KR102075593B1 - 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법 및 이를 이용한 단백질의 정제와 시료에 존재하는 타겟병원균의 분리농축 방법을 개시한다. 본 발명은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란(dextran)을 코팅하여 핵형성제(nucleation agent)를 제조하는 단계; 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법 및 이의 응용{METHOD FOR SYNTHESIS OF MONODISPERSE MAGNETIC AMYLOSE MICROBEADS AND ITS APPLICATIONS}
본 발명은 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법 및 이의 응용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 균일한 크기를 갖는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법 및 타겟병원균의 분리·농축 등 타겟물질과의 친화도(affinity)와 이들이 가지고 있는 자성특성을 이용하여 시료로부터 목적하는 물질을 효율적으로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
단백질의 분리 및 정제에 응용하기 위하여, 지난 수십년 동안 높은 친밀도와 선택성을 갖고 단백질과 결합할 수 있는 다양한 종류의 리간드가 주목을 받아오고 있다(Young et al 2012 Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications, Ha et al 2008 Purification of his-tagged proteins using Ni2+-poly(2-acetamidoacrylic acid) hydrogel). 그 중, 복합체 매트릭스(complex matrices)를 이용한 단백질의 선택적 분리 및 정제는 단백질 및 효소 엔지니어링을 위한 중요한 기술이다.
또한, 자성 입자는 단백질 정제 및 시료 내에 존재하는 타겟 물질을 선택적으로 분리하는 소재로 널리 사용이 되고 있다. 특히 식품이나 음용수 또는 환경에 적은 수로 존재하는 특정 병원균을 검출하기 위해서는 이들을 시료로부터 효과적으로 분리 농축하는 과정이 필요하며, 이때 특정병원균과 특이적으로 결합하는 수용체를 가지고 있는 자성입자를 이용하게 되면 손쉽고 간단하게 시료로부터 타겟병원균을 분리 농축하여 정확한 검출을 가능하게 한다. 이러한 수요를 충족시키기 위해 Pierce, Sigma, Thermo Fisher 등 여러 글로벌 기업에서는 다양한 종류의 자성 입자를 판매하고 있고, 이들 자성 입자는 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 베이스 소재에 자성 나노입자를 도입하여 제작이 되고 있으며 가격이 밀리리터 당 USD100-300 정도로 고가에 판매가 되고 있다.
따라서, 아밀로오스 합성효소의 생물학적 반응을 이용하여 슈크로오스로부터 아밀로오스를 합성하고, 합성된 아밀로오스는 자기조립반응을 통해 입자의 형태로 제작되는 기술이 연구되었다. 이 기술은 아밀로오스 분자의 자기조립 과정 중 자성 나노입자를 첨가해 주게 되면 아밀로오스와 함께 입자를 형성하게 되고, 이렇게 제작된 아밀로스 자성 나노입자는 초상자성(Superparamagnetic) 특성을 가지게 되며, 이는 타겟 바이오물질을 시료로부터 선택적으로 분리하는 소재로 높은 가치를 가지고 있다. 특히 저가의 슈크로오스를 기질로 사용하며, 복잡한 공정이 필요 없는 단순한 생물학적 반응과 상온에서의 자기조립과정을 통해 제작이 되기 때문에 제작에 소요되는 비용에 있어서 상기 기술한 상용제품과 비교할 수 없을 정도도 강점을 가지고 있다.
하지만 이 기술은 고온의 가열 과정을 필요로 하고, 아밀로오스 입자에 포집되는 자성 나노입자의 양이 많지 않아 자기응답력(magnetic sensitivity)이 낮으며 만들어지는 입자의 크기가 균일하지 않는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 개선하기 위해, 자기응답력(magnetic sensitivity)이 높고 크기가 균일한 입자를 제조하는 기술이 요구되고 있다. 자성입자의 높은 자기응답력(magnetic sensitivity)은 신속한 분리농축에 있어서 중요하며, 균일한 입자의 크기는 자성입자가 용액에서 가지는 분산특성(dispersibility)과 비표면적의 정확한 예측에 있어서 중요하며 소재를 이용한 분리농축 공정의 재현성 확보에 있어서 필수적인 요소이다.
대한민국 공개특허공보 제2009-0121313호, "저항성 전분 산물의 생산" 대한민국 등록특허공보 제1214572호, "환상 아밀로오스의 제조방법"
본 발명은 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 사용하여 단 사슬 아밀로오스의 결정화를 촉진시켜 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조하기 위한 것이다.
본 발명은 덱스트란-자성 나노입자 코어-쉘 구조의 핵형성제를 사용하여 자성 나노입자와 단 사슬 아밀로오스 사이의 친화력을 향상시켜 자성 나노입자의 포집량을 높이고 이에 따라 자기응답력(magnetic sensitivity)이 향상된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조하기 위한 것이다.
본 발명은 핵형성제의 농도를 조절하여 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기를 균일하게 제조하고, 핵형성제의 농도는 제조되는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기 및 균일도를 결정하기 때문에 이러한 특성을 이용하여 균일한 크기의 입자를 제조하기 위한 것이다.
본 발명은 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 이용하여 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 MBP-융합 단백질을 분리하고, 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 목적 분자의 탐지 성능을 향상시키기 위한 것이다.
