellet)은 1% SDS를 포함하는 용해 버퍼에 현탁시켜 10초 동안 초음파 분쇄(sonication)하였다. 각각의 세포 용해물(상등액 및 펠렛)에 램리 버퍼를 첨가하여 끓이고, 상기 5와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 진행하였다.
13. 아넥신 V-FITC(annexin V-FITC) 형광 확인
리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000; Invitrogen)으로 세포에 플라스미드 DNA 0.5 ㎍을 형질주입한 후 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 원심분리로 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 재현탁시킨 후 아넥신 V-FITC(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit; BioVision)와 어두운 곳에서 반응시켰다. 염색된 세포는 FITC 필터가 구비된 공초점 현미경으로 관찰하였으며, 획득한 이미지는 LAS AF 소프트웨어로 분석하였다. 스케일 바는 25 ㎚를 나타낸다.
14. 세포내 활성산소(intracellular reactive oxygen species) 분석
세포에 각각의 플라스미드 DNA 0.5 ㎍을 형질주입한 후 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 세척하고, DCFHDA(2′,7′'-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFHDA; Molecular Probes, USA) 염료 10 μM을 처리하여 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 염색된 세포는 LAS AF 소프트웨어가 구비된 공초점 현미경으로 관찰하였다. 스케일 바는 25 ㎚를 나타낸다.
세포내 활성산소 생성 수준은 2′,7′'-디클로로디하이드로플루오레세인 (2′,7′'-dichlorodihydrofluorescein)이 디클로로플루오레세인 (dichlorofluorescein)으로 산화되면서 발생한 형광 수준을 확인하여 측정하였다. 형광 수준은 여기 파장(excitation wavelength) 504 ㎚ 및 방출 파장(emission wavelength) 524 ㎚에서 확인하였다.
15. LRRK2 기질 추정-인 실리코 예측(in silico prediction)
LRRK2의 추정상 기질은 인산화 상응 서열(consensus sequences)인 F/Y-X-T-X-K/R 및 R-X-X-S 서열의 존재 유무에 기반하여 동정하였다. LRRK2 기질 모티프(motif)에 매칭하는 인산화 부위를 갖는 단백질을 동정하기 위하여, PROSITE 데이터베이스(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)를 사용하여 단백체 (proteome)를 분석하였다.
기능적 신호 전달 경로를 예측하기 위하여, OMIM (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 및 DISEASES (http://diseases.jensenlab.org/Search) 데이터베이스를 사용하여 후보 기질을 관련 질환과 함께 분석하였다. LRRK2 기질 모티프에 상응하는 모티프를 갖는 후보 기질은 인산화 부위를 확인하기 위하여 질량 분석 결과를 사용하여 PhosphoSite(www.phosphosite.org) 데이터베이스에서 추가로 분석하였다. 서열 보전(sequence conservation) 여부는 UniProt(www.uniprot.org) 및 NCBI Protein (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/protein) 데이터베이스에서 확인하였다. ASK1, MLK3, TAK1 및 RAF1(Protein Datebase 코드: 2CLQ, 3DTC, 2EVA 및 3OMV)의 결정 구조는 Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)를 사용하여 분석하였다.
16. 통계 분석
실험 결과에 대한 그래프는 SigmaPlot 소프트웨어(SYSTAT)로 작성하였다. 평균값의 통계적 비교는 2개의 데이터 세트에 대해 비대응 스튜던트 양측 t-검정(unpaired Student's 2-tailed t-test)를 사용하여 수행하였다. 모든 통계적 검정에서 p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 모든 실험 결과는 표준 편차(standard deviation, SD)를 계산하고, 실험 및 관련 데이터의 변동을 오차 막대(error bar)로 표시하였다. 모든 결과 값은 평균±표준편차로 표시하였다.
