KR102084186B1 - Dna 단일가닥 절단에 의한 염기 교정 비표적 위치 확인 방법 - Google Patents

Dna 단일가닥 절단에 의한 염기 교정 비표적 위치 확인 방법 Download PDF

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Abstract

시티딘 디아미나제, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는, DNA 단일 가닥 절단 (single strand break)용 조성물, 이를 이용한 DNA 단일 가닥 절단 (single strand break) 생성 방법, 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법, 및 염기 교정 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site), 및/또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법이 제공된다.

Description

DNA 단일가닥 절단에 의한 염기 교정 비표적 위치 확인 방법{Method of identifying genome-wide off-target sites of base editors by detecting single strand breaks in genomic DNA}
시티딘 디아미나제(deaminase), 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는, DNA 단일 가닥 절단 (single strand break)용 조성물, 이를 이용한 DNA 단일 가닥 절단 (single strand break) 생성 방법, 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법, 및 염기 교정 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site), 및/또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법과 관련된 것이다.
DNA 결합 모듈과 시티딘 디아미나제(cytidine deaminase)를 포함하는 염기 교정기 (Base Editor; Programmable deaminase)는 DNA 이중 가닥 절단 (DNA double-strand breaks)을 생성하지 않고 유전체에서 표적화 된 뉴클레오티드 치환 또는 염기 교정을 가능하게 한다. 표적 부위에 작은 삽입 또는 결실 (indels)을 유도하는 CRISPR-Cas9 및 ZFN (zinc-finger nucleases)과 같은 programmable nucleases와 달리, programmable 디아미나제는 표적 부위에서 몇 개의 뉴클레오타이드 내에서 C를 T로 (또는 보다 적은 비율로 C를 G 또는 A로) 변환시킨다. 염기교정기는 인간의 세포, 동물 및 식물에 대한 유전 질환을 유발하는 점 돌연변이를 수정하거나 단일염기다형성 (single-nucleotide polymorphisms; SNP)을 생성 할 수 있다.
염기교정기는 다음의 4 종류가 보고되어 있다:
1) S. pyogenes에서 유래하는 촉매적으로 결핍된 Cas9 (catalytically-deficient Cas9; dCas9) 또는 D10A Cas9 니케이즈 (nCas9)와, 래트의 시티딘 디아미나아제인 rAPOBEC1를 포함하는 베이스 에디터 (Base Editors; BEs); 2) dCas9 또는 nCas9와, 바다칠성장어(sea lamprey)의 activation-induced cytidine deaminase (AID) ortholog인 PmCDA1 또는 인간 AID를 포함하는 Target-AID; 3) MS2-결합 단백질에 융합된 과활성화된 AID 변이체를 모집하기 위해 MS2 RNA 헤어핀에 연결된 sgRNAs와 dCas9를 포함하는 CRISPR-X; 및 4) 징크-핑거 단백질 또는 transcription activator-like effectors (TALEs)가 시티딘 디아미나제에 융합 된 것.
염기교정기에 의한 염기 교정(base editing)에 대한 광범위한 관심에도 불구하고, 염기교정기의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석할 수 있는 수단이 개발된 바가 없다. 따라서, 염기교정기의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석하여, 염기교정기의 염기 교정 효율, 비표적 사이트 (off-target site), 비표적 효과(off-target effect) 등을 분석할 수 있는 수단의 개발이 필요하다.
본 명세서에서는 염기교정기의 유전체 전체에 대한 표적 특이성을 분석할 수 있는 수단, 및 이를 통하여 염기교정기의 비표적 사이트, 비표적 효과 등을 분석할 수 있는 수단이 제공된다.
일 예는 (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 포함하는, DNA 단일 가닥 절단 (single strand breaks)용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 포함하지 않는 것일 수 있다.
다른 예는, (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA 단일 가닥 절단 (single strand break) 방법을 제공한다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
다른 예는,
(i) (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계; 및
(ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계
를 포함하는, 상기 디아미나제에 의하여 염기 교정 (base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법을 제공한다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
다른 예는,
(i) (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA) 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;
(ii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및
(iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계
를 포함하는, 디아미나제의 염기 교정 또는 단일가닥절단 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site), 및/또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 예컨대, 상기 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전, 동시 또는 이후에, (iii-1) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터(sequence read)에서 염기 교정 (예컨대, 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환) 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 방법 (예컨대, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site) 확인 방법)은, 상기 단계 (iii) 이후에, (iv) 상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 확인(판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 Digenome-seq를 수정하여 인간 유전체에서 Cas9 니케이즈(nickase)와 디아미나제 (deaminase)로 구성된 염기교정기 (예컨대, Base Editor 3; BE3)의 특이성을 평가하였다. 유전체 DNA를 BE3 및 가이드 RNA로 시험관내에서 처리하여 DNA 이중 가닥 중 단일 가닥에 절단이 생성되는 것을 확인하였다. 본 명세서에서 제공되는 디아미나제를 이용한 DNA 단일 가닥 절단 방법 및 이를 이용한 핵산 서열 분석 방법에 의하여, BE3 비표적 사이트를 전체 유전체 시퀀싱 데이터를 사용하여 계산적으로 확인할 수 있다.
우선, DNA에 이중 가닥 절단을 유발하지 않는 디아미나제를 이용하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 기술이 제공된다.
일 예는 일 예는 (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 포함하는, DNA 단일 가닥 절단 (single strand breaks)용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 암호화 유전자는 cDNA, rDNA 또는 이를 포함하는 재조합 벡터, 또는 mRNA 형태로 사용될 수 있다.
상기 디아미나제는 시티딘 디아미나제일 수 있다. 시티딘 디아미나제는 뉴클레오타이드에 존재하는 염기인 시토신 (예컨대, 2중 가닥 DNA 또는 RNA에 존재하는 시토신)을 우라실 (또는 티민)로 변환 (C-to-U(or C-to-T) conversion or C-to-U(or C-to-T) editing)시키는 활성을 갖는 모든 효소를 의미하는 것으로, 표적 부위의 서열 (표적 서열)의 PAM 서열이 존재하는 가닥에 위치하는 시토신을 우라실로 변환시킨다. 일 예에서, 상기 시티딘 디아미나제는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 시티딘 디아미나제는 APOBEC　("apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like") 패밀리에 속하는 효소들, AID (activation-induced cytidine deaminase), CDA (cytidine deaminase; 예컨대, CDA1) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 다음으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
APOBEC1: 인간 (Homo sapiens) APOBEC1 (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001291495.1, NP_001635.2, NP_005880.2 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001304566.1, NM_001644.4, NM_005889.3 등), 마우스 (Mus musculus) APOBEC1 (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001127863.1, NP_112436.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001134391.1, NM_031159.3 등);
APOBEC2: 인간 APOBEC2 (단백질: GenBank Accession No. NP_006780.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_006789.3 등), 마우스 APOBEC2 (단백질: GenBank Accession No. NP_033824.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_009694.3 등);
APOBEC3B: 인간 APOBEC3B (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001257340.1, NP_004891.4 등; 유전자 (mRNA or cDNA, 이하 동일) (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001270411.1, NM_004900.4 등), 마우스 (Mus musculus) APOBEC3B (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001153887.1, NP_001333970.1, NP_084531.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001160415.1, NM_001347041.1, NM_030255.3 등);
APOBEC3C: 인간 APOBEC3C (단백질: GenBank Accession No. NP_055323.2 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_014508.2 등);
APOBEC3D (including APOBEC3E): 인간 APOBEC3D (단백질: GenBank Accession No. NP_689639.2 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_152426.3 등);
APOBEC3F: 인간 APOBEC3F (단백질: GenBank Accession Nos. NP_660341.2, NP_001006667.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): NM_145298.5, NM_001006666.1 등);
APOBEC3G: 인간 APOBEC3G (단백질: GenBank Accession Nos. NP_068594.1, NP_001336365.1, NP_001336366.1, NP_001336367.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): NM_021822.3, NM_001349436.1, NM_001349437.1, NM_001349438.1 등);
APOBEC3H: 인간 APOBEC3H (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001159474.2, NP_001159475.2, NP_001159476.2, NP_861438.3 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): NM_001166002.2, NM_001166003.2, NM_001166004.2, NM_181773.4 등);
APOBEC4 (including APOBEC3E): 인간 APOBEC4 (단백질: GenBank Accession No. NP_982279.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_203454.2 등); 마우스 APOBEC4 (단백질: GenBank Accession No. NP_001074666.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_001081197.1 등);
Activation-induced cytidine deaminase (AICDA　또는 AID): 인간 AID (단백질: GenBank Accession Nos. NP_001317272.1, NP_065712.1 등; 유전자 (앞에 기재된 단백질 순서대로 이를 암호화 하는 유전자를 기재함): GenBank Accession Nos. NM_001330343.1, NM_020661.3 등); 마우스 AID (단백질: GenBank Accession No. NP_033775.1 등; 유전자: GenBank Accession No. NM_009645.2 등); 및
CDA (cytidine deaminase; EC number 3.5.4.5; 예컨대, CDA1): GenBank Accession Nos. NP_001776.1 (유전자: NM_001785.2), CAA06460.1 (유전자: AJ005261.1), NP_416648.1 (유전자: NC_000913.3) 등.
본 명세서에 사용된 바로서, 표적 특이적 뉴클레아제는, 유전자 가위 (programmable nuclease)라고도 불리며, 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 모든 형태의 엔도뉴클레아제를 통칭한다.
예컨대, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델 (insertion and/or deletion, Indel)을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대, Cas9, Cpf1, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질(CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) associated protein 9)), Cpf1 단백질 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 등과 같은 타입 Ⅱ 및/또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 엔도뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro)에서 전사된(transcribed) 것일 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제 및 가이드 RNA는 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 사용될 수 있으며, 상기 리보핵산 단백질은 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자 및 RNA 또는 이의 암호화 유전자가 혼합물 또는 서로 결합된 복합체 형태로 포함된 것일 수 있다.
Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase 기능을 할 수 있는 단백질이다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은
스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질 (예컨대, SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1) (암호화 유전자: 서열번호 4);
캄필로박터 속, 예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질;
스트렙토코커스 속, 예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질;
네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질;
파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 예컨대, 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질;
프란시셀라 (Francisella) 속, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질
등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cpf1 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracrRNA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한, 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.
예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Paceibacter , Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .
상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적 특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)은 재조합 DNA에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN(Recombinant DNA; rDNA)는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 표적 특이적 엔도뉴클레아제를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 암호화 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 표적특이적 엔도뉴클레아제을 의미하는 것으로, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니케이즈 활성을 갖는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니케이즈 활성을 모두 상실한 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 니케이즈 활성을 갖는 것일 수 있으며, 이 경우 상기 시토신이 우라실로 변환되는 것과 동시 또는 순서와 무관하게 순차적으로, 시토신이 우라실로 변환된 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대 반대 가닥)에서 nick이 도입된다 (예컨대, PAM 서열이 존재하는 가닥의 반대 가닥에 PAM 서열의 5' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 해당하는 위치에 nick이 도입됨). 이와 같은 표적특이적 엔도뉴클레아제의 변형(돌연변이)는 적어도 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 예컨대, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)가 임의의 다른 아미노산으로 치환된 Cas9의 돌연변이를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바로서, 상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다.