즉, 본 발명은 특정 미생물에 특이적으로 결합하는 항체를 수식하기 위하여 융합 MBP를 가교단백질로 활용하여 식품, 음용수 또는 환경에 미량으로 존재하는 병원성 미생물의 효과적인 분리농축에 사용하기 위한 것이다. 또한, 본 발명은 분리 농축된 타겟병원균은 이 후 PCR이나 기타 분석법을 통해 정량 검출할 수 있다.
본 발명은 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 이용하여 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 MBP-융합 단백질을 분리하고, 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 특정 타겟병원균 및 목적 분자의 정확한 탐지에 필요한 분리농축 수단을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란(dextran)을 코팅하여 핵형성제(nucleation agent)를 제조하는 단계; 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계를 포함한다.
상기 핵형성제는 코어-쉘 구조를 가지고, 코어부에는 상기 자성 나노입자를 포함하고, 쉘부는 상기 덱스트란을 포함할 수 있다.
상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기는 상기 핵형성제의 함량에 따라 조절될 수 있다.
상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기는 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 합성 시간에 따라 조절될 수 있다.
상기 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계는, 아밀로오스 합성효소를 준비하는 단계; 기질 및 용매를 포함하는 기질 용액을 준비하는 단계; 및 상기 아밀로오스 합성효소를 상기 기질 용액에 첨가하고 효소 반응시켜 단 사슬 아밀로오스를 합성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 아밀로오스 합성효소는 아밀로슈크라제(amylosucrase), 포스포릴라아제(phosphorylase), 전분합성효소(starch synthase), 아밀라제 및 D-효소(D-enzyme) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 자성 나노입자는 산화철 나노입자일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된다.
상기 자성 아밀로오스 마이크로비드는 막대(rod) 형상일 수 있다.
상기 자성 아밀로오스 마이크로비드는 치료용 물질, 진단용 물질, 기능성 건강식품 소재 포장제, 코팅제 또는 크로마토그래피용 레진에 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계; 단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계; 타겟병원균을 포함하고 있는 시료에 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드를 첨가 후 이에 타겟병원균을 결합시키는 단계; 및 상기 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계를 포함한다.
상기 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계는, 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 타겟병원균에 대한 경쟁적 바인더를 첨가하여 상기 아밀로오스 자성 비드로부터 타겟병원균을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면은 MBP-SPG 융합단백질을 가교제로 이용하여 상기 타겟병원균에 특이적인 항체가 수식될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계; 단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계; 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드에 목적 단백질을 결합시키는 단계; 및 상기 목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.
상기 목적 단백질은 MBP(maltose binding proteins)-융합 단백질(MBP-tagged protein)일 수 있다.
상기 목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 정제하는 단계는, 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 목적 단백질에 대한 경쟁적 바인더를 첨가하여 상기 아밀로오스 자성 비드로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 사용하여 단 사슬 아밀로오스의 결정화를 촉진시켜 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 덱스트란-자성 나노입자 코어-쉘 구조의 핵형성제를 사용하여 자성 나노입자와 단 사슬 아밀로오스 사이의 친화력을 향상시켜 자성 나노입자의 포집률을 향상시키고, 따라서 자기응답력이 향상된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 이용하여 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 MBP-융합 단백질을 분리하고, 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 목적 분자의 탐지 성능을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 이용하여 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 MBP-융합 단백질을 분리하고, 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 목적 분자의 탐지 비용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 자성 아밀로오스 마이크로비드에 MBP-SPG 융합단백질을 가교제로 사용하여 타겟병원균에 특이적으로 결합하는 항체를 수식하고 이를 이용하여 시료에 존재하는 타겟병원균을 분리 및 농축함으로써, 분리 및 농축된 타겟병원균은 PCR이나 기타 분석방법을 이용하여 정량적 검출이 가능하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 사용하여 작은 부피의 단백질 분리 및 정제, 바이오 센서 및 엑추에이터(actuator)와 같은 다양한 분야에 응용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 도시한 도면이다.
도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법에 사용된 핵형성제의 구조를 도시한 단면도이다.
도 2a는 핵형성제의 투과전자현미경(Transmission electron microscopy; TEM) 결과 이미지를 도시한 것이고, 도 2b는 핵형성제의 크기 분포를 도시한 그래프이다.
도 2c는 핵형성제를 구성하고 있는 덱스트란 및 산화철 나노입자의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.
도 2d는 γ-Fe2O3(i), 핵형성제(ii), Fe3O4의 기준 패턴(reference patterns)(iii) 및 γ-Fe2O3 의 기준 패턴(iv)에 대한 X-선회절 분석법(X-ray Diffraction Spectroscopy; XRD) 결과를 도시한 그래프이다.
도 3a는 핵형성제 없이 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이고, 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
도 4a는 핵형성제의 농도에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기(평균 직경)를 도시한 그래프이다.
도 4b는 합성 시간에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기(평균 직경)를 도시한 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과 이미지 및 크기 분포를 도시한 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 전자 맵핑(electron mapping) 및 투과전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
도 5c는 말토오스 결합단백질-녹색형광단백질(MBP-GFP) 융합단백질이 기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형광 현미경(Fluorescence microscopy) 이미지 결과를 도시한 이미지이다.
도 5d는 용액 내에 분산되어 있는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 외부 자력에 의한 반응을 도시한 이미지이다.