실험 결과
1. LRRK2에 의한 ASK1 신호전달경로 조절
LRRK2와 ASK1-p38 MAPK 신호전달경로(pathway)의 관련성을 확인하기 위하여, 시험관 내 인산화효소 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이 LRRK2가 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)의 단백질 수준은 변화시키지 않으면서 인산화효소 활성을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1의 A, B 및 C에 나타난 바와 같이 LRRK2 G2019S는 ASK1, MKK6(MAPK kinase 6) 및 p38 MAPK의 인산화효소 활성을 현저하게 상승시켰다. 그러나 인산화효소 도메인에서 ATP-결합 부위가 파괴된 우성-음성 돌연변이체(dominant-negative mutant)인 LRRK2 K1906M에서는 인산화효소 활성 상승 효과를 확인할 수 없었다.
또한, 도 2의 A에 나타난 바와 같이 LRRK2 G2019S는 ASK1의 이량체화(dimerization)를 촉진하는 반면, LRRK2 K1906M은 ASK1의 이량체화를 저해하였다. 도 2의 B에 나타난 바와 같이 G2019S 및 R1441C와 같은 LRRK2의 활성 돌연변이 단백질들은 야생형 LRRK2와 비교하여 ASK1의 인산화효소 활성을 유도하는 것을 알 수 있었다. 그러나 LRRK2 K1906M과 같이 인산화효소 활성이 제거된 돌연변이체의 경우 ASK1의 인산화효소 활성을 유도하지 못하는 것을 알 수 있었다. 상기 실험 결과는 LRRK2의 인산화효소 활성이 ASK1-p38 MAPK 신호전달경로의 활성화에 중요함을 의미한다.
한편, LRRK2의 표적을 확인하기 위하여 LRRK2가 ASK1을 통하여 p38 MAPK 신호전달경로에 관여하는 인산화효소를 활성화시키는지 여부를 실험하였다.
실험 결과, 도 3의 A 및 B에 나타난 바와 같이 shRNA로 ASK1의 발현을 억제하는 경우 LRRK2에 의한 MKK6 및 p38 MAPK의 활성화가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 도 4의 A 및 B에 나타난 바와 같이 ASK1을 녹다운(knockdown)시킨 HEK293 세포 및 Ask1이 결실된 MEF(이하, MEF(Ask1-/-)로 기재함)에서 LRRK2에 의한 ATF2의 전사 활성이 억제되었다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이 야생형 MEF와 비교하여 MEF(Ask1-/-)에서 p38 MAPK 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 LRRK2에 의한 p38 MAPK 신호전달경로의 활성화가 ASK1 의존적인 것임을 확인할 수 있었다.
산화 스트레스와 같은 세포외 스트레스(extracellular stress)는 14-3-3 단백질과 티오레독신(thioredoxin)의 분리, ASK1의 이량체화 및 시그날로좀 복합체(signalosome complex) 형성을 통하여 ASK1을 활성화시킨다.
따라서, 산화 스트레스에 의한 ASK1 활성화에 LRRK2가 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 산화 스트레스에 의해 유도된 ASK1의 인산화효소 활성이 LRRK2 녹다운에 의하여 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
종합적으로 상기 실험 결과들은 ASK1-p38 MAPK 신호전달경로가 LRRK2의 하위 표적(downstream target)임을 의미한다.
2. LRRK2와 ASK1의 결합 여부 확인
LRRK2와 ASK1의 연관성을 추가로 확인하기 위하여, LRRK2와 ASK1을 이소성으로 발현시킨 HEK293 세포에서 co-IP 실험을 수행하였다.
실험 결과, 도 7의 A에 나타난 바와 같이 LRRK2와 ASK1이 서로 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 7의 B에 나타난 바와 같이 산화 스트레스에 의하여 ASK1과 LRRK2의 활성화 및 결합이 촉진되는 것을 알 수 있었다.
또한, LRRK2의 인산화효소 활성이 단백질 결합에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 LRRK2의 인산화효소-활성(G2019S) 및 인산화효소-비활성(K1906M) 돌연변이 단백질로 co-IP 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 야생형 LRRK2와 비교하여 ASK1이 LRRK2 G2019S와는 강하게 결합하나, LRRK2 K1906M과는 약하게 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
ASK1과 LRRK2의 결합 여부를 추가로 확인하기 위하여 H2O2를 처리 또는 무처리한 SH-SY5Y 세포의 용해물로부터 수크로스 농도구배 침강으로 다중단백질 복합체(multiprotein complexes)의 혼합물을 분리하였다.
