KR102086408B1 - Stem cell activating method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor - Google Patents

Stem cell activating method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor Download PDF

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Abstract

본 발명은 유효성분으로 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제를 줄기세포에 처리함으로써, Wnt 신호 경로에 관련된 β-카테닌 및 이와 관련된 단백질인 TCF4, 사이클린 D1, c-myc의 발현을 촉진하고, 피부 각질 줄기세포 마커인 α6 인테그린과 모낭 줄기세포 마커인 CD34의 발현을 촉진하여, 줄기세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. The present invention treats stem cells with lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitors as active ingredients, thereby promoting the expression of β-catenin and its related proteins TCF4, cyclin D1, and c-myc, which are involved in the Wnt signaling pathway. The present invention relates to a method for activating stem cells by promoting expression of α6 integrin, which is a keratin stem cell marker, and CD34, a hair follicle stem cell marker.

Description

라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제를 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 활성화 방법{Stem cell activating method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor} Stem cell activation method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor to stem cells {Stem cell activating method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor}

본 발명은 줄기세포 활성화 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제를 줄기세포에 처리함으로써, 줄기세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for activating stem cells, and more particularly, to a method for activating stem cells by treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor to stem cells.

인간의 피부는 표피와 진피로 나뉘어져 있다. 표피의 가장 아래에 있는 기저 층에서 새로이 형성된 각질 형성세포는 표피 아래층에서 위층으로 서서히 이동하면서, 약 14일 이후에 각질로 변하게 되고, 다시 14일 정도 뒤에는 완전히 노화되어 허물이나 때가 되어 벗겨져 나간다. 피부는 이와 같이 지속적으로 재생(renew)되며, 피부의 상피에 존재하는 줄기세포 즉, 피부의 표피 줄기세포(epidermal stem cells)는 상처 후 표피의 복구에 관여하는 것으로 알려져 있다(Epidermal Stem Cells of the Skin, Cedric Blanpain, Elaine Fuchs, Annual Review of Cell and Developmental Biology, November 2006, Vol. 22, Pages 339-373).
Human skin is divided into epidermis and dermis. The newly formed keratinocytes in the basal layer at the bottom of the epidermis gradually migrate from the epidermis to the upper layer, turning into keratin after about 14 days and completely aging after about 14 days and peeling off. The skin is continuously renewed in this way, and stem cells in the epidermis of the skin, that is, epidermal stem cells of the skin, are known to be involved in the repair of the epidermis after the wound (Epidermal Stem Cells of the Skin, Cedric Blanpain, Elaine Fuchs, Annual Review of Cell and Developmental Biology, November 2006, Vol. 22, Pages 339-373).

상처를 입는 경우, 생체는 이를 치유하기 위하여 다양한 생리적 반응을 나타내는데, 일반적으로 상해를 받은 세포의 변성(變性), 사멸 과정을 거쳐 위성 줄기세포가 조직재생을 위한 분화를 유도함으로써 상처를 치유한다. 구체적으로 상처는 주변 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 특이한 미세환경(microenvironment)을 창출한다. 상처 미세환경의 일부 인자는 충분히 오랜 기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로의 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에의 참여를 유발한다.
When wounded, the living body exhibits various physiological responses in order to heal the wound. Generally, the wounded cells are healed by inducing differentiation for tissue regeneration through the process of degeneration and death of the injured cells. Specifically, the wound creates a unique microenvironment consisting of growth factors, cytokines, neurohormones, and extracellular matrix secreted from surrounding cells, blood derived cells, and sensory neurons. Some factors of the wound microenvironment persist for a long enough time to spread into peripheral blood, which then affects stem cells, causing the migration of bone marrow cells to peripheral blood, supplying to the wound site, and participation in wound healing.

노화 세포나, 노화된 동물, 그리고 노인 등 나이에 따라 상처 치유의 정도가 달라지며 나이가 들면서 상처 치유가 잘 안 된다는 것이 잘 알려져 있다(Agren et al., 1999; Hardman and Ashcroft, 2008; Marcus et al., 2000; Spindler et al., 1995 Jeong et al., 2008). 노화 세포는 젊은 사람에 비해 나이 든 사람의 피부에 더 많이 존재하며, 그래뉼 조직을 형성하기 위하여 필요한 세포복제가 감소되고, 이로 인하여 상처 치유의 속도를 감소시키는 결과를 보인다(Pitterman, 2007).
It is well known that the extent of wound healing varies with age, such as senescent cells, aged animals, and the elderly, and that wound healing is poor with age (Agren et al., 1999; Hardman and Ashcroft, 2008; Marcus et al. al., 2000; Spindler et al., 1995 Jeong et al., 2008). Aging cells are more present in the skin of older people than in young ones, resulting in a decrease in the cellular replication required to form granule tissue, thereby reducing the rate of wound healing (Pitterman, 2007).

최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 조직항상성과 재생에는 줄기세포의 재활성화가 필수적이라는 점이 보고되고 있다. 상기 줄기세포가 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용(paracrine effect)이라 알려져 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine, 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). 현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다.
Recently published studies report that stem cell reactivation is essential for tissue homeostasis and regeneration. The stem cells promote regeneration of skin tissue, which is known as a paracrine effect (protein complex) secreted from stem cells (Pankaj KMJ Cardiovascular Medicine, 2008). Most of the complex proteins are known as growth factors, and active research on these growth factors has recently been conducted. It has been found that these growth factors decrease in body concentration with increasing age, and that the decrease in growth factor concentration in the body is closely related to aging (Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). At present, various studies are being conducted to suppress the aging of living organisms by supplying growth factors from the outside, and also studies on specific effects of individual growth factors are being conducted.

한편, LPA는 혈소판 응고, 부드러운 근육의 수축, 세포의 형태변화, 주화성, 세포 증식 또는 세포 분열과 같은 다수의 신체적 반응을 유도하는 물질로 알려져 있다. 이러한 LPA는 특이적인 G-단백질 짝지음 수용체(G-protein-coupled receptors)를 활성화시키고(An et al., 1998; Bandoh et al., 1999; Erickson et al., 2000; Noguchi et al.,2003), 이로 인해 세포질의 칼슘의 증가, 포스포리파아제의 자극 활성, PI3K, 또는 Ras-Raf-MAP 키나아제의 일련의 단계적인 반응을 활성화시키거나, 아데닐일 사이클라아제를 억제시키는 등의 역할을 한다(Contos et al.,2000; Fukushima and Chun, 2001; Fukushima et al., 2001; Takuwa et al., 2002).
On the other hand, LPA is known to induce a number of physical reactions, such as platelet coagulation, smooth muscle contraction, cell morphology, chemotaxis, cell proliferation or cell division. These LPAs activate specific G-protein-coupled receptors (An et al., 1998; Bandoh et al., 1999; Erickson et al., 2000; Noguchi et al., 2003 This results in increased cytoplasmic calcium, stimulating activity of phospholipase, activating a series of cascaded responses of PI3K, or Ras-Raf-MAP kinase, or inhibiting adenylyl cyclase. (Contos et al., 2000; Fukushima and Chun, 2001; Fukushima et al., 2001; Takuwa et al., 2002).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 줄기세포를 활성화시킴으로써, 상처 치유, 조직 재생을 효과적으로 유도할 수 있는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제가 줄기세포 마커의 발현을 증가시킴으로써, 피부 각질 줄기세포 및 모낭줄기세포를 효과적으로 활성화시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Against this background, the present inventors have diligently sought to find a substance that can effectively induce wound healing and tissue regeneration by activating stem cells. As a result, lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitors inhibit the expression of stem cell markers. By increasing, it was confirmed that the keratinocytes and hair follicle stem cells effectively activate the skin and completed the present invention.

본 발명은 유효성분으로 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제를 줄기세포에 처리함으로써, Wnt 신호 경로에 관련된 β-카테닌 및 이와 관련된 단백질인 TCF4, 사이클린 D1, c-myc의 발현을 촉진하고, 피부 각질 줄기세포 마커인 α6 인테그린과 모낭 줄기세포 마커인 CD34의 발현을 촉진하여, 줄기세포를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.
The present invention treats stem cells with lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitors as active ingredients, thereby promoting the expression of β-catenin and its related proteins TCF4, cyclin D1, and c-myc, which are involved in the Wnt signaling pathway. In addition, the present invention provides a method for activating stem cells by promoting expression of α6 integrin, which is a skin keratin stem cell marker, and CD34, a hair follicle stem cell marker.