일 예에서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 변형 Cas9 단백질인 경우, 변형 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질(예컨대, SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1))에 D10 또는 H840 위치에서의 돌연변이 (예컨대, 다른 아미노산으로의 치환) 가 도입되어 엔도뉴클레아제 활성이 상실되고 니케이즈 활성을 갖는 변형 Cas9, 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 D10 및 H840 위치 모두에 돌연변이(예컨대, 다른 아미노산으로의 치환)가 도입되어 엔도뉴클레아제 활성 및 니케이즈 활성을 모두 상실한 변형 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 CAs9 단백질의 D10 위치에서의 돌연변이는 D10A 돌연변이 (Cas9 단백질의 아미노산 중 10번째 아미노산인 D가 A로 치환된 돌연변이를 의미함; 이하, Cas9에 도입된 돌연변이는 동일한 방법으로 표기됨)일 수 있고, 상기 H840 위치에서의 돌연변이는 H840A 돌연변이일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질 (서열번호 4)의 D10가 A로 치환된 D10A 돌연변이를 갖는 니케이즈 (예컨대, 서열번호 11에 의하여 코딩됨)일 수 있다.
상기 시티딘 디아미나제와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 직접 또는 펩타이드 링커를 통하여 서로 융합된 융합 단백질 (예컨대, N-말단에서 C-말단 방향으로 시티딘 디아미나제-불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 순서로 위치하거나 (즉, 시티딘 디아미나제의 C-말단에 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 융합됨), 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제-시티딘 디아미나제 순서로 위치(즉, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 C-말단에 시티딘 디아미나제가 융합됨)할 수 있음) 형태로 사용(또는 상기 조성물에 포함)되거나 되거나, 정제된 시티딘 디아미나제 또는 이를 암호화하는 mRNA와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 mRNA의 혼합물 형태로 사용(또는 상기 조성물에 포함)되거나, 시티딘 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 모두 포함 (예컨대, 상기 두 유전자는 앞서 설명한 융합 단백질을 암호화하도록 포함됨)된 하나의 플라스미드 형태로 사용(또는 상기 조성물에 포함)되거나, 시티딘 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 각각 별개의 플라스미드에 포함된 시티딘 디아미나제 발현 플라스미드와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 발현 플라스미드의 혼합물 형태로 사용(또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다. 일 구체예에서는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 시티딘 디아미나제-불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 순서로 위치하는 융합 단백질, 또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제-시티딘 디아미나제 순서로 위치하는 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 암호화하도록 시티딘 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자가 하나의 플라스미드에 포함된 형태로 사용될 수 있다.
상기 플라스미드는 상기 시티딘 디아미나제 암호화 유전자 및/또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 모든 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS) 및/또는 전자 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 당업계에서 사용되는 플라스미드, 예컨대, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 상기 시티딘 디아미나제에 의하여 염기 교정 또는 이중 가닥 절단을 도입하고자 하는 세포 (예컨대, 인간 세포 등과 같은 포유류 세포를 포함하는 진핵 세포) 또는 상기 시티딘 디아미나제 암호화 유전자 및/또는 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 발현하여 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 발현할 수 있는 모든 세포 (예컨대, E. coli 등) 들 중에서 선택될 수 있다.
상기 가이드 RNA는 상기 시티딘 디아미나제와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 혼합물 또는 융합 단백질을 표적 부위로 안내하는 역할을 하는 것으로, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 사용된 표적특이적 엔도뉴클레아제 의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.
표적특이적 엔도뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(Xcas9)m-3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
Ncas9는 표적화 서열, 즉 표적 유전자(target gene)의 표적 부위(target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (즉, 표적 부위의 서열과 혼성화 가능한 서열임)이며, l은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 17 내지 23 또는 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고;
상기 표적 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA; 서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,
Xcas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 예에서, 상기 Xcas9는 UGCUGUUUUG(서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:
5'-(Ycas9)p-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 2)
상기 일반식 2에서,
60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC; 서열번호 3)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,
Ycas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서, crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
일 예에서, sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(올리고뉴클레오타이드 링커)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 3)
상기 일반식 3에서, (Ncas9)l는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.
상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif　서열(S. pyogenes Cas9의 경우, 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17개 내지 약 23개 또는 약 18개 내지 약22개, 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열(5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥)의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.
본 명세서에서, 표적 부위의 핵산 서열은 표적 유전자의 해당 유전자 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥이므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, 표적 부위의 서열과 동일한 핵산 서열을 갖게 된다. 따라서, 본 명세서에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 부위의 서열 (또는 절단 부위의 서열)은 T와 U가 상호 변경되는 것을 제외하고 동일한 핵산 서열로 표시된다.
상기 가이드 RNA는 RNA 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나, 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 포함 또는 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 우라실-특이적 제거 시약은 상기 시티딘 디아미나제에 의하여 시토신로부터 변환된 우라실을 제거하고, 및/또는 상기 우라실이 제거된 위치에 DNA 절단을 도입하는 역할을 하는 모든 물질을 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)은 우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG), 엔도뉴클레아제 VIII, 및 이들의 조합을 포함한다. 일 예에서, 상기 우라실-특이적 제거 시약은 엔도뉴클레아제 VIII 또는 우라실 DNA 글라이코실라제와 엔도뉴클레아제 VIII의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG)는 DNA에 존재하는 우라실 (U)을 제거하여 DNA의 mutagenesis를 방지하는 작용을 하는 효소로서, 우라실의 N-glycosylic bond을 절단함으로써 base-excision repair (BER) pathway를 개시하도록 하는 역할을 하는 모든 효소들 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 우라실 DNA 글라이코실라제는 Escherichia coli 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대, GenBank Accession Nos. ADX49788.1, ACT28166.1, EFN36865.1, BAA10923.1, ACA76764.1, ACX38762.1, EFU59768.1, EFU53885.1, EFJ57281.1, EFU47398.1, EFK71412.1, EFJ92376.1, EFJ79936.1, EFO59084.1, EFK47562.1, KXH01728.1, ESE25979.1, ESD99489.1, ESD73882.1, ESD69341.1 등), 인간 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대, GenBank Accession Nos. NP_003353.1, NP_550433.1 등), 마우스 우라실 DNA 글라이코실라제 (예컨대, GenBank Accession Nos. NP_001035781.1, NP_035807.2 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엔도뉴클레아제 VIII는 상기 우라실이 제거된 뉴클레오타이드를 제거하는 역할을 하는 것으로, 상기 우라실 DNA 글라이코실라제에 의하여 손상된 우라실을 이중 가닥 DNA로부터 제거하는 N-glycosylase 활성과 상기 손상된 우라실 제거로부터 발생한 apurinic site (AP site)의 3' 및 5' 말단을 절단하는 AP-lyase 활성을 모두 갖는 모든 효소들 중에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 엔도뉴클레아제 VIII는 인간 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대, GenBank Accession Nos. BAC06476.1, NP_001339449.1, NP_001243481.1, NP_078884.2, NP_001339448.1 등), 마우스 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대, GenBank Accession Nos. BAC06477.1, NP_082623.1 등), Escherichia coli 엔도뉴클레아제 VIII (예컨대, GenBank Accession Nos. OBZ49008.1, OBZ43214.1, OBZ42025.1, ANJ41661.1, KYL40995.1, KMV55034.1, KMV53379.1, KMV50038.1, KMV40847.1, AQW72152.1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는, (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를,
세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시키는 단계
를 포함하는, DNA에 단일 가닥 절단 (double strand break)를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
이와 같이 DNA에 단일 가닥 절단을 생성 (또는 도입)함으로써, 유전체 DNA 또는 DNA의 표적 부위에서 시티딘 디아미나제에 의하여 염기 교정(base editing, 즉 C에서 U로의 변환)이 일어난 위치 또는 상기 단일 가닥 절단이 생성 (도입)된 위치, 염기 교정 효율 등을 분석할 수 있으며, 이를 통하여, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, on-target 서열에 대한 특이성, off-target 서열 등을 확인 (또는 측정)할 수 있다.
다른 예는,
(i) (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계; 및
(ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계
를 포함하는, 디아미나제에 의하여 염기 교정(base editing)이 도입된 DNA의 핵산 서열 분석 방법을 제공한다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
　다른 예는,
(i) (a) 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자 (cDNA, rDNA, 또는 mRNA), 및 (b) 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자(cDNA, rDNA, 또는 mRNA) 및 (c) 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;
(ii) 상기 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및
(iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계
를 포함하는, 디아미나제의 염기 교정 위치, 단일 가닥 절단 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site), 및/또는 표적 특이성을 확인 (또는 측정 또는 검출)하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 예컨대, 상기 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전, 동시 또는 이후에, (iii-1) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터(sequence read)에서 염기 교정 (예컨대, 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환) 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)을 처리하여 DNA에 이중 가닥 절단을 생성하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 방법 (예컨대, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site) 확인 방법)은, 상기 단계 (iii) 이후에, (iv) 상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 확인(판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 디아미나제, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA 및 우라실-특이적 제거 시약은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 제공된 방법들은 세포 내 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있으며, 예컨대, 시험관 내에서 수행되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 방법의 모든 단계가 시험관 내 (in vitro)에서 수행되거나, 상기 단계 (i)은 세포 내에서 수행되고, 상기 단계 (ii) 이후 단계는 상기 단계 (i)이 수행된 세포에서 추출된 DNA (예컨대, 유전체 DNA)를 사용하여 시험관 내 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 단계 (i)은 디아미나제 (또는 이의 암호화 유전자) 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 (또는 이의 암호화 유전자)와 가이드 RNA를 세포에 형질감염시키거나, 또는 상기 세포로부터 추출된 DNA에 접촉 (예컨대, 함께 배양)시켜, 가이드 RNA에 의하여 표적화되는 표적 부위 내에서 염기 교정 (염기 변환, 예컨대, 시토신에서 우라실로의 변환) 및 DNA 단일 가닥에 nick 발생을 유도하는 단계이다. 상기 세포는 디아미나제에 의한 염기 교정 및/또는 단일 가닥 절단을 도입하고자 하는 모든 진핵 세포들 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 세포를 포함하는 포유 동물 세포들 중에서 선택될 수 있다.
상기 형질감염은
(1) 디아미나제, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 및 가이드 RNA의 혼합물 또는 이들이 결합된 복합체 (리보핵산단백질; RNP),
(2) 디아미나제 암호화 mRNA, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 mRNA, 및 가이드 RNA의 혼합물, 또는
(3) 디아미나제 암호화 유전자 및 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 각각 또는 함께 포함하는 플라스미드 (재조합 벡터), 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드
를 통상적인 모든 수단에 의하여 세포에 도입시킴으로써 수행될 수 있으며, 예컨대, 상기 도입은 전기천공 (electroporation), 리포펙션, 미세주입 등에 의하여 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 단계 (i)은 상기 세포 (디아미나제 및 불활성화된 엔도뉴클레아제에 의한 염기 교정 (염기 교정 위치, 염기 교정 효율 등) 및/또는 단일 가닥 절단 (절단 위치, 절단 효율 등)을 확인하고자 하는 세포)로부터 추출된 DNA를 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 (예컨대, 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 Cas9 단백질을 포함하는 융합 단백질) 및 가이드 RNA와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다 (in vitro). 상기 세포로부터 추출된 DNA는 유전체 DNA (genome DNA) 또는 표적 유전자 또는 표적 부위를 포함하는 PCR (polymerase chain reaction) 증폭 산물일 수 있다.
