KR102076619B1 - 생체 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법 - Google Patents

생체 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는, 생체 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법으로, 폴리머칩 내부의 채널에 로드를 삽입한 후, 상기 채널과 로드 사이에 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 주입하여 인공 조직 칩을 제조하고, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널에 반복적으로 로드를 삽입 및 제거하거나 세포를 부착하는 간단한 방식으로 다중 레이어 튜브 구조체를 제작할 수 있어, 시간 및 비용 측면에서 효율적이다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체는 단계별로 주입된 세포접착물질, 세포 또는 이들의 혼합물이 서로 섞이지 않고, 주입된 순서에 따라 각각의 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성하며, 상기 구조는 칩 내에 안정하게 고정된 상태로 유지되어, 다중 레이어 구조인 생체 조직을 모사하여 세포 메커니즘 연구, 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구에 활용 가능하다.

Description

생체 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법 {METHOD FOR PREPARING A THREE-DIMENSIONAL MULTI-LAYER TUBE STRUCTURE TO MIMIC LIVING TISSUE}
본 명세서에는 생체 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법이 개시된다.
살아있는 세포를 기반으로 하는 분석기술은 다양한 기초연구를 비롯해 신약 개발 및 약동력학 시험에서 주요하게 활용되고 있다. 세포 기반 분석기술은 기존의 생화학적 분석이나 실험동물 모델을 이용한 분석방법과 대비하여 인간 생체모사 측면에서 뛰어나며, 기간과 비용 면에서 경제적이어서 관련 업계의 수요가 증대되는 추세이다. 또한 세포 기반 분석기술은 생체 외 분석임에도 불구하고 세포성 보조인자를 통한 약물 투과성 측정 등 인체 내 환경을 반영한 약물 특성 및 효능을 연구할 수 있어 약물반응과 관련한 전체적 분자 메커니즘의 연구가 가능한 장점이 있다.
이러한 장점 때문에 세포 기반 분석기술은 날로 발전하고 있으며, 2차원 세포 기반 분석기술의 한계 극복을 위해 콜라겐, 세포외 기질, 하이드로젤 등을 포함한 스캐폴드 구조를 사용해 배양한 3차원 세포를 기반으로 생체 내 환경 또는 질병 상태를 보다 정확히 모사하는 3차원 세포기반 분석기술의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히, 생체 내에서 3차원 접촉을 하고 있는 뉴런(neuron) 및 신경줄기세포(neural stem cell)를 가지는 뇌조직세포의 경우 상기 2차원 세포배양모델의 한계로 인해서, 살아있는 조직의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 잘 모사하는 3차원 세포배양모델에 대한 관심이 높아지고 있다. 3차원 세포배양모델은 생체 내 상태를 잘 모방하므로 생체 외 실험에서 방향적 성장과 세포-세포 연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 더불어 2차원 세포배양모델에 비하여 개선된 세포 생존과 향상된 신경줄기세포 분화를 보여준다. 따라서, 3차원 세포배양모델은 분자 기반의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원 세포배양모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전과 약물 반응을 잘 포착하는데 유용하다.
이러한 3차원 세포배양, 즉 3차원 인공 조직 제조방법으로 콜라겐-세포 시트를 제작한 후, 자동 튜브 제조 (ATF, automated tube fabricator) 장비에 넣은 후 자동적으로 시트를 말아 튜브 구조를 제작하는 등 특정 장비를 이용하여 제조하는 기술이 개발되었으나, 상기 ATF 장비를 비롯한 기타 장비들은 가격이 비싸고 복잡한 구조를 가진다. 또한, 튜브 제조 중에 시트의 접착을 위해 추가적으로 피브린이 사용되는데, 이는 제작 비용을 증가시키고, 조건 최적화에 많은 시간이 소요되며, 오히려 레이어간의 융합(fusion)을 방해할 수 있다는 단점이 있다. 나아가, 종래 3차원 인공 조직 제조기술은 보통 생체 이식을 목적으로 하는 인공 조직을 제조하는 데에 그칠 뿐이다.
따라서 본 발명자들은 비용 및 시간 효율적으로 생체 조직을 모사하는 다중 레이어 튜브 구조체를 제조하기 위한 방법을 개발하고자 하였다.
Rebeen Othmand, et al., An automated fabrication strategy to create tubular architectures at cell and tissue scales, Biofabrication (2015)
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 2 이상의 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물이 각각 층을 이루는 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 2 이상의 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물이 각각 층을 이루는 다중 레이어 튜브 구조체에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인공 조직 제조방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 챔버(20), 상기 챔버(20)를 관통하는 제 1 채널(30) 및 상기 제 1 채널(30)에 삽입된 제 1 로드(40)를 포함하는 폴리머칩(10)의 상기 챔버(20)에 제 1 제제를 주입한 후, 상기 제 1 제제를 고형화하여 인공 조직 칩(2)을 제조하는 단계; 상기 인공 조직 칩(2)에서 상기 제 1 로드(40)를 제거하여 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 제 2 채널(50)을 형성하는 단계; 및 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널 내부에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널(70)을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계는 1회 이상 반복하고, 상기 제 1 제제는 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물이고, 상기 제 2 제제는 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물인, 다중 레이어(multi-layer) 튜브 구조체(1) 제조방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체(1)를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체(1)에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인공 조직 제조방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 제 1 채널(30)을 포함하는 폴리머칩(10); 제 1 로드(40) 및 상기 제 1 로드보다 작은 직경을 갖는 하나 이상의 제 2 로드(60); 및 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하는 제 1 제제, 및 제 2 제제;를 포함하고, 상기 제 2 로드(60)가 2 이상인 경우, 제 2 로드의 직경의 길이는 서로 다른, 다중 레이어 튜브 구조체 제조 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 제 1 채널(30)을 포함하는 폴리머칩(10); 제 1 로드(40); 및 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하는 제 1 제제, 및 세포를 포함하는 제 2 제제;를 포함하는, 다중 레이어 튜브 구조체 제조 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 폴리머칩 내부의 채널에 로드를 삽입한 후, 상기 채널과 로드 사이에 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 주입하여 인공 조직 칩을 제조하고, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널에 반복적으로 로드를 삽입 및 제거하거나 세포를 부착하는 간단한 방식으로 다중 레이어 튜브 구조체를 제작할 수 있어, 고가의 장비 내지 고도의 프로그래밍 및 조건 최적화 과정이 필요하지 않아 시간 및 비용 측면에서 효율적이다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체는 단계별로 주입된 세포접착물질, 세포 또는 이들의 혼합물이 서로 섞이지 않고, 주입된 순서에 따라 각각의 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성하며, 상기 구조는 칩 내에 안정하게 고정된 상태로 유지된다. 따라서, 상기 다중 레이어 튜브 구조체는 다중 레이어 구조인 생체 조직을 모사함으로써 세포 메커니즘 연구를 비롯해 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구에 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체의 제조과정을 예시적으로 나타낸 것이다(도 1의 부호가 나타내는 바는 다음과 같다. 10: 폴리머칩, 20: 챔버, 30: 제 1 채널, 40: 제 1 로드, 2: 인공 조직 칩, 3: 제 1 레이어, 50: 제 2 채널, 60: 제 2 로드, 5: 제 2 레이어, 70: 제 3 채널, 7: 제 3 레이어).