분리 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 LRRK2, ASK1, MKK3/6 및 p38 MAPK가 올리고머 복합체(oligomeric complexes)를 구성하고, 산화 스트레스를 받으면 이 복합체가 고분자량 복합체로 약간 이동하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 올리고머 복합체를 생체 내에서 추가로 확인하기 위해 마우스의 뇌 조직에서 LRRK2 특이적 항체로 co-IP를 수행하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 ASK1 신호전달경로에 관여하는 인산화효소와 LRRK2가 마우스의 뇌에서 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, ASK1이 삼중 복합체(ternary complex)의 형성을 매개할 수 있으므로 ASK1-결핍 조건에서 인산화효소의 결합 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 ASK1 신호전달경로의 하위 인산화효소인 MKK3/6 및 p38 MAPK가 MEF(Ask1-/-)에서 LRRK2에 결합하는 것을 알 수 있었다. 본 실험 결과는 ASK1 신호전달경로의 하위 인산화효소가 ASK1과 독립적으로 LRRK2와 직접 결합하는 것을 의미한다.
3. LRRK2와 ASK1 결합의 JIP1 의존성 확인
LRRK2가 다른 MAPK 신호전달경로에서도 핵심 역할을 수행하는지 여부를 확인하기 위하여, HEK293 세포에서 MLK3(mixed lineage kinase 3), MEKK1(MAPK/ERK kinase kinase 1), TAK1(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7, MAP3K7) 및 Raf-1(v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1, serine/threonine kinase)을 포함하는 다른 MAP3K(MAP kinase kinase kinase, MEKK)와 LRRK2의 결합 여부를 확인하였다. 확인 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 ASK1 이외에 LRRK2가 MLK3 및 MEKK1과 결합하는 것을 알 수 있었다.
JIP(JNK-interacting protein)는 JNK (c-Jun N-terminal kinase) 및 p38 MAPK 신호전달경로를 조절하는 핵심 단백질이며(Oncogene 26, 2007, 3185-3202), LRRK2와 결합하는 것으로 알려져 있다(Neurodegener. Dis. 7, 2010, 68-75). 따라서, JIP1이 LRRK2와 MLK3 사이의 결합을 매개하는지 확인하였다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 야생형 JIP1을 발현하는 MEF(JIP1+/+)에서 LRRK2와 MLK3가 결합하는 것을 알 수 있었다. 그러나 JIP1가 결손된 MEF(JIP1-/-)에서는 두 단백질의 결합이 현저하게 감소하였다.
또한, LRRK2와 p38 MAPK 또는 JNK 신호전달경로의 구성 요소 사이의 결합에 JIP1이 필수인지 여부를 확인하였다. 확인 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 MEF(JIP1+/+) 및 MEF(JIP1-/-) 모두에서 LRRK2가 ASK1 및 MKK3과 결합하는 것을 알 수 있었다. 그러나 LRRK2와 p38 MAPK의 결합은 MEF(JIP1-/-)에서 약간 감소하였다. 또한, JNK 신호전달경로의 구성 요소인 JNK1과 LRRK2의 결합은 MEF(JIP1-/-)에서 확인할 수 없었다.
상기 실험 결과들은 LRRK2가 JIP1 의존성 및 JIP1 의존성 방식으로 각각 p38 MAPK 및 JNK 신호전달경로의 구성 요소와 특이적으로 상호작용함을 의미한다.
4. LRRK2에 의한 ASK1의 인산화(Thr832)가 필수인지 여부 확인
LRRK2가 ASK1 신호전달경로의 직접적인 상위 인산화효소인지 확인하기 위해 GST-ASK1을 사용하여 생체 외(in vitro) 키나아제 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 LRRK2 K1906M을 제외한 LRRK2 야생형(WT)과 G2019S에 의하여 ASK1이 인산화되는 것을 확인할 수 있었다.