임의로, 상기 단계 (i) 수행 (또는 완료) 후 단계 (ii) 수행 전에, (a) 단계 (i)에서 사용된 디아미나제, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제, 및/또는 가이드 RNA를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 단계 (i) 수행 (또는 완료) 후 단계 (ii) 수행 전에, 단일가닥 절단이 일어난 이중가닥 DNA 절편의 말단 평활화 (또는 말단 수선; end repair) 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 말단 평활화 단계는 (b) 단일가닥 절단이 일어난 이중가닥 DNA 절편에서, 절단이 일어나지 않은 가닥의 3'쪽 (절단된 가닥의 절단 지점의 5' 말단쪽과 상보적 위치)의 연장된 뉴클레오타이드를 제거(절단)하는 3'-to-5' 절단 (3'-to-5' trimming) 단계, 및/또는 (c) 단일가닥 절단이 일어난 이중가닥 DNA 절편에서, 절단이 일어난 가닥의 절단 지점에서의 3' 말단의 뉴클레오타이드를 연장시키는 5'-to-3' DNA 합성 단계를 추가로 포함할 수 있다 (실시예 1의 그림 참조). 상기 3'-to-5' 절단 단계는 적절한 통상의 엑소뉴클레아제를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 5'-to-3' DNA 합성 단계는 적절한 통상의 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 임의로, 상기 단계 (i) 수행 (또는 완료) 후 단계 (ii) 수행 전에, 단계 (ii)의 DNA 절편의 핵산 서열 분석을 보다 용이하게 하기 위하여, 단일가닥 절단된 DNA 절편 (DNA 이중 가닥 중, 절단된 가닥의 절단 위치(cleavage site)를 포함하는 연속하는 10 내지 30nt 또는 15 내지 25nt의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 절단되지 않은 가닥의 절단 위치와 대응되는(상보적인) 위치를 포함하는 연속하는 10 내지 30nt 또는 15 내지 25nt의 올리고뉴클레오타이드)를 증폭시키는 과정을 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계 (ii)에서 핵산 서열 분석에 사용되는 단일 가닥 절단된 DNA 절편은, 단일가닥 절단이 일어난 가닥의 절단 위치를 포함하는 연속하는 10 내지 30nt 또는 15 내지 25nt의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 절단되지 않은 가닥의 절단 위치와 대응되는(상보적인) 위치를 포함하는 연속하는 10 내지 30nt 또는 15 내지 25nt의 올리고뉴클레오타이드; 및/또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 증폭산물을 포함할 수 있다.
상기 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA와 함께 사용되어 서열 특이성 (specificity)을 가지므로 대부분 표적 위치(on-target)에 작용하지만, 표적 서열 이외의 부위에 표적 서열과 유사한 서열이 어느 정도 존재하는지에 따라 비표적 위치 (off-target site)에 작용하는 부작용이 발생할 수도 있다. 본 명세서에서, 비표적 위치 (off-target site)라 함은 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 부위는 아니지만 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 활성을 가지는 위치를 말한다. 즉, 표적 위치 이외의, 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 염기 교정 및/또는 절단되는 위치를 말한다. 일 예에서, 상기 비표적 위치는 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 대한 실제 비표적 위치뿐만 아니라 비표적 위치가 될 가능성이 있는 잠재적인 비표적 위치까지 포함하는 개념으로 사용될 수 있다. 상기 비표적 위치는 이에 제한되는 것은 아니나, 시험관 내 (in vitro)에서 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 표적 위치 이외의 모든 위치를 의미할 수 있다.
디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 표적 위치 이외의 위치에서도 활성을 가지는 것은 다양한 원인에 의해 야기될 수 있다. 예컨대, 표적 부위에 대하여 설계된 표적 서열과 뉴클레오타이드 불일치 (mismatch) 수준이 낮아서, 표적 서열과 서열 상동성이 높은 표적 서열 이외의 서열 (비표적 서열)의 경우 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 작동할 가능성이 있다.
상기 비표적 위치는 이에 제한되는 것은 아니나, 다음의 조건 중 하나 이상을 만족하는 서열 부위 (유전자 부위)일 수 있다:
5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드의 수가 2 이상, 예컨대, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상;
이중가닥 DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 PAM 서열을 포함;
이중가닥 DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 표적 위치의 서열(표적 서열)과 15개 이하 또는 10개 이하, 예컨대, 1개 내지 15개, 1개 내지 14개, 1개 내지 13 개, 1개 내지 12개, 1개 내지 11개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개, 또는 1개의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드를 포함; 및
이중가닥 DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 염기 교정 (하나 이상의 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환)을 포함.
비표적 위치에서 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제가 작동하는 경우 유전체 내에서 원치 않는 유전자의 돌연변이를 야기할 수 있어 심각한 문제가 야기될 수 있다. 이에, 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 위치에서의 활성 못지 않게 비표적 서열을 정확히 검출하여 분석하는 과정 또한 매우 중요할 수 있으며, 이는 비표적 효과 없이 표적 위치에만 특이적으로 작동하는 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적상 상기 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro)에서 활성을 가질 수 있으므로, 시험관 내에서 DNA (예컨대, 유전체 DNA)의 비표적 위치를 검출하는데 사용될 수 있으며, 이를 생체 내에서 적용하였을 때 상기 검출된 비표적 위치 (비표적 서열을 포함하는 유전자상 위치 (부위))와 동일한 위치에도 활성을 가질 것을 예상할 수 있다.
상기 단계 (ii)는 상기 단계 (i)에서 절단 (단일 가닥 절단)된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계로서, 통상적인 모든 핵산 서열 분석 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 단계 (i)에서 사용된 분리된 DNA가 유전체 DNA인 경우, 상기 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing)에 의하여 수행될 수 있다. 전체 유전체 시퀀싱을 수행하는 경우, 표적 부위의 서열과 상동성을 가지는 서열을 찾아 비표적 위치일 것으로 예측하는 간접적인 방법과 달리 전체 유전체 수준에서 실질적으로 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 절단되는 비표적 위치를 검출할 수 있으므로, 보다 정확하게 비표적 위치를 검출할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, "전체 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing; WGS)"은 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10 X, 20 X, 40 X 형식으로 여러 배수로 유전체를 읽는 방법을 의미한다. "차세대 시퀀싱"은 칩 (Chip) 기반 및 PCR 기반 페어드엔드 (paired end) 형식으로 전장 유전체를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응 (hybridization)에 기초하여 초고속으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미한다.
상기 단계 (iii)은 상기 단계 (ii)에서 수득한 염기서열 데이터 (sequence read)에서 DNA가 절단된 위치를 확인 (또는 결정)하는 단계로서, 시퀀싱 데이터를 분석하여 표적 위치 (on-target site)와 비표적 위치(off-target site)를 간편하게 검출할 수 있다. 상기 염기서열 데이터로부터 DNA가 절단된 특정 위치를 결정하는 것은 다양한 접근 방법으로 수행될 수 있으며, 본 명세서에서는 상기 위치를 결정하기 위한 여러 가지의 합리적인 방법들을 제공한다. 그러나 이는 본 발명의 기술적 사상에 포함되는 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이들 방법에 의해 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 절단된 위치를 결정하기 위한 일례로서, 전체 유전체 시퀀싱을 통해 수득한 염기서열 데이터를 유전체 상의 위치에 따라 정렬하였을 경우, 5' 말단이 수직 정렬된 위치가 DNA가 절단된 위치를 의미할 수 있다. 상기 염기서열 데이터를 유전체 상의 위치에 따라 정렬하는 단계는 분석 프로그램 (예를 들어, BWA/GATK 또는 ISAAC 등)을 이용하여 수행할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바로서, 상기 용어 "수직 정렬"이란, BWA/GATK 또는 ISAAC 등의 프로그램으로 전체 유전체 시퀀싱 결과를 분석할 때, 인접한 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand) 각각에 대해, 2 개 이상의 염기서열 데이터의 5' 말단이 유전체 상의 동일한 위치 (nucleotide position)에서 시작되는 배열을 말한다. 이로 인하여, 상기 단계 (ii)에서 절단되어 동일한 5' 말단을 갖게 되는 DNA 단편들이 각각 시퀀싱되어 나타나게 된다.
즉, 상기 단계 (i)에서의 절단이 표적 위치 및 비표적 위치에서 일어나는 경우, 염기서열 데이터를 정렬하게 되면 공통적으로 절단된 부위는 각각 그 위치가 5' 말단으로 시작되므로 수직 정렬되나, 절단되지 않은 부위에는 5' 말단이 존재하지 않으므로 정렬 시 스태거드 (staggered) 방식으로 배열될 수 있다. 따라서, 수직 정렬된 위치를 상기 단계 (i)에서 절단된 부위로 볼 수 있으며, 이는 곧 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의하여 절단된 표적 위치 또는 비표적 위치를 의미하는 것일 수 있다.
상기 "정렬"은 표준 염기서열 (reference genome)로 염기서열 데이터를 맵핑한 뒤, 유전체에서 동일 위치를 가지는 염기들을 각 위치에 맞게 배열하는 것을 의미한다. 따라서, 염기서열 데이터를 상기와 같은 방식으로 정렬할 수 있다면 어떠한 컴퓨터 프로그램도 이용될 수 있으며, 이는 당업계에 이미 알려진 공지의 프로그램이거나 또는 목적에 맞게 제작된 프로그램들 중에서 선택될 수 있다. 일 실시예에서는 ISAAC를 이용하여 정렬을 수행하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
정렬 결과, 상기 설명한 바와 같은 5' 말단이 수직 정렬된 위치를 찾는 등의 방법을 통해 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의해 DNA가 절단된 위치를 결정할 수 있고, 상기 절단된 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아니라면, 비표적 위치 (off-target site)로 판단할 수 있다. 다시 말해, 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제의 표적 위치로 설계한 염기 서열과 동일한 서열은 표적 위치이고, 상기 염기 서열과 동일하지 않은 서열은 비표적 위치로 볼 수 있다. 이는 상기 기술한 비표적 위치의 정의상 자명한 것이다.
상기 방법 (예컨대, on-target 부위에서의 염기 교정 효율, 비표적 위치 (off-target site) 확인 방법)은, 상기 단계 (iii) 이후에, 상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 확인(판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
염기교정기 (디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제)에 의해 절단된 DNA 절편 중 절단된 가닥은 5' 말단이 수직정렬된다. 상기5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 (DNA read; 본 명세서에서 사용되는 바로서, 5' 말단이 수직정렬되고 동일한 핵산 서열을 갖는 DNA 단편 또는 상기 DNA 단편의 집단을 의미함)의 개수에 따라서, 절단 위치의 개수를 확인할 수 있다. 예컨대, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드의 개수가 1인 경우, 상기 염기교정기에 의하여 하나의 위치, 즉 표적 위치에서만 절단이 일어났음을 확인할 수 있다. 5' 말단이 수직 정렬되는 DNA 리드의 개수가 2이상, 예컨대, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상인 경우, 2 이상의 다수의 위치에서 절단이 일어났음을 확인할 수 있으며, 이는 표적위치 이외의 위치 (비표적 위치)에서 DNA 절단이 있음을 의미하는 것이다. 또한, 상기 5' 말단이 수직정렬되는 DNA 리드들 중 표적 위치가 아닌 것 (즉, 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 것)은 비표적 위치라고 확인 (또는 결정)할 수 있다.