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체를 개략적으로 나타낸 개념도이고, 도 2b는 무세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체의 단면을 개략적으로 나타낸 것이다(도 2a 및 도 2b의 부호가 나타내는 바는 다음과 같다. 1: 다중 레이어 튜브 구조체, 3: 제 1 레이어, 5: 제 2 레이어, 7: 제 3 레이어).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경(Confocal microscope)을 이용하여 촬영한 사진이며, 도 3b는 상기 도 3a의 확대도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체를 개략적으로 나타낸 개념도이고, 도 4b는 유세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체의 단면을 개략적으로 나타낸 것이다(도 4a 및 도 4b의 부호가 나타내는 바는 다음과 같다. 1: 다중 레이어 튜브 구조체, 3: 제 1 레이어, 5: 제 2 레이어, 7: 제 3 레이어).
도 5a 내지 도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경을 이용하여 촬영한 사진으로, 도 5a는 제 1 혼합물 주입 후, 도 5b는 제 2 혼합물 주입 후, 도 5c는 제 3 혼합물 주입 후의 구조체 사진이며, 도 5d는 제 3 혼합물 주입 후 최종적으로 제조된 구조체의 단면 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 다중 레이어 튜브 구조체의 제조과정을 예시적으로 나타낸 것이다(도 6의 부호가 나타내는 바는 다음과 같다. 10: 폴리머칩, 20: 챔버, 30: 제 1 채널, 40: 제 1 로드, 2: 인공 조직 칩, 3: 제 1 레이어, 50: 제 2 채널, 5: 제 2 레이어, 70: 제 3 채널, 7: 제 3 레이어, 80: 제 4 채널, 9: 제 4 레이어, 90: 제 5 채널).
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 다중 레이어 튜브 구조체를 개략적으로 나타낸 개념도이고, 도 7b는 세포 다중 레이어 튜브 구조체의 단면을 개략적으로 나타낸 것이다(도 7a의 부호가 나타내는 바는 다음과 같다. 1: 다중 레이어 튜브 구조체, 3: 제 1 레이어, 5: 제 2 레이어, 7: 제 3 레이어, 9: 제 4 레이어). 본 발명의 일 실시예로서, 실시예 3에 따르면, 상기 도 7b의 세포 A는 본 발명의 실시예 3의 성상교세포, 세포 B는 혈관주위세포, 세포 C는 뇌혈관내피세포에 해당한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경을 이용하여 촬영한 사진으로, 왼쪽부터 순서대로 성상교세포층(1st), 혈관주위세포층(2nd) 및 뇌혈관내피세포층(3rd) 각각의 형광이 발현된 사진이고, 가장 오른쪽 사진(Merge)은 상기 3종의 세포층의 형광이 모두 발현되도록 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경을 이용하여 촬영한 사진으로, 왼쪽부터 순서대로 성상교세포층(1st), 성상교세포층 및 혈관주위세포층(2nd), 및 성상교세포층, 혈관주위세포층 및 뇌혈관세포층(3nd) 각각의 형광이 발현된 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 챔버(20), 상기 챔버(20)를 관통하는 제 1 채널(30) 및 상기 제 1 채널(30)에 삽입된 제 1 로드(40)를 포함하는 폴리머칩(10)의 상기 챔버(20)에 제 1 제제를 주입한 후, 상기 제 1 제제를 고형화하여 인공 조직 칩(2)을 제조하는 단계; 상기 인공 조직 칩(2)에서 상기 제 1 로드(40)를 제거하여 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 제 2 채널(50)을 형성하는 단계; 및 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널 내부에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널(70)을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계는 1회 이상 반복하고, 상기 제 1 제제는 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물이고, 상기 제 2 제제는 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물인, 다중 레이어(multi-layer) 튜브 구조체 제조방법을 제공한다.
상기 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 2 제제가 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물인 경우, 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계는 상기 제 2 채널(50)을 형성하는 단계 수행 후 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널보다 작은 직경을 갖는 제 2 로드(60)를 삽입하고, 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 존재하는 채널과 제 2 로드(60) 사이에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하는 단계; 및 상기 인공 조직 칩(2)에서 상기 제 2 로드(60)를 제거하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널(70)을 형성하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 2 제제가 세포인 경우, 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계는 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 주입된 제 2 제제를 부착하는 단계를 포함하고, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복하여 수행할 때 상기 제 2 제제 주입 전 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 세포접착물질을 주입 및 고형화하는 것일 수 있다.
또한, 상기 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계 수행 후 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 제 3 채널(70)에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 주입된 제 2 제제를 고형화 또는 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체는 단계별로 주입된 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물이 서로 섞이지 않고, 주입된 순서에 따라 각각의 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성하는 3차원 구조체로서, 상기 구조체는 인공 조직 칩 내에 안정하게 고정된 상태로 유지되며, 다중 레이어 구조인 생체 조직을 모사하여 세포 메커니즘 연구 외에도 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트에 활용 가능하다. 상기 다중 레이어 튜브 구조체는 생체 조직, 예를 들어 혈관 조직, 피부 조직 등을 모사하는 3차원 형태라면 그 형태는 제한되지 않으며, 구체적으로 내부에 다중 레이어의 원통형 내지 비정형 기둥 형태를 가질 수 있다. 또한, 상기 다중 레이어 튜브 구조체는 내부에 채널(channel)을 가질 수 있고, 또는 내부 채널이 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물로 채워져 있을 수 있다.