하나의 양태로서, 본 발명은 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA) 및 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor) 중 어느 하나 이상을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 활성화 방법에 관한 것이다.
In one embodiment, the present invention provides a method for activating a stem cell comprising the step of treating any one or more of lysophosphatidic acid (LPA) and adenylyl cyclase inhibitor to the stem cells It is about.

본 발명에서 사용되는 "라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA)"은 인간의 이배성 섬유아세포에서 세포내 Ca2 +의 이동, 액틴 중합 및 포스파티드산의 생성을 포함하는 동일한 신호 전달 현상을 유도하는 주요한 미토겐 효현제로서, 포스파티드산의 2위 아실기가 유리하여 하이드록실기가 된 형태의 라이소체인지질을 의미한다.
The same signaling phenomena, including the "Lai parcel spa lactide acid (lysophosphatidic acid, LPA)" is moved within Ca 2 + cells from human twofold property fibroblasts, actin polymerization and the generation of phosphatidic deusan used in the present invention As a major mitogen agonist to induce, lysozyme phospholipid in the form of a hydroxyl group is advantageous because the second acyl group of phosphatidic acid is advantageous.

본 발명에서 사용되는 "아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor)"는 아데닐일 사이클라아제를 억제하는 물질을 의미하는 것으로 특별히 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 알려진 억제제를 포함한다. 예를 들어, 상기 억제제는 2',5'-디데옥시아데노신(2',5'-dideoxyadenosine), 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민(cis-N-(2-phenylcyclopentyl)azacyclotridec-1-en-2-amine), 및 9-(테트라히드로-2'-푸릴)아데닌 (9-(tetrahydro-2'-furyl)adenine)일 수 있다.
As used herein, "adenylyl cyclase inhibitor" refers to a substance that inhibits adenylyl cyclase, and is not particularly limited, and includes inhibitors known in the art. For example, the inhibitor may be 2 ', 5'-dideoxyadenosine, cis-N- (2-phenylcyclopentyl) azacyclotridec-1-en-2-amine ( cis-N- (2-phenylcyclopentyl) azacyclotridec-1-en-2-amine), and 9- (tetrahydro-2'-furyl) adenine (9- (tetrahydro-2'-furyl) adenine).

본 발명에 따른 "줄기세포"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하는 것으로, 줄기세포 자체, 줄기세포를 포함하는 조성물, 줄기세포를 포함하는 조직, 줄기세포를 포함하는 개체를 포함한다. "Stem cell" according to the present invention means a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having a self-replicating ability, the stem cell itself, a composition containing stem cells, a tissue including stem cells, stem Includes individuals including cells.

바람직하게, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 피부 각질 줄기세포 또는 모낭 줄기세포일 수 있다.  Preferably, the stem cells may be mesenchymal stem cells (MSC), skin keratin stem cells or hair follicle stem cells.

상기 피부 각질 줄기세포는 지속적으로 분열하여 전이-증폭 세포를 만드는데, 이러한 전이-증폭 세포들은 십여차례 이상의 분열을 하면서 피부의 주요 세포 중 하나인 각질 세포(Keratinocyte cells)가 되며, 분화를 통하여 피부 표면으로 올라가게 된다. 따라서, 피부 각질 줄기세포의 증식을 통해 궁극적으로는 표피를 재생시키는 역할을 한다. The dermal keratinocytes divide continuously to form metastasis-amplified cells, which are divided into a dozen or more divisions and become keratinocytes, one of the main cells of the skin, through the differentiation of the skin surface. Will go up. Thus, through the proliferation of cutaneous keratinocyte stem cells ultimately play a role in regenerating the epidermis.

또한, 상기 모낭 줄기세포는 모낭과 모낭 사이의 표피라고 불리는 표피의 기저층에 위치하고 있는 약 10%의 줄기세포 및 모낭에 존재하는 줄기세포를 포함하는 것으로 특히, 모낭 줄기세포는 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련하여 중요한 역할을 담당하고 있다. In addition, the hair follicle stem cells include about 10% of the stem cells located in the basal layer of the epidermis called the epidermis between the hair follicles and the hair follicles, and stem cells present in the hair follicles. It plays an important role in the regeneration of the epidermis.

상기 중간엽 줄기세포, 피부 각질 줄기세포 또는 모낭 줄기세포는 상업적으로 구입하거나 또는 포유류의 상피조직, 예를 들어, 두피조직으로부터 분리하여 사용할 수 있다.
The mesenchymal stem cells, cutaneous keratinocytes or hair follicle stem cells may be purchased commercially or used separately from mammalian epithelial tissue, for example, scalp tissue.

본 발명에서 사용된 "줄기세포 활성화"란 구체적으로 줄기세포 마커의 발현을 증가시키는 것으로, 예컨대, 중간엽 줄기세포, 피부 각질세포 또는 모낭 줄기세포의 베타 카테닌 등의 단백질 발현 정도를 증가되는 것을 의미한다. 줄기세포가 활성화되면 상처 치유 및 조직 재생을 유도할 수 있다.
As used herein, "stem cell activation" specifically refers to increasing expression of stem cell markers, for example, increasing the expression level of proteins such as beta-catenin in mesenchymal stem cells, skin keratinocytes or hair follicle stem cells. do. When activated, stem cells can induce wound healing and tissue regeneration.

본 발명에 따른 상기 줄기세포의 마커는 Wnt 신호 경로에 따라 증폭되는 β-카테닌 및 이와 관련한 단백질인 TCF4, 사이클린 D1, 또는 c-myc와 피부 각질 줄기세포 마커인 α6 인테그린 또는 모낭과 모낭 사이의 기저 표피(interfollicular basal epidermis) 및 모낭 돌출부(follicle bulge region)의 줄기세포 마커인 CD34 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
The marker of the stem cells according to the present invention is β-catenin amplified by the Wnt signaling pathway and the related protein TCF4, cyclin D1, or c-myc and the basal between the keratin stem cell marker α6 integrin or hair follicle and hair follicle It is preferably one of CD34, which is a stem cell marker of the interfollicular basal epidermis and follicle bulge region.

본 발명에서 사용된 "β-카테닌"은 세포의 발생, 증식 및 분화에서 결정적인 역할을 하는 물질로서, Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. As used herein, "β-catenin" is a substance that plays a critical role in the development, proliferation and differentiation of cells, and is known to play an important role in activating the Wnt signaling pathway.

또한, 본 발명에서 사용된 "TCF4"는 피부 줄기세포의 핵 내부에 존재하는 단백질로서, 주로 피부 외피의 재생과 모낭 세포의 활성화에 관여한다고 알려져 있다. 상기 단백질이 발현되지 않는 넉아웃 마우스에서 피부 외피의 장기 항상성이 유지되지 못하는 것이 알려져 있다. 또한, 본 발명에서 사용된 "사이클린 D1(Cyclin D1)"은 CDK(cyclin dependent kinase)와 결합을 이루고, 세포분열을 조절하는 인자를 의미하며, "c-myc"는 정상적인 세포분열에 관여하는 유전자의 하나로서, 세포 성장, 분화 및 아폽토시스를 조절하는 역할을 한다. In addition, "TCF4" used in the present invention is a protein existing inside the nucleus of skin stem cells, and is known to be mainly involved in skin regeneration and activation of hair follicle cells. It is known that organ homeostasis of the skin envelope is not maintained in knockout mice that do not express the protein. In addition, "Cyclin D1" used in the present invention means a factor that binds to cyclin dependent kinase (CDK) and regulates cell division, and "c-myc" is a gene involved in normal cell division. As one of them, it plays a role in regulating cell growth, differentiation and apoptosis.

또한, 본 발명에서 사용된 "CD34"는 모낭과 모낭 사이의 기저 표피(interfollicular basal epidermis) 및 모낭 돌출부(follicle bulge region)의 줄기세포 마커로서, CD34 양성 조혈모세포는 대개 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 다양한 종류로 분화될 수 있다.In addition, as used herein, "CD34" is a stem cell marker of the interfollicular basal epidermis and follicle bulge region between hair follicles and hair follicles, and CD34 positive hematopoietic stem cells are usually erythrocytes, leukocytes, platelets, etc. It can be differentiated into various kinds.

