KR102085554B1 - 사카로마이세스 세레비시애의 g-단백질 연결 수용체에 대한 알파 팩터의 친화도 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수용체에 대한 친화도가 높은 형광단 결합 탐지 펩티드를 이용하여 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 G-단백질 연결 수용체에 대한 알파 팩터의 친화도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 탐지 펩티드를 이용하면 기존 기술 대비 12,500배 향상된 민감도로 알파 팩터의 친화도를 확인할 수 있다.

Description

사카로마이세스 세레비시애의 G-단백질 연결 수용체에 대한 알파 팩터의 친화도 측정방법{Method for measuring of α-factor affinity for their G protein-coupled receptors in Saccharomyces cerevisiae}
본 발명은 수용체에 대한 친화도가 높은 펩티드를 이용하여 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 G-단백질 연결 수용체에 대한 알파 팩터의 친화도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
진핵 세포의 세포막을 통한 신호 전달은 매우 특이적이며 매우 정교하게 민감하다. 신호 특이성은 리간드 및 수용체 결합으로 일어나는 약한 힘에 의해 매개되는 신호 및 수용체 분자 사이의 정확한 분자적 상보성(complementarity)을 통하여 이루어진다. 리간드와 수용체 사이의 결합은 수용체의 구조 변화를 유도하여, 결과적으로 신호 전달을 일으킨다. 결합 반응은 일반적으로 리간드의 유리 상태 및 결합 상태 사이의 단순한 평형 상태를 포함할 것으로 추정된다. 또한, 세포막의 지질 이중층에 일부 리간드가 파티셔닝(partitioning) 하는 것이 리간드와 수용체의 결합을 촉진하는 것으로 추정된다. 실제로, 수용체가 리간드를 인식하는 것(특이적 결합)을 도와주는 리간드 파티셔닝(비특이적 결합)은 수용체 활성화를 촉진하며 수용체에 인식된 리간드의 형태를 안정화시킨다.
알파 팩터(α-factor) 페로몬 수용체인 Ste2p는 인간에서 미생물에 이르기까지 다양한 생명체에서 신호 전달에 관여하고 있는 G-단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)에 속하는 단백질이다. GPCR은 다양한 대사 조절에 관여하고 있으며, 통증 지각(pain perception), 성장, 혈압 조절, 및 바이러스 감염증 발생(viral pathogenesis)에 관여하는 과정들을 조절한다. 연구 중인 제약의 약 30% 정도가 GPCR을 표적으로 하고 있으며, 이는 GPCR의 강한 리간드 특이성에 기인한다.
본 발명자들은 GPCR에 대한 알파 팩터의 친화도를 측정할 수 있는 방법을 연구한 결과, 형광단이 부착된 알파 팩터 아날로그를 이용하면 기존의 흡광도를 이용한 측정 방법에 비하여 알파 팩터의 친화도를 현저히 우수한 민감도로 측정할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1762833호
본 발명의 일 목적은 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도를 측정할 수 있는 탐지 펩티드, 이를 포함하는 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정용 키트 및 친화도 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 G-단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor)에 대한 리간드의 친화도를 측정할 수 있는 하기 일반식 I로 표시되는 탐지 펩티드를 제공한다:
일반식 I
Trp-His-Trp-Leu-Xaa1-Xaa2-Lys-Pro-Xaa3-Gln-Pro-Met-Tyr
상기 일반식에서 Xaa1은 Orn, Glu, Asp 및 Arg로 이루어진 군에서 선택되고, Xaa2는 Orn(ornithine), Dap(diaminopimelic acid), Dab(2,4-diaminobutyric acid), Lys, Arg 및 Glu로 이루어진 군에서 선택되며, Xaa3은 Aib, D-Ala, D-Cys, D-Glu, D-Phe, D-Leu 및 D-Ser으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 명세서에 사용된 용어, "탐지 펩티드"는 G-단백질 연결 수용체에 결합하여 G-단백질 연결 수용체의 리간드와 결합 경쟁을 할 수 있는 펩티드를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 G-단백질 연결 수용체는 효모에 존재하는 것일 수 있으며, Ste2p 또는 Ste3p인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 탐지 펩티드는 C-말단에 형광 표지를 포함할 수 있으며, 형광 표지는 에단(EDAN, 5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 탐지 펩티드는 서열번호 2 내지 19로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 탐지 펩티드를 포함하는 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정용 키트는 본 발명의 탐지 펩티드를 하나 이상 포함할 수 있으며, 특정 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정용 키트는 탐지 펩티드의 형광 수준을 측정할 수 있는 제재, 또는 이외에 키트가 이용하는 형광 측정에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계로 이루어지는 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정 방법을 제공한다:
1) 본 발명의 탐지 펩티드의 형광계수를 측정하는 단계;
2) 상기 탐지 펩티드와 G-단백질 연결 수용체의 포화 결합을 유도하는 단계;
3) 리간드를 추가하여 경쟁 결합을 유도하는 단계; 및
4) 상기 리간드의 친화도를 결정하는 단계.