본 발명의 고형화는 세포접착물질을 포함하는 제제(제 1 제제 또는 제 2 제제)를 고형화하는 것을 의미하고, 상기 고형화는 교화(gelation)일 수 있고, 10분 내지 60분 동안 수행될 수 있으며, 구체적으로, 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 25분 이상, 30분 이상, 35분 이상, 40분 이상, 45분 이상 또는 50분 이상 수행될 수 있고, 60분 이하, 55분 이하, 50분 이하, 45분 이하, 40분 이하, 35분 이하, 30분 이하, 25분 이하 또는 20분 이하 동안 수행될 수 있다. 또한 상기 고형화의 온도 조건은 30 내지 45℃ 일 수 있고, 구체적으로 30℃ 이상, 32℃ 이상, 34℃ 이상, 36℃ 이상, 37℃ 이상, 38℃ 이상, 40℃ 이상, 42℃ 이상 또는 44℃ 이상일 수 있고, 45℃ 이하, 44℃ 이하, 42℃ 이하, 40℃ 이하, 38℃ 이하, 37℃ 이하, 36℃ 이하, 34℃ 이하 또는 32℃ 이하일 수 있다. 또한, 상기 고형화 수행 시의 CO2 농도는 1 내지 10%일 수 있고, 구체적으로, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상 또는 9% 이상일 수 있고, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하 또는 2% 이하일 수 있다.
본 발명의 부착은 세포를 포함하는 제제(제 2 제제)를 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널의 내부에 부착시키는 것을 의미하고, 상기 부착은 세포를 배양하는 것일 수 있으며, 배양은 5분 내지 60분 동안 수행될 수 있고, 구체적으로, 5분 이상, 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 25분 이상, 30분 이상, 35분 이상, 40분 이상, 45분 이상 또는 50분 이상 수행될 수 있고, 60분 이하, 55분 이하, 50분 이하, 45분 이하, 40분 이하, 35분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 20분 이하, 15분 이하 또는 10분 이하 동안 수행될 수 있다. 또한 상기 배양의 온도 조건은 30 내지 45℃ 일 수 있고, 구체적으로 30℃ 이상, 32℃ 이상, 34℃ 이상, 36℃ 이상, 37℃ 이상, 38℃ 이상, 40℃ 이상, 42℃ 이상 또는 44℃ 이상일 수 있고, 45℃ 이하, 44℃ 이하, 42℃ 이하, 40℃ 이하, 38℃ 이하, 37℃ 이하, 36℃ 이하, 34℃ 이하 또는 32℃ 이하일 수 있다.
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 챔버(20), 상기 챔버(20)를 관통하는 제 1 채널(30) 및 상기 제 1 채널(30)에 삽입된 제 1 로드(40)를 포함하는 폴리머칩(10)의 상기 챔버(20)에 제 1 제제를 주입한 후, 상기 제 1 제제를 고형화하여 인공 조직 칩(2)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리머칩(10)은 펀치(punch)를 이용하여 챔버(chamber)(20)를 만들 수 있는 폴리머로 된 3차원 구조의 칩, 또는 챔버(20)를 포함하고 있는 폴리머로 된 3차원 구조의 칩이라면 종류 및 형태에 관계없이 사용 가능하다. 상기 폴리머칩을 이루는 재료는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 폴리디메틸실록산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리머칩의 형태는 3차원 구조라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 직육면체형을 예로 들 수 있다. 상기 폴리머칩의 크기는 본 발명의 제조방법에 따라 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있는 것이라면 제한되지 않고, 구체적으로는 45 mm x 35 mm x 4 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리머칩(10)은 챔버(20), 상기 챔버(20)를 관통하는 제 1 채널(30) 및 상기 제 1 채널(30)에 삽입된 제 1 로드(40)를 포함할 수 있다. 상기 챔버(20)는 폴리머칩(10)에 펀치를 이용하여 만든 챔버일 수 있다. 상기 챔버(20)의 크기는 세포접착물질 용액, 또는 세포접착물질과 세포 현탁액의 혼합물을 주입하여 3차원의 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있는 것이라면 제한되지 않고, 구체적으로는 그 단면이 10 mm x 4 mm 일 수 있다. 또한, 상기 챔버(20)의 형태는 3차원 구조라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 직육면체형을 예로 들 수 있다. 상기 제 1 채널(30)은 상기 챔버(20)를 관통할 수 있고, 나아가 폴리머칩(10) 및 챔버(20)를 관통할 수 있으며, 3차원 구조라면 그 형태는 제한되지 않으며, 구체적으로는 원통형일 수 있으며, 직경은 3차원 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있는 크기라면 제한되지 않는다. 상기 제 1 채널(30)에는 제 1 로드(40)가 삽입될 수 있고, 상기 제 1 로드(40)의 형태는 3차원 구조라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 상기 제 1 채널(30)의 형태와 같거나 다를 수 있으며, 보다 구체적으로는 원통형일 수 있다. 상기 제 1 로드(40)의 직경은 상기 제 1 채널(30)의 직경과 동일하거나 더 작을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 제 1 로드(40)의 길이는 상기 제 1 채널(30), 및 제 1 로드(40)가 삽입되는 방향의 폴리머칩(10)의 길이보다 더 길 수 있고, 상기 제 1 로드(40)의 재료는 제 1 로드 제거 시 고형화된 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물이 제 1 로드에 부착되지 않는 물질이라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 금속일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테인리스(stainless, stainless steel), 알루미늄(aluminium), 티타늄(titanium) 등일 수 있으며, 제 1 로드는 예를 들어 스테인리스 니들(needle)일 수 있다.
본 발명의 제 1 제제는 상기 챔버(20), 제 1 채널(30) 및 제 1 로드(40)를 포함하는 폴리머칩(10)의 챔버(20)에 주입되는 것으로, 상기 제 1 제제는 주입 후 고형화될 수 있는 생체 적합성 물질이라면 그 종류에 제한되지 않으며, 구체적으로 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물일 수 있다.
상기 인공 조직 칩 제조 단계는 제 1 제제로 이루어진 인공 조직 칩(2)을 제조하는 단계일 수 있으며, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법을 통해 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 주입된 세포접착물질, 세포, 또는 이들의 혼합물 각각이 서로 섞이지 않고, 주입된 순서에 따라 각각이 단일의 층을 이루는 다중 레이어 튜브 구조체를 형성할 수 있다.
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 인공 조직 칩(2)에서 상기 제 1 로드(40)를 제거하여 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 제 2 채널(50)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 챔버(20), 상기 챔버(20)를 관통하는 제 1 채널(30) 및 상기 제 1 채널(30)에 삽입된 제 1 스테인리스 니들(40)을 포함하는 PDMS 칩(10)의 상기 챔버(20)에 제 1 제제로 제 1 콜라겐 용액(실시예 1 및 3) 또는 제 1 콜라겐 용액과 성상교세포가 혼합된 제 1 혼합물(실시예 2)을 주입하고 이를 고형화한 다음에, 상기 제 1 채널(30)에서 상기 제 1 스테인리스 니들(40)을 제거하였을 때, 상기 콜라겐 또는 제 1 혼합물로 이루어진 인공 조직 칩(2) 내부에 상기 제 1 채널에 삽입한 제 1 니들의 크기만큼 제 2 채널(50)이 형성되었으며, 상기 제 2 채널(50)을 포함하는 인공 조직 칩(2)의 내부에 제 1 제제로 이루어진 단일 레이어(3)가 생성됨을 확인하였다(실시예 1 내지 3).