본 발명에서 사용된 "α6 인테그린(α6 integrin)은 세포와 이를 둘러싼 조직간의 부착을 매개하는 수용체로서, 세포의 상호 전달, 세포 이동, 증식 및 분화와 같은 다양한 세포 기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 상기 α6 인테그린은 피부 각질 줄기세포의 마커의 하나로서, 상기 단백질이 발현되지 않는 넉아웃 마우스에서 심각한 피부 수포가 생긴 것이 관찰되었으며, 출생하자마자 사망하는 것으로 알려져 있다. α6 인테그린은 피부 각질 줄기세포에서 주로 β4 인테그린과 결합된 상태로, 헤미데스모솜이라고 하는 세포 구조 복합체의 중요한 인자를 이루고 있다.
As used herein, "α6 integrin" is a receptor that mediates adhesion between cells and tissues surrounding them, and is known to affect various cellular functions such as intercellular transfer, cell migration, proliferation and differentiation. The α6 integrin is one of the markers of cutaneous keratinocytes and has been observed to cause severe skin blisters in knockout mice that do not express the protein, and is known to die at birth. In combination with β4 integrins, they form an important factor in the cellular structural complex called hemidesmosome.

본 발명의 LPA 및/또는 ACI는 줄기세포 마커의 발현을 효과적으로 증가시킴으로서 줄기세포를 활성화시킬 수 있다.
LPA and / or ACI of the present invention can activate stem cells by effectively increasing the expression of stem cell markers.

구체적인 일실시예에서, 본 발명의 LPA 또는 ACI를 중간엽 줄기세포(MCS)에 처리하였고, 전체 세포 lysate와 핵 분획물에 대해서 단백질 발현 양상을 웨스턴 블롯 시험으로 확인하였다. 그 결과, LPA와 ACI는 모두 MCS의 β-카테닌 및 사이클린 D1의 발현 정도를 증가시키는 것을 확인하였다. In a specific example, LPA or ACI of the present invention was treated to mesenchymal stem cells (MCS), and protein expression patterns of whole cell lysate and nuclear fractions were confirmed by Western blot test. As a result, it was confirmed that both LPA and ACI increased the expression levels of β-catenin and cyclin D1 in MCS.

또한, 구체적인 다른 실시예에서, 본 발명의 LPA 및/또는 ACI를 마우스의 피부에 처리하고, 면역형광검사 및 웨스턴블로팅을 수행한 결과, 젊은 마우스와 노화된 마우스의 표피 두께가 현저하게 증가하였으며, β-카테닌, TCF4, 사이클린 D1, c-myc 및 CD34의 발현을 증가시킴으로써, 효과적으로 줄기세포를 활성화시키는 것을 확인하였다. In another specific embodiment, treatment of the skin of mice with LPA and / or ACI of the present invention, immunofluorescence and western blotting resulted in a significant increase in epidermal thickness of young and aged mice. By increasing the expression of β-catenin, TCF4, cyclin D1, c-myc and CD34, it was confirmed that the stem cells are effectively activated.

또한, 다른 구체적인 일실시예에서, 본 발명의 LPA 및/또는 ACI를 마우스의 피부에 처리하고, RT-PCR 및 아가로스 전기영동을 수행한 결과, 젊은 마우스와 노화된 마우스의 표피 두께가 현저하게 증가하였으며, 피부 각질 줄기세포 마커인 α6 인테그린의 발현이 증가한 것을 확인하였다. In another specific embodiment, the LPA and / or ACI of the present invention was treated to the skin of mice and RT-PCR and agarose electrophoresis resulted in markedly reduced epidermal thickness of young and aged mice. It was confirmed that the expression of the keratin stem cell marker α6 integrin was increased.

특히, 젊은 마우스에서 보다 노화된 마우스에서 모든 줄기세포 마커(β-카테닌, TCF4, 사이클린 D1, c-myc, CD34 및 α6 인테그린)의 발현이 대조군(Control)에 비하여 현저하게 증가하였으며, 이로써 본 발명의 LPA 및/또는 ACI는 노화로 인해 활성이 감소한 줄기세포를 효과적으로 재활성화시킴을 알 수 있었다.
In particular, the expression of all stem cell markers (β-catenin, TCF4, cyclin D1, c-myc, CD34 and α6 integrin) was significantly increased in comparison to the control in younger mice. LPA and / or ACI was found to effectively reactivate stem cells with reduced activity due to aging.

바람직하게, 상기 줄기세포의 활성화는 체외(in vitro)에서 이루어질 수 있다.
Preferably, activation of the stem cells may be made in vitro.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제 중 어느 하나 이상을 줄기세포에 처리하여 활성화시킨 줄기세포에 관한 것이다.
As another aspect, the present invention relates to a stem cell activated by treating any one or more of the lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor to the stem cell.

또한, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA) 및 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor) 중 어느 하나 이상을 줄기세포에 처리한, 줄기세포 활성화 조성물에 관한 것이다.
In still another aspect, the present invention provides a stem cell activating composition to which one or more of lysophosphatidic acid (LPA) and adenylyl cyclase inhibitor is treated to stem cells. It is about.

본 발명에 따른 라이소포스파티드산 및 아데닐일 사이클라아제 억제제는 Wnt 신호 경로에 관련된 β-카테닌 및 이와 관련된 단백질인 TCF4, 사이클린 D1, c-myc의 발현을 촉진하고, 피부 각질 줄기세포 마커인 α6 인테그린과 모낭 줄기세포 마커인 CD34의 발현을 촉진함으로써, 줄기세포를 활성화시키는 효과가 있다. Lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitors according to the present invention promote the expression of β-catenin and its related proteins TCF4, cyclin D1, c-myc, which are involved in the Wnt signaling pathway, By promoting the expression of α6 integrin and CD34, a hair follicle stem cell marker, it has an effect of activating stem cells.