본 명세서에 사용된 용어, "포화 결합"은 수용체와 리간드의 결합 및 해리가 동일한 비율로 일어나서 수용체와 리간드 사이의 결합이 평형 상태에 이른 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 단계 1)의 형광계수는 탐지 펩티드에 결합된 형광단의 형광도를 형광광도계를 이용하여 측정하여 계산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 단계 2)의 G-단백질 연결 수용체는 Ste2p 또는 Ste3p인 것이 바람직하며, 포화 결합 여부는 형광 측정을 통하여 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 단계 3)의 리간드는 알파 팩터인 것이 바람직하며, 특정 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형광단 결합 탐지 펩티드를 이용하면, 효모의 G-단백질 연결 수용체에 대한 알파 팩터의 친화도를 현저히 민감한 수준으로 확인할 수 있다.
도 1은 Ste2p 단백질 발현에 이용한 pESC-LEU 플라스미드의 개략적인 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 pESC-LEU-STE2 플라스미드를 BamH1 및 HindⅢ 효소로 절단한 후 전기영동한 결과를 보여준다.
도 3은 pESC-LEU-STE2 플라스미드를 효모에 형질전환시킨 후 Ste2p 단백질의 발현 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 효모 Y7925 및 LM102 균주에서 [Orn6]α-factor-[Cys]3와 Ste2p 수용체의 포화 결합 실험을 수행한 결과를 보여준다: 도 4에서 [RL]은 수용체와 결합한 펩티드(bound detector)를 나타내고, [Lf]는 결합하지 않은 펩티드(unbound free detector)를 나타내며, 삽도(inset)는 스캐차드 분석(scatchard analysis) 결과를 보여준다. 또한,
Figure 112018018446073-pat00001
는 Y7925,
Figure 112018018446073-pat00002
는 Y7925 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide),
Figure 112018018446073-pat00003
는 LM102 및
Figure 112018018446073-pat00004
는 LM102 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide)를 의미한다.
도 5는 효모 Y7925 및 LM102 균주에서 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan과 Ste2p 수용체의 포화 결합 실험을 수행한 결과를 보여준다: 도 5에서 [RL]은 수용체와 결합한 펩티드(bound detector)를 나타내고, [Lf]는 결합하지 않은 펩티드(unbound free detector)를 나타내며, 삽도(inset)는 스캐차드 분석(scatchard analysis) 결과를 보여준다. 또한,
Figure 112018018446073-pat00005
는 Y7925,
Figure 112018018446073-pat00006
는 Y7925 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide),
Figure 112018018446073-pat00007
는 LM102 및
Figure 112018018446073-pat00008
는 LM102 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide)를 의미한다.
도 6은 서로 다른 세포 농도에서 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 팩터 아날로그인 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan과 Ste2p 수용체의 포화 결합 실험을 수행한 결과를 보여준다.
도 7은 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan의 농도에 따른 형광 표준 곡선을 보여준다.
도 8은 FDG(Fluorescein-containing β-D-Galactopyranoside) 용액의 농도에 따른 형광 표준 곡선을 보여준다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 팩터 아날로그 1 내지 19에 의한 FUS1 유전자의 발현 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 팩터 아날로그 1 내지 19의 효모 생장 저해 활성을 확인한 결과를 보여준다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 알파 팩터 아날로그 합성
모든 알파 팩터 아날로그(α-factor analogs)는 당업계에 알려진 고체상(solid-phase) 방법(KR 10-1690891)으로 합성하였다. 합성한 알파 팩터 아날로그는 분석용 Vydac Everest C18 역상 폴리머 컬럼(250 ㎜ x 22 ㎜)을 장착한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC; Shimadzu Prominence HPLC, 교토, 일본)로 220 ㎚에서 분석하였다. 분석 결과, 97% 이상의 동질성(homogeneity)을 보이는 분획들을 모아서 동결건조(lyophilization)하고, 최종 펩티드의 분자량은 LC/MS(Agilent HP1100 series, Santa Clara, 미국)로 분석하였다. 합성한 알파 팩터 아날로그의 서열을 하기 표 1에 기재하였다. 하기 서열에서 Orn은 오르니틴(ornithine), Aib는 2-aminoisobutyric acid, Dap(또는 Dpm)는 diaminopimelic acid를 의미한다. 또한, Dab(또는 Dbu)는 2,4-diaminobutyric acid를 의미하고, Homo-Arg는 homoarginine을 나타내며, Lys*은 메틸화(methylation)된 라이신을 의미한다.