최근 LRRK2가 인식하는 인산화 공통 서열(putative phosphorylation consensus sequences)이 밝혀졌다(PLoS One, 5, 2010, e13672). 상기 인산화 공통 서열 및 인 실리코(in silico) 방법을 사용하여 LRRK2에 의해 인산화되는 MAPK의 아미노산 잔기를 분석하였다.
그 결과, 도 16의 하단에 나타난 바와 같이 마우스 ASK1(mASK1)은 사람 ASK1의 Thr825와 상동인(homologous) Thr832를 포함하는 활성화 루프에 잠재적 LRRK2 인산화 모티프를 포함하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 상기 인산화 모티프는 제브라 피쉬를 비롯한 여러 척추동물(vertebrates)에 걸쳐 보존되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, ASK1의 돌연변이 단백질에 대한 LRRK2의 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 17의 A 및 B에 나타난 바와 같이 ASK1 T832A는 LRRK2에 의하여 인산화되지 않고, 활성화되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 17의 C에 나타난 바와 같이 LRRK2에 의하여 유도되는 ATF2의 전사 활성을 ASK1 T832A가 저해하는 것을 알 수 있었다.
또한, 야생형 ASK1, ASK1 T832A(인산화-결핍 ASK1) 및 ASK1 인산화 모방체(ASK1 T832E 및 ASK1 T832D)의 활성을 비교하였다. 그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이 야생형 ASK1 및 ASK1 T832A와 비교하여 ASK1 T832E 및 ASK1 T832D가 강하게 활성화되는 p38 MAPK인 것을 확인할 수 있었다.
산화 스트레스 조건에서 ASK1 T845의 자가인산화(autophosphorylation)는 ASK1의 활성화에 중요한 것으로 알려져 있다(J. Cell. Physiol. 191, 2002, 95-104). 따라서 ASK1 T832의 인산화 여부가 T845의 인산화를 조절하는지 확인하였다.
확인 결과, 도 19의 A에 나타난 바와 같이 Thr845의 인산화 수준이 ASK1 T832A에서는 감소하고 인산화 모방체인 ASK1 T832E 및 ASK1 T832D에서 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 19의 B에 나타난 바와 같이 ASK1 T832A 및 ASK1 T845A는 산화 스트레스에 의하여 활성화되지 않는 것을 알 수 있었다.
한편, T832 및 T845의 인산화가 ASK1 활성화에 필수적인지 여부를 인산화 모방 및/또는 결핍 돌연변이 단백질로 확인하였다.
그 결과, 도 20의 A에 나타난 바와 같이 단일 인산화 모방 돌연변이체(Single phosphorylation-mimic mutant)인 ASK1 T832E/T845A(EA)와 ASK1 T832A/T845E(AE)는 야생형 ASK1 인산화 활성의 중간 정도 활성(moderate activation)을 나타내었다. 반면, 야생형 ASK1과 이중 인산화 모방 돌연변이체 (dual phosphorylation-mimic mutants)인 ASK1 T832E/T845E(EE)는 유사한 수준의 인산화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 20의 B에 나타난 바와 같이 ATF2 전사 활성 또한 유사한 경향을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과는 Thr832와 Thr845의 인산화가 ASK1의 완전한 활성화에 필수충분 조건임을 의미한다.
5. ASK1의 Thr832 인산화에 의한 신경세포의 세포사멸 촉진
LRRK2 G2019S는 파킨슨병의 특징인 비정상적 단백질 응집체의 형성을 촉진하여 신경세포의 사멸을 촉진한다. 따라서 사람 신경아세포종 (neuroblastoma)인 SH-SY5Y 세포에서 면역형광 염색을 수행하여 응집체 (inclusion body)의 형성 여부를 확인하였다. 확인 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 ASK1 녹다운에 의해 LRRK2를 포함하는 단백질 응집체의 수준이 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, ASK1 T832A는 LRRK2에 의해 활성화되지 않으므로 ASK1 T832A에 의하여 응집체가 형성되는지 확인하였다. 그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이 야생형 ASK1에 비해 ASK1 T832A를 형질주입한 경우 응집체 형성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 23에 나타난 바와 같이 ASK1가 녹다운되거나 ASK1 T832A를 형질주입한 경우 LRRK2 G2019S에 의한 세포 내 활성 산소종 생성이 감소하는 것을 알 수 있었다.