도 6a는 인산완충식염수(phosphate buffer saline ; PBS) 내의 박테리아 수에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6b는 우유 내의 박테리아 수에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6c는 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스 균(Bacillus cereus), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)에 대한 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6d는 박테리아 분리에 대한 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 재활용성(Number of Recycling)을 도시한 그래프(왼쪽) 및 각 사이클에서의 FITC-Ab-기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형광 현미경 이미지(오른쪽) 결과를 도시한 이미지이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드를 도시한 이미지이다.
도 7d는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이고, 도 7e는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 투과전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.
또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or'이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or'를 의미한다. 즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다'라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.
또한, 본 명세서 및 청구항들에서 사용되는 단수 표현("a" 또는 "an")은, 달리 언급하지 않는 한 또는 단수 형태에 관한 것이라고 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 일반적으로 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.
도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 도시한 도면이다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란(dextran)을 코팅하여 핵형성제(nucleation agent; Dex@IONPs)를 제조하는 단계(S110) 및 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 합성하는 단계(S120)를 포함한다.
단계 S110에서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란(dextran)을 코팅하여 핵형성제(Dex@IONPs)를 제조한다.
보다 구체적으로, 단계 S110는 용매 내에 자성 나노입자 전구체 및 덱스트란을 첨가하여 핵형성제 용액을 제조하는 단계 및 핵형성제 용액을 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
먼저, 용매 내에 자성 나노입자 전구체 및 덱스트란을 첨가하여 핵형성제 용액을 제조한다.
바람직하게는, 자성 나노입자 전구체로는 염화제이철 육수화물(FeCl3 ·6H2O) 및 염화제일철 사수화물(FeCl2·4H2O) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
용매로는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 용매로는 탈이온수가 사용될 수 있다.
또한, 핵형성제 용액은 침전제를 포함할 수 있고, 침전제로는 수산화나트륨(NaOH) 및 수산화암모늄(NH4OH) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있고, 침전제는 핵형성제 용액의 pH를 9 - 12 범위로 조절할 수 있다.
또한, 핵형성제 용액을 초음파 처리하는 단계는 핵형성제 용액을 1분 내지 20분 동안 초음파 처리할 수 있다.
초음파 처리 시간이 1분 미만이면 핵형성제(Dex@IONPs)가 완전히 생성되지 않고, 20분을 초과하면 핵형성제(Dex@IONPs)의 크기가 작아지는 문제가 있다.
초음파 처리가 완료되면 핵형성제 용액 내에 핵형성제(Dex@IONPs)가 침전된다. 따라서, 상등액은 버리고 침전된 핵형성제(Dex@IONPs)를 3차 증류수로서 세척액의 pH가 6~7이될 때까지 세척하여 수득한다. pH를 6~7로 한정하는 이유는 중성으로 조절하여 핵형성제(Dex@IONPs)를 안정화시키기 위한 것이다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 핵형성제 용액을 초음파 처리함으로써, 빠르게 분산시켜 안전한 콜로이드 용액을 제조할 수 있고, 핵형성제(Dex@IONPs)가 응집되는 핵형성제(Dex@IONPs) 응집 현상을 방지할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 따라 제조된 핵형성제(Dex@IONPs)는 코어-쉘 구조를 가질 수 있고, 코어-쉘 구조는 도 1b에서 상세히 설명하기로 한다.
도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 따라 제조된 핵형성제의 구조를 도시한 단면도이다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 따라 제조된 핵형성제(Dex@IONPs)는 코어-쉘 구조를 가질 수 있고, 코어부(110)에는 자성 나노입자를 포함하고, 쉘부(120)는 덱스트란을 포함할 수 있다.
코어부(110)에 포함되는 자성 나노입자는 자성을 띄는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금으로 이루어진 것이라면 제한없이 사용될 수 있고, 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있고, 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 및 Cr 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있고, p 및 q는 각각 식 0 < p ≤3 및 0 < q ≤5이다.)중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있으며, 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, NiFeCo 및 MnFe2O4 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 자성 나노입자는 산화철 나노입자를 포함하고, 더욱 바람직하게는, 자성 나노입자는 2 ㎚ 내지 20 ㎚의 직경을 갖는 마그헤마이트(Fe2O3) 및 마그네타이트(Fe3O4) 중 적어도 하나를 포함함으로써 초상자성(SPIO 혹은 USPIO)을 가질 수 있다.
자성 나노입자 표면에 코팅되는 쉘부(120)로 덱스트란을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않고, 키토산, 녹말 또는 올리고당과 같은 다당질류가 사용될 수 있다.
자성 나노입자를 이용하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조하는 종래의 경우, 자성 나노입자가 쉘부(120)를 포함하지 않기 때문에 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면에 자성 나노입자가 형성되어, 자성 아밀로오스 마이크로비드 간의 응집력이 향상되어 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조할 수 없다.
또한, 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면에 형성된 자성 나노입자로 인해 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면을 기능화하기가 어렵다.
그러나, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 따라 제조된 핵형성제(Dex@IONPs)는 코어부(110)에는 자성 나노입자를 포함하고, 쉘부(120)에는 덱스트란을 포함하는 코어-쉘 구조를 가지기 때문에, 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 표면에 자성 나노입자가 노출되지 않아, 자성 나노입자 간 발생할 수 있는 응집력을 감소시켜, 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 제조할 수 있다.
또한, 핵형성제는 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs) 제작 반응 중 핵형성 반응을 촉진시켜 짧은 시간 내에 핵형성을 유발하기 때문에 제조되는 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기를 균일하게 형성시켜줄 수 있다.