도 1은, 본 발명의 일실시예에 따른, β-카테닌의 발현 수준을 확인한 면역형광검사 결과이다.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른, β-카테닌의 면역형광검사 결과(도 1)를 분석한 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 일실시예에 따른, β-카테닌 발현 수준 측정을 위한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른, β-카테닌의 웨스턴 블로팅 결과(도 2)를 분석한 그래프이다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른, TCF4의 발현 수준을 확인한 면역형광검사 결과이다.
도 6은, 본 발명의 일실시예에 따른, TCF4의 면역형광검사 결과(도 5)를 분석한 그래프이다.
도 7은, 본 발명의 일실시예에 따른, TCF4 발현 수준 측정을 위한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 8은, 본 발명의 일실시예에 따른, TCF4의 웨스턴 블로팅 결과(도 6)를 분석한 그래프이다.
도 9는, 본 발명의 일실시예에 따른, 사이클린 D1(Cycline D1)의 발현 수준을 확인한 면역형광검사 결과이다.
도 10은, 본 발명의 일실시예에 따른, 사이클린 D1(Cycline D1)의 면역형광검사 결과(도 9)를 분석한 그래프이다.
도 11은, 본 발명의 일실시예에 따른, 사이클린 D1(Cycline D1)의 발현 수준 측정을 위한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 12는, 본 발명의 일실시예에 따른, 사이클린 D1(Cycline D1)의 웨스턴 블로팅 결과(도 10)를 분석한 그래프이다.
도 13은, 본 발명의 일실시예에 따른, c-myc의 발현 수준을 확인한 면역형광검사 결과이다.
도 14는, 본 발명의 일실시예에 따른, c-myc의 면역형광검사 결과(도 13)를 분석한 그래프이다.
도 15는, 본 발명의 일실시예에 따른, c-myc의 발현 수준 측정을 위한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 16는, 본 발명의 일실시예에 따른, c-myc의 웨스턴 블로팅 결과(도 14)를 분석한 그래프이다.
도 17은, 본 발명의 일실시예에 따른, CD34의 발현 수준을 확인한 공초점 현미경 관찰 결과이다.
도 18은, 본 발명의 일실시예에 따른, CD34의 발현 수준 측정을 위한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 19는, 본 발명의 일실시예에 따른, CD34의 웨스턴 블로팅 결과를 분석한 그래프이다.
도 20은, 본 발명의 일실시예에 따른, α6 인테그린의 발현 수준을 확인한 공초점 현미경 관찰 결과이다.
도 21은, 본 발명의 일실시예에 따른, α6 인테그린의 발현 수준 측정을 위한 전기영동 결과이다.
도 22는, 본 발명의 일실시예에 따른, α6 인테그린의 전기영동 결과를 분석한 그래프이다.
도 23은, 본 발명의 일실시예에 따른, 혈관신생 관찰 결과 및 이의 형광강도를 분석한 그래프이다.
도 24는, 본 발명의 일실시예에 따른, 세포외기질 리모델링 관찰 결과 및 이의 형광 강도를 분석한 그래프이다.
도 25는, 본 발명의 일실시예에 따른, MSC 줄기세포에 대한 LPA와 ACI의 β-카테닌 신호절달 변화 및 전사활성 변화를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다(A: 세포 total lysate를 웨스턴 블롯으로 단백질 발현 양상을 확인한 결과, B: 세포를 균질화 후 nuclear fration과 cytosol fraction으로 분리하여 각각의 단백질 발현 양상을 확인한 결과). 1 is an immunofluorescence test result confirming the expression level of β-catenin according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a graph analyzing the immunofluorescence test results (β 1) of β-catenin according to an embodiment of the present invention.
3 is a Western blotting result for measuring β-catenin expression level according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a graph analyzing the results of Western blotting (Fig. 2) of β-catenin according to an embodiment of the present invention.
5 is an immunofluorescence test result confirming the expression level of TCF4 according to an embodiment of the present invention.
6 is a graph analyzing the results of immunofluorescence test (FIG. 5) of TCF4 according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 is a Western blotting result for measuring TCF4 expression level, according to an embodiment of the present invention.
8 is a graph analyzing Western blotting results (FIG. 6) of TCF4 according to an embodiment of the present invention.
9 is an immunofluorescence test result confirming the expression level of cyclin D1 (Cycline D1) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a graph illustrating an immunofluorescence test result (FIG. 9) of cyclin D1 according to an embodiment of the present invention.
11 is a Western blotting result for measuring the expression level of cyclin D1 (Cycline D1) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a graph illustrating Western blotting results (FIG. 10) of cyclin D1 according to an embodiment of the present invention.
13 is an immunofluorescence test result confirming the expression level of c-myc according to an embodiment of the present invention.
14 is a graph analyzing the immunofluorescence test results (c. 13) of c-myc according to an embodiment of the present invention.
15 is a Western blotting result for measuring the expression level of c-myc, according to an embodiment of the present invention.
16 is a graph analyzing Western blotting results (FIG. 14) of c-myc according to an embodiment of the present invention.
17 is a confocal microscope observation result confirming the expression level of CD34, according to an embodiment of the present invention.
18 is a Western blotting result for measuring the expression level of CD34, according to an embodiment of the present invention.
19 is a graph analyzing Western blotting results of CD34 according to an embodiment of the present invention.
20 is a confocal microscope observation result confirming the expression level of α6 integrin, according to an embodiment of the present invention.
21 is an electrophoresis result for measuring the expression level of α6 integrin, according to an embodiment of the present invention.
22 is a graph analyzing the electrophoresis result of α6 integrin according to an embodiment of the present invention.
FIG. 23 is a graph illustrating angiogenesis observation results and fluorescence intensity thereof according to an embodiment of the present invention. FIG.
24 is a graph analyzing the results of extracellular matrix remodeling observation and its fluorescence intensity according to an embodiment of the present invention.
25 is a result of Western blot analysis of β-catenin signaling changes and transcriptional changes of LPA and ACI on MSC stem cells according to an embodiment of the present invention (A: cell total lysate as a Western blot As a result of confirming the protein expression pattern, B: homogenized the cells and separated into nuclear fration and cytosol fraction to confirm the expression of each protein).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it is to those of ordinary skill in the art that the gist of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. Will be self-evident.

실시예Example 1. 실험재료  1. Experimental Materials

프로테아제 억제제 칵테일은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO, USA))로부터 구입하였고, 케타민(ketamine) 및 자일라진(xylazine)은 Phoenix Pharmaceuticals Inc(Phoenix, TX, USA)로부터 구입하였으며, OCT는 Tissue-Tek (Sakura, Japan); 일차 항-β-카테닌 항체는 BD-Pharmingen(Mountain View, CA, USA); FITC-콘쥬게이티드 항-TCF4 및 로다민-콘쥬게이티드 항-β-카테닌 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA); FITC-콘쥬게이티드 항-사이클린 D1, 로다민-콘쥬게이티드 항-α6 인테그린 및 FITC-콘쥬게이티드 항-CD34 다중클론항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA, USA); 알렉사 546-콘쥬게이티드 염소 항-토끼 이차 항체, 알렉사 488-콘쥬게이티드 팔로이딘, 트리졸 시약 및 슈퍼스크립트 II 역전사효소는 Invitrogen(Eugene, OR, USA); DAPI는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA); Immuno-mount는 Shandon Lipshaw(Pittsburgh, PA, USA); BCA 단백질 시험 키트는 Pierce Biotechnology(Lockford, IL, USA); 홀스래디쉬 퍼록시데이스-콘쥬게이티드 이차 항-IgG 항체는 Vector Laboratories(Burlingame, CA, USA); 그리고 AngSense 720 및 MMPSense 680는 VisEn Medical Inc(Woburn, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
Protease inhibitor cocktails were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and ketamine and xylazine were purchased from Phoenix Pharmaceuticals Inc (Phoenix, TX, USA). , OCT, Tissue-Tek (Sakura, Japan); Primary anti-β-catenin antibodies include BD-Pharmingen (Mountain View, CA, USA); FITC-conjugated anti-TCF4 and rhodamine-conjugated anti-β-catenin antibodies are described in Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); FITC-conjugated anti-cyclin D1, rhodamine-conjugated anti-α6 integrin and FITC-conjugated anti-CD34 polyclonal antibodies are described in Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA); Alexa 546-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody, Alexa 488-conjugated paloidine, Trizol reagent and SuperScript II reverse transcriptase are described in Invitrogen (Eugene, OR, USA); DAPI is described in Molecular Probes (Eugene, OR, USA); Immuno-mount is described by Shandon Lipshaw (Pittsburgh, Pa., USA); BCA protein test kits include Pierce Biotechnology (Lockford, IL, USA); The horseradish peroxidase-conjugated secondary anti-IgG antibody is disclosed in Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA); AngSense 720 and MMPSense 680 were purchased from VisEn Medical Inc (Woburn, MA, USA) and used.

실시예Example 2. 실험동물  2. Experimental Animal

젊은(평균연령: 6개월, n=9) 수컷 C57/BL6 마우스와 노화된(평균연령 24개월, n=9) 수컷 C57/BL6 마우스를 중앙 실험동물(Chung-Ang Laboratory Animal Co., Seoul Korea)에서 구입하여 사용하였고, 12시간 : 12시간의 낮-밤 사이클로, 통제된 온도 및 습도 하에 케이지 당 두마리씩 넣었다. 동물들은 Korean Association for Accreditation of Laboratory Animal Care로 승인된 동물 시설에서 표준 식품으로 관리하였다. 상기 동물 프로토콜은 Animal Care 및 서울대학교 위원회의 승인을 받았다.
Young (average age: 6 months, n = 9) male C57 / BL6 mice and aged (average age 24 months, n = 9) male C57 / BL6 mice were used as central laboratory animals (Chung-Ang Laboratory Animal Co., Seoul Korea). ) 12 hours: 12 hours day-night cycle, two per cage per controlled temperature and humidity. Animals were administered as standard food at an animal facility approved by the Korean Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. The animal protocol was approved by Animal Care and Seoul National University Committee.

실시예Example 3.  3. 피부상처Skin wound 및 면역조직화학의 준비  And preparation of immunohistochemistry

케타민과 자일라진 혼합물(각각 15 mg/kg, 1 mg/kg)을 쥐의 복강에 주입하여 마취하였다. 피부에 상처를 내고 Balazs(Balazs et al., 2001)의 방법을 응용하여 피부 부위를 보호하는 시술을 시행하였다. 이를 서술하면, 쥐의 등에 면도를 하여 상처 낼 부분의 털을 제거하였다. 그 후에 다이아몬드 바를 사용하여, 피부찰상을 내는 기술을 이용하여 4 군데에 2도 정도의 부분 두께만 제거한 1.0 cm지름의 원을 만들었다. 상처는 건조를 막기 위해 투명 반-밀봉 드레싱(테가덤, 3M)으로 덮었다.
A mixture of ketamine and xylazine (15 mg / kg and 1 mg / kg, respectively) was injected into the abdominal cavity of rats and anesthetized. The procedure was performed to protect the skin area by injuring the skin and applying Balazs (Balazs et al., 2001). In other words, the hair of the wound was removed by shaving the rat's back. A diamond bar was then used to create a 1.0 cm diameter circle using only a two-degree partial thickness in four places, using a technique of skin scratching. The wound was covered with a transparent semi-sealing dressing (Tegaderm, 3M) to prevent drying.