서열번호 표시 펩티드 서열
1 Native a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr
2 [Orn6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
3 [Orn6,Aib9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-Aib-Gln-Pro-Met-Tyr
4 [Orn6,D-Cys9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Cys-Gln-Pro-Met-Tyr
5 [Orn6,D-Glu9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Glu-Gln-Pro-Met-Tyr
6 [Orn6,D-Phe9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Phe-Gln-Pro-Met-Tyr
7 [Orn6,D-Leu9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Leu-Gln-Pro-Met-Tyr
8 [Orn6,D-Ser9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Orn-Lys-Pro-D-Ser-Gln-Pro-Met-Tyr
9 [Dap6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Dap-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
10 [Dab6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Dab-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
11 [Lys6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Lys-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
12 [Lys*6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Lys-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
13 [Arg6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Arg-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
14 [Homo-Arg6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Homo-Arg-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
15 [Glu6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Gln-Glu-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
16 [Orn5,Arg6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Orn-Arg-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
17 [Glu5,Arg6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Glu-Arg-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
18 [Glu5,Orn6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Glu-Orn-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
19 [Asp5,Orn6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Asp-Orn-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
20 [Arg5,6,D-Ala9]a-factor Trp-His-Trp-Leu-Arg-Arg-Lys-Pro-D-Ala-Gln-Pro-Met-Tyr
실시예 2. pESC -LEU- STE2 플라스미드 제작 및 형질전환
2-1. 미생물 배양
사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae, 이하 S. cerevisiae로 표기함) Y7925 [MATa his3-532 trp1 gal2] 균주와 E. coli DH5α [fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80 ' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi -1 hsdR17] 균주는 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 구입하였다. S. cerevisiae LM102 [MATa , bar1 , leu2 , ura3 , FUS1 - lacZ:URA3 , ste2-dl] 균주는 테네시대학교(The University of Tennessee)의 J. M. Becker 교수로부터 제공받았다. 상기 S. cerevisiae Y7925 및 LM102 균주는 YEPD 배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로오스 2%)를 이용하여 30℃에서 배양하였다.
2-2. pESC -LEU- STE2 플라스미드 제작 및 증폭
야생형 GPCR인 Ste2p 유전자의 cDNA를 seq-F 프라이머 (CTTTCAACATTTTCGGTTTG; 서열번호 21) 및 seq-R 프라이머 (CGTCTGTACAGAAAAAAAAG; 서열번호 22)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 이때, Ste2p의 C-말단에 HHHHHH(His6 tag) 서열을 추가하였다. PCR은 Teq DNA polymerase(Invitrogen Life Tech.) 1.25 U, 2x PCR x enhancer solution, dNTPs 0.3 mmol/L, MgSO4 1 mmol/L 및 각 프라이머 0.3 ㎛ol/L를 이용하였다. 또한, PCR은 94℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 68℃에서 2.5분을 30 사이클 반복하고, 68℃에서 5분 동안 반응시켜 수행하였다. 증폭 산물은 PCR purificationkit(Qiagen SA, Couraboeuf, France)로 분리하여 BamH1 및 HindⅢ 효소로 절단하고, pESC-LEU 플라스미드에 클로닝하여 pESC-LEU-STE2 플라스미드를 제작하였다.
도 1에 pESC-LEU 플라스미드의 개략적인 구조, 제한효소 인식 서열을 도시하였다.
Escherichia coli(이하, E. coli로 기재함) DH5α 컴피턴트 셀(competent cell)과 pESC-LEU-STE2 플라스미드를 혼합한 후 42℃ 열충격(head-shock)을 가하고, 암피실린을 포함하는 LB 액체배지에서 배양하였다. 배양된 세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하고, 세포 펠렛에 SP2 용액(0.2 N NaOH, 1% SDS)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 증폭된 pESC-LEU-STE2 플라스미드는 스핀 컬럼(spin column)으로 분리하였다. 분리한 pESC-LEU-STE2 플라스미드에 제한효소 BamH1 및 HindⅢ를 처리하여 전기영동한 후, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
확인 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 1.6 kb 크기의 DNA 단편을 확인하여 pESC-LEU 플라스미드에 STE2 유전자가 제대로 삽입된 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 효모에서 재조합 Ste2p 수용체의 발현 여부 확인
효모 LM102 세포에 변성된 연어 정자 운반 DNA(denatured salmon sperm carrier DNA) 및 pESC-LEU-STE2 플라스미드를 첨가하고, 42℃ 열충격을 가하였다. 효모 세포 현탁액을 Synthetic Defined Dropout Media (KOMABIOTECH, 대한민국) 플레이트에 도말한 후 30℃에서 배양하였다.
형질전환된 상기 LM102 세포를 2% 갈락토스(galactose)를 포함하는 배지에서 배양한 후 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하였다. 세포 펠렛을 차가운 증류수로 세척하고, 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail; Sigma-Aldrich, USA)을 포함하는 글래스 비드(glass bead)로 세포를 용해시켰다. Ni-NTA 친화도 컬럼(HisTrap excel, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 세포 용해물로부터 단백질을 분리하고, 8% SDS-폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동한 후 PVDF 막(Polyvinylidene fluoride membrane; Millipore, Billerica, MA, USA)으로 단백질을 이동시켰다. PVDF 막을 3% BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 TBS(Tris-buffered saline)-Tween 20으로 1시간 동안 블록킹 (blocking)하고, 6-His 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)와 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PVDF 막을 세척하고, HRP-결합 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PVDF 막을 pierceTM ECC western blotting substrate(ThermoFisher Scientific Life Sciences, Waltham, MA, USA)로 발색시킨 후, 단백질 밴드를 확인하였다.