다음으로 LRRK2가 ASK1을 인산화시킴으로써 신경세포의 사멸을 유도하는지 확인하였다. 그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이 ASK1가 녹다운되거나 ASK1 T832A를 형질주입한 경우 LRRK2 G2019S에 의한 세포사멸(apoptosis)이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과는 LRRK2가 ASK1의 Thr832를 인산화시킴으로써 신경 독성을 유도함을 시사한다.
6. LRRK2에 의한 ASK1 의존적 신경줄기세포(neuronal stem cell) 사멸 효과
프로테아좀 기능 장애(Proteasomal dysfunction)는 노화 과정에서 프로테아좀(proteasome)의 활성을 감소시키고, 신경세포의 사멸에 관여하며, 부적절하게 접힌 단백질(misfolding protein)의 분해를 감소시켜 신경세포를 사멸에 이르게 한다. 따라서 NSC에 프로테아좀 저해제인 MG132(Sigmal Aldrich, 미국)를 처리하여 NSC에 노화 관련 세포사멸을 유도하였다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이 LRRK2 G2019S(LRRK2 G2019S mut)를 발현하는 NSC의 경우 MG132 처리에 의하여 콜로니 형성능(colony-forming ability)이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, LRRK2와 ASK1이 NSC의 복제성 확장(clonal expansion)을 조절하는지 확인하기 위해, LRRK2 저해제인 IN-1(Sigmal Aldrich) 또는 ASK1 저해제 PFTA-1(Sigmal Aldrich)을 NSC에 처리한 후 콜로니 형성능을 측정하였다. 측정 결과, 도 25에 나타난 바와 같이 MG132 처리에 의하여 감소하였던 LRRK2 G2019S-발현 NSC의 콜로니 형성능이 유의하게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 인산화된 ASK1 T832 또는 T845에 대한 항체를 사용하여 NSC에서 인산화된 ASK1의 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 26에 나타난 바와 같이 MG132가 T832 및 T845 모두에서 인산화를 강하게 유도하는 반면, PFTA-1과 IN-1은 LRRK2-mut NSC에서 ASK1의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Parkinson's Disease comprising apoptosis signal-regulating kinase 1 Phosphorylation Inhibitor <130> PN180124 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 1 gcactccttc atcgagcta 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 2 caatgtcagg tgttataata t 21 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T832A <400> 3 agatctctga cttcggagca tcaaagaggc ttgct 35 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T832D <400> 4 ttctcaagat ctctgacttc ggagattcaa agaggcttgc tggca 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T832E <400> 5 ttctcaagat ctctgacttc ggagagtcaa agaggcttgc tggca 45 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T845A <400> 6 ataaacccct gtactgaagc ttttactggt accctcc 37 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T845D <400> 7 gcataaaccc ctgtactgaa gattttactg gtaccctcca gt 42 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T845E <400> 8 ctggcataaa cccctgtact gaagagttta ctggtaccct ccagtatat 49 <210> 9 <211> 1380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse ASK1 protein sequence <400> 9 Met Gly Thr Glu Ala Gly Glu Gly Ile Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Phe Cys Thr Ile Pro Glu Gly Gly Ser Cys Arg Arg 20 25 30 Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Glu Gly Glu Pro Ser Leu Gln Pro 35 40 45 Leu Leu Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val 50 55 60 Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Cys Pro Thr Thr Ala Pro Gly 65 70 75 80 Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg Gly Asn Ser Gly Ser Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val Ile Asn Glu Ala Ser Gln Gly Gln Leu 100 105 110 Val Val Ala Glu Ser Glu Ala Leu Gln Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu 115 120 