따라서, 상기 단계 (iii)의 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 (a) 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드의 수를 확인(또는 측정)하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드의 수가 2 이상, 예컨대, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상인 경우, 표적 위치가 아닌 위치 (비표적 위치)에서 DNA 절단이 일어난 것으로 확인 (또는 결정)할 수 있다. 또한, 이 경우, 상기 단계 (iv)의 비표적 위치로 확인하는 단계는 (iv-1) 상기 2개 이상의 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드를 비표적 위치로 확인 (또는 결정)하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 비표적 위치가 PAM 서열을 포함하는지 여부를 확인(보다 구체적으로, 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)이 PAM 서열을 포함하는지 여부를 확인)함으로써, 염기교정기에 포함된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 의한 표적특이적 절단이 아닌 오류로 절단된 위치를 배제하여 비표적 위치의 정확도를 보다 증가시킬 시킬 수 있다. 따라서, 상기 단계 (iii)의 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는, (b) 비표적 위치가 PAM 서열을 포함하는지 여부를 확인하는 단계, 예컨대, 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)이 염기교정기에 포함된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 특이적인 PAM 서열을 포함하는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 단계 (iv)의 비표적 위치로 확인하는 단계는, (iv-2) 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)이 염기교정기에 포함된 표적특이적 엔도뉴클레아제에 특이적인 PAM 서열을 포함하는 경우, 비표적 위치로 확인 (또는 결정)하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 비표적 위치는 표적 위치의 서열과 상동성을 가지는 서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 위치 서열은 PAM 서열을 포함하는 가닥의 핵산 서열로 표현되므로, 상기 비표적 위치는, 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)의 핵산 서열이 표적 위치와 1 개 이상의 뉴클레오타이드 불일치 (mismatch)를 가지는 서열, 더욱 구체적으로 표적 위치(표적 서열)와 15개 이하 또는 10개 이하, 예컨대, 1개 내지 15개, 1개 내지 14개, 1개 내지 13개, 1개 내지 12개, 1개 내지 11개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지는 것일 수 있다.
따라서, 상기 단계 (iii)의 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는, (c) 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)의 표적 위치 서열에 대한 불일치 뉴클레오타이드 수를 확인 (또는 측정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 불일치 뉴클레오타이드 수가 15개 이하 또는 10개 이하, 예컨대, 1개 내지 15개, 1개 내지 14개, 1개 내지 13개, 1개 내지 12개, 1개 내지 11개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개인 경우, 상기 DNA 리드를 표적 위치가 아닌 위치 (비표적 위치)에서 DNA 절단이 일어난 것으로 확인 (또는 결정)할 수 있다. 또한, 이 경우, 상기 단계 (iv)의 비표적 위치로 확인하는 단계는, (iv-3) 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)의 표적 위치 서열에 대한 불일치 뉴클레오타이드가 15개 이하 또는 10개 이하, 예컨대, 1개 내지 15개, 1개 내지 14개, 1개 내지 13개, 1개 내지 12개, 1개 내지 11개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개인 경우, 비표적 위치로 확인 (또는 결정)하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (iii)는 단계 (a), (b), 및 (c) 중 하나 이상 (예컨대, 단계 (a) 및, (b)와 (c) 중 하나 이상)을 포함할 수 있으며, 상기 단계 (a), (b), 및 (c) 중 2 이상을 포함하는 경우, 이들은 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 수행되는 것일 수 있다. 또한, 단계 (iv)는 단계 (iv-1), (iv-2), 및 (iv-3) 중 하나 이상(예컨대, 단계 (iv-1) 및, (iv-2)와 (iv-3) 중 하나 이상)을 포함할 수 있으며, 상기 단계 (iv-1), (iv-2), 및 (iv-3) 중 2 이상을 포함하는 경우, 이들은 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 단계 (iii-1)의 염기 교정 (예컨대, 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환) 여부를 확인하는 단계는, 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)이 염기 교정 (하나 이상의 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환)을 포함하는지 여부를 확인 (측정)하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 단계 (iv)의 비표적 위치로 확인하는 단계는, (iv-4) 절단된 DNA 절편 중, 5' 말단이 수직정렬 되는 DNA 리드 중 표적 위치의 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는 DNA 리드와 상보적 가닥 (상보적 서열을 갖는 가닥)이 염기 교정 (하나 이상의 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환)을 포함하는 경우, 비표적 위치로 확인 (또는 결정)하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 유전체 DNA에 대하여 상기 단계 (i)를 수행하여 단일 가닥 절단한 뒤, 전체 유전체 분석 (단계 (ii)) 수행 후, 이를 ISAAC로 정렬하여 절단된 위치에서는 수직 정렬, 절단되지 않은 위치에서는 스태거드 방식으로 정렬되는 패턴을 확인하여, 이를 5' 말단 플롯으로 나타내었을 때 절단 부위에서 독특한 패턴이 나타날 수 있다.
나아가 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적인 일례로 왓슨 가닥 (Watson strand)과 크릭 가닥 (Crick strand)에 해당하는 염기서열 데이터 (sequence read)가 각각 두 개 이상씩 수직으로 정렬되는 위치를 비표적 위치인 것으로 판단할 수 있고, 또한 20 % 이상의 염기서열 데이터가 수직으로 정렬되고, 각각의 왓슨 가닥 및 크릭 가닥에서 동일한 5' 말단을 가진 염기서열 데이터의 수가 10 이상인 위치가 비표적 위치, 즉 절단되는 위치인 것으로 판단할 수 있다.
상기한 방법은 단계 (ii) 및 (iii)의 과정은 Digenome-seq (digested-genome sequencing일 수 있으며, 보다 구체적인 내용은 한국 특허공개 제10-2016-0058703호에 기재되어 있다 (상기 문헌은 본 발명에 참조로서 포함된다).
앞서 설명한 방법에 의하여, 디아미나제의 염기 교정 위치 및/또는 단일 가닥 절단 위치, on-target 부위에서의 염기 교정 효율 또는 표적 특이성 (즉, [on-target 부위에서의 염기 교정 또는 절단 빈도]/[전체 염기 교정 또는 절단 빈도]), 및/또는 비표적 위치 (off-target site; 디아미나제의 염기 교정 위치로 확인된 위치 중 on-target 위치가 아닌 위치)를 확인 (또는 측정 또는 검출)할 수 있다.
상기 비표적 위치 확인(검출)은 시험관 내 (in vitro)에서 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제를 유전체 DNA에 처리하여 수행될 수 있다. 이에 상기 방법을 통해 확인(검출)된 비표적 위치에 대하여 실질적으로 생체 내 (in vivo)에서도 비표적 효과가 나타나는지 확인해볼 수 있다. 다만 이는 추가적인 검증 과정에 불과하므로 본 발명의 범위에 필수적으로 수반되는 단계는 아니며, 필요에 따라 추가적으로 수행될 수 있는 단계에 불과하다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "비표적 효과 (off-target effect)"는 비표적 위치 (off-target site)에서 염기 교정 및/또는 이중 가닥 절단이 일어나는 수준을 의미하기 위한 것일 수 있다. 용어 "인델(Insertion and/or deletion; Indel)"은 DNA의 염기 배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나 (insertion) 및/또는 결실된 (deletion) 변이를 총칭한다.
본 명세서에서 제공되는 시티딘 디아미나제를 이용한 DNA 단일 가닥 절단 방법 및 이를 이용한 핵산 서열 분석 기술에 의하여, 시티딘 디아미나제의 염기 교정 위치, 표적 특이성, 및/또는 비표적 위치를 보다 정확하고 효율적으로 확인할 수 있다.
도 1은 EMX1의 표적 위치에서의 C→U 변환 및 직선 정렬(straight alignment)을 보여주는 대표적인 IGV 이미지이다.
도 2는 Digenome-seq 결과 얻어진 하나의 가닥에서만 시퀀스 리드의 균일한 정렬을 갖는 절단 위치(nicked sites)의 개수 및 이들 위치 중 10개 이하의 mismatch를 갖는 PAM-포함 위치의 개수 보여준다.
도 3a는 rAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS 벡터의 개열지도이다.
도 3b는 rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS 벡터의 개열지도이다.
도 3c는 rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS 벡터의 개열지도이다.
도 4는 Cas9 expression plasmid의 개열지도이다.
도 5는 pET28b-BE1 벡터의 개열지도이다.
도 6은 pET28b-BE3 delta UGI 벡터의 개열지도이다
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[ 참고예 ]
1. 세포 배양 및 형질감염
HEK293T 세포 (ATCC CRL-11268)를 10%(w/v) FBS 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토 마이신 (Welgene)으로 보충된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에서 유지시켰다. HEK293T 세포 (1.5x105)를 24- 웰 플레이트에 접종하고, Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 sgRNA plasmid (500 ng)와, Base Editor plasmid (Addgene plasmid #73019 (Expresses BE1 with C-terminal NLS in mammalian cells; rAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS; 도 3a), #73020 (Expresses BE2 in mammalian cells; rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS; 도 3b), #73021 (Expresses BE3 in mammalian cells; rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS; 도 3c)) (1.5㎍) 또는 Cas9 expression plasmid (Addgene plasmid #43945; 도 4)를 형질감염시켰다 (at ~80% confluency). 형질감염 후 72 시간 후에 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 유전체 DNA를 분리하였다. 상기 세포에 대하여 마이코플라스마 오염 여부를 테스트하지 않았다.
하기하는 실시예에 사용된 sgRNA는 표적 부위 서열 (표적 서열; EMX1 on-target 서열; GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG (서열번호 14)) 중 5' 말단의 PAM 서열 (5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))을 제외한 서열에서 T를 U로 바꾼 서열을 아래의 일반식 3의 표적화 서열 '(Ncas9)l'로 하여 제작된 것을 사용하였다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA; 서열번호 1)-(GAAA)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC; 서열번호 3)-3' (일반식 3; 올리고뉴클레오타이드 링커: GAAA).
2. 단백질 정제
His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9 단백질을 코딩하는 플라스미드(pET28b-BE1; Expresses BE1 with N-terminal His6 tag in E. Coli; 도 5)는 David Liu (Addgene plasmid #73018)로부터 제공받고, 상기 His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9 단백질을 코딩하는 플라스미드 pET28b-BE1에서 site directed mutagenesis를 이용하여 dCas9의 A840을 H840로 치환하여, His6-rAPOBEC1-nCas9 단백질 (BE3 delta UGI; UGI 도메인을 결여한 BE3 변이형)을 코딩하는 플라스미드(pET28b-BE3 delta UGI; 도 6)를 제작하였다.
Rosetta 발현 세포 (Novagen, catalog number: 70954-3CN)를 상기 준비된 pET28b-BE1 또는 pET28b-BE3 delta UGI로 형질 전환시키고, 100 ㎍/ml kanamycin 과 50 mg/ml carbenicilin을 포함하는 Luria-Bertani (LB) brot에서 37 조건으로 밤새 배양하였다. pET28b-BE1 또는 pET28b-BE3 delta UGI을 함유하는 Rosetta 세포를 밤새 배양한 배양물 10ml를 100㎍/ml kanamycin 및 50mg/ml carbenicilin을 함유하는 400ml LB broth에 접종하고 OD600이 0.5-0.6에 도달 할 때까지 30 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 1 시간 동안 16 로 냉각시키고, 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 보충하여, 14-18 시간 동안 배양하였다.