확인 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 47.5 kDa 크기의 단백질 밴드를 확인하여 Ste2p 유전자가 LM102 세포에서 발현되는 것을 알 수 있었다. 도 3에서 A는 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 쿠마시(coomassie)로 염색한 결과를 보여주며, 레인 1은 단백질 마커, 레인 2는 pESC-LEU-STE2 플라스미드로 형질전환된 LM102의 세포 용해물, 레인 3은 pESC-LEU 플라스미드(empty vector)로 형질전환된 LM102의 세포 용해물 및 레인 4는 Ni-NTA 친화도 컬럼으로 분리한 Ste2p 수용체 단백질이다. 도 3의 B는 Ni-NTA 친화도 컬럼으로 분리한 Ste2p 수용체 단백질을 6-His 항체로 확인한 결과이다.
실시예 3. 알파 팩터 아날로그를 이용한 정상 상태 포화결합(steady-state saturation binding) 확인
3-1. 흡광도 기반(absorption-based) 포화 결합 실험
형질전환된 효모세포에서 Ste2p 수용체의 발현 여부를 확인하기 위하여 [Orn6]α-factor-[Cys]3 펩티드를 이용하여 포화결합 실험을 수행하였다.
먼저 효모세포에 대사 저해제를 전처리하여, 결합 반응 동안의 하향 조절(down regulation)에 의하여 Ste2p 수용체 변이가 일어나는 것을 방지하였다. 구체적으로, 세포 현탁액(2.5x1011 세포/㎖) 1 ㎖, 10 mM 아지드화나트륨(NaN3) 100 ㎕ 및 10 mM 플루오린화 칼륨(KF) 100 ㎕를 함께 섞어 테스트 튜브에 담고, 식염수를 넣어 최종 부피를 2 ㎖로 맞추었다. 그 후, 계속적으로 볼텍싱(2,000 rpm)하면서 22℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리(9,000 rpm, 15분)하여 상층액은 버리고, 펩티드 가수분해효소 저해제 100 ㎕, p-토실-아르기닌 메틸 에스터(p-tosyl-arginine methyl ester, TAME) 10 mM을 테스트 튜브에 첨가하였다.
5 ㎖ 테스트 튜브에 효모세포 현탁액(2.5x1011 세포/㎖) 1 ㎖을 분주하고, 4.69x10-3 M 농도의 [Orn6]α-factor-[Cys]3를 1 내지 15 ㎕씩 첨가하였다. 최종 부피 2 ㎖이 되도록 각 테스트 튜브에 식염수를 첨가하고, 파인믹서 엠엑스 2(Finemixer Mx 2, Finepcr, 경기도, 대한민국)에서 계속 볼텍싱(vortexing, 2,000 rpm)하면서 결합 반응(22℃, 30분)을 수행하였다. 35분 후에 원심분리(9,000 rpm 및 15분)하고, 상층액(약 1.25 ㎖)만 취하여 0.2 ㎛ 아크로디스크 LC 주사기 필터(Sigma Aldrich Korea, 서울, 대한민국)로 걸러냈다. 여과액 중 950 ㎕를 50 ㎕ 엘만 용액(10 mM)이 들어 있는 1 ㎝ 큐벳에 분주하여 412 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
하기 표 2에 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 실험 결과를 기재하였다. 표 2에서 Bcell은 세포당 결합 부위(수용체)의 수(binding sites per cell)를 의미하고, b IC 50은 50% 포화결합할 수 있는 펩티드의 농도를 의미한다.
α-cell Bcell IC50 KD a Concentration Relative
binding site
Y7925 28600b 7.20x10-6 1.73x10-7 7.44x10-5 100
27742c 7.17x10-6 1.68x10-7 7.44x10-5 97
LM102 20020b 7.41x10-6 2.47x10-7 7.44x10-5 70
17446c 1.02x10-5 2.85x10-7 7.44x10-5 60
aKD as determined from Scatchard analysis of the [Om6]α-factor-[Cys]3 binding isotherm. KD=calculated according to Linden.
bThese values were determined without NaN3, KF, TAME and cycloheximide.
cThese values were determined with NaN3, KF, TAME and cycloheximide.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 농도가 증가할수록 Ste2p 수용체와의 결합이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4에서 [RL]은 수용체와 결합한 펩티드(bound detector)를 나타내고, [Lf]는 결합하지 않은 펩티드(unbound free detector)를 나타내며, 삽도(inset)는 스캐차드 분석(scatchard analysis) 결과를 보여준다. 또한, 도 4에서
Figure 112018018446073-pat00009
는 Y7925,
Figure 112018018446073-pat00010
는 Y7925(+NaN3, KR, TAME, cycloheximide),
Figure 112018018446073-pat00011
는 LM102 및
Figure 112018018446073-pat00012
는 LM102 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide)를 의미한다.