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널 내부에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널(70)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널은 상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계 및 제 2 채널을 형성하는 단계를 수행하여 얻어진 제 2 채널(50)일 수 있고, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법의 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 수행하여 얻어진 제 3 채널(70)일 수 있으며, 또는 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법의 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 이상 수행하여 얻어진 제 3 채널(실시예 3의 제 4 채널(80) 또는 제 5 채널(90))일 수 있다.
본 발명의 제 2 제제는 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널과 제 2 로드(60) 사이, 또는 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널 내부에 주입되는 것으로, 상기 제 2 제제는 주입 후 고형화 또는 부착될 수 있는 생체 적합성 물질이라면 그 종류에 제한되지 않으며, 구체적으로 세포접착물질, 세포 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 제 2 제제가 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물인 경우, 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계는 상기 제 2 채널(50)을 형성하는 단계 수행 후 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널보다 작은 직경을 갖는 제 2 로드(60)를 삽입하고, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널과 제 2 로드(60) 사이에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하는 단계; 및 상기 인공 조직 칩에서 상기 제 2 로드(60)를 제거하여 인공 조직 칩(2) 내부에 제 3 채널(70)을 형성하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 제 2 제제가 세포접착물질을 포함하는 경우, 상기 제 2 제제는 고형화될 수 있다. 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널에는 제 2 로드(60)가 삽입될 수 있고, 상기 제 2 로드(60)의 형태는 3차원 구조라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 상기 제 2 채널(50) 또는 제 3 채널(70)의 형태와 동일하거나 상이할 수 있으며, 보다 구체적으로는 원통형일 수 있다. 상기 제 2 로드(60)의 직경은 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 채널의 직경보다 작을 수 있고, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법의 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복할 때마다 삽입하는 제 2 로드(60)의 직경은 점점 작아질 수 있으며, 구체적으로 제 2 로드의 직경은 그 전 단계에서 삽입 및 제거된 로드(제 1 로드, 또는 그 전에 삽입 및 제거된 제 2 로드)의 직경보다 100 내지 600 μm 더 작을 수 있고, 보다 구체적으로 100 μm 이상, 110 μm 이상, 120 μm 이상, 130 μm 이상, 140 μm 이상, 150 μm 이상, 160 μm 이상, 170 μm 이상, 180 μm 이상, 190 μm 이상, 200 μm 이상, 210 μm 이상, 220 μm 이상, 230 μm 이상, 240 μm 이상, 250 μm 이상, 260 μm 이상, 270 μm 이상, 280 μm 이상, 290 μm 이상, 300 μm 이상, 310 μm 이상, 320 μm 이상, 330 μm 이상, 340 μm 이상, 350 μm 이상, 360 μm 이상, 370 μm 이상, 380 μm 이상, 390 μm 이상, 400 μm 이상, 410 μm 이상, 420 μm 이상, 430 μm 이상, 440 μm 이상, 450 μm 이상, 460 μm 이상, 470 μm 이상, 480 μm 이상, 490 μm 이상, 500 μm 이상, 510 μm 이상, 520 μm 이상, 530 μm 이상, 540 μm 이상, 550 μm 이상, 560 μm 이상, 565 μm 이상, 570 μm 이상, 580 μm 이상 또는 590 μm 이상 더 작을 수 있고, 600 μm 이하, 590 μm 이하, 580 μm 이하, 570 μm 이하, 565 μm 이하, 560 μm 이하, 550 μm 이하, 540 μm 이하, 530 μm 이하, 520 μm 이하, 510 μm 이하, 500 μm 이하, 490 μm 이하, 480 μm 이하, 470 μm 이하, 460 μm 이하, 450 μm 이하, 440 μm 이하, 430 μm 이하, 420 μm 이하, 410 μm 이하, 400 μm 이하, 390 μm 이하, 380 μm 이하, 370 μm 이하, 360 μm 이하, 350 μm 이하, 340 μm 이하, 330 μm 이하, 320 μm 이하, 310 μm 이하, 300 μm 이하, 290 μm 이하, 280 μm 이하, 270 μm 이하, 260 μm 이하, 250 μm 이하, 240 μm 이하, 230 μm 이하, 220 μm 이하, 210 μm 이하, 200 μm 이하, 190 μm 이하, 180 μm 이하, 170 μm 이하, 160 μm 이하, 150 μm 이하, 140 μm 이하, 130 μm 이하, 120 μm 이하 또는 110 μm 이하 더 작을 수 있으며, 보다 더 구체적으로 300 내지 570 μm 더 작을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 제 2 로드(60)의 길이는 상기 제 2 채널(50) 또는 제 3 채널(70)의 길이와 같거나 이보다 더 길 수 있고, 상기 제 2 로드(50)의 재료는 제 2 로드(50) 제거 시 고형화된 세포접착물질, 또는 세포접착물질 및 세포의 혼합물이 제 2 로드(50)에 부착되지 않는 물질이라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 금속일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테인리스(stainless, stainless steel), 알루미늄(aluminium), 티타늄(titanium) 등일 수 있고, 제 2 로드는 예를 들어 스테인리스 니들(needle)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인공 조직 칩(2) 내부에 존재하는 채널에 제 2 스테인리스 니들(60)을 삽입하고, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널과 제 2 니들(60) 사이에 제 2 제제로 제 2 콜라겐 용액(실시예 1) 또는 제 2 콜라겐 용액과 혈관주위세포가 혼합된 제 2 혼합물(실시예 2)을 주입하고 이를 고형화 또는 부착한 다음에, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널에서 상기 제 2 스테인리스 니들(60)을 제거하였을 때, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널에 삽입한 제 2 니들의 크기만큼 인공 조직 칩(2) 내부에 제 3 채널(70)이 형성됨을 확인하였다. 또한, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널과 제 3 채널(70) 사이에 제 2 제제로 이루어진 단일 레이어(제 2 레이어(5))가 생성되었으며, 제 1 제제로 이루어진 레이어(제 1 레이어(3))와 혼합되지 않고, 각각의 층을 이루고 있음을 확인하였다(실시예 1 및 2).