단백질 정제를 위해, 세포를 4 에서 10 분 동안 5000xg에서 원심 분리하여 수확하고, 리소자임 (Sigma) 및 프로테아제 억제제 (Roche complete, EDTA-free)보충된 용해 완충액 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM DTT 및 10 mM imidazole, pH 8.0) 5 ml 에서 초음파 처리하여 용해시켰다. 상기 얻어진 세포 반응물을 4 에서 13,000 rpm로 30분 동안 원심분리하여 얻어진 용해성 세포 용해물을 Ni-NTA 아가로즈 레진(Qiagen)과 함께 4에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포 용해물/Ni-NTA 혼합물을 컬럼에 적용하고 완충액 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 세척하였다. BE3 단백질을 용출 완충액 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 저장 완충액 (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM DTT 및 20% 글리세롤)으로 버퍼 교체하여 저장하고 원심 분리 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 농축시켜, rAPOBEC1-nCas9 단백질을 정제하였다.
3. 유전체 DNA의 탈아민화
유전체 DNA는 제조자의 지시에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 사용하여 HEK293T 세포로부터 정제(추출)하였다. 유전체 DNA (10 ㎍)를 상기 참고예 2에서 정제된 rAPOBEC1-nCas9 단백질 (300 nM)과 sgRNA (900 nM)와 함께 500 ㎕의 반응 용량으로 37 에서 8 시간 동안 완충액 (100 mM NaCl, 40 mM) Hris-HCl, 10 mM MgCl2, 및 100 ㎍/ml BSA, pH 7.9)에서 배양하였다.
상기 사용된 sgRNA는 표적 부위 서열 (표적 서열; EMX1 on-target 서열; GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG (서열번호 14)) 중 5' 말단의 PAM 서열 (5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))을 제외한 서열에서 T를 U로 바꾼 서열을 아래의 일반식 3의 표적화 서열 '(Ncas9)l'로 하여 제작된 것을 사용하였다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(GAAA)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 3; 올리고뉴클레오타이드 링커: GAAA).
RNase A (50 ㎍/mL)를 사용하여 sgRNA를 제거한 후, 우라실 함유 유전체 DNA를 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)로 정제하였다. 표적 부위를 SUN-PCR 블렌드를 사용하여 PCR 증폭시키고 생거 (Sanger) 서열 분석을 수행하여 BE3-매개 시토신 탈아민화 및 DNA 절단을 확인하였다.
4. 전체 유전체 및 Digenome Sequencing
Covaris 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 400-500 bp 범위로 유전체 DNA (1 ㎍)를 단편화하고 End Repair Mix (Thermo Fischer)를 사용하여 blunt-ended 시켰다. 단편화된 DNA를 어댑터로 연결하여 라이브러리를 생성 한 다음, ㈜마크로젠에 의뢰하여 HiSeq X Ten Sequencer (Illumina)를 사용하여 WGS(whole genome sequencing)를 수행하였다 (Kim, D., Kim, S., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome research 26, 406-415 (2016)).
5. 표적 심층 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)
deep sequencing 라이브러리 생성을 위해, 표적과 잠재적인 비표적 부위를 KAPA HiFi HotStart PCR 키트 (KAPA Biosystems # KK2501)로 증폭시켰다. 풀링된 PCR 증폭물을 TruSeq HT Dual Index 시스템 (Illumina)이 장착된 MiniSeq (Illumina) 또는 Illumina Miseq(LAS Inc. 한국)을 사용하여 시퀀싱하였다.
상기 표적 심층 시퀀싱에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
EMX1
On-target sequence: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG (서열번호 14)
1st PCR
Forward(5'→3'):
AGTGTTGAGGCCCCAGTG (서열번호 15);
Reverse(5'→3'):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (서열번호 16);
2nd PCR
Forward(5'→3'):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGCCTCCTGAGTTTCTCAT (서열번호 17);
Reverse(5'→3')
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (서열번호 18);
실시예 1. Digenome - seq를 이용한 BE3 비표적 위치 확인
생체 외에서 (in vitro), 인간 유전체 DNA에 EMX1 특이적 sgRNA (참고예 3 참조; on target 서열: 서열번호 14)와 rAPOBEC1-nCas9 단백질 (BE3: 참고예 2에서 정제됨)이 복합체를 형성한 리보핵산단백질을 처리하여 표적 (on-target) 위치 및 비표적 (off-target) 위치에서 한 가닥에는 C→U 변환을, 다른 가닥에서는 절단 (nick)을 유도한 후, 참고예 4를 참조하여 Digenome-seq를 수행하였다. 본 실시예에서, Uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII는 사용하지 않았다. end repair 및 adaptor ligation 후, BE3 처리된 유전체 DNA에 대하여 전체 유전체 시퀀싱 (WGS)을 수행하였다.
그 과정을 모식적으로 나타내면 다음과 같다:
Figure 112018005354662-pat00001
한 가닥에서 서열 리드의 균일한 정렬 및 다른 가닥에서 C→U 변환이 일어난 표적 위치 및 비표적 위치를 계산적으로 확인하였다.
도 1은 EMX1의 표적 위치에서의 C→U 변환 및 직선 정렬(straight alignment)을 보여주는 대표적인 IGV 이미지이다.
상기 Digenome-seq 결과 얻어진 하나의 가닥에서만 시퀀스 리드의 균일한 정렬을 갖는 절단 위치(nicked sites; 5' 말단이 수직정렬을 갖는 위치(read))의 개수 및 이들 위치 중 10개 이하의 mismatch를 갖는 PAM-포함 위치(read)의 개수를 도 2에 나타내었다. 그룹 A와 B는 동일한 5' 말단을 갖는 시퀀스 리드의 절대 개수 (n ≥ 5 또는 10) 및 상대 개수 (각각 10% 또는 20%)를 갖는 것으로 확인되고 표적 서열과 상동성을 갖는 위치의 개수를 보여준다.
인간 유전체 전역에서 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 절대적 개수 (n≥ 5 또는 10) 및 상대적 개수 (각각 10 % 또는 20 %)를 계수하여 유전체 내에서의 균일한 정렬 패턴과 관련된 모든 위치를 열거하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 각각 90,496 또는 1,807 개의 해당 위치들을 확보하였다. 단일가닥 절단 (nick)이 있는 위치들 중 34 개 (그룹 A) 또는 142 개 (그룹 B; 상기 그룹 A를 포함함) 위치들은 각각 단일가닥 절단 위치의 하류방향의 PAM (5'-NGN-3' 또는 5'-NNG-3') 3 염기쌍을 가지며, 10 개 이하의 불일치 염기를 갖는 EMX1 표적 서열과 10개 이하의 mismatches를 갖는 정도의 상동성을 갖는다.
Digenome-seq를 통해 확인된 EMX1에 대한 BE3 비표적 위치에서의 Cas9 유도 indel 빈도와 BE3 유도 치환 빈도를 HEK293T 세포에서 표적심층시퀀싱(참고예 5 참조)을 사용하여 측정하였다. 손상되지 않은 유전체 DNA 또는 rAPOBEC1-nCas9로 처리된 유전체 DNA를 사용하여 얻어진 WGS 데이터에서의 이들 위치 각각에서 C→T 변환이 일어나는지 여부를 확인하였다.
EMX1에서 BE3에 의하여 절단된 DNA 서열 (표적 위치 1개 + 비표적 위치 141개 = 총 142개)을 아래의 표 1에 정리하였다 (아래 표 1에서, on target 서열과 mismatch인 염기는 소문자로 표시함).
Chr Position DNA seq at a nickage sites 서열번호
EMX1-001
(on- target)		 chr2 73160998 GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG 14
EMX1-002 chr4 131662222 GAaTCCaAG-AGAAGAAGAATGG 19
EMX1-003 chr2 219845072 GAGgCCGAGCAGAAGAAagACGG 20
EMX1-004 chr11 62365273 GAaTCCaAGCAGAAGAAGAgAAG 21
EMX1-005 chr8 128801258 GAGTCCtAGCAGgAGAAGAAGAG 22
EMX1-006 chr15 44109763 GAGTCtaAGCAGAAGAAGAAGAG 23
EMX1-007 chr19 24250503 GAGTCCaAGCAGtAGAgGAAGGG 24
EMX1-008 chr6 9118799 acGTCtGAGCAGAAGAAGAATGG 25
EMX1-009 chr5 9227162 aAGTCtGAGCAcAAGAAGAATGG 26
EMX1-010 chr1 4515013 GtGTCCtAG-AGAAGAAGAAGGG 27
EMX1-011 chr5 45359067 GAGTtaGAGCAGAAGAAGAAAGG 28
EMX1-012 chr13 96928092 GAGaCaGAG-AGAAGAAGAATGG 29
EMX1-013 chr18 34906762 GAGcCtGAGCgGAAGAgGAAAGG 30
EMX1-014 chr1 184236243 aAtaCaGAGCAGAAGAAGAATGG 31
EMX1-015 chr18 1677040 agtcCaGAGCAaAAtAAGAAGGG 32
EMX1-016 chr1 33606480 GAGcCtGAGCAGAAGgAGAAGGG 33
EMX1-017 chr3 111296327 GAagaaGAGCAaAAGAAGAAGGG 34
EMX1-018 chr22 34716275 GtGaCaGAGCAaAAGAAGAAAGG 35
EMX1-019 chr3 37781974 GAagagGAGCAaAAGAAGAAGGG 36
EMX1-020 chr20 6653999 aAGTCCagaCAGAAGAAGAAGGA 37
EMX1-021 chr16 78848850 aAaTCCaAcCAGAAGAAGAAAGG 38
EMX1-022 chr6 92449690 GttcaaGAGCAGgAGAAGAAGGG 39
EMX1-023 chr4 87256692 GAGTaaGAGaAGAAGAAGAAGGG 40
EMX1-024 chr11 43747948 aAGcCCGAGCAaAgGAAGAAAGG 41
EMX1-025 chr5 160643032 cctataGAGCAaAAGAAGAAAGG 42
EMX1-026 chr11 120873098 GAtcaaGAGaAGAAGAAGAAGGG 43
EMX1-027 chr5 62692054 cAaaaaGAGCAaAAGAAGAACGG 44
EMX1-028 chrX 3077291 tAcagtGAGCAaAAGAAGAAGGG 45
EMX1-029 chr14 98236084 GttcaaGAGCAGgAGAAGAAGGG 46
EMX1-030 chr2 205473563 ttcTCaGAGCAaAAGAAGAATGG 47
EMX1-031 chr3 189633259 cttTGCcAGGAGAAGgAcAtTGC 48
EMX1-032 chr10 58498683 agGTtaGAGCAaAAGAAGAAAGG 49
EMX1-033 chr1 35818892 tAtaCgGAGCAGAAGAAGAATGG 50
EMX1-034 chr3 45605387 GAGTCCacaCAGAAGAAGAAAGA 51
EMX1-035 chr3 5031614 GAaTCCaAGCAGgAGAAGAAGGA 52
EMX1-036 chr12 106646090 aAGTCCatGCAGAAGAgGAAGGG 53
EMX1-037 chr1 23720618 aAGTCCGAGgAGAgGAAGAAAGG 54
EMX1-038 chr11 107812992 aAGTCCaAGt-GAAGAAGAAAGG 55
EMX1-039 chr4 169444372 GAGaaCGAGaAGAAagAGgAGAG 56
EMX1-040 chr6 18327737 GAGagaGAGagagAGAgGgAGGG 57
EMX1-041 chr2 230161576 ctGgCaGAGCAaAAGAAGAgGGG 58
EMX1-042 chr3 95690186 tcaTCCaAGCAGAAGAAGAAGAG 59
EMX1-043 chr4 33321466 GtacagGAGCAGgAGAAGAATGG 60
EMX1-044 chr22 49900715 aAGaagGAGaAGAAGAAGAAGGG 61
EMX1-045 chr12 94591214 GAGagaGAGagagAGAgaAAGGG 62
EMX1-046 chr5 146833190 GAGcCgGAGCAGAAGAAGgAGGG 63
EMX1-047 chr6 111509461 GAGggaGAGagGgAGAgagAAAG 64
EMX1-048 chr1 26490139 ttaTCtccGagaAgGAAGAAGGG 65
EMX1-049 chr6 31265461 GAtTCtGtcCcGAAtcAGAAGGG 66
EMX1-050 chr14 30099303 atGcaaGAGaAGAAGAAGAAAGG 67
EMX1-051 chr3 83057859 agcaggGAGCAGAgGAAGAATGG 68
EMX1-052 chr15 35575311 GAGaagGAGaAGAAGAAGAAGGG 69
EMX1-053 chr1 55846672 actctaGAGCAGAAaAAGAATGG 70
EMX1-054 chr6 104384459 GAGgagGAGgAGgAGgAaggAGG 71
EMX1-055 chr19 9975831 aAagagGAGaAGAAGAAGAAGGG 72
EMX1-056 chr12 99525769 GgGgagGAGCAGAAGAAGAgAGG 73
EMX1-057 chr6 162280006 agGcCgagGCAGgAGAAtAgGAG 74
EMX1-058 chr7 85359110 GAGaagGAGCAGAAaAAGAATGG 75
EMX1-059 chr2 10462867 acagtaGAGCAGAAGAAGAcTGG 76
EMX1-060 chr3 18195303 atccaaGAGCAGgAGAAGAAGGG 77
EMX1-061 chr2 57855994 ataagaGAGCAaAAGAAGAAAGG 78
EMX1-062 chr6 33957284 GAGagaGAGagagAGAgaAACGG 79
EMX1-063 chr22 37474903 GAGaagGAGaAGAAGgAGAAGAG 80
EMX1-064 chr8 141193983 aAGaagaAGaAGAAGAAGAAGAG 81
EMX1-065 chr1 110038435 tttcggGAGCAGAAGAAGAACAG 82
EMX1-066 chr4 117483357 atcaCaGAGCAGgAGAAGAAGGG 83
EMX1-067 chr4 6150362 aAacagGAGCAGAgGAAGAAGGG 84
EMX1-068 chr2 116142148 aAGaagagGaAGAgGAgGAAAAG 85
EMX1-069 chr12 30794309 GAaatgGAGaAGAAGAAGAAGGG 86
EMX1-070 chr22 44527016 GAGagaGAaagaAAGAAaAAGGA 87
EMX1-071 chr9 96189722 GctgtgGAGCAaAAGAAGAAAGG 88
EMX1-072 chr8 113493465 GAGgagGAGCAGAAGAAGAAAAG 89
EMX1-073 chr11 46171476 tAaaagGAGCAGAAaAAGAAGGG 90