3-2. 형광 기반(fluorescent-based) 포화결합 실험
1.5 ㎖ 테스트 튜브에 S. cerevisiae Y7925 및 LM102의 세포 현탁액 1 ㎖(2.5x1011 세포/㎖)을 각각 분주하고, 상기 8-1에서 처리한 대사 저해제와 10 mM 시클로헥사미드(cycloheximide;) 50 ㎕를 각각 첨가하여 30분 동안 방치하였다. 이후 원심분리(8,000 rpm 및 10분)하여 튜브를 세척하고, 다양한 농도의 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan을 테스트 튜브에 첨가하고, 식염수(saline water)를 첨가하여 최종 부피를 1 ㎖로 맞추었다: [0.1 ㎕(4.32x10- 10 mol, 4.32x10-7 M), 0.3 ㎕(1.30x10-9 mol, 1.30x10-6 M), 0.5 ㎕(2.16x10- 9 mol, 2.16x10-6 M), 0.7 ㎕(3.03x10-9 mol, 3.03x10-6 M), 1 ㎕(4.32x10- 9 mol, 4.32x10-6 M), 1.3 ㎕(5.62x10-9 mol, 5.62x10-6 M), 및 1.5 ㎕(6.48x10- 9 mol, 6.48x10-6 M).
결합 반응은 파인믹서 엠엑스 2로 튜브를 계속 볼텍싱(vortexing, 2,000 rpm)하면서 4℃에서 수행하였다. 30분 후, 모든 테스트 튜브를 원심분리(8,000 rpm 및 10분)하고, 상층액(약 1 ㎖)만 취하여 0.2 ㎛ Acrodisc LC syringe filters(Sigma Aldrich Korea, 서울, 대한민국)로 여과하였다. 여과액 중 1 ㎖를 1 ㎝ 큐벳에 분주하여 형광 광도계(fluorophotometer)로 430 ㎚에서 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. Ste2p 수용체와 결합한 알파 팩터 아날로그의 총 농도는 결합 반응 30분 후에 형광 강도의 감소 정도에 기반하여 계산하였다.
확인 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan의 농도가 증가할수록 Ste2p 수용체와의 결합이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 형질전환된 LM102에서 세포당 Ste2p 수용체의 수(=결합 부위의 수)를 확인한 결과 형질전환된 Y7925에서의 Ste2p 수용체의 수보다 약 30% 적은 것을 알 수 있었다.
도 5에서 [RL]은 수용체와 결합한 펩티드(bound detector)를 나타내고, [Lf]는 결합하지 않은 펩티드(unbound free detector)를 나타낸다. 또한,
Figure 112018018446073-pat00013
는 Y7925,
Figure 112018018446073-pat00014
는 Y7925(+NaN3, KR, TAME, cycloheximide),
Figure 112018018446073-pat00015
는 LM102 및
Figure 112018018446073-pat00016
는 LM102 (+NaN3, KR, TAME, cycloheximide)를 의미한다.
상기와 동일한 방법으로 세포 농도에 따른 포화 결합 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 Y7925 및 LM102의 세포 농도가 증가할수록 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan과 Ste2p 수용체의 결합 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 비발색 경쟁자( nonchromogenic competitors)와 알파 팩터 아날로그의 결합 경쟁 확인
4-1. 흡광도 측정 기반 결합 경쟁 실험
당업계에 알려진 방법(Bull.Korean Chem. Soc. 2015, Vol. 36, 1885-1896; KR 10-1690891) 및 상기 실시예 3-1에 기재된 방법을 이용하여 비발색성 경쟁자 펩티드와 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 결합 경쟁 실험을 수행하였다. 비발색성 경쟁자 펩티드로는 상기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 20의 펩티드를 이용하고, 효모세포 현탁액은 2.5x1011 세포/㎖ 농도를 사용하였다. KD(해리 상수, dissociation rate)는 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 결합을 50% 치환할 수 있는 경쟁자의 농도를 [1+ HT/KD] 값으로 나누어 계산할 수 있으며, HT는 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 농도, KD는 [Orn6]α-factor-[Cys]3의 해리 상수를 의미한다.
하기 표 3에 실험 결과를 기재하였다.
서열
번호		 펩티드 Y7925 LM102
IC50 a R.A IC50 a R.A
1 Native a-factor 6.47x10-6 100 7.05x10-6 100
2 [Orn6,D-Ala9]a-factor 1.98x10-6 327 2.36x10-6 298
3 [Orn6,Aib9]a-factor 6.67x10-6 97 7.08x10-6 100
4 [Orn6,D-Cys9]a-factor 7.19x10-5 9.0 6.40x10-5 11
5 [Orn6,D-Glu9]a-factor 1.29x10-5 50 1.26x10-5 56
6 [Orn6,D-Phe9]a-factor 2.02x10-5 32 1.91x10-5 37
7 [Orn6,D-Leu9]a-factor 1.75x10-5 37 2.35x10-6 30
8 [Orn6,D-Ser9]a-factor 7.80x10-6 83 7.75x10-6 91
9 [Dap6,D-Ala9]a-factor 2.51x10-6 258 3.05x10-6 231
10 [Dab6,D-Ala9]a-factor 6.22x10-6 104 6.35x10-6 111
11 [Lys6,D-Ala9]a-factor 6.10x10-6 106 6.98x10-6 101
12 [Lys*6,D-Ala9]a-factor 9.11x10-6 71 7.42x10-6 95
13 [Arg6,D-Ala9]a-factor 5.35x10-6 121 6.46x10-6 109
14 [Homo-Arg6,D-Ala9]a-factor 6.81x10-6 95 7.44x10-6 105
15 [Glu6,D-102Ala9]a-factor 2.63x10-6 246 3.43x10-6 205
16 [Orn5,Arg6,D-Ala9]a-factor 1.03x10-5 63 9.40x10-6 75
17 [Glu5,Arg6,D-Ala9]a-factor 4.14x10-6 156 4.76x10-6 148
18 [Glu5,Orn6,D-Ala9]a-factor 6.83x10-6 95 7.50x10-6 94
19 [Asp5,Orn6,D-Ala9]a-factor 7.80x10-6 83 8.49x10-6 83
20 [Arg5,6,D-Ala9]a-factor 1.75x10-5 37 2.35x10-5 30
a IC 50=the concentration of detector for 50% of the specific binding.