125 Ala Val Gly Ala Thr Leu Glu Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe 130 135 140 Gly Glu Thr Ala Val Leu Asp Arg Phe Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Val Glu Met Ser Asp Ala Phe Arg Gln Pro Ser Leu Phe Tyr His Leu 165 170 175 Gly Val Arg Glu Ser Phe Ser Met Ala Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Cys 180 185 190 Asp Thr Asn Ser Asp Ser Leu Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ile Cys Gln 195 200 205 Lys Asn Thr Val Cys Thr Gly Asn Tyr Thr Phe Ile Pro Tyr Met Val 210 215 220 Thr Pro His Asn Lys Val Tyr Cys Cys Asp Ser Ser Phe Met Lys Gly 225 230 235 240 Leu Thr Glu Leu Met Gln Pro Asn Phe Glu Leu Leu Leu Gly Pro Ile 245 250 255 Cys Leu Pro Leu Val Asp Arg Phe Val Gln Leu Leu Lys Val Ala Gln 260 265 270 Ala Ser Ser Ser Gln Tyr Phe Arg Glu Ser Ile Leu Ser Asp Ile Arg 275 280 285 Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala 290 295 300 Arg Ile Arg Gln Arg Val Asp Asn Ile Glu Val Leu Thr Ala Asp Ile 305 310 315 320 Val Ile Asn Leu Leu Leu Ser Tyr Arg Asp Ile Gln Asp Tyr Asp Ser 325 330 335 Ile Val Lys Leu Val Glu Thr Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu 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550 555 560 Val Thr Val Val Arg Phe Pro Val Leu Ile Leu Glu Pro Thr Lys Ile 565 570 575 Tyr Gln Pro Ser Tyr Leu Ser Ile Asn Asn Glu Val Glu Glu Lys Thr 580 585 590 Ile Ser Ile Trp His Val Leu Pro Asp Asp Lys Lys Gly Ile His Glu 595 600 605 Trp Asn Phe Gly Ala Ser Ser Val Arg Gly Val Ser Ile Ser Lys Phe 610 615 620 Glu Glu Arg Cys Cys Phe Leu Tyr Val Leu His Asn Ser Asp Asp Phe 625 630 635 640 Gln Ile Tyr Phe Cys Thr Glu Leu His Cys Lys Arg Phe Phe Glu Met 645 650 655 Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu Lys Gly Arg Gly Ala Glu Asp Gly Asp 660 665 670 Cys Glu Gly Asp Ser Leu Glu Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn Gly 675 680 685 Asp Arg Val Val Leu Gly Lys Gly Thr Tyr Gly Ile Val Tyr Ala Gly 690 695 700 Arg Asp Leu Ser Asn Gln Val Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile Pro Glu 705 710 715 720 Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gln Pro Leu His Glu Glu Ile Ala Leu His 725 730 735 Lys His Leu Lys His Lys Asn Ile Val Gln Tyr Leu Gly Ser Phe Ser 740 745 750 Glu Asn Gly Phe Ile Lys Ile Phe Met Glu Gln Val Pro Gly Gly Ser 755 760 765 Leu Ser Ala Leu Leu Arg Ser Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn Glu 770 775 780 Gln Thr Ile Gly Phe Tyr Thr Lys Gln Ile Leu Glu Gly Leu Lys Tyr 785 790 795 800 Leu His Asp Asn Gln Ile Val His Arg Asp Ile Lys Gly Asp Asn Val 805 810 815 Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Thr 820 825 830 Ser Lys Arg Leu Ala Gly Ile Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr Gly 835 840 845 Thr Leu Gln Tyr Met Ala Pro Glu Ile Ile Asp Lys Gly Pro Arg Gly 850 855 860 Tyr Gly Lys Ala Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile Glu 865 870 875 880 Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gln Ala 885 890 895 Ala Met Phe Lys Val Gly Met Phe Lys Val His Pro Glu Ile