EMX1-074 chrX 3075272 tAccttGAGCAaAAGAAGAAGGG 91
EMX1-075 chr5 56038567 aAGaagGAGaAGAAGAAGAAGGG 92
EMX1-076 chr2 71789100 GcaggaGAGCAGAAGAAGAAAGG 93
EMX1-077 chr7 52389195 aAGagCGAGattAAGAgGAATGG 94
EMX1-078 chr5 31088930 aAGaaaGgagAGgAGAgGAgAGG 95
EMX1-079 chr11 111680806 agtagtGAGCAGAAGAAGAtAGG 96
EMX1-080 chr20 51306677 aAGaagGAGaAGAAGAAGAAGAG 97
EMX1-081 chr19 38433655 GAGagaGAGagagAGAgaAAGAG 98
EMX1-082 chr8 60956107 GgccagGAGCAGgAGAAGAAGGG 99
EMX1-083 chr16 26617803 agaggaGAGCAGAAGAAGgATGG 100
EMX1-084 chr12 52621931 aAGaagGAGaAGAAGAAGgAGGA 101
EMX1-085 chr3 156028864 cAtTaaGAGCAGgAGAAGAAGGG 102
EMX1-086 chr6 40280504 cgcTgatAcagaAAGAAGAATGG 103
EMX1-087 chr1 35385601 GAagtgGAGCAGgAGAAGAAGGG 104
EMX1-088 chr1 59299359 tttgtgGAGCAGAAaAAGAAAGG 105
EMX1-089 chr15 61646877 aAGTCaGAGgAGAAGAAGAAGGG 106
EMX1-090 chr2 159685754 aAagCtGAGCAGAAaAAGAAGGG 107
EMX1-091 chr12 41494108 GcagtgGAGCAGAAGAAGAtGGG 108
EMX1-092 chr7 119831026 acaaaaGAGCAGAgGAAGAAAGG 109
EMX1-093 chr1 234492864 GAagtaGAGCAGAAGAAGAAGCG 110
EMX1-094 chr14 104091588 aAagagGgagAGAAGAAGAAGGG 111
EMX1-095 chr1 31954326 aAGaagGAGaAGAAGAAGAAGAG 112
EMX1-096 chr8 120587501 aAGgCCaAGCAGAAGAgtAATGG 113
EMX1-097 chr2 46020469 acacaaGAGCAGAAGAAGAAAGA 114
EMX1-098 chr2 219294645 GccaatGAGCAGgAGAAGAAGGG 115
EMX1-099 chr8 11924153 cAtataGAGCAaAAGAAGAgAGG 116
EMX1-100 chr6 54740531 GAGgtgGAGggGAAGAgGgAAGG 117
EMX1-101 chr1 156786840 GAGagaGAGagagAGAgaAAGGG 118
EMX1-102 chr6 30791217 aAGgagGAGaAGAAGAAGAAGGG 119
EMX1-103 chr3 192777993 GAGggaGAGagagAGAgagAAAG 120
EMX1-104 chr2 36207879 agtcggGAGCAGgAGAAGAAAGG 121
EMX1-105 chr16 54831367 GttcaaGAGCAGAAGAAGAATGG 122
EMX1-106 chr6 160868147 tctaaaGAGCAGAAaAAGAAAGG 123
EMX1-107 chr2 24438043 actgatGAGCAGAAGAAGAAAGG 124
EMX1-108 chr22 37102243 aAGaagGAGaAGAAGAAGgAGGA 125
EMX1-109 chr11 121786535 agGaaaagagAGAAGAAGAAGGG 126
EMX1-110 chr7 3337380 GAGgagGAGaAGAAGAAGAAGGG 127
EMX1-111 chr8 112924257 GAGagaGAGagagAGAgaAAGGG 128
EMX1-112 chr16 69047289 GAGgCCGAagctgAGgtGggAGG 129
EMX1-113 chr8 105164125 GAGcCCaAGaAGAAGAAGAAGGA 130
EMX1-114 chr13 83353702 atGTaCagagAGAAGAAGAAAGG 131
EMX1-115 chr2 102929260 GccTtCagagAGAAGAAGAATGG 132
EMX1-116 chr15 22366621 GgagtaGAGCAGAgGAAGAAGGG 133
EMX1-117 chr2 172374203 GAagtaGAGCAGAAGAAGAAGCG 134
EMX1-118 chr8 31096390 GctcCtGAGCAGAAGAAGAACAG 135
EMX1-119 chr2 66729772 agtTCaGAGCAGgAGAAGAATGG 136
EMX1-120 chr2 14472327 atGaaCagagAGAAGAAGAATGG 137
EMX1-121 chr8 140468447 GAGagCGAGagagAGAgagAGGG 138
EMX1-122 chr7 52204863 aAaaagGAGCAGAAGAAGAAGGA 139
EMX1-123 chr1 151027598 ttcTCCaAGCAGAAGAAGAAGAG 140
EMX1-124 chr1 35590719 GAGagaGAGagagAGAgaAAGGG 141
EMX1-125 chr1 106744880 ttGgaaagagAGAAGAAGAAGGG 142
EMX1-126 chr10 115484209 aAGaggaAGaAGAAGAAGAAGAG 143
EMX1-127 chr3 119686684 GAGagaGAGaAagAGAAagAGAG 144
EMX1-128 chr8 53295601 GAagaaGAGaAGAAGAAGAAGGG 145
EMX1-129 chr18 12032247 GAtTCtGAGaAaAttAAGAtGGG 146
EMX1-130 chr15 61383748 GgGctCcgGCAGAAGAtGccATG 147
EMX1-131 chr1 209298672 GAtTCCaAGCAatgGAgGAgGGG 148
EMX1-132 chr7 17446438 GtccaaGAGCAGgAGAAGAAGGG 149
EMX1-133 chr13 74473871 atcTggGAGCAGgAGAAGAAGGG 150
EMX1-134 chr5 5141237 GAGgatccGagGAtGtAGAAGGG 151
EMX1-135 chr12 5041728 GAagaaGAagAaAgaAAGAAAGA 152
EMX1-136 chr8 112756160 cAGagaGAGaAtAAGtAGcATAG 153
EMX1-137 chr8 17384135 tgaggaagagAGAAGAAGAAAGG 154
EMX1-138 chr12 4545932 cAagCatgagAGAAGAAGAtGGG 155
EMX1-139 chr10 58848728 GAGcaCGAGCAagAGAAGAAGGG 156
EMX1-140 chr14 48932119 GAGTCCcAGCAaAAGAAGAAAAG 157
EMX1-141 chr3 145057362 GAGTCCct-CAGgAGAAGAAAGG 158
EMX1-142 chr9 111348573 GAGTCCttG-AGAAGAAGgAAGG 159
표 1에 열거된 절단 사이트에서 측정된 count (동일한 5' 말단을 갖는 sequence reads의 개수), depth (특정 위치에서의 sequence reads 개수), %(count/depth) 및 C→T 변환이 일어난 reads 개수를 아래의 표 2에 나타내었다:
count depth %(count/depth) C to T conversion Group A Group B
(+) Base editor Untreated
EMX1-001
(on- target)		 21 51 41.2 6 0 v v
EMX1-002 21 39 53.8 8 0 v v
EMX1-003 22 41 53.7 0 0 v v
EMX1-004 36 79 45.6 10 0 v v
EMX1-005 29 68 42.6 1 0 v v
EMX1-006 26 62 41.9 9 0 v v
EMX1-007 10 29 34.5 0 0 v v
EMX1-008 24 86 27.9 0 0 v v
EMX1-009 44 159 27.7 10 0 v v
EMX1-010 11 41 26.8 0 0 v v
EMX1-011 50 109 45.9 N.A. N.A. v v
EMX1-012 15 43 34.9 1 0 v v
EMX1-013 16 46 34.8 0 0 v v
EMX1-014 22 64 34.4 0 1 v v
EMX1-015 16 53 30.2 0 0 v v
EMX1-016 19 63 30.2 1 0 v v
EMX1-017 24 82 29.3 N.A. N.A. v v
EMX1-018 24 85 28.2 0 0 v v
EMX1-019 14 50 28.0 N.A. N.A. v v
EMX1-020 10 36 27.8 0 0 v v
EMX1-021 13 47 27.7 0 0 v v
EMX1-022 13 48 27.1 1 0 v v
EMX1-023 10 37 27.0 N.A. N.A. v v
EMX1-024 11 42 26.2 0 0 v v
EMX1-025 15 58 25.9 N.A. N.A. v v
EMX1-026 11 43 25.6 0 0 v v
EMX1-027 16 67 23.9 N.A. N.A. v v
EMX1-028 10 44 22.7 N.A. N.A. v v
EMX1-029 10 45 22.2 0 0 v v
EMX1-030 14 63 22.2 0 0 v v
EMX1-031 13 61 21.3 0 0 v v
EMX1-032 13 61 21.3 N.A. N.A. v v
EMX1-033 14 66 21.2 0 0 v v
EMX1-034 14 53 26.4 2 0 v v
EMX1-035 9 48 18.8 0 0 - v
EMX1-036 8 46 17.4 1 0 - v
EMX1-037 8 51 15.7 0 0 - v
EMX1-038 6 42 14.3 0 0 - v
EMX1-039 7 22 31.8 1 0 - v
EMX1-040 7 22 31.8 N.A. N.A. - v
EMX1-041 7 23 30.4 0 0 - v
EMX1-042 7 25 28.0 0 0 - v
EMX1-043 6 23 26.1 0 0 - v
EMX1-044 7 27 25.9 N.A. N.A. - v
EMX1-045 8 35 22.9 N.A. N.A. - v
EMX1-046 9 40 22.5 0 0 - v
EMX1-047 8 38 21.1 N.A. N.A. - v
EMX1-048 5 24 20.8 0 0 - v
EMX1-049 7 34 20.6 0 0 - v
EMX1-050 8 40 20.0 0 0 - v
EMX1-051 6 30 20.0 N.A. N.A. - v
EMX1-052 10 51 19.6 N.A. N.A. - v
EMX1-053 12 63 19.0 0 0 - v
EMX1-054 7 37 18.9 N.A. N.A. - v
EMX1-055 12 64 18.8 N.A. N.A. - v
EMX1-056 8 43 18.6 N.A. N.A. - v
EMX1-057 5 27 18.5 1 0 - v
EMX1-058 9 49 18.4 N.A. N.A. - v
EMX1-059 13 71 18.3 N.A. N.A. - v
EMX1-060 10 55 18.2 0 0 - v
EMX1-061 10 55 18.2 N.A. N.A. - v
EMX1-062 5 28 17.9 N.A. N.A. - v
EMX1-063 5 28 17.9 N.A. N.A. - v
EMX1-064 7 40 17.5 N.A. N.A. - v
EMX1-065 13 76 17.1 0 0 - v
EMX1-066 5 30 16.7 0 0 - v
EMX1-067 5 30 16.7 0 0 - v
EMX1-068 6 36 16.7 N.A. N.A. - v
EMX1-069 19 115 16.5 N.A. N.A. - v
EMX1-070 6 37 16.2 N.A. N.A. - v
EMX1-071 9 56 16.1 N.A. N.A. - v
EMX1-072 15 94 16.0 N.A. N.A. - v
EMX1-073 11 70 15.7 N.A. N.A. - v
EMX1-074 7 45 15.6 0 0 - v
EMX1-075 9 59 15.3 N.A. N.A. - v
EMX1-076 9 59 15.3 N.A. N.A. - v
EMX1-077 5 33 15.2 0 0 - v
EMX1-078 14 93 15.1 N.A. N.A. - v
EMX1-079 6 40 15.0 N.A. N.A. - v
EMX1-080 11 75 14.7 N.A. N.A. - v
EMX1-081 6 42 14.3 N.A. N.A. - v
EMX1-082 6 43 14.0 0 0 - v
EMX1-083 6 43 14.0 N.A. N.A. - v
EMX1-084 7 50 14.0 N.A. N.A. - v
EMX1-085 7 50 14.0 N.A. N.A. - v
EMX1-086 5 36 13.9 N.A. N.A. - v
EMX1-087 7 51 13.7 N.A. N.A. - v
EMX1-088 7 51 13.7 N.A. N.A. - v
EMX1-089 6 44 13.6 0 0 - v
EMX1-090 10 74 13.5 0 0 - v
EMX1-091 12 89 13.5 N.A. N.A. - v
EMX1-092 5 37 13.5 N.A. N.A. - v
EMX1-093 7 52 13.5 N.A. N.A. - v
EMX1-094 6 45 13.3 N.A. N.A. - v
EMX1-095 6 46 13.0 N.A. N.A. - v
EMX1-096 11 85 12.9 0 0 - v
EMX1-097 6 47 12.8 0 0 - v
EMX1-098 5 39 12.8 N.A. N.A. - v
EMX1-099 6 48 12.5 N.A. N.A. - v
EMX1-100 6 48 12.5 N.A. N.A. - v
EMX1-101 8 64 12.5 N.A. N.A. - v
EMX1-102 7 57 12.3 N.A. N.A. - v
EMX1-103 6 50 12.0 N.A. N.A. - v
EMX1-104 7 59 11.9 0 0 - v
EMX1-105 6 51 11.8 0 0 - v
EMX1-106 9 77 11.7 N.A. N.A. - v
EMX1-107 8 69 11.6 N.A. N.A. - v
EMX1-108 5 43 11.6 N.A. N.A. - v
EMX1-109 5 43 11.6 N.A. N.A. - v
EMX1-110 7 61 11.5 N.A. N.A. - v
EMX1-111 7 61 11.5 N.A. N.A. - v
EMX1-112 5 44 11.4 0 0 - v
EMX1-113 5 44 11.4 0 0 - v
EMX1-114 7 62 11.3 0 0 - v
EMX1-115 6 53 11.3 0 0 - v
EMX1-116 8 71 11.3 N.A. N.A. - v
EMX1-117 6 53 11.3 N.A. N.A. - v
EMX1-118 6 54 11.1 0 0 - v
EMX1-119 5 45 11.1 0 0 - v
EMX1-120 5 46 10.9 0 0 - v
EMX1-121 6 55 10.9 0 0 - v
EMX1-122 6 55 10.9 N.A. N.A. - v
EMX1-123 8 75 10.7 0 0 - v
EMX1-124 6 56 10.7 N.A. N.A. - v
EMX1-125 7 66 10.6 N.A. N.A. - v
EMX1-126 5 47 10.6 N.A. N.A. - v
EMX1-127 5 47 10.6 N.A. N.A. - v
EMX1-128 8 76 10.5 N.A. N.A. - v
EMX1-129 5 48 10.4 0 0 - v
EMX1-130 5 48 10.4 0 0 - v
EMX1-131 5 48 10.4 0 0 - v
EMX1-132 5 48 10.4 1 0 - v
EMX1-133 5 48 10.4 N.A. N.A. - v
EMX1-134 7 68 10.3 0 0 - v
EMX1-135 6 59 10.2 N.A. N.A. - v
EMX1-136 5 49 10.2 N.A. N.A. - v
EMX1-137 7 69 10.1 N.A. N.A. - v
EMX1-138 5 50 10.0 0 0 - v
EMX1-139 5 50 10.0 0 0 - v
EMX1-140 7 44 15.9 0 0 - v
EMX1-141 5 40 12.5 1 0 - v
EMX1-142 6 49 12.2 1 0 - v
(N.A.: not applicable because there are no cytosines to be deaminated at these sites)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, BE-3 처리된 유전체 DNA 또는 손상되지 않은 (BE-3 미처리) 유전체 DNA를 사용하여 얻은 WGS 데이터에서 142개의 그룹 B 위치들 중 16개 위치 (BE-3 처리군) 또는 1개 위치(BE-3 미처리군)에서 C→T 변환이 각각 관찰되었다. 이들 위치들 중 70 개 위치는 BE3-매개 디아미네이션의 window인 4 내지 8 번 위치 (5'에서 3' 방향으로 1 내지 20번으로 넘버링됨)에 시토신을 갖지 않는다 (표 2에서 N.A.로 표시).