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 2 제제가 세포인 경우, 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계는 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 주입된 제 2 제제를 부착하는 단계를 포함하고, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복하여 수행할 때 상기 제 2 제제 주입 전 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 세포접착물질을 주입 및 고형화하는 것일 수 있다. 상기 제 2 제제를 부착하는 것은 세포를 포함하는 제 2 제제를 배양, 또는 배양 후 세척하는 것일 수 있으며, 상기 부착 및 배양은 상술한 바와 같다. 상기 제 2 제제가 세포인 경우, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복하여 수행할 때 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 주입되는 세포접착물질은 각 단계에서 주입된 세포가 부착되어 구조체를 이룰 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않으며, 구체적으로 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 콜라겐, 피브론엑틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 비트로넥틴, 엘라스틴 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복하여 수행할 때 상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 주입되는 세포접착물질의 농도는 10 내지 200 μg/mL일 수 있고, 구체적으로 10 μg/mL 이상, 20 μg/mL 이상, 30 μg/mL 이상, 40 μg/mL 이상, 50 μg/mL 이상, 60 μg/mL 이상, 70 μg/mL 이상, 80 μg/mL 이상, 90 μg/mL 이상, 100 μg/mL 이상, 110 μg/mL 이상, 120 μg/mL 이상, 130 μg/mL 이상, 140 μg/mL 이상, 150 μg/mL 이상, 160 μg/mL 이상, 170 μg/mL 이상, 180 μg/mL 이상 또는 190 μg/mL 이상일 수 있고, 200 μg/mL 이하, 190 μg/mL 이하, 180 μg/mL 이하, 170 μg/mL 이하, 160 μg/mL 이하, 150 μg/mL 이하, 140 μg/mL 이하, 130 μg/mL 이하, 120 μg/mL 이하, 110 μg/mL 이하, 100 μg/mL 이하, 90 μg/mL 이하, 80 μg/mL 이하, 70 μg/mL 이하, 60 μg/mL 이하, 50 μg/mL 이하, 40 μg/mL 이하, 30 μg/mL 이하 또는 20 μg/mL 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인공 조직 칩(2) 내부에 존재하는 채널에 성상교세포 현탁액을 주입하고 이를 배양하여 부착시킨 후, PBS로 세척하였을 때, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널 내부에 제 3 채널(70)이 형성되며, 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 성상교세포로 이루어진 단일 레이어(제 2 레이어(5))가 생성되고, 상기 레이어는 제 1 제제로 이루어진 레이어(제 1 레이어(3))와 혼합되지 않고, 각각의 층을 이루고 있음을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 이상 반복하는 것을 포함할 수 있고, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 수행하여 제조된 다중 레이어 튜브 구조체(1)는 폴리머칩(10)의 챔버(20) 형태로 고형화된 제 1 제제 내부에 제 2 제제로 이루어진 단일 레이어가 존재하는 실린더(cylinder) 형태일 수 있다(도 6의 단계 S650). 또한, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법은 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 이상 반복할 수 있으며, 이 때 상기 제 3 채널을 형성하는 단계가 수행될 때마다 주입되는 제 2 제제는 제 1 제제 또는 기주입된 제 2 제제와 동일 종류이거나 동일 농도일 수 있고, 또는 다른 종류이거나 다른 농도일 수 있다. 예를 들어, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 수행 시 주입된 제 2 제제는, 상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계에서 주입된 제 1 제제와 동일 종류이거나 동일 농도일 수 있고, 또는 다른 종류이거나 다른 농도일 수 있으며, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 수행 시 주입된 제 2 제제는, 상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계에서 주입된 제 1 제제 또는 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 수행 시 주입된 제 2 제제와 동일 종류이거나 동일 농도일 수 있고, 또는 다른 종류이거나 다른 농도일 수 있으며, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 3회 수행 시 주입된 제 2 제제는, 상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계에서 주입된 제 1 제제, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 1회 수행 시 주입된 제 2 제제, 또는 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 수행 시 주입된 제 2 제제와 동일 종류이거나 동일 농도일 수 있고, 또는 다른 종류이거나 다른 농도일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 이상 수행하고, 상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계에서 주입된 제 1 제제와 상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 반복하여 수행할 때마다 주입된 제 2 제제의 종류 또는 농도가 동일 또는 상이하도록 제조된 다중 레이어 튜브 구조체는 고형화된 제 1 제제 내부에 주입된 제 2 제제 각각이 단일 레이어를 이루고, 각 레이어의 세포접착물질 또는 세포가 서로 섞이지 않고 형성된 다중 레이어 구조의 실린더(cylinder) 형태를 이루는 것을 확인하였다(실시예 1 내지 3).
특히, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 2 제제가 세포인 경우, 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 존재하는 제 3 채널(70) 내부에 100 μg/mL 농도의 콜라겐 용액을 주입하고, 배양(incubation)하여 고형화(교화(gelation))한 후, 상기 제 3 채널(70) 내부에 혈관주위세포 현탁액을 주입, 배양, 부착 및 세척하여 제 4 채널(80)을 형성하였다. 또한, 상기 형성된 제 4 채널(80) 내부에 100 μg/mL 농도의 콜라겐 용액을 주입하고, 배양(incubation)하여 고형화(교화(gelation))한 후, 상기 제 4 채널(80) 내부에 뇌혈관내피세포 현탁액을 주입, 배양, 부착 및 세척한 결과, 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 콜라겐으로 이루어진 레이어(제 1 레이어(3)), 성상교세포로 이루어진 레이어(제 2 레이어(5)), 혈관주위세포로 이루어진 레이어(제 3 레이어(7)) 및 뇌혈관내피세포(제 4 레이어(9))로 이루어진 레이어가 생성되었으며, 상기 각 레이어의 세포들이 서로 섞이지 않고 다중 레이어 구조의 실린더 형태를 이루는 것을 확인하였다(실시예 3).
또한, 상기 제조방법은 상기 제 3 채널(70)을 형성하는 단계 수행 후 상기 인공 조직 칩(2) 내부에 형성된 제 3 채널(70)에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 주입된 제 2 제제를 고형화 또는 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 3 채널을 형성하는 단계 수행 후 형성된 채널에 콜라겐 용액 또는 콜라겐 용액과 뇌혈관내피세포의 혼합물을 주입하고 이를 고형화 또는 부착하여 제조된 다중 레이어 튜브 구조체(1)는 구조체의 가장 안쪽에 존재하는 채널에 콜라겐 또는 콜라겐과 뇌혈관내피세포의 혼합물을 포함하고, 각 단계별로 주입된 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물이 서로 섞이지 않고 각각 단일 레이어로 존재하는, 다중 레이어 구조를 이루는 것을 확인하였다(실시예 1 및 2).