또한 상처 부위에 1.2cm정도의 지름을 가진 테프론 챔버를 조직접합체인 Histoacryl과 수술용 나이론 실(Ethicon 4-0)을 사용하여 고정하였다. 외상의 상처부위를 보호하기 위해 LPA나 ACI 같은 시약을 처리할 때도 유리필터(GF-C Whatman)를 사용하여 뿌린 후 처리해 주었다. 이러한 실험은 실험의 일관성과 정확성을 위하여 한 명의 성형외과의에 의해 수행되었다. LPA (30μM), ACI (300μM) 및 상기 LPA와 ACI의 혼합물(LPA: 30μM, ACI: 300μM)을 각각 식염수에 용해하고, 메톡시플루란으로 흡입마취시킨 마우스의 상처 부위에 하루 두 번 처리하였다. 대조군으로 식염수만을 상처 부위에 처리하였다. 시술 4일 후, 상기 마우스들을 케타민과 자일라진을 이용하여 마취한 다음, 각 군당 세마리씩 PBS(pH 7.4) 내의 4% (w/v) 파라포름알데하이드로 심장관류시켜 희생시켰다. 그 후 5 mm 두께로 박절한 조직 절편을 차가운 10% 파라포름알데하이드에 담궈 밤샘 처리한 후 파라핀에 담가 샘플을 준비하였다.
In addition, a 1.2 cm diameter Teflon chamber was fixed to the wound using Histoacryl, a tissue conjugate, and a surgical nylon thread (Ethicon 4-0). In order to protect the wounds of the trauma, they were also sprayed with a glass filter (GF-C Whatman) to treat reagents such as LPA and ACI. These experiments were performed by one plastic surgeon to ensure the consistency and accuracy of the experiments. LPA (30 μM), ACI (300 μM) and the mixture of LPA and ACI (LPA: 30 μM, ACI: 300 μM) were respectively dissolved in saline and treated twice daily to wound sites of mice inhaled with methoxyflurane. . Only saline was treated at the wound site as a control. Four days after the procedure, the mice were anesthetized with ketamine and xylazine, and then sacrificed by cardiac perfusion with 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS (pH 7.4), three of each group. Thereafter, 5 mm thick tissue sections were immersed in cold 10% paraformaldehyde overnight, and then immersed in paraffin to prepare samples.

실시예Example 4: 통계학적 분석 4: statistical analysis

이하에서 수행한 실험은 처리군 사이에서의 차이점을 확인하기 위하여 Student's t-test for paired variables (Office Excel 2007; Microsoft, Redmond, WA, USA)를 사용하였고, 데이타는 적어도 세 번의 실험으로 평균 ±표준편차로 표시하였다. P < 0.05는 통계적인 유의성이 있음을 의미한다.
The experiments performed below used Student's t-test for paired variables (Office Excel 2007; Microsoft, Redmond, WA, USA) to identify differences between treatment groups. Deviation is indicated. P <0.05 means statistical significance.

실시예Example 5: β- 5: β- 카테닌Catenin 발현 수준 확인을 위한  For checking expression levels 면역형광검사Immunofluorescence

상처를 cranial-caudal axis를 따라 이등분하고, optimum cutting temperature (OCT)에서 얼리거나, 10% 포르말린에 밤새 두었다. 얼린 조직은 10 ㎛ 절편으로 잘랐고, 100%의 차가운 아세톤으로 후-고정하였다. 그리고 1% 소혈청알부민(BSA)에서 1시간동안 처리하였다. 면역형광을 위해서, 일차 항-β-카테닌을 PBS 중의 0.1%의 BSA로 1:500 희석하였고, 1시간동안 상기 조직 절편과 함께 배양하였다. 상기 조직을 세척하고, 동시에 Alexa 546-콘쥬게이티드 염소 항-토끼 이차 항체(4 g/ml) 및 Alexa 488-콘쥬게이티드 팔로이딘(0.67 U/ml)으로 0.1% BSA/PBS에서 1시간동안 배양하였다. 이어서, 핵을 가시화하기 위하여 조직을 DAPI로 5분동안 염색하였다. 커버슬립(coverslip)을 면역-고정을 사용하여 슬라이드에 고정하였고, 상기 슬라이드를 Leica DEF 280 현미경으로 사진촬영(x400)하였고 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
The wound was bisected along the cranial-caudal axis, frozen at optimum cutting temperature (OCT), or left overnight at 10% formalin. Frozen tissue was cut into 10 μm sections and post-fixed with 100% cold acetone. And it was treated for 1 hour in 1% bovine serum albumin (BSA). For immunofluorescence, primary anti-β-catenin was diluted 1: 500 with 0.1% BSA in PBS and incubated with the tissue sections for 1 hour. The tissues were washed and at the same time for 1 hour in 0.1% BSA / PBS with Alexa 546-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (4 g / ml) and Alexa 488-conjugated paloidine (0.67 U / ml) Incubated. The tissue was then stained for 5 minutes with DAPI to visualize the nucleus. Coverslips were fixed to slides using immuno-fixation, and the slides were photographed (x400) with a Leica DEF 280 microscope and the results are shown in FIGS. 1 and 2.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 나타나듯이, LPA를 처리한 경우, 젊은 마우스 및 노화된 마우스에서 피부 표피(Epidermis)의 두께가 효과적으로 증가하였으며, ACI를 처리한 경우, 젊은 마우스에서는 차이가 미소하였으나 노화된 마우스의 표피 두께는 LPA과 비슷한 정도로 증가한 것을 확인하였다. LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 젊은 마우스, 노화된 마우스 모두 현저한 증가를 관찰함으로써, LPA와 ACI가 피부 각질 줄기 세포를 유의성 있게 활성화시키는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figures 1 and 2, when the LPA treatment, the thickness of the epidermis (Epidermis) effectively increased in young and aged mice, the difference was small in young mice when ACI treatment. Epidermal thickness of aged mice was found to increase to a similar level as LPA. When LPA and ACI were simultaneously treated, it was confirmed that LPA and ACI significantly activated skin keratinocytes by observing a significant increase in both young and aged mice.

실시예Example 6: β- 6: β- 카테닌Catenin 발현 수준 측정을 위한  For measuring expression levels 웨스턴Weston 블롯팅Blotting

조직을 얼음에서 5분동안 프로테아제 저해제 칵테일(1 mL/20 g 조직)을 포함하는 RIPA 버퍼에서 균질화시켰다. PMSF (30 ㎍/g 조직)을 상기 라이세이트에 가하고, 얼음에서 30분동안 배양하였다. 14,000 rpm으로 30분동안 원심분리시켜 세포 잔해를 제거하였다. 상기 라이세이트의 총 단백질 함량은 제조사의 설명서에 따라 BCA 단백질 시험 키트를 사용하여 확인하였다. 동량의 단백질을 포함하는 세포 라이세이트를 SDS-PAGE로 용해하고 니트로셀룰로오스 필터(Protran, Schleicher & Schuell)로 이동시켰다. 블롯은 5%의 비-지방 건조 우유 및 0.1% 트윈 20으로 블로킹하였다. 블로킹 후에, 상기 블롯을 블로킹 용액 내의 항체로 밤새 처리하고, 홀스라디쉬 퍼록시데이스-콘쥬게이티드 항-IgGs (1:5000)으로 세척하고 배양하였다. 상기 면역 복합체는 강화된 화학 발광으로 가시화시켜 이를 도 3에 나타내었고, β-카테닌의 상대적인 비율을 계산하여 도 4에 나타내었다.
Tissues were homogenized in RIPA buffer containing protease inhibitor cocktail (1 mL / 20 g tissue) for 5 minutes on ice. PMSF (30 μg / g tissue) was added to the lysate and incubated for 30 minutes on ice. Cell debris was removed by centrifugation at 14,000 rpm for 30 minutes. The total protein content of the lysate was confirmed using the BCA protein test kit according to the manufacturer's instructions. Cell lysates containing the same amount of protein were lysed by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose filters (Protran, Schleicher & Schuell). Blots were blocked with 5% non-fat dry milk and 0.1% Tween 20. After blocking, the blots were treated overnight with antibodies in the blocking solution, washed with Horseradish Peroxides-conjugated anti-IgGs (1: 5000) and incubated. The immune complex was visualized by enhanced chemiluminescence and shown in FIG. 3, and the relative ratio of β-catenin was calculated and shown in FIG. 4.