Digenome-seq에 의해 확인된 그룹 A와 그룹 B 사이트의 일부에서의 비표적 효과(off-target effect)를 확인하기 위하여, HEK293T 세포에서 targeted deep sequencing을 수행하고, BE3-유도 염기교정 빈도와 Cas9-유도 indel 빈도를 측정하여, 하기의 표 3에 나타내었다:
Validation by NGS
Indel frequency (%) Base editing frequency (%)
(-) Cas9 (+) Cas9 Validation (-) BE3 (+) BE3 Validation
EMX1-001
(on- target)		 0.15 61.59 Validated 0.10 49.33 Validated
EMX1-002 0.01 0.01 Invalidated 0.16 1.05 Validated
EMX1-003 0.00 7.94 Validated 0.24 4.04 Validated
EMX1-004 0.00 0.01 Validated 0.16 0.93 Validated
EMX1-005 0.00 8.63 Validated 0.05 2.47 Validated
EMX1-006 0.29 38.25 Validated 0.04 15.59 Validated
EMX1-007 0.01 0.01 Invalidated 0.08 0.13 Validated
EMX1-008 0.02 0.17 Validated 0.03 0.62 Validated
EMX1-009 0.10 3.45 Validated 0.02 0.15 Validated
EMX1-010 0.08 0.08 Invalidated 0.07 0.70 Validated
EMX1-034 0.00 0.00 Invalidated 0.33 0.40 Invalidated
EMX1-035 0.46 0.89 Validated 0.23 0.48 Validated
EMX1-036 0.01 0.02 Invalidated 0.09 0.31 Validated
EMX1-037 0.01 0.23 Validated 0.20 0.23 Validated
EMX1-038 0.01 0.01 Invalidated 0.14 0.16 Validated
EMX1-140 0.01 0.00 Invalidated 0.38 0.36 Invalidated
EMX1-141 0.00 0.00 Invalidated 0.30 0.37 Invalidated
EMX1-142 0.01 0.01 Invalidated 0.19 0.17 Invalidated
표 3에 나타난 바와 같이, 총 18 개 사이트를 분석하였으며, EMX1 on-target site를 포함한 14 개 사이트에서 시퀀싱 에러에 의한 noise 수준 (0.002~0.38%) 이상의 빈도로 BE3에 의한 점돌연변이가 일어남을 관찰하였다 (유효성 확인 비율 78%). BE3는 background noise 수준보다 낮은 빈도로 다른 BE3-관련 Digenome-양성 사이트에서 변이를 유도하는 것이 가능하다. 중요한 것은, 상기 방법에 의하여 0.13% 이하의 빈도로 염기 교정이 검출되는 BE3 비표적 위치의 확인이 가능하다는 것이며, 이는 Digenome-seq가 매우 민감한 방법임을 보여준다. EMX1에 특이적인 Cas9 뉴클레아제는 노이즈 수준 이상의 빈도로 18 개 위치 중 9 개 위치에서 indels를 유도하며, 이는 BE3 및 Cas9 비표적 위치가 종종 다르다는 것을 보여준다. 종합하면, 이러한 결과는 BE3 비표적 위치가 Digenome-seq 데이터를 사용하여 확인될 수 있음을 보여준다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> METHOD OF IDENTIFYING GENOME-WIDE OFF-TARGET SITES OF BASE EDITORS BY DETECTING SINGLE STRAND BREAKS IN GENOMIC DNA <130> DPP20176864KR <150> 62/446,951 <151> 2017-01-17 <160> 159 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of crRNA <400> 1 guuuuagagc ua 12 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-terminal part of crRNA <400> 2 ugcuguuuug 10 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of tracrRNA <400> 3 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 4 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 from Streptococcus pyogenes <400> 4 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1365 <210> 5 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9-coding sequence <400> 5 atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggtacca acagcgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgc 120 cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggcga gaccgccgag 180 gccacccgcc tgaagcgcac cgcccgccgc cgctacaccc gccgcaagaa ccgcatctgc 240 tacctgcagg agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccaccgc 300 ctggaggaga gcttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcgccaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcgcaag 420 aagctggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcgcctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccgcggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgagcg cccgcctgag caagagccgc 660 cgcctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgag cgacgccatc 900 ctgctgagcg acatcctgcg cgtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgccagc 960 atgatcaagc gctacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgc 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc cagccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgcgagga cctgctgcgc 1200 aagcagcgca ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc gccgccagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg cgagaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ccctggcccg cggcaacagc 1380 cgcttcgcct ggatgacccg caagagcgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440 gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcgcaagcc cgccttcctg 1620 agcggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgacag cgtggagatc 1740 agcggcgtgg aggaccgctt caacgccagc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860 ctgaccctga ccctgttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctacgcc 1920 cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc gccgctacac cggctggggc 1980 cgcctgagcc gcaagcttat caacggcatc cgcgacaagc agagcggcaa gaccatcctg 2040 gacttcctga agagcgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtga gcggccaggg cgacagcctg 2160 cacgagcaca tcgccaacct ggccggcagc cccgccatca agaagggcat cctgcagacc 2220 gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggccgcc acaagcccga gaacatcgtg 2280 atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacag ccgcgagcgc 2340 atgaagcgca tcgaggaggg catcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa ggagcacccc 2400 gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgc 2460 gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aaccgcctga gcgactacga cgtggaccac 2520 atcgtgcccc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtgct gacccgcagc 2580 gacaagaacc gcggcaagag cgacaacgtg cccagcgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc gccagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcgcaagtt cgacaacctg 2700 accaaggccg agcgcggcgg cctgagcgag ctggacaagg ccggcttcat caagcgccag 2760 ctggtggaga cccgccagat caccaagcac gtggcccaga tcctggacag ccgcatgaac 2820 accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgcgaggtga aggtgatcac cctgaagagc 2880 aagctggtga gcgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccgcaagcgc 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgcgacttc 3240 gccaccgtgc gcaaggtgct gagcatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttcagcaa ggagagcatc ctgcccaagc gcaacagcga caagctgatc 3360 gcccgcaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420 tacagcgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaaga gcaagaagct gaagagcgtg 3480 aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cgcagcagct tcgagaagaa ccccatcgac 3540 ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600 tacagcctgt tcgagctgga gaacggccgc aagcgcatgc tggccagcgc cggcgagctg 3660 cagaagggca acgagctggc cctgcccagc aagtacgtga acttcctgta cctggccagc 3720 cactacgaga agctgaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttcag caagcgcgtg 3840 atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca ccgcgacaag 3900 cccatccgcg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960 cccgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac cagcaccaag 4020 gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gtctgtacga gacccgcatc 4080 gacctgagcc agctgggcgg cgactaa 4107 <210> 6 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APOBEC-1 from Rattus norvegicus <400> 6 Met Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg 1 5 10 15 Arg Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu 20 25 30 Arg Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His 35 40 45 Ser Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val 50 55 60 Asn Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr 65 70 75 80 Arg Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys 85 90 95 Ser Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu 100 105 110 Phe Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg 115 120 125 Gln Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met 130 135 140 Thr Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser 145 150 155 160 Pro Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg 165 170 175 Leu Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys 180 185 190 Leu Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile 195 200 205 Ala Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp 210 215 220 Ala Thr Gly Leu Lys 225 <210> 7 <211> 5148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BE3 coding sequence <400> 7 catcatcatc atcatcacat gtcttctgaa accggtccgg ttgcggttga cccgaccctg 60 cgtcgtcgta tcgaaccgca cgaattcgaa gttttcttcg acccgcgtga actgcgtaaa 120 gaaacctgcc tgctgtacga aatcaactgg ggtggtcgtc actctatctg gcgtcacacc 180 tctcagaaca ccaacaaaca cgttgaagtt aacttcatcg aaaaattcac caccgaacgt 240 tacttctgcc cgaacacccg ttgctctatc acctggttcc tgtcttggtc tccgtgcggt 300 gaatgctctc gtgcgatcac cgaattcctg