bR.A=Relative Affinity
4-2. 형광 측정 기반 결합 경쟁 실험
1.5 ㎖ 테스트 튜브에 S. cerevisiae Y7925 및 LM102의 세포 현탁액 1 ㎖(1x108 세포/㎖)을 각각 분주하고, 10 mM의 시클로헥사미드(cycloheximide;) 50 ㎕를 각각 첨가하여 30분 동안 방치하였다. 이후, 원심분리(8,000 rpm 및 10분)하여 튜브를 세척하고, 식염수 110 ㎕를 첨가하였다. 여기에 3.75x10-3 M 농도의 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan 1 ㎎을 테스트 튜브에 첨가하고, 3.96x10-3 M 농도의 경쟁자 펩티드를 각각 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 및 15 ㎕씩 추가하였다. 식염수를 첨가하여 최종 부피를 1 ㎖로 맞추고, 파인믹서 엠엑스 2로 튜브를 계속 볼텍싱(vortexing, 2,000 rpm)하면서 4℃에서 결합 반응을 수행하였다. 30분 후, 모든 테스트 튜브를 원심분리(8,000 rpm 및 10분)하고, 상층액(약 1 ㎖)만 취하여 0.2 ㎛ Acrodisc LC syringe filters로 여과하였다. 여과액 중 1 ㎖를 1 ㎝ 큐벳에 분주하여 형광 광도계로 430 ㎚에서 형광 강도를 측정하고, 수용체에 결합된 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan의 농도를 계산하였다. 수용체에 결합한 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan의 총 농도는 결합 반응 30분 후에 형광 강도의 감소 정도에 기반하여 계산하였다. 하기 표 4에 실험 결과를 기재하였다.
실험 결과, 형광을 이용한 결합 경쟁 실험이 흡광도를 이용한 결합 경쟁 실험보다 민감도가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 흡광도를 이용한 결합 경쟁 실험은 1x108 세포/㎖ 농도의 세포 및 3.75x10-3 M (2.5 ㎕)의 알파 팩터 펩티드를 이용하는 반면, 형광을 이용한 실험은 1x108 세포/㎖ 농도의 세포 및 3.75x10-3 M (0.5 ㎕)의 알파 팩터 펩티드를 이용하므로 형광을 이용한 알파 팩터 아날로그의 민감도가 약 12,500배 우수하다.
서열
번호		 펩티드 Y7925 LM102
IC50 R.A IC50 R.A
1 Native a-factor 1.20x10-6 100 7.41x10-6 100
2 [Orn6,D-Ala9]a-factor 3.0lx10-6 238 3.53x10-6 210
3 [Orn6,Aib9]a-factor 9.67x10-6 73 1.13x10-5 65
4 [Orn6,D-Cys9]a-factor 2.16x10-4 3.0 2.54x10-4 1.0
5 [Orn6,D-Glu9]a-factor 9.93x10-6 70 1.11x10-6 60
6 [Orn6,D-Phe9]a-factor 1.43x10-5 50 1.38x10-5 35
7 [Orn6,D-Leu9]a-factor 6.93x10-5 14 6.91x10-5 15
8 [Orn6,D-Ser9]a-factor 7.41x10-6 98 8.75x10-6 80
9 [Dap6,D-Ala9]a-factor 3.00x10-6 240 3.30x10-6 220
10 [Dab6,D-Ala9]a-factor 7.18x10-6 101 8.09x10-6 87
11 [Lys6,D-Ala9]a-factor 1.41xl0-5 51 1.44x10-5 48
12 [Lys*6,D-Ala9]a-factor 1.74x10-5 41 1.74x10-5 41
13 [Arg6,D-Ala9]a-factor 6.60x10-6 109 6.67x10-6 101
14 [Homo-Arg6,D-Ala9]a-factor 4.50x10-6 160 4.57x10-6 158
15 [Glu6,D-102Ala9]a-factor 6.00x10-6 120 6.53x10-6 103
16 [Orn5,Arg6,D-Ala9]a-factor 9.63x10-6 75 1.11x10-5 60
17 [Glu5,Arg6,D-Ala9]a-factor 6.64x10-6 102 7.53x10-6 103
18 [Glu5,Orn6,D-Ala9]a-factor 7.45x10-6 97 6.75x10-6 95
19 [Asp5,Orn6,D-Ala9]a-factor 9.93x10-6 70 9.93x10-6 70
20 [Arg5,6,D-Ala9]a-factor 1.94x10-5 30 1.94x10-5 30
실시예 5. 알파 팩터 아날로그를 이용한 FUS1 - lacZ 유전자 발현 유도
LM102 균주는 FUS1 유전자를 갖고 있으며, 알파 팩터에 의해 발현이 유도되어 리포터 유전자인 베타-갈락토시다제(β-Galactosidase, lacZ)와 결합한다.