그러나, 핵형성제가 없는 종래 반응의 경우 반응시간 전체에 거쳐 핵형성이 발생하기 때문에 만들어지는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기가 균일하지 않는 문제가 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법을 따라 제조된 핵형성제는 쉘부(120)에 덱스트란을 포함하기 때문에 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면을 기능화하기 용이하다.
다시 도 1a를 참조하면, 단계 S120에서는, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계를 진행한다.
바람직하게는, 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCAs)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 합성하는 단계는, 기질 용액을 제조하는 단계 및 기질 용액에 아밀로오스 합성효소 및 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 합성하는 단계를 포함한다.
실시예에 따라, 단 사슬 아밀로오스(SCAs)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성(SAMBs)하는 단계는, 아밀로오스 합성효소를 준비하는 단계, 기질 및 용매를 포함하는 기질 용액을 준비하는 단계 및 아밀로오스 합성효소를 상기 기질 용액에 첨가하고 효소 반응시켜 단 사슬 아밀로오스를 합성하는 단계를 진행한 다음, 단 사슬 아밀로오스(SCAs)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 합성할 수 있다.
먼저, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 기질 용액을 제조한다.
기질 용액은 아밀로오스 합성효소가 기질로 사용하는 당류를 포함한 생리활성용액으로, 용매에 기질(substrate)를 첨가하여 만든다. 기질은 아밀로오스를 합성하는 과정에서 아밀로오스 합성효소에 의해 이용되어 중합체를 형성하는 단량체로써의 역할을 한다. 이러한 기질로는 포도당(glucose), 올리고당(oligosaccharide) 및 자당(sucrose) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
용매로는 Tris-HCl, PBS 등이 사용될 수 있다. 기질 용액의 제조 시, 용매 100중량부에 대해 기질은 2 ~ 25 중량부 함유되는 것이 바람직하다. 기질이 2 중량부 미만으로 함유되면 아밀로오스 합성효소에 의해 아밀로오스 사슬은 형성되지만 자성 아밀로오스 마이크로비드가 형성되지 않는 문제가 발생한다. 그리고 기질이 25 중량부를 초과이면 아밀로오스 합성효소가 기질을 소모하고 만들어지는 산물이 이성체가 형성될 확률이 높아지는 문제가 있다.
또한, 용매의 pH 값은 6 ~ 9인 것이 바람직하다. 용매의 pH 값이 6 미만이면 효소 반응에서 아밀로오스 합성효소의 활성이 낮아 반응산물의 형성이 원활하지 않은 문제가 생긴다. 용매의 pH 값이 9를 초과하는 경우에도 효소 반응에서 아밀로오스 합성효소의 활성이 낮아지는 문제가 발생한다.
마지막으로, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 기질 용액에 아밀로오스 합성효소 및 핵형성제(Dex@IONPs)를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성한다.
아밀로오스 합성효소는 아밀로슈크라제(amylosucrase), 포스포릴라아제(phosphorylase), 전분합성효소(starch synthase), 아밀라제 및 D-효소(D-enzyme) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
따라서, 기질 용액은 용매 내에 아밀로오스 합성효소 및 기질을 포함함으로써 단 사슬 아밀로오스를 생성할 수 있다.
핵형성제(Dex@IONPs)는 용매 100 중량부에 대해 0.1 ~ 30 중량부의 범위로 첨가되는 것이 바람직하다. 핵형성제(Dex@IONPs)가 0.1 중량부 미만으로 함유되면 자성 나노입자의 기능을 발휘할 수 없는 문제가 발생할 우려가 있어 바람직하지 않고, 핵형성제(Dex@IONPs)가 30 중량부를 초과하면 아밀로오스 합성효소의 활성을 저해하여 반응산물의 형성이 원만하지 않은 문제가 발생할 우려가 있으며, 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기가 균일하지 않게 되어 바람직하지 않다.
핵형성제(Dex@IONPs)를 기질 용액에 첨가하고 효소 반응시켜 기질 용액을 합성함에 있어서, 효소 반응 온도는 20℃ 내지 60℃의 온도 범위가 바람직하다. 반응 온도가 20℃ 미만이면, 아밀로오스 합성효소의 활성이 낮아 반응산물의 형성이 원만하지 않은 문제가 발생한다. 그리고 반응 온도가 60℃를 초과하면 아밀로오스 합성효소가 열적 스트레스로 인해 활성을 잃어버리는 문제가 발생하며, 반감기 또한 짧아지는 문제가 발생하게 된다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조방법은, 종래와 같이 복잡하거나 고온의 공정을 거치지 않고 아밀로오스 합성효소 및 핵형성제(Dex@IONPs)를 이용하여 간단하게 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 합성할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조방법은 아밀로오스 합성효소 및 핵형성제(Dex@IONPs)를 기질 용액에 첨가하고 일정 조건에서 효소 반응을 진행시켜 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 형성하는 것으로, 아밀로오스 합성효소의 기질 소모와 함께 형성된 단 사슬 아밀로오스(SCAs)의 자가 조립을 통해 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)가 자발적으로 형성된다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조방법은 효소적 합성에 의해 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 형성하는 것이므로, 제조 과정이 간단하고, 종래와 같이 고온의 열처리가 필요 없다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조방법으로 제조되는 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 아밀로오스의 순도가 높다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법에 의해 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기(직경)는 핵형성제(Dex@IONPs)의 함량에 따라 조절될 수 있다.