상기 제 1 제제 또는 제 2 제제에 포함되는 세포접착물질은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질일 수 있고, 상기 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 피브론엑틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 비트로넥틴, 엘라스틴 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 콜라겐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 제 1 제제 또는 제 2 제제에 포함되는 세포접착물질의 농도는 0.1 내지 20 mg/mL일 수 있고, 구체적으로 0.1 mg/mL 이상, 0.2 mg/mL 이상, 0.4 mg/mL 이상, 0.6 mg/mL 이상, 0.8 mg/mL 이상, 1 mg/mL 이상, 2 mg/mL 이상, 3 mg/mL 이상, 4 mg/mL 이상, 5 mg/mL 이상, 6 mg/mL 이상, 7 mg/mL 이상, 8 mg/mL 이상, 9 mg/mL 이상, 10 mg/mL 이상, 11 mg/mL 이상, 12 mg/mL 이상, 13 mg/mL 이상, 14 mg/mL 이상, 15 mg/mL 이상, 16 mg/mL 이상, 17 mg/mL 이상, 18 mg/mL 이상 또는 19 mg/mL 이상일 수 있고, 20 mg/mL 이하, 19 mg/mL 이하, 18 mg/mL 이하, 17 mg/mL 이하, 16 mg/mL 이하, 15 mg/mL 이하, 14 mg/mL 이하, 13 mg/mL 이하, 12 mg/mL 이하, 11 mg/mL 이하, 10 mg/mL 이하, 9 mg/mL 이하, 8 mg/mL 이하, 7 mg/mL 이하, 6 mg/mL 이하, 5 mg/mL 이하, 4 mg/mL 이하, 3 mg/mL 이하, 2 mg/mL 이하, 1 mg/mL 이하, 0.9 mg/mL 이하, 0.8 mg/mL 이하, 0.7 mg/mL 이하, 0.6 mg/mL 이하, 0.5 mg/mL 이하, 0.4 mg/mL 이하, 0.3 mg/mL 이하 또는 0.2 mg/mL 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제 1 제제 또는 제 2 제제에 포함되는 세포는 3차원 환경에서 존재하는 세포, 또는 내강(lumen)이나 다중 레이어(multilayer) 구조를 형성하는 세포라면 제한되지 않으며, 구체적으로 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 성상교세포(astrocyte), 골조상세포(osteoprogenitor cell), 뼈세포(osteocyte), 골아세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌세포(melanocyte), 랑게르한스세포(Langerhans' cell), 비만세포(mast cell), 부정형세포(indeterminate cell), 머켈세포(Merkel cell), 기저세포(basal cell), 진피세포(epidermis cell), 지방세포(adipocyte), 신경세포(neuron), 글리아세포(glial cell) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 다중 레이어(multi-layer) 튜브 구조체 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체일 수 있다. 또한, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체는 세포 배양용일 수 있다. 상기 세포는 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 배양될 수 있는 세포라면 그 종류가 제한되지 않으며, 구체적으로 3차원 환경에서 존재하는 세포, 또는 내강(lumen)이나 다중 레이어(multilayer) 구조를 형성하는 세포라면 제한되지 않으며, 보다 구체적으로 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 성상교세포(astrocyte), 골조상세포(osteoprogenitor cell), 뼈세포(osteocyte), 골아세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌세포(melanocyte), 랑게르한스세포(Langerhans' cell), 비만세포(mast cell), 부정형세포(indeterminate cell), 머켈세포(Merkel cell), 기저세포(basal cell), 진피세포(epidermis cell), 지방세포(adipocyte), 신경세포(neuron), 글리아세포(glial cell) 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 뇌혈관내피세포 (brain endothelial cell), 혈관주위세포 (pericyte), 성상교세포(astrocyte) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 성상교세포(astrocyte), 혈관주위세포(pericyte) 및 뇌혈관내피세포(endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 세포와 세포접착물질(예를 들어, 콜라겐)의 혼합물을 배양하여, 혈관 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있다. 또는 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 골조상세포(osteoprogenitor cell), 뼈세포(osteocyte), 골아세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 세포와 세포접착물질(예를 들어, 콜라겐 또는 프로테오글리칸 등)의 혼합물을 배양하여, 뼈 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있다. 또는 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌세포(melanocyte), 랑게르한스세포(Langerhans' cell), 비만세포(mast cell), 부정형세포(indeterminate cell), 머켈세포(Merkel cell), 기저세포(basal cell), 진피세포(epidermis cell), 지방세포(adipocyte) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 세포와 세포접착물질(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸 등)의 혼합물을 배양하여, 피부 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있다. 또는 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 신경세포(neuron), 글리아세포(glial cell) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포, 또는 상기 세포와 세포접착물질(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸 등)의 혼합물을 배양하여, 신경 조직을 모사하는 3차원 다중 레이어 튜브 구조체를 제조할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 다중 레이어(multi-layer) 구조체 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인공 조직 제조방법일 수 있다. 상기 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체에서 배양되는 세포는 상기 기재된 바와 같다. 또한, 상기 인공 조직은 혈관 조직, 피부 조직, 뼈 조직, 신경 조직 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제 1 채널(30)을 포함하는 폴리머칩(10); 제 1 로드(40) 및 상기 제 1 로드보다 작은 직경을 갖는 하나 이상의 제 2 로드(60); 및 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하는 제 1 제제, 및 제 2 제제;를 포함하고, 상기 제 2 로드가 2 이상인 경우, 제 2 로드의 직경의 길이는 서로 다른, 다중 레이어 제조 키트일 수 있다. 또는 본 발명은 제 1 채널(30)을 포함하는 폴리머칩(10); 제 1 로드(40); 및 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하는 제 1 제제, 및 세포를 포함하는 제 2 제제;를 포함하는, 다중 레이어 튜브 구조체 제조 키트일 수 있다. 상기 제 1 채널(30), 폴리머칩(10), 제 1 로드(40) 및 제 2 로드(60), 제 1 제제 및 제 2 제제 등에 관한 설명은 상기 기재된 바와 같다. 상기 키트는 챔버 형성용 펀치(punch)를 더 포함할 수 있으며, 상기 펀치(punch)는 상기 폴리머칩에 챔버를 형성하기 위한 펀치라면 그 종류, 형태 및 크기 관계없이 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 무세포(acellular) 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체 제조
본 발명의 일 실시예로서, 다중 레이어 구조를 갖는 무세포 콜라겐 구조체를 제조하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였으며, 이를 도 1과 같이 도식화하였다. 하기에서 사용된 제 1 내지 3의 콜라겐 용액은 쥐 꼬리 콜라겐(rat tail collagen)을 주성분으로 하는 용액(Collagen Type I Rat Tail High Concentration, Corning Inc.사)이며, 상기 용액의 콜라겐 농도는 모두 3 mg/mL 이다.