먼저, 당업계에 알려진 방법(A. Plovins, Appl. Envir. Micro. 1994, 60, 4638)으로 FDG(Fluorescein-containing β-D-Galactopyranoside) 및 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan(3.75x10-3 M)에 대한 표준 곡선을 작성하였다. 각각의 FDG 용액에 대한 플로오레세인의 형광은 여기 파장 489 ㎚(Edan에 대해서는 430 ㎚) 및 방출 파장 520 ㎚(Edan에 대해서는 510 ㎚)에서 측정하였다.
도 7은 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan에 대한 표준 곡선이고, 도 8은 FDG 용액에 대한 형광 표준 곡선이며, 도 8에서 [Arg6, D-Ala9]α-factor-Edan은 1 mM 농도를 사용하였다.
세포막의 투과성을 높이기 위하여 LM102에 SDS, 클로로포름 및 디기토닌(digitonin)을 각각 처리하고, 세포막의 투과성을 확인한 결과 디기토닌의 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이후 실험은 LM102에 디기토닌을 처리하여수행하였다.
디기토닌을 처리한 LM102 세포 현탁액 950 ㎕와 알파 팩터 또는 알파 팩터 아날로그 1 ㎕를 혼합하고, 증류수로 최종 부피를 1 ㎖로 맞춘 후 30분 동안 반응시켰다. 플로오레세인은 cuvettecell reader (Fluorophotometer LS55, PerkinElmer, Boston, USA)로 여기 파장(excitation wavelength) 460 ㎚ 및 방출 파장(emission wavelength) 520 ㎚에서 측정하였다. 측정 결과는 알파 팩터 아날로그의 농도에 따라 형광 세기를 플롯팅한 후 분석하였다.
실험 결과, 도 9 및 표 5에 나타난 바와 같이 알파 팩터 아날로그에 의하여 FUS1 유전자의 발현이 유도되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 알파 팩터 아날로그가 야생형 알파 팩터와 유사한 생체 활성을 가짐을 의미한다.
서열번호 펩티드 Gene induction assay
EC50 상대적 활성
1 Native a-factor 6.25x10-6 100
2 [Orn6,D-Ala9]a-factor 4.37x10-6 143
3 [Orn6,Aib9]a-factor 8.57x10-6 60
4 [Orn6 ,D-Cys9]a-factor 2.16x10-6 31
5 [Orn6,D-Glu9]a-factor 8.65x10-6 58
6 [Orn6,D-Phe9]a-factor 6.71x10-6 51
7 [Orn6,D-Leu9]a-factor 9.21x10-6 45
8 [Orn6,D-Ser9]a-factor 7.85x10-6 70
9 [Dap6,D-Ala9]a-factor 3.74x10-6 167
10 [Dab6,D-Ala9]a-factor 7.05x10-6 88
11 [Lys6,D-Ala9]a-factor 8.44 x10-6 62
12 [Lys*6,D-Ala9]a-factor 9.50x10-6 50
13 [Arg6,D-Ala9]a-factor 6.42x10-6 94
14 [Homo-Arg6,D-Ala9]a-factor 5.16x10-6 121
15 [Glu6,D-Ala9]a-factor 6.01x10-6 107
16 [Orn5,Arg6,D-Ala9]a-factor 8.49x10-6 62
17 [Glu5,Arg6,D-Ala9]a-factor 6.71x10-6 92
18 [Glu5,Orn6,D-Ala9]a-factor 7.24x10-6 82
19 [Asp5,Orn6,D-Ala9]a-factor 7.82x10-6 70
20 [Arg5,6,D-Ala9]a-factor 1.12x10-6 41
실시예 6. 알파 팩터 아날로그의 효모 생장 저해 활성 확인(halo assay)
Y7925 또는 LM102의 세포 현탁액(1.2x106 세포/㎖) 2 ㎕를 2% 한천을 함유한 6 ㎖ YEPD[효모 추출물 1%(w/v), 펩톤 2%, (w/v) 및 덱스트로오스 2%(w/v)] 배지에 희석하여 플레이팅하였다. 알파 팩터 및 각각의 알파 팩터 아날로그 용액 10 ㎕(100 ㎍/디스크)를 8 ㎜ 지름의 필터 디스크(Advantech, 타이페이, 대만)에 각각 파이펫팅하고, 30℃에서 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후, 디스크 주위의 생육저지환(clear zones, halos)을 관찰하였다. 실험 결과는 디스크의 직경을 포함한 각 생육저지환의 직경으로 나타내었으며, 필터 디스크의 지름이 8 ㎜이기 때문에 생장 저해의 최소 수치는 9 ㎜이다. 개별 탐지 펩티드의 활성은 30 ㎜ 크기의 생육저지환을 형성하는 펩티드 농도로 비교하였다.