보다 구체적으로, 기질 용액 내에 포함되는 단 사슬 아밀로오스(SCAs)의 양은 한정되어 있기 때문에, 핵형성제(Dex@IONPs)의 농도가 증가할수록 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기는 감소될 수 있다.
띠라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 핵형성제(Dex@IONPs)의 농도에 따라 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기를 용이하게 조절할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법에 의해 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기는 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 합성 시간에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 자가 조립 반응(self-assembly reaction)에 의해 아밀로오스 마이크로 비드(SAMBs)가 형성되기 때문에 반응 초기에는 핵 형성하기 위한 반응 지연 시간을 포함하고, 이 후에는 핵이 성장된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 반응 초기에는 핵형성제(Dex@IONPs)와 단 사슬 아밀로오스(SCAs)가 반응하여 핵형성제-단 사슬 아밀로오스 복합체(Dex@IONPs/SCAs complexes)를 형성한 다음, 핵형성제-단 사슬 아밀로오스 복합체(Dex@IONPs/SCAs complexes)와 아밀로오스 합성효소의 기질 소모로 인해 형성된 단 사슬 아밀로오스(SCAs)의 자가 조립을 통해 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)가 자발적으로 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 합성 시간에 따라, 입자의 크기가 점점 성장되기 때문에 합성 시간이 증가함에 따라, 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기가 증가될 수 있다.
그러나, 기질 용액 내에 포함되는 단 사슬 아밀로오스(SCAs)의 양은 한정되어 있기 때문에, 일정 시간이 지나면 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 크기는 더 이상 증가하지 않는다.
실시예에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 막대(rod) 형태로 재배열할 수 있다.
단 사슬 아밀로오스(SCAs)를 포함하는 기질 용액에 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계 S120를 진행한 후, 외부 자력을 이용하면, 자성 아밀로오스 마이크로비드는 일자(linear)로 배열을 하게 되고, 그 표면에 단 사슬 아밀로오스(SCAs)의 추가적인 자기조립과정을 통해 막대형태의 구조가 안정화 된다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 형상을 구형뿐만 아니라 막대 형상으로도 제조할 수 있어, 다양한 분야에 활용하기 용이하다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 치료용 물질, 진단용 물질, 기능성 건강식품 소재 포장제, 코팅제 또는 크로마토그래피용 레진에 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 타겟병원균의 분리, 농축 또는 단백질의 정제에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 면역 자성입자를 이용하여 타겟병원균 검출을 위한 타겟병원균의 분리 및 농축에 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계, 단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계, 타겟병원균을 포함하고 있는 시료에 자성 아밀로오스 마이크로비드를 첨가하여 타겟병원균을 결합시키는 단계 및 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계 및 단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계는 도 1a 및 도 1b에서 설명한 바와 동일하므로, 동일한 설명에 대해서는 생략하기로 한다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 타겟병원균을 포함하고 있는 시료에 자성 아밀로오스 마이크로비드를 첨가하여 타겟병원균을 결합시키는 단계를 진행한다.
시료에는 분리하고자 하는 병원성 미생물, 미생물, 기타 미생물, 식품 기질 등이 포함되어 있고, 이들 중에 분리하고자 하는 미생물을 분리하기 위해 분리하고자 하는 표적 물질(예; 타겟병원균)에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 미생물이 포함된 시료에 처리하면, 표적 물질(예; 타겟병원균)에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티가 반응하여 표적 물질-타겟팅 모이어티 결합체가 생성 된다.
"타겟팅 모이어티(targeting moiety)"는 타겟 미생물의 표면에 존재하는 항원 또는 미생물 내의 단백질 또는 유전자에 결합할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 타겟팅 모이어티는 단백질, 단편을 이용한 조립항체, 펩타이드, 항체, 항체 단편 또는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면은 MBP-SPG 융합단백질을 가교제로 이용하여 상기 타겟병원균에 특이적인 항체가 수식될 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 MBP-SPG 융합단백질을 가교제로 사용하여 타겟병원균에 특이적으로 결합하는 항체를 자성 아밀로오스 마이크로입자 표면에 수식하고 이를 이용하여 시료에 존재하는 타겟병원균을 분리 및 농축할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계를 포함한다.
타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계는, 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 타겟병원균에 대해 경쟁적 바인더를 첨가하여 아밀로오스 자성 비드로부터 타겟병원균을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 타겟병원균에 대한 경쟁적 바인더는 말토오스(maltose)일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법은 타겟병원균을 보다 용이하게 검출하기 위해 타겟병원균에 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제거할 수도 있다. 표적 물질이 미생물인 경우에는 미생물을 검출하기 위해 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 사용할 수 있으며, 표적 물질이 유전자인 경우에는 PCR 방법 등을 통해 유전자를 증폭하여 검출할 수도 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법에 따라 분리 및 농축된 타겟병원균은 PCR이나 기타 분석방법을 이용하여 정량적 검출이 가능하다
따라서, 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 MBP-융합 단백질을 분리하고 리간드-융합 MBP 단백질이 기능화된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 사용하여 목적 분자 및 타겟 미생물을 탐지하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법은 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계, 단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계, 자성 아밀로오스 마이크로비드에 목적 단백질을 결합시키는 단계 및 목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법은 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 이용하여 목적 단백질을 정제할 수 있다.
목적 단백질은 MBP(maltose binding proteins)-융합 단백질(MBP-tagged protein)일 수 있다.