먼저, 제 1 채널(30)을 갖는 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane) 칩(10)에 스퀘어 펀치(square punch)를 이용해 챔버(chamber)(20)를 만들고, 상기 PDMS 칩(10)의 제 1 채널(30) 내에 직경이 800 μm 인 제 1 스테인리스 니들(needle)(40)을 삽입하였다. 그런 다음, 상기 PDMS 칩의 스퀘어 챔버에 제 1 콜라겐 용액 10 μL을 주입하고, 30 분간 37 ℃에서 교화(gelation)시킨 후, 콜라겐 교화가 끝나면 상기 제 1 스테인리스 니들을 제거하였다. 이 때 상기 제 1 채널(30)에 주입한 제 1 니들의 크기만큼 콜라겐 내부에 제 2 채널(50)이 형성되었다(도 1의 단계S140). 그 후, 상기 새로 형성된 제 2 채널(50)에 상기 제 1 스테인리스 니들(40)보다 직경이 565 μm 더 작은, 직경이 235 μm 인 제 2 스테인리스 니들(60)을 삽입하였다. 그런 다음, 제 2 채널(50)과 제 2 스테인리스 니들(60) 사이에 제 2 콜라겐 용액 10 μL 을 주입하고, 30 분간 37 ℃에서 교화(gelation)시킨 후, 콜라겐 교화가 끝나면 상기 제 2 스테인리스 니들(60)을 제거하였다. 상기 제 2 스테인리스 니들(60)을 제거 후, 상기 제 2 채널(50)에 삽입한 제 2 스테인리스 니들의 크기만큼 상기 제 2 채널(50) 내부에 제 3 채널(70)이 형성되고, 상기 제 2 채널과 제 3 채널 사이에 제 2 레이어(5)가 형성되었음을 확인하였다(도 1의 단계S170). 상기 새로 형성된 제 3 채널(70)에 제 3 콜라겐 용액 10 μL을 주입하고, 30 분간 37 ℃에서 교화(gelation)시켜 무세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체(1)를 제조하였다.
상기 제조된 무세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경(Confocal microscope)(LSM 700, ZEISS 사)을 이용하여 촬영한 사진은 도 3a 및 도 3b와 같다. 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, PDMS 칩을 이용해 제조한 무세포 콜라겐 구조체는 제 1 내지 3 채널에 주입한 제 1 내지 3 콜라겐 용액 각각이 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 2] 유세포(cellular) 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체 제조
본 발명의 일 실시예로서, 다중 레이어 구조를 갖는 유세포 콜라겐 구조체를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였으며, 다만, 상기 실시예 1의 제 1 콜라겐 용액 대신 3 mg/mL 농도의 제 1 콜라겐 용액과 성상교세포 현탁액이 혼합된 제 1 혼합물 10 μL을, 상기 실시예 1의 제 2 콜라겐 용액 대신 3 mg/mL 농도의 제 2 콜라겐 용액과 혈관주위세포(주피세포, pericyte) 현탁액이 혼합된 제 2 혼합물 10 μL을, 상기 실시예 1의 제 3 콜라겐 용액 대신 3 mg/mL 농도의 제 3 콜라겐 용액과 뇌혈관내피세포 현탁액이 혼합된 제 3 혼합물 10 μL을 사용하였다. 상기 제 1 내지 3 혼합물에 포함된 각 세포의 농도는 1 X 106 cell/mL이며, 콜라겐 용액은 실시예 1과 동일하고, 상기 제 1 혼합물을 녹색, 상기 제 2 혼합물을 빨간색, 상기 제 3 혼합물을 파란색으로 염색하였다. 이 때, 상기 제 1 내지 3 혼합물 각각을 주입 후 교화 및 니들 제거 단계를 거친 유세포 콜라겐 다중 레이어 튜브 구조체 각각을 공초점 현미경(LSM 700, ZEISS 사)을 이용하여 촬영하였으며, 촬영된 사진은 도 5a 내지 도 5d와 같다.
구체적으로, 도 5a는 제 1 혼합물 주입 후, 도 5b는 제 2 혼합물 주입 후, 도 5c는 제 3 혼합물 주입 후의 구조체 사진이며, 도 5d는 제 3 혼합물 주입 후 최종적으로 제조된 구조체의 단면 사진으로, 상기 구조체는 인공 조직 칩(2) 내부에 고정된 상태로 안정적으로 존재하며, 각각의 혼합물이 섞이지 않고 각각의 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
[실시예 3] 세포 다중 레이어 튜브 구조체 제조
본 발명의 일 실시예로서, 다중 레이어 구조를 갖는 세포 구조체를 제조하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였으며, 이를 도 6에 도식화하였다.
먼저, 제 1 채널(30)을 갖는 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane) 칩(10)에 스퀘어 펀치(square punch)를 이용해 챔버(chamber)(20)를 만들고, 상기 PDMS 칩(10)의 제 1 채널(30) 내에 직경인 800 μm 인 제 1 스테인리스 니들(needle)(40)을 삽입하였다. 그런 다음, 상기 PDMS 칩(10)의 스퀘어 챔버(20)에 상기 실시예 1의 콜라겐 용액(단, 용액 내 콜라겐 농도는 4 mg/mL) 10 μL을 주입하고, 30 분간 37 ℃에서 교화(gelation)시킨 후, 콜라겐 교화가 끝나면 상기 제 1 스테인리스 니들(40)을 제거하여 상기 제 1 채널(30)에 주입한 제 1 니들의 크기만큼 콜라겐 내부에 제 2 채널(50)을 형성하였다(도 6의 단계 S640). 그 후, 상기 새로 형성된 제 2 채널(50)에 CellTrackerTM Blue CMAC로 염색된 5 X 106 cell/mL 농도의 성상교세포 현탁액 10 μL 을 주입하고, 30 분간 37 ℃에서 상기 세포를 배양하여 부착(adhension)시킨 후, PBS로 세척하여, 상기 제 2 채널(50) 내부에 제 2 레이어(5) 및 제 3 채널(70)이 형성되었음을 확인하였다(도 6의 단계 S650). 그런 다음, 상기 제 3 채널(70) 내부에 100 μg/mL 농도의 콜라겐 용액을 주입하고, 30 분간 37℃에서 배양(incubation)하였다(도 6의 단계 S660). 그 후, 상기 제 3 채널(70) 내부에 CellTrackerTM Red CMTPX로 염색된 5 X 106 cell/mL 농도의 혈관주위세포 현탁액 10 μL 을 주입한 후, 상기 제 3 채널(70) 형성 과정과 동일한 과정을 수행하여 상기 제 3 채널 내부에 제 3 레이어(7) 및 제 4 채널(80)이 형성되었음을 확인하였다(도 6의 단계 S670). 상기 새로 형성된 제 4 채널(80) 내부에 100 μg/mL 농도의 콜라겐 용액을 주입하고, 30 분간 37℃에서 배양(incubation)하여 교화(gelation)시킨 후(도 6의 단계 S680), 상기 제 4 채널(80) 내부에 CellTrackerTM Green CMFDA로 염색된 5 X 106 cell/mL 농도의 뇌혈관내피세포 현탁액 10 μL 을 주입하였다. 그 후, 30 분간 37 ℃에서 상기 세포를 배양하여 부착(adhension)시킨 뒤, PBS로 세척하여, 도 7과 같이 3 종의 세포가 각각 층을 이루어 구조체를 제조하였으며, 상기 제 4 채널(80) 내부에 제 4 레이어(9) 및 제 5 채널(90)이 형성되었음을 확인하였다(도 6의 단계 S690).