그 결과, 도 3 및 4에서 확인할 수 있듯이, LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 대조군에 비하여, 3배에 달하는 발현 증가를 나타내어 피부 표피 재생에 효과적임을 확인하였다.
As a result, as can be seen in Figures 3 and 4, when treated with LPA and ACI at the same time, compared to the control group, it showed an expression of up to three times, confirming that it is effective for skin epidermal regeneration.

실시예Example 7:  7: TCF4TCF4 의 발현 수준 확인을 위한 To check the expression level of 면역형광검사Immunofluorescence

면역형광을 위한 항체로서, 일차 항-β-카테닌 및 로다민-콘쥬게이티드 항-β-카테닌 대신에, FTIC-콘쥬게이티드 항-TCF4를 사용한 것을 제외하고 실시예 5의 방법과 동일하게 면역형광검사를 수행하였고, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
Immunization in the same manner as in Example 5 except that FTIC-conjugated anti-TCF4 was used as an antibody for immunofluorescence instead of primary anti-β-catenin and rhodamine-conjugated anti-β-catenin Fluorescence was performed and the results are shown in FIGS. 5 and 6.

그 결과, 도 5 및 6에서 나타나듯이, LPA를 처리한 경우, 젊은 마우스 및 노화된 마우스에서 피부 표피가 효과적으로 증가하였으며, ACI를 처리한 경우, 젊은 마우스에서는 차이가 미소하였으나, 노화된 마우스의 표피는 LPA과 비슷한 정도로 증가한 것을 확인하였다. LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 젊은 마우스, 노화된 마우스 모두 현저한 표피 증가를 관찰함으로써, LPA와 ACI가 표피(각질) 줄기세포를 유의성 있게 활성화시키는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figures 5 and 6, LPA treatment, the skin epidermis was effectively increased in young and aged mice, when ACI was treated, the difference was small in young mice, but the epidermis of aged mice Has increased to a similar degree as LPA. When LPA and ACI were treated simultaneously, both young and aged mice observed significant epidermal growth, indicating that LPA and ACI significantly activated epidermal stem cells.

실시예Example 8:  8: TCF4TCF4 의 발현 수준 측정을 위한 For measuring expression level of 웨스턴Weston 블롯팅Blotting

TCF4의 발현 수준 측정을 위해, 실시예 6와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하였고, 이를 도 7에 나타내었고, TCF4의 상대적인 비율을 계산하여 도 8에 나타내었다.
In order to measure the expression level of TCF4, Western blotting was performed in the same manner as in Example 6, which is shown in FIG. 7, and the relative ratio of TCF4 was calculated and shown in FIG. 8.

그 결과, 도 7 및 8에서 확인할 수 있듯이, LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 대조군에 비하여, 2.5배에 달하는 TCF4 발현 증가를 나타내어 피부 표피 재생에 효과적임을 확인하였다.
As a result, as can be seen in Figures 7 and 8, when treated with LPA and ACI at the same time, compared to the control, it showed an increase in TCF4 expression up to 2.5 times, confirming that it is effective for skin epidermal regeneration.

실시예Example 9:  9: 사이클린Cyclin D1D1 (( CyclinCyclin D1D1 )의 발현 수준 확인을 위한 To confirm the expression level of 면역형광검사Immunofluorescence

면역형광을 위한 항체로서, FITC-콘쥬게이티드 항-사이클린 D1를 사용한 것을 제외하고 실시예 5의 방법과 동일하게 면역형광검사를 수행하였고, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.
As an antibody for immunofluorescence, immunofluorescence was performed in the same manner as in Example 5 except that FITC-conjugated anti-cyclin D1 was used, and the results are shown in FIGS. 9 and 10.

그 결과, 도 9 및 10에서 나타나듯이, 젊은 마우스의 경우 LPA 또는 ACI 처리에 따른 표피증가의 차이가 미소하였으나, 노화된 마우스의 경우 LPA 또는 ACI 처리시 현저하게 표피 두께가 증가한 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Figures 9 and 10, the difference in the epidermal increase according to LPA or ACI treatment in young mice was small, it was confirmed that the epidermal thickness was significantly increased in the LPA or ACI treatment in aged mice.

실시예Example 10:  10: 사이클린Cyclin D1D1 (( CyclinCyclin D1D1 )의 발현 수준 측정을 위한 For measuring expression level 웨스턴Weston 블롯팅Blotting

사이클린 D1의 발현 수준을 측정하기 위해 실시예 6과 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하였고, 이를 도 11에 나타내었고, 사이클린 D1의 상대적인 비율을 계산하여 도 12에 나타내었다.
Western blotting was performed in the same manner as in Example 6 to measure the expression level of cyclin D1, which is shown in FIG. 11, and the relative ratio of cyclin D1 was calculated and shown in FIG. 12.

그 결과, 도 11 및 12에서 확인할 수 있듯이, 노화된 마우스에서 LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 대조군에 비하여 약 2.5배에 달하는 사이클린 D1 발현 증가를 나타내어 LPA 및 ACI가 효과적으로 줄기세포를 활성화시키는 것을 알 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figures 11 and 12, when treated with LPA and ACI at the same time in the aged mice, the expression of about 2.5-fold increase in cyclin D1 expression compared to the control group LPA and ACI effectively activate stem cells Could know.

실시예Example 11: c- 11: c- mycmyc 의 발현 수준 확인을 위한 To check the expression level of 면역형광검사Immunofluorescence

면역형광을 위한 항체로서, 일차 항-β-카테닌 및 로다민-콘쥬게이티드 항-β-카테닌 대신에, FITC-콘쥬게이티드 항-c-myc를 사용한 것을 제외하고 실시예 5의 방법과 동일하게 면역형광검사를 수행하였고, 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다.
As an antibody for immunofluorescence, the same method as in Example 5 except for using FITC-conjugated anti-c-myc instead of primary anti-β-catenin and rhodamine-conjugated anti-β-catenin Immunofluorescence was performed, and the results are shown in FIGS. 13 and 14.

그 결과, 도 13 및 14에서 나타나듯이, 젊은 마우스의 경우 LPA 또는 ACI 처리에 따른 표피 두께 증가의 차이가 미소하였으나, 노화된 마우스의 경우 LPA 또는 ACI 처리시 현저하게 표피 두께가 증가한 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Figures 13 and 14, the difference in epidermal thickness increase according to LPA or ACI treatment in young mice was small, it was confirmed that the epidermal thickness was significantly increased in LPA or ACI treatment in aged mice.

실시예Example 12: c- 12: c- mycmyc 의 발현 수준 측정을 위한 For measuring expression level of 웨스턴Weston 블롯팅Blotting

c-myc의 발현 수준을 측정하기 위해 조직을 실시예 6와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하였고, 이를 도 15에 나타내었고, c-myc의 상대적인 비율을 계산하여 도 16에 나타내었다.
Western blotting was performed in the same manner as in Example 6 to measure the expression level of c-myc, which is shown in FIG. 15, and the relative ratio of c-myc was calculated and shown in FIG. 16.

그 결과, 도 15 및 16에서 확인할 수 있듯이, 노화된 마우스에서 LPA와 ACI를 동시에 처리한 경우, 대조군에 비하여 약 3.2배에 달하는 c-myc 발현 증가를 나타내어 LPA 및 ACI가 효과적으로 줄기세포를 활성화시키는 것을 알 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figures 15 and 16, when treated with LPA and ACI at the same time in aged mice, the expression of c-myc expression of about 3.2-fold increase compared to the control group, LPA and ACI effectively activate stem cells I could see that.

실시예Example 13:  13: CD34CD34 의 발현 확인을 위한 To check the expression of 공초점Confocal 현미경 관찰 Microscopic observation

면역형광을 위한 항체로서, FITC-콘쥬게이티드 항 CD34 다클론 항체를 사용하고, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 것을 제외하고 실시예 5의 방법과 동일하게 면역형광검사를 수행하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
As an antibody for immunofluorescence, immunofluorescence was carried out in the same manner as in Example 5 except that the FITC-conjugated anti CD34 polyclonal antibody was used and observed using confocal microscopy. It is shown in FIG.