목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 분리 및 정제하는 단계는, 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs) 표면에 목적 단백질에 대한 경쟁적 바인더를 첨가하여 아밀로오스 자성 비드로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법은 아밀로슈크라제-매개 촉매반응을 통한 순수한 아밀로오스 분자와 핵형성제(Dex@IONPs)로 구성되는 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 빠르고 효율적인 합성과 MBP-융합 단백질의 자성 분리 및 정제에 이들의 응용을 입증한다.
상향식 접근방식(bottom-up approach)에 기반한 효소 촉매의 사용은 핵형성제(Dex@IONPs)가 기질과 반응하여 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs) 복합체를 형성하는 것을 가능하게 한다. 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs) 표면의 아밀로오스 분자는 MBP-융합 단백질과 친화 흡착을 위해 사용될 수 있다.
단백질의 자성 분리 및 정제를 위한 친화 주형으로 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 효율은 모델 단백질로 MBP-융합 녹색 형광 단백질(GFP)에 의해 증명될 수 있었다. 생체분자 분리에 있어서 응용을 연구하기 위하여, 아밀로오스 자성 비드의 선택성 및 재활용을 조사하였다. 자성 아밀로오스 마이크로비드는 목적 단백질의 정제 수용력에 유효한 손실 없이 몇 번이고 재활용될 수 있다.
구체적으로, 시험관내에서 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)의 효소적 합성은 아밀로오스-나노 물질 혼성 마이크로 입자의 제조를 위한 강력한 상향식 접근방식(bottom-up approach)이다.
자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 효소적 반응 동안 아밀로오스 및 핵형성제(Dex@IONPs)의 소수성 반응에 의해 합성된 아밀로오스 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 자성적 특성 때문에 아밀로오스 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)는 생체물질의 자성적 분리 적용을 위한 사용이 가능하게 한다. 자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)를 사용하여 대장균 세포 용액물로부터 MBP-융합 GFP의 분리 및 정제를 테스트함에 의해 자성 분리력을 측정하였고, 정제 수용력은 아밀로오스 자성 비드 ㎎ 당 단백질 72 ㎍ 이었다.
이하에서는, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법에 의해 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드의 특성에 대해 설명하기로 한다.
제조예
핵형성제(Dex@IONPs)
80mmol의 FeCl3 ·6H2O, 40mmol의 FeCl2 ·4H2O 및 150mg의 덱스트란(dextran)을 20ml의 탈이온수(deionized water; DW)에 용해시켜 핵형성제 용액을 제조하였다. 핵형성제 용액을 2분 동안 질소 가스를 부드럽게 흘려주어(gentle stream) 버블링시키고, Q500 초음파기(VC 750, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)를 이용하여 초음파 처리하였다.
초음파 처리는 6-mm의 초음파 프로브(ultrasound probe)를 사용하여, 25%의 진폭(amplitude)으로 3분동안 얼음 배쓰(ice bath)에서 5초의 간격(interval)과 5초의 파쇄 주기(disruption period)로 진행되었다.
자성 아밀로오스 마이크로비드(SAMBs)
데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis; DGAS)로부터 유래된 아밀로슈크라제(amylosucrase)를 사용하는 효소 중합 반응(enzymatic polymerization)을 이용하여 단 사슬 아밀로오스(SCA)를 제조하였다. 50mM의 Tris-HCl 용액(pH 8.0)에 500 단위(unit)의 데이노코커스 제오써르말리스 및 500mM의 자당(sucrose)을 포함하는 기질 용액에 핵형성제(Dex@IONPs)를 혼합하였다.
탈이온수(deionized water; DW)를 이용하여 자성 아밀로오스 마이크로비드 용액이 1mL가 되도록 혼합하고, 40℃에서 48시간동안 배양하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하였다. 자성 아밀로오스 마이크로비드는 자기 분리법(magnetic separation method)으로 분리되고, 탈이온수 및 에탄올로 3번 세척된 다음, 4℃의 20% 에탄올에 보관하였다.
도 2a는 핵형성제의 투과전자현미경(Transmission electron microscopy; TEM) 결과 이미지를 도시한 것이고, 도 2b는 핵형성제의 크기 분포를 도시한 그래프이다.
도 2a 및 도 2b를 참조하면, 127.4±35 nm의 직경의 핵형성제가 잘 형성된 것을 알 수 있다.
도 2c는 핵형성제, 덱스트란 및 산화철 나노입자의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 그래프이다.
도 2c에서 핵형성제는 붉은색 그래프 선을 나타내고, 덱스트란은 검은색 그래프 선을 나타내며, 산화철 나노입자는 파랑색 그래프 선을 나타낸다.
도 2c를 참조하면, 핵형성제의 FT-IR 스펙트럼은 덱스트란의 C-C-O 및 C-H에 대응하는 1150-1085 cm-1 및 3600-3200 cm-1에서 흡수가 나타나고, 산화철 나노입자(마그네타이트)의 Fe-O 결합에 해당하는 538 cm-1에서 흡수를 나타냈다.
도 2d는 γ-Fe2O3(i), 핵형성제(ii), Fe3O4의 기준 패턴(reference patterns)(iii) 및 γ-Fe2O3 의 기준 패턴(iv)에 대한 X-선회절 분석법(X-ray Diffraction Spectroscopy; XRD) 결과를 도시한 그래프이다.