상기 제조된 세포 다중 레이어 튜브 구조체를 공초점 현미경(LSM 700, ZEISS 사)을 이용하여 촬영한 사진은 도 8 및 9와 같다. 도 8 및 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 상기 구조체 내에 존재하는 3종의 세포는 서로 섞이지 않고 각각의 층(제 2 내지 4 레이어, 도 8에서 성상교세포(제 2 레이어)는 1st, 혈관주위세포(제 3 레이어)는 2nd, 뇌혈관내피세포(제 4 레이어)는 3rd에 해당한다)을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법에 의해 제조된 다중 레이어 튜브 구조체는 인공 조직 칩 내에 안정하게 고정된 상태로 유지되고, 각 단계별로 주입된 세포접착물질, 세포 또는 이의 혼합물이 서로 섞이지 않고, 주입된 순서에 따라 각각의 층을 이룬 채로 다중 레이어 구조를 형성함으로써, 다중 레이어 튜브 구조인 생체 조직을 모사함으로써 세포 메커니즘 연구를 비롯해 약물 효능 테스트 및 기타 유해 물질 테스트를 포함하는 방대한 범위의 연구에 활용 가능하다.

Claims (18)

  1. 챔버, 상기 챔버를 관통하는 제 1 채널 및 상기 제 1 채널에 삽입된 제 1 로드를 포함하는 폴리머칩의 상기 챔버에 제 1 제제를 주입한 후, 상기 제 1 제제를 고형화하여 인공 조직 칩을 제조하는 단계;
    상기 인공 조직 칩에서 상기 제 1 로드를 제거하여 상기 인공 조직 칩 내부에 제 2 채널을 형성하는 단계; 및
    상기 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널 내부에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 제 3 채널을 형성하는 단계는 1회 이상 반복하고,
    상기 제 1 제제 및 제 2 제제는 세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하고,
    상기 제 3 채널을 형성하는 단계는 상기 제 2 채널을 형성하는 단계 수행 후 인공 조직 칩 내부에 형성된 채널보다 작은 직경을 갖는 제 2 로드를 삽입하고, 상기 인공 조직 칩 내부에 존재하는 채널과 제 2 로드 사이에 제 2 제제를 주입한 후, 상기 제 2 제제를 고형화 또는 부착하는 단계; 및 상기 인공 조직 칩에서 상기 제 2 로드를 제거하여 인공 조직 칩 내부에 제 3 채널을 형성하는 단계를 포함하는,
    다중 레이어(multi-layer) 튜브 구조체 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제 3 채널을 형성하는 단계를 2회 이상 반복하고, 상기 제 3채널을 형성하는 단계를 수행할 때마다 주입하는 제 2 제제는 제 1 제제 또는 기주입된 제 2 제제와 다른 종류이거나 또는 다른 농도인 것인, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머칩은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 실리콘 고무로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 포함하는, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포접착물질은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질인, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 피브론엑틴, 라미닌, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 비트로넥틴, 엘라스틴 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 인공 조직 칩을 제조하는 단계 및 제 3 채널을 형성하는 단계의 고형화는 제 1 제제 또는 제 2 제제를 30 내지 45℃에서 10 내지 60분간 고형화하는 것인, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제 3 채널을 형성하는 단계의 부착은, 상기 제 2 제제가 세포를 포함하는 경우 수행되고, 상기 부착은 제 2 제제를 30 내지 45℃에서 5 내지 60분간 배양하는 것인, 다중 레이어 튜브 구조체 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제1항, 제5항 내지 제10항 중 하나의 방법으로 제조된, 다중 레이어 튜브 구조체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 다중 레이어 튜브 구조체는 제 2 제제로 세포접착물질을 포함하는, 다중 레이어 튜브 구조체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 다중 레이어 튜브 구조체는 세포 배양용인, 다중 레이어 튜브 구조체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 성상교세포(astrocyte), 골조상세포(osteoprogenitor cell), 뼈세포(osteocyte), 골아세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌세포(melanocyte), 랑게르한스세포(Langerhans' cell), 비만세포(mast cell), 부정형세포(indeterminate cell), 머켈세포(Merkel cell), 기저세포(basal cell), 진피세포(epidermis cell), 지방세포(adipocyte), 신경세포(neuron) 및 글리아세포(glial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인, 다중 레이어 튜브 구조체.
  16. 제1항, 제5항 내지 제10항 중 하나의 방법으로 제조된 다중 레이어 튜브 구조체에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인공 조직 제조방법.
  17. 제1항, 제5항 내지 제10항 중 하나의 방법용 키트로,
    제 1 채널을 포함하는 폴리머칩;
    제 1 로드 및 상기 제 1 로드보다 작은 직경을 갖는 하나 이상의 제 2 로드; 및
    세포접착물질, 또는 세포접착물질과 세포의 혼합물을 포함하는 제 1 제제, 및 제 2 제제;를 포함하고,
    상기 제 2 로드가 2 이상인 경우, 제 2 로드의 직경의 길이는 서로 다른, 다중 레이어 제조 키트.
  18. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Biomater. Sci., vol.4, pp.1503~1514(2016)*
Cell Adh Migr. 2013 May 1; 7(3): 267-274.

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