tctcgttacc cgcacgttac cctgttcatc 360 tacatcgcgc gtctgtacca ccacgcggac ccgcgtaacc gtcagggtct gcgtgacctg 420 atctcttctg gtgttaccat ccagatcatg accgaacagg aatctggtta ctgctggcgt 480 aacttcgtta actactctcc gtctaacgaa gcgcactggc cgcgttaccc gcacctgtgg 540 gttcgtctgt acgttctgga actgtactgc atcatcctgg gtctgccgcc gtgcctgaac 600 atcctgcgtc gtaaacagcc gcagctgacc ttcttcacca tcgcgctgca gtcttgccac 660 taccagcgtc tgccgccgca catcctgtgg gcgaccggtc tgaaatccgg tagcgaaaca 720 ccggggactt cagaatcggc caccccggag tctgataaga aatactcaat aggcttagct 780 atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa 840 aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc cacagtatca aaaaaaatct tataggggct 900 cttttatttg acagtggaga gacagcggaa gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga 960 aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt tatctacagg agattttttc aaatgagatg 1020 gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac 1080 aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag 1140 aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa aaattggtag attctactga taaagcggat 1200 ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt 1260 gagggagatt taaatcctga taatagtgat gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa 1320 acctacaatc aattatttga agaaaaccct attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg 1380 attctttctg cacgattgag taaatcaaga cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc 1440 ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct 1500 aattttaaat caaattttga tttggcagaa gatgctaaat tacagctttc aaaagatact 1560 tacgatgatg atttagataa tttattggcg caaattggag atcaatatgc tgatttgttt 1620 ttggcagcta agaatttatc agatgctatt ttactttcag atatcctaag agtaaatact 1680 gaaataacta aggctcccct atcagcttca atgattaaac gctacgatga acatcatcaa 1740 gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc 1800 ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca ggttatattg atgggggagc tagccaagaa 1860 gaattttata aatttatcaa accaatttta gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg 1920 gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt 1980 ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat gctattttga 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ttaaagaaga cattcaaaaa 2880 gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta catgaacata ttgcaaattt agctggtagc 2940 cctgctatta aaaaaggtat tttacagact gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta 3000 atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact 3060 caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa 3120 ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag 3180 ctctatctct attatctcca aaatggaaga gacatgtatg tggaccaaga attagatatt 3240 aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac attgttccac aaagtttcct taaagacgat 3300 tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt 3360 ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa aactattgga gacaacttct aaacgccaag 3420 ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa 3480 cttgataaag ctggttttat caaacgccaa ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat 3540 gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat actaaatacg atgaaaatga taaacttatt 3600 cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc 3660 caattctata aagtacgtga gattaacaat taccatcatg 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sequence <400> 146 gattctgaga aaattaagat ggg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-130 off-target sequence <400> 147 gggctccggc agaagatgcc atg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-131 off-target sequence <400> 148 gattccaagc aatggaggag ggg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-132 off-target sequence <400> 149 gtccaagagc aggagaagaa ggg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-133 off-target sequence <400> 150 atctgggagc aggagaagaa ggg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-134 off-target sequence <400> 151 gaggatccga ggatgtagaa ggg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-135 off-target sequence <400> 152 gaagaagaag aaagaaagaa aga 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-136 off-target sequence <400> 153 cagagagaga ataagtagca tag 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-137 off-target sequence <400> 154 tgaggaagag agaagaagaa agg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-138 off-target sequence <400> 155 caagcatgag agaagaagat ggg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-139 off-target sequence <400> 156 gagcacgagc aagagaagaa ggg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-140 off-target sequence <400> 157 gagtcccagc aaaagaagaa aag 23 <210> 158 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-141 off-target sequence <400> 158 gagtccctca ggagaagaaa gg 22 <210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1-142 off-target sequence <400> 159 gagtccttga gaagaaggaa gg 22

Claims (15)

  1. 삭제
  2. (i) 시티딘 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자, 및 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;
    (ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및
    (iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계
    를 포함하고,
    상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질이고,
    상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 5개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 10% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것이고,
    시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,
    단계 (i)의 세포로부터 분리된 DNA는 유전체 DNA이고,
    단계 (ii)의 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱에 의하여 수행되는 것인,
    시티딘 디아미나제의 염기 교정 위치 확인 방법.
  3. (i) 시티딘 디아미나제 또는 이의 암호화 유전자, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이의 암호화 유전자, 및 가이드 RNA 또는 이의 암호화 유전자를 세포에 도입하거나 세포로부터 분리된 DNA에 접촉시켜 DNA 단일 가닥 절단을 유도하는 단계;
    (ii) 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편의 핵산 서열을 분석하는 단계; 및
    (iii) 상기 분석에 의여 수득된 핵산 서열 데이터로부터 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계
    를 포함하고,
    상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실한 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질이고,
    상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 5개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 10% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것이고,
    시험관 내 (in vitro)에서 수행되고,
    단계 (i)의 세포로부터 분리된 DNA는 유전체 DNA이고,
    단계 (ii)의 핵산 서열 분석은 전체 유전체 시퀀싱에 의하여 수행되는 것인,
    시티딘 디아미나제의 비표적 위치 (off-target site) 확인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질의,
    (1) D10, H840, 또는 D10 및 H840;
    (2) D1135, R1335, 및 T1337로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는
    (3) 상기 (1) 및 (2)의 아미노산 잔기 모두
    가 야생형과 다른 아미노산으로 치환된 것인, 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA, 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)인, 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 시티딘 디아미나제는 APOBEC　(apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like), AID (activation-induced cytidine deaminase), CDA (cytidine deaminase), 또는 이들이 조합인, 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 시티딘 디아미나제 및 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제는
    융합단백질 형태,
    시티딘 디아미나제 또는 이를 암호화하는 mRNA와, 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 mRNA의 혼합물 형태, 또는
    시티딘 디아미나제 암호화 유전자와 불활성화된 표적특이적 엔도뉴클레아제 암호화 유전자를 각각 또는 함께 포함하는 플라스미드 형태
    로 사용되는 것인, 방법
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 우라실-특이적 제거 시약 (Uracil-Specific Excision Reagent; USER)를 사용하지 않고,
    상기 우라실-특이적 제거 시약은 우라실 DNA 글라이코실라제 (Uracil DNA glycosylase; UDG), 엔도뉴클레아제 VIII, 및 이들의 조합인,
    방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단일 가닥 절단 위치를 확인하는 단계는 상기 단일 가닥 절단된 DNA 절편을 수직 정렬하여 동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 수가 10개 이상이고, %([동일한 5' 말단을 갖는 서열 리드의 개수]/[특정 위치에서의 sequence reads 개수])가 20% 이상인 위치에 대하여 수행하는 것인,
    방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제3항에 있어서, 상기 단계 (iii) 이후에,
    (iv) 상기 절단 위치가 표적 위치 (on-target site)가 아닌 경우, 비표적 위치 (off-target site)로 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서,
    상기 비표적 위치는 다음 중 하나 이상에 해당하는 것인, 방법:
    DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 PAM 서열을 포함;
    DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 표적 위치의 서열과 15개 이하의 불일치 뉴클레오타이드를 포함; 및
    DNA 절편 중 절단이 일어난 가닥과 상보적 가닥이 하나 이상의 시토신(C)의 우라실(U) 또는 티민 (T)으로의 변환을 포함.
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