도 2d를 참조하면, 핵형성제의 X-선회절 분석법 결과는 Fe2O3 결정에 특징적인 피크를 나타내고, 결정질 γ-Fe2O3와 비교하여 낮은 피크 쪽으로 피크가 약간 이동되었다.
도 3a는 핵형성제 없이 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이고, 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드 제조 시, 10mg/ml의 핵형성제가 첨가되었다.
도 3a 및 도 3b를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 사용함으로써, 핵형성제 없이 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드에 비해 균일한 크기의 자성 아밀로오스 마이크로비드가 형성되는 것을 알 수 있다.
또한, 핵형성제 없이 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드는 자성 아밀로오스 마이크로비드들 간에 응집이 발생하나, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 표면에 덱스트란이 코팅된 자성 나노입자를 핵형성제로 사용함으로써, 자성 아밀로오스 마이크로비드들 간에 응집이 발생하지 않는 것을 알 수 있다.
도 4a는 핵형성제의 농도에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기(평균 직경)를 도시한 그래프이다.
도 4a는 24시간 동안 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성시켰다.
도 4a를 참조하면, 핵형성제의 농도가 증가할수록 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기가 감소하는 것을 알 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 제조할 때, 단 사슬 아밀로오스의 양은 한정되어 있기 때문에, 핵형성제의 농도가 증가할수록 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 평균 직경이 감소된다. 띠라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 핵형성제의 농도에 따라 자성 아밀로오스 마이크로비드의 평균 직경이 조절될 수 있다.
도 4b는 합성 시간에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기(평균 직경)을 도시한 그래프이다.
도 4b는 핵형성제 사용하지 않거나(control), 6 mg/ml 및 10 mg/ml의 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하였다.
도 4b를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 자가 조립 반응(self-assembly reaction)은 반응 초기에 지연 시간을 갖는 비선형 S자 성장 곡선(non-linear sigmoidal growth curve)을 나타내고, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 자가 조립 반응이 핵 형성 단계 및 성장 단계로 구성되는 것을 알 수 있다.
도 5a는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 전자주사현미경 결과 이미지 및 크기 분포를 도시한 그래프이다.
도 5a를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 1.25㎛를 중심으로 균일한 크기의 분포를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 5b는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 전자 맵핑(electron mapping) 및 투과전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
도 5b는 투과 전자현미경(TEM, JEM-2010F, JEOL, Tokyo, Japan)으로 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형태와 전자 맵핑을 관찰하였다. 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 화학적 조성을 EDX 스펙트로미터로 측정하였다.
또한, 도 5b은 철, 탄소 및 산소가 각각 적색, 녹색 및 청색의 점으로 표시하였다.
도 5b를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 구형의 형상을 갖고, 약 1.25 ㎛ 의 직경을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 투과 전자현미경 및 전자 맴핑으로부터 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드 내에 철 및 산소로 인해 산화철이 위치함을 명백하게 관찰될 수 있고, 탄소 및 산소로 인해 덱스트란 및 아밀로오스 분자가 위치하는 것을 확인할 수 있다.
도 5c는 말토오스 결합단백질-녹색형광단백질(MBP-GFP) 융합단백질이 기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형광 현미경(Fluorescence microscopy) 이미지 결과를 도시한 이미지이다.
도 5c를 참조하면, 녹색형광단백질을 통해 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드가 말토오스 결합단백질과 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
특히, 오른쪽 이미지는 외부 자력(magnetic field)이 가해졌을 때의 말토오스 결합단백질-녹색형광단백질(MBP-GFP) 융합단백질이 기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형광 현미경(Fluorescence microscopy) 이미지 결과를 도시한 것으로, 이를 통해 외부 자력(magnetic field)이 가해졌을 시, 초상자성 특성을 가지고 있는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드가 자력의 방향에 따라 한 줄로 배열되는 것을 알 수 있다.
도 5d는 용액 내에 분산되어 있는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 외부 자력에 의한 반응을 도시한 이미지이다.
도 5d를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드가 분산된 용액에 자석을 접근시키면 5초 내에 용액으로부터 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 말토오스 결합 단백질(MBP, maltose binding protein) 융합 단백질의 분리, 정제 및 농축 등에 사용하여 성능을 향상시킬 수 있다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드(immune-SAMBs)의 타겟병원균 포집 효율(Capture efficiency)을 측정하기 위하여, 재조합 MBP-타겟-연쇄상구균G군의 단백질G(recombinant MBP-tagged Streptococcal protein G(MBP-SPG)) 융합 단백질이 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면 상에 결합되어, 대장균(E. coli) O157:H7에 대해 특이적인 항체를 접합시키는 가교제(cross-linker)로 사용되었다.
도 6a는 인산완충식염수(phosphate buffer saline ; PBS) 내의 분산되어 있는 박테리아 수에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6a는 타겟 박테리아는 대장균이다.
도 6a를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드(immune-SAMBs)는 가장 널리 사용되고 있는 시제품인 폴리스티렌 기반 자기비드(polystyrene based immunomagnetic beads; PSMBs)(commercial) 보다 포집 효율이 약간 더 높음을 알 수 있다.
도 6b는 우유 내의 박테리아 수에 따른 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6b는 타겟 박테리아는 대장균이고, 102 CFU/ml 내지 106 CFU/ml의 박테리아 농도에서 진행됐다.
도 6b를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드(immune-SAMBs)는 가장 널리 사용되고 있는 시제품인 폴리스티렌 기반 자기비드(polystyrene based immunomagnetic beads; PSMBs)(commercial) 보다 포집 효율이 유의미하게 더 높다는 것을 알 수 있다.