확인 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 알파 팩터 및 탐지 펩티드가 디스크 주위에 생육저지환(clear zone)을 형성하는 것을 확인하여 Y7925(MATa) 및 LM102(MATa)에서 알파 팩터 아날로그가 농도 의존적으로 알파 팩터 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 도 8에서 숫자 1 내지 20은 알파 팩터와 알파 팩터 아날로그 1 내지 19를 의미한다.
또한, 탐지 펩티드의 상대적인 활성을 비교하기 위하여 30 ㎜ 크기의 생육저지환을 형성하는 탐지 펩티드 농도를 계산하고, 그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.
서열
번호		 펩티드 Y7925 LMI02
생육저지환
(㎕/30 ㎜)		 상대적
활성		 생육저지환
(㎕/30 ㎜)		 상대적
활성
1 Native a-factor 10 100 5.0 100
2 [Orn6,D-Ala9]a-factor 0.66 1500 0.33 1500
3 [Orn6,Aib9]a-factor 16.6 60 8.33 60
4 [Orn6 ,D-Cys9]a-factor 20.0 50 25.0 20
5 [Orn6,D-Glu9]a-factor 10. 100 4.16 120
6 [Orn6,D-Phe9]a-factor 20.0 50 10.0 50
7 [Orn6,D-Leu9]a-factor 2.0 500 1.02 500
8 [Orn6,D-Ser9]a-factor 1.66 600 0.77 650
9 [Dap6,D-Ala9]a-factor 100 10 25.0 20
10 [Dab6,D-Ala9]a-factor 0.71 1400 0.35 1400
11 [Lys6,D-Ala9]a-factor 0.55 1800 0.27 1850
12 [Lys*6,D-Ala9]a-factor 0.62 1600 0.31 1600
13 [Arg6,D-Ala9]a-factor 0.51 1950 0.25 2000
14 [Homo-Arg6,D-Ala9]a-factor 100 10 50.0 10
15 [Glu6,D-Ala9]a-factor 1.43 700 0.30 1500
16 [Orn5,Arg6,D-Ala9]a-factor 1.11 900 0.41 1250
17 [Glu5,Arg6,D-Ala9]a-factor 0.71 1400 0.32 1550
18 [Glu5,Orn6,D-Ala9]a-factor 0.83 1200 0.41 1200
19 [Asp5,Orn6,D-Ala9]a-factor 1.33 750 0.55 90
20 [Arg5,6,D-Ala9]a-factor 1.25 800 0.35 1300
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Yeungnam University Technology Licensing&Commercialization Office <120> Method for measuring of a factor affinity for their G protein coupled receptors in Saccharomyces cerevisiae <130> PN180014 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Trp His Trp Leu Gln Leu Lys Pro Gly Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 2 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> Aib(2-Aminoisobutyric acid) <400> 3 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Cys <400> 4 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Glu <400> 5 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Phe <400> 6 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Leu <400> 7 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ser <400> 8 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Dpm(diaminopimelic acid) <400> 9 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Dbu(2,4-Diaminobutyric acid) <400> 10 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Lys <400> 11 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> methylated lysine <400> 12 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Arg <400> 13 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> homoarginine <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 14 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Glu <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 15 Trp His Trp Leu Gln Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (5) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 16 Trp His Trp Leu Xaa Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (5) <223> Glu <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 17 Trp His Trp Leu Xaa Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (5) <223> Glu <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 18 Trp His Trp Leu Xaa Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (5) <223> Asp <220> <221> MUTAGEN <222> (6) <223> Orn <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 19 Trp His Trp Leu Xaa Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptides <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(6) <223> Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (9) <223> D-Ala <400> 20 Trp His Trp Leu Xaa Xaa Lys Pro Xaa Gln Pro Met Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 21 ctttcaacat tttcggtttg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 22 cgtctgtaca gaaaaaaaag 20

Claims (10)

  1. 서열번호 9, 10, 14, 17 및 18로 이루어진 군에서 선택되고, C-말단에는 형광 표지로 에단(EDAN, 5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid)을 포함하는 효모의 G-단백질 연결 수용체(G-protein coupled receptor)에 대한 리간드의 친화도를 측정할 수 있는 탐지 펩티드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 G-단백질 연결 수용체는 Ste2p 것인 탐지 펩티드.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항의 탐지 펩티드를 하나 이상 포함하는 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정용 키트.
  8. 하기 단계로 이루어지는 효모의 G-단백질 연결 수용체에 대한 리간드의 친화도 측정 방법:
    1) 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항의 탐지 펩티드의 형광계수를 측정하는 단계;
    2) 상기 탐지 펩티드와 G-단백질 연결 수용체의 포화 결합을 유도하는 단계;
    3) 리간드를 추가하여 경쟁 결합을 유도하는 단계; 및
    4) 상기 리간드의 친화도를 결정하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 단계 2)의 G-단백질 연결 수용체는 Ste2p 또는 Ste3p인 것을 특징으로 하는 친화도 측정 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단계 3)의 리간드는 알파 팩터인 것을 특징으로 하는 친화도 측정 방법.
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