그 결과, 도 17에서 나타나듯이, 젊은 마우스와 노화된 마우스 모두 LPA와 ACI를 처리한 경우, 형광으로 표시된 부분, 즉 CD34의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 17, it was confirmed that when both young and aged mice were treated with LPA and ACI, expression of fluorescence, that is, expression of CD34 was increased.

실시예Example 14:  14: CD34CD34 의 발현 수준 측정을 위한 For measuring expression level of 웨스턴Weston 블롯팅Blotting

CD34의 발현수준을 측정하기 위해, 다클론 항-CD34 항체를 사용하여 실시예 6와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었고, CD34의 상대적인 비율을 계산하여 도 19에 나타내었다.
In order to measure the expression level of CD34, Western blotting was performed in the same manner as in Example 6 using polyclonal anti-CD34 antibody. The result is shown in FIG. 18, and the relative ratio of CD34 is calculated and shown in FIG. 19.

그 결과, 도 18 및 19에 나타나듯이, LPA를 처리한 경우, 젊은 마우스에서 대조군(β-actin)과 비교하여, CD34의 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 특히 노화된 마우스의 경우에는 LPA 뿐만 아니라 ACI를 처리한 경우에도 CD34의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Figure 18 and 19, when treated with LPA, it was confirmed that the expression level of CD34 increased in young mice compared to the control (β-actin). In addition, especially in aged mice, it was confirmed that the expression of CD34 was significantly increased when treated with ACI as well as LPA.

실시예Example 15: α6  15: α6 인테그린의Integrin 발현 확인을 위한  For confirming expression 공초점Confocal 현미경 관찰. Microscopic observation.

면역형광을 위한 항체로서, 로다민-콘쥬게이티드 α6 인테그린 항체를 사용하고, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 것을 제외하고 실시예 5의 방법과 동일하게 면역형광검사를 수행하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
As an antibody for immunofluorescence, immunofluorescence was performed in the same manner as in Example 5 except for using Rhodamine-conjugated α6 integrin antibody and observed using confocal microscopy. Shown in 20.

그 결과, 도 20에서 나타나듯이, 젊은 마우스와 노화된 마우스 모두 LPA와 ACI를 처리한 경우, 형광으로 표시된 부분, 즉 α6 인테그린의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 20, both young mice and aged mice, when treated with LPA and ACI, it was confirmed that the expression of fluorescence, that is, the expression of α6 integrin increased.

실시예Example 16: α6  16: α6 인테그린의Integrin 발현 수준 측정을 위한  For measuring expression levels RTRT -- PCRPCR

실시예 15에서 사용한 동일한 조직으로부터, 액체 질소-냉각 모타르 및 막자를 사용하여 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 균질화시키기 위해 트리아졸 제제를 가하였고, 유지 용적 12 ㎕으로 총 RNA 용적의 2 ㎍를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT 반응은 수퍼스크립트 Ⅱ 역전사효소를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 최종 용적 20 ㎕로 수행하였고, 4 ㎕의 최종 RT 수득 혼합물은 PCR로 증폭시켰다.
From the same tissue used in Example 15, RNA was extracted using liquid nitrogen-cooled mortar and pestle. Triazole preparation was added to homogenize the RNA and cDNA was synthesized using 2 μg of total RNA volume with 12 μl of maintenance volume. The RT reaction was carried out using a Superscript II reverse transcriptase in a final volume of 20 μl according to the manufacturer's protocol and 4 μl of the final RT obtained mixture was amplified by PCR.

α6 인테그린 발현 수준 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기와 같다. Primers used for the α6 integrin expression level analysis are as follows.

5'-GAGGAATATTCCAAACTGAACTAC-3' (서열번호 1)5'-GAGGAATATTCCAAACTGAACTAC-3 '(SEQ ID NO: 1)

5'-GGAATGCTGTCATCGTACCTAGAG-3' (서열번호 2)
5'-GGAATGCTGTCATCGTACCTAGAG-3 '(SEQ ID NO: 2)

또한, 대조군으로 사용한 GAPDH 프라이머는 하기와 같다. In addition, GAPDH primers used as a control is as follows.

5'-TGCGTGACATCAAAGAGAAG-3' (서열번호 3)5'-TGCGTGACATCAAAGAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 3)

5'-CGGATGTCAACGTCACACTT-3' (서열번호 4)
5'-CGGATGTCAACGTCACACTT-3 '(SEQ ID NO: 4)

실시예Example 17: α6  17: α6 인테그린의Integrin 발현 수준 측정을 위한 전기영동 Electrophoresis to Measure Expression Levels

상기 실시예 16의 증폭 산물을 아가로스 전기영동으로 분리하여 사진을 촬영하였다. 이를 도 21에 나타내었고, α6 인테그린 mRNA 발현량의 상대적인 비율을 계산하여 도 22에 나타내었다.
The amplification product of Example 16 was separated by agarose electrophoresis and photographed. This is illustrated in FIG. 21, and the relative ratio of α6 integrin mRNA expression was calculated and shown in FIG. 22.

그 결과, 도 21 및 22에 나타나듯이, 젊은 마우스와 노화된 마우스 모두에서 대조군(GAPDH)과 비교하여, α6 인테그린의 발현 수준이 약 2배 정도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이로서, 본 발명의 LPA 및 ACI가 세포의 성장 및 분화에 관련한 줄기세포 마커인 α6 인테그린을 효과적으로 활성화시키는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Figures 21 and 22, compared to the control group (GAPDH) in both young and aged mice, it was confirmed that the expression level of α6 integrin increased by about 2 times. As a result, it was confirmed that LPA and ACI of the present invention effectively activate α6 integrin, a stem cell marker related to cell growth and differentiation.

실시예Example 18:  18: LPALPA 및  And ACIACI 으로 유도한 혈관신생 및 Induced angiogenesis and 세포외기질의Extracellular matrix 리모델링 형광분자단층촬영 Remodeling Fluorescence Molecular Tomography

혈관신생의 분석을 위하여 실시예 3으로 준비한 마우스를 LPA 및/또는 ACI로 2 내지 4일간 처리하고, AngSense 720 프로브(2 nmol in 150 ㎕ of saline; 약 80 nmol/kg 체중)로 이미징 1시간 전에 정맥주사하였다. 또한, 세포외기질 리모델링분석을 위하여, MMP 활성을 MMPSense 680 프로브 모니터링을 통하여 평가하였고, 이는 이미징 8시간 전에 정맥주사하였다(2 nmol in 150 ㎕ saline). 그리고 나서 상기 마우스를 케타민과 자일라진의 용액으로 마취시킨 후 VisEn's FMT 시스템을 이용하여 분석하고 각각의 형광이미지를 얻었으며, 그 결과를 도 23 및 24에 나타내었다. 각 실험은 독립적으로 3번 실시하였고, 히스토그램은 평균 및 표준편차로 표시하였다.
Mice prepared in Example 3 for analysis of angiogenesis were treated with LPA and / or ACI for 2-4 days, and 1 hour prior to imaging with AngSense 720 probe (2 nmol in 150 μl of saline; about 80 nmol / kg body weight). Intravenously. In addition, for extracellular matrix remodeling analysis, MMP activity was evaluated via MMPSense 680 probe monitoring, which was injected intravenously 8 hours prior to imaging (2 nmol in 150 μl saline). The mice were then anesthetized with a solution of ketamine and xylazine and analyzed using VisEn's FMT system to obtain respective fluorescence images. The results are shown in FIGS. 23 and 24. Each experiment was performed three times independently and histograms were expressed as mean and standard deviation.

그 결과, 도 23에서 확인할 수 있듯이, 젊은 마우스와 노화된 마우스 모두에서 상처가 치유되고, 조직 및 모발이 재생한 것을 확인할 수 있었다. 특히, AngSense의 형광 강도는 미처리한 대조군(Control)과 비교하여 현저하게 높았다.As a result, as can be seen in Figure 23, the wound was healed in both young and aged mice, it was confirmed that the tissue and hair regeneration. In particular, the fluorescence intensity of AngSense was significantly higher compared to the untreated control (Control).