도 6c는 대장균(E. coli), 세레우스 균(Bacillus cereus), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)에 대한 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 포집 효율을 도시한 그래프이다.
도 6c는 타겟 박테리아는 대장균이다.
도 6c를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드(immune-SAMBs)는 대장균(E. coli)에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
도 6d는 박테리아 분리에 대한 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 재활용성(Number of Recycling)을 도시한 그래프(왼쪽) 및 각 사이클에서의 FITC-Ab-기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형광 현미경 이미지(오른쪽) 결과를 도시한 이미지이다.
도 6d는 3번의 재사용 동안 FITC-Ab-기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 상대적 정제 수용력을 측정하였다.
도 6d를 참조하면, FITC-Ab-기능화된 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 폴리스티렌 기반 자기비드(polystyrene based immunomagnetic beads; PSMBs)(commercial) 보다 포집 효율이 높고, 3번의 재생 및 재사용 후에 MBP-융합 단백질에 대한 친밀도와 특이성이 유지되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드는 세포 용해물로부터 MBP-융합 단백질의 분리/ 정제 및 시료에 존재하는 특정 미생물의 검출에 필수적인 분리농축 과정에의 적용에 적합하다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드를 도시한 이미지이다.
도 7a를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 기질 용액 내에 첨가된 핵형성제의 우수한 감도와 안정성으로 인해 자성 아밀로오스 마이크로비드는 외부 자기장(magnet)으로 쉽게 정렬될 수 있고, SCA-간접 침전법(SCA-mediated precipitation process)에 의해 용이하게 고정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법은 외부 자기장을 조절하여 자성 아밀로오스 마이크로비드의 형상을 제어할 수 있다.
도 7d는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 주사전자현미경 결과를 도시한 이미지이고, 도 7e는 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드의 투과전자현미경 결과를 도시한 이미지이다.
도 7d 및 도 7e를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 막대 형상의 자성 아밀로오스 마이크로비드가 선형으로 정렬되어 막대 형상을 갖는 것을 알 수 있다.
한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시 예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
110: 코어부 120: 쉘부

Claims (16)

  1. 자성 나노입자의 표면에 덱스트란(dextran)을 코팅하여 핵형성제(nucleation agent)를 제조하는 단계; 및
    단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계를 포함하며,
    상기 첨가되는 핵형성제의 농도는 2 내지 10 mg/ml인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드(magnetic amylose microbead; SAMB)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵형성제는 코어-쉘 구조를 가지고, 코어부에는 상기 자성 나노입자를 포함하고, 쉘부는 상기 덱스트란을 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기는 상기 핵형성제의 함량에 따라 조절되는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 크기는 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 합성 시간에 따라 조절되는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단 사슬 아밀로오스(Short chain amylose; SCA)를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계는,
    아밀로오스 합성효소를 준비하는 단계;
    기질 및 용매를 포함하는 기질 용액을 준비하는 단계; 및
    상기 아밀로오스 합성효소를 상기 기질 용액에 첨가하고 효소 반응시켜 단 사슬 아밀로오스를 합성하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아밀로오스 합성효소는 아밀로슈크라제(amylosucrase), 포스포릴라아제(phosphorylase), 전분합성효소(starch synthase), 아밀라제 및 D-효소(D-enzyme) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 자성 나노입자는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 자성 아밀로오스 마이크로비드의 제조 방법으로 제조된 자성 아밀로오스 마이크로비드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드는 막대(rod) 형상인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드는 치료용 물질, 진단용 물질, 기능성 건강식품 소재 포장제, 코팅제 또는 크로마토그래피용 레진에 이용되는 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드.
  11. 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계;
    단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계;
    타겟병원균을 포함하고 있는 시료에 상기 자성 아밀로오스 마이크로비드를 첨가하여 타겟병원균을 결합시키는 단계; 및
    상기 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계를 포함하며,
    상기 첨가되는 핵형성제의 농도는 2 내지 10 mg/ml인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 타겟병원균이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 농축하는 단계는,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 타겟병원균에 대한 경쟁적 바인더를 첨가하여 상기 아밀로오스 자성 비드로부터 타겟병원균을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드의 표면은 MBP-SPG 융합단백질을 가교제로 이용하여 상기 타겟병원균에 특이적인 항체가 수식된 것을 특징으로 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 타겟병원균의 분리 및 농축방법.
  14. 자성 나노입자의 표면에 덱스트란을 코팅하여 핵형성제를 제조하는 단계;
    단 사슬 아밀로오스를 포함하는 기질 용액에 상기 핵형성제를 첨가하여 자성 아밀로오스 마이크로비드를 합성하는 단계;
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드에 목적 단백질을 결합시키는 단계; 및
    상기 목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하며,
    상기 첨가되는 핵형성제의 농도는 2 내지 10 mg/ml인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 MBP(maltose binding proteins)-융합 단백질(MBP-tagged protein)인 것을 특징으로 하는 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 목적 단백질이 결합된 자성 아밀로오스 마이크로비드를 분리 및 정제하는 단계는,
    상기 자성 아밀로오스 마이크로비드 표면에 목적 단백질에 대한 경쟁적 바인더를 첨가하여 상기 아밀로오스 자성 비드로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 자성 아밀로오스 마이크로비드를 이용한 목적 단백질의 정제방법.
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