Pro Glu 900 905 910 Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys Ala Phe Ile Leu Lys Cys Phe Glu Pro 915 920 925 Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys Ala Asn Asp Leu Leu Ile Asp Glu Phe 930 935 940 Leu Lys Val Ser Ser Lys Lys Lys Lys Thr Gln Pro Lys Leu Ser Ala 945 950 955 960 Leu Ser Thr Gly Ser Asn Glu Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Leu Pro Val 965 970 975 Pro Val Leu Val Glu Asp Thr Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Gly Ser Val 980 985 990 Ser Pro Asp Thr Glu Leu Lys Ala Asp Pro Phe Ser Phe Lys Ala Arg 995 1000 1005 Ala Lys Ser Cys Gly Glu Lys Asp Gly Lys Gly Ile Arg Thr Leu Phe 1010 1015 1020 Leu Gly Ile Pro Asp Glu Asn Phe Glu Asp His Ser Ala Pro Pro Ser 1025 1030 1035 1040 Pro Glu Glu Lys Asp Ser Gly Phe Phe Met Leu Arg Lys Asp Ser Glu 1045 1050 1055 Arg Arg Ala Thr Leu His Arg Ile Leu Thr Glu Asp Gln Asp Lys Val 1060 1065 1070 Val Arg Asn Leu Met Glu Ser Leu Ala Gln Gly Ala Glu Glu Pro Lys 1075 1080 1085 Leu Lys Trp Glu His Ile Thr Thr Leu Ile Ser Ser Leu Arg Glu Phe 1090 1095 1100 Val Arg Ser Thr Asp Arg Lys Ile Ile Ala Thr Thr Leu Ser Lys Leu 1105 1110 1115 1120 Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp Ser His Gly Ile Ser Gln Val Gln Val 1125 1130 1135 Val Leu Phe Gly Phe Gln Asp Ala Val Asn Lys Val Leu Arg Asn His 1140 1145 1150 Asn Ile Lys Pro His Trp Met Phe Ala Leu Asp Ser Ile Ile Arg Lys 1155 1160 1165 Ala Val Gln Thr Ala Ile Thr Ile Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro His 1170 1175 1180 Phe Ser Leu Ala Ser Glu Ser Asp Thr Ala Asp Pro Glu Asp Leu Asp 1185 1190 1195 1200 Val Glu Asp Glu His Glu Glu Leu Ser Ser Asn Gln Thr Val Arg Arg 1205 1210 1215 Pro Gln Ala Ile Thr Glu Asp Ala Val Ala Thr Ser Gly Val Ser Thr 1220 1225 1230 Leu Ser Ser Thr Val Ser His Asp Ser Gln Asn Ala His Arg Ser Leu 1235 1240 1245 Asn Val Gln Leu Gly Arg Met Lys Ile Glu Thr Asn Arg Leu Leu Glu 1250 1255 1260 Glu Leu Val Arg Lys Glu Arg Glu Leu Gln Ala Leu Leu His Gln Ala 1265 1270 1275 1280 Ile Glu Glu Lys Asp Gln Glu Ile Arg His Leu Lys Leu Lys Ser Gln 1285 1290 1295 Pro Ile Asp Ile Pro Gly Phe Pro Val Cys His Leu Asn Ser Pro Gly 1300 1305 1310 Thr Thr Thr Glu Asp Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Arg Glu Asn Gly 1315 1320 1325 Ala Asp Glu Asp Thr Ile Ser Arg Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Thr Leu 1330 1335 1340 Val Asp Val Leu Tyr Tyr Val Thr Arg Asp Asp Leu Lys Cys Leu Arg 1345 1350 1355 1360 Leu Arg Gly Gly Met Leu Cys Thr Leu Trp Lys Ala Ile Ile Asp Phe 1365 1370 1375 Arg Asn Lys Cys 1380

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. ⒜ ASK1 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및
    ⒝ 상기 세포에서 ASK1의 인산화 여부를 확인하는 단계를 포함하며,
    상기 ASK1의 인산화 여부를 확인하는 단계는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열에서 832번째 아미노산인 트레오닌의 인산화 여부를 확인하는 것인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
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PLoS one, Vol. 7, e29935, pages 1-8 (2012)*

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