또한, 도 24에서 확인할 수 있듯이, 젊은 마우스와 노화된 마우스 모두에서 MMPSence 형광 강도가 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 이로서, LPA와 ACI가 젊은 마우스와 노화된 마우스에서 혈관신생과 세포외기질 리모델링을 촉진함을 알 수 있었다.
In addition, as can be seen in Figure 24, it was confirmed that MMPSence fluorescence intensity was significantly increased in both young and aged mice. As a result, it was found that LPA and ACI promote angiogenesis and extracellular matrix remodeling in young and aged mice.

실시예Example 19:  19: MCSMCS 줄기세포에서  In stem cells LPALPA 또는  or ACIACI 에 의한 β-Β- by 카테닌Catenin 신호전달 변화와 전사활성의 변화 Changes in signal transduction and transcriptional activity

10% FBS/DMEM 배지에서 Mesenchymal stem cell (MSC, p10)를 하루 동안 배양한 후 0.1% BSA/DMEM (SFM)에서 이틀 배양하여 quiescent 상태로 만들고, 여기에 SFM에 희석한 LPA (100μM) 및 ACI (100μM)를 시간별로 처리하였다. 그 후 total lysate를 준비하고 Western blotting으로 단백질 발현여부를 확인하였다(도 25의 A).Mesenchymal stem cells (MSC, p10) were incubated in 10% FBS / DMEM medium for one day, then incubated for two days in 0.1% BSA / DMEM (SFM), quiescent, and diluted with SFM in LPA (100 μM) and ACI. (100 μM) was processed hourly. Thereafter, total lysate was prepared and protein expression was confirmed by Western blotting (FIG. 25A).

또한, 10% FBS/DMEM 배지에서 Mesenchymal stem cell (MSC, p12)을 하루 동안 배양한 후 0.1% BSA/DMEM (SFM)에서 이틀 배양하여 quiescent 상태로 만들고, 여기에 SFM에 희석한 LPA (100μM) 및 ACI (100μM)을 시간별로 처리하였다. 그 후, 세포를 homogenizer로 분쇄한 후 nuclear fraction과 cytosol fraction 분리하여 Western blotting으로 단백질 발현여부를 확인하였다(도 25의 B).
In addition, Mesenchymal stem cells (MSC, p12) were cultured in 10% FBS / DMEM medium for one day, then incubated in 0.1% BSA / DMEM (SFM) for 2 days to make a quiescent state, and LPA (100 μM) diluted in SFM. And ACI (100 μM) were treated hourly. Thereafter, the cells were crushed with a homogenizer and separated from the nuclear fraction and the cytosol fraction to confirm protein expression by Western blotting (FIG. 25B).

그 결과, 도 25의 A에 나타나듯이 LPA와 ACI는 MSC 줄기세포에서 총 β-catenin의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 25의 B에 나타나듯이 LPA와 ACI는 MSC 줄기세포에서 β-catenin의 핵으로의 이동을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 25A LPA and ACI was found to increase the expression of total β-catenin in MSC stem cells. In addition, as shown in B of FIG. 25, LPA and ACI were confirmed to promote the migration of β-catenin to the nucleus in MSC stem cells.

<110> GACHON UNIVERSITY OF MEDICINE & SCIENCE INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Stem cell activating method comprising a step of treating lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor <130> PA121151KR <150> KR 10-2011-0130609 <151> 2011-12-07 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha 6 integrin forward primer <400> 1 gaggaatatt ccaaactgaa ctac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha 6 integrin reverse primer <400> 2 ggaatgctgt catcgtacct agag 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 3 tgcgtgacat caaagagaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 4 cggatgtcaa cgtcacactt 20 <110> GACHON UNIVERSITY OF MEDICINE & SCIENCE INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Stem cell activating method comprising a step of treating          lysophosphatidic acid and adenylyl cyclase inhibitor <130> PA121151KR <150> KR 10-2011-0130609 <151> 2011-12-07 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha 6 integrin forward primer <400> 1 gaggaatatt ccaaactgaa ctac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha 6 integrin reverse primer <400> 2 ggaatgctgt catcgtacct agag 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 3 tgcgtgacat caaagagaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 4 cggatgtcaa cgtcacactt 20

Claims (13)

인간을 제외한 대상체의 줄기세포의 활성화 방법으로서, i) 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA) 및 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor), 또는 ii) 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor)를 상기 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하고, 상기 아데닐일 사이클라아제 억제제는 2',5'-디데옥시아데노신, 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민, 및 9-(테트라하이드로-2'-푸릴)아데닌 중에서 선택되는 것인, 방법.
A method for activating stem cells of a subject other than human, comprising: i) lysophosphatidic acid (LPA) and adenylyl cyclase inhibitor, or ii) adenylyl cyclase inhibitor inhibitor) to the stem cells, wherein the adenylyl cyclase inhibitor is 2 ', 5'-dideoxyadenosine, cis-N- (2-phenylcyclopentyl) azacyclotridec-1- En-2-amine, and 9- (tetrahydro-2'-furyl) adenine.
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 피부 각질 줄기세포 또는 모낭 줄기세포인 것인, 방법.
The method of claim 1, wherein the stem cells are mesenchymal stem cells, skin keratin stem cells or hair follicle stem cells.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포 활성화는 줄기세포 마커의 발현 증가에 기인하는 것인, 방법.
The method of claim 1, wherein the stem cell activation is due to increased expression of stem cell markers.
제4항에 있어서, 상기 줄기세포 마커는 β-카테닌(β-catenin), TCF4(T-cell factor 4), 사이클린 D1, CD34, 또는 α6-인테그린(α6-integrin)인 것인, 방법.
The method of claim 4, wherein the stem cell marker is β-catenin, β-catenin, TCF4 (T-cell factor 4), cyclin D1, CD34, or α6-integrin.
체외(in vitro)에서 줄기세포를 활성화하는 방법으로서, i) 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA) 및 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor), 또는 ii) 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor)를 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하고, 상기 아데닐일 사이클라아제 억제제는 2',5'-디데옥시아데노신, 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민, 및 9-(테트라하이드로-2'-푸릴)아데닌 중에서 선택되는 것인, 방법.
A method for activating stem cells in vitro, comprising: i) lysophosphatidic acid (LPA) and adenylyl cyclase inhibitor, or ii) adenylyl cyclase inhibitor ( adenylyl cyclase inhibitor) to a stem cell, wherein the adenylyl cyclase inhibitor is 2 ', 5'-dideoxyadenosine, cis-N- (2-phenylcyclopentyl) azacyclotridec-1 -En-2-amine, and 9- (tetrahydro-2'-furyl) adenine.
삭제delete i) 라이소포스파티드산(lysophosphatidic acid, LPA) 및 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor), 또는 ii) 아데닐일 사이클라아제 억제제(adenylyl cyclase inhibitor)를 포함하고, 상기 아데닐일 사이클라아제 억제제는 2',5'-디데옥시아데노신, 시스-N-(2-페닐시클로펜틸)아자시클로트리덱-1-엔-2-아민, 및 9-(테트라하이드로-2'-푸릴)아데닌 중에서 선택되는 것인, 줄기세포 활성화 조성물.
i) lysophosphatidic acid (LPA) and adenylyl cyclase inhibitor, or ii) adenylyl cyclase inhibitor, wherein said adenylyl cyclase Inhibitors are selected from 2 ', 5'-dideoxyadenosine, cis-N- (2-phenylcyclopentyl) azacyclotridec-1-en-2-amine, and 9- (tetrahydro-2'-furyl) adenine Will be selected, stem cell activating composition.
삭제delete 제8항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 피부 각질 줄기세포 또는 모낭 줄기세포인 것인, 조성물.
The composition of claim 8, wherein the stem cells are mesenchymal stem cells, skin keratin stem cells, or hair follicle stem cells.
제8항에 있어서, 상기 줄기세포 활성화는 줄기세포 마커의 발현 증가에 기인하는 것인, 조성물.
The composition of claim 8, wherein the stem cell activation is due to increased expression of stem cell markers.
제11항에 있어서, 상기 줄기세포 마커는 β-카테닌(β-catenin), TCF4(T-cell factor 4), 사이클린 D1, CD34, 또는 α6-인테그린(α6-integrin)인 것인, 조성물.
The composition of claim 11, wherein the stem cell marker is β-catenin, β-catenin, TCF4 (T-cell factor 4), cyclin D1, CD34, or α6-integrin.
제8항에 있어서, 체외(in vitro)에서 활성화되는 것인, 조성물.






The composition of claim 8 which is activated in vitro.






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