KR102073338B1 - 인간 단맛 수용체의 발현 및 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 막 통과 부위(transmembrane domain)가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 및 이의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3의 막 통과 부위를 포함한 상태로 효모 발현계에서 고순도로 발현시킴으로써, AOX1 프로모터와 Strep tag로 인해 발현 및 정제가 용이할 뿐만 아니라 시료 확보에 유리하여, 단백질의 특성분석에 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

인간 단맛 수용체의 발현 및 정제 방법{Method for expression and purification of human sweet taste receptor}

본 발명은 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다.

세포 내부의 단맛 신호 전달은 단맛 물질이 단맛 수용체와 결합하여 구조적 변화를 일으키면, 단맛수용체의 밑부분에 결합하고 있던 G-단백질이 활성화되어 해리되면서 개시된다. 이 G-단백질은 α 소단위체와 βγ 소단위체의 복합체로 구성되어 있다GPCR이 활성화되면 α 소단위체와 결합되어 있던 GDP가 분리되고, 그 자리에 GTP가 붙으면서 α 소단위체와 βγ 소단위체의 해리가 이루어지게 된다. 해리된 α 소단위체와 βγ 소단위체는 각각 다른 신호 경로를 개시한다. βγ 소단위체는 PLC(phospholipase C)를 활성화시켜 PIP2(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)를 IP3(inositol trisphosphate)로 전환시키고 이 IP3는 세포 내부의 칼슘 이온 방출을 유도한다. 그리고 α 소단위체는 ATP를 cAMP로 전환하고, cAMP는 PKA (protein kinase A)를 활성화하여 연속된 신호전달을 진행시킨다.

인간의 단맛수용체는 G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)의 Class C에 속하는 두 가지 단량체인 T1R2, T1R3의 이종이합체로 이루어져 있다. 이 단량체들은 아직 고차 구조가 밝혀져 있지 않지만 이미 고차 구조가 밝혀진 글루탐산 수용체(mGluR1, mGluR3), 로돕신 등과 유사한 아미노산 서열을 가지고 있기 때문에 이들과 비슷한 구조를 가질 것이라고 예측된다(Assadi-Porter et al., 2010). 일반적인 class C GPCR은 구조적 기준에서 VFTM(Venus flytrap module), CRD(Cysteine rich domain), TMD(Transmembrane domain)으로 나눌 수 있다(도 1). 우선, 세포 바깥에 위치한 VFTM(Venus flytrap module)은 파리지옥(Venus flytrap)과 유사한 형태를 가지고 있으며, 두 개의 lobe, 즉 lobe1과 lobe2로 이루어져있다. T1R2-T1R3는 아직 고차 구조가 밝혀져 있지 않기 때문에 이미 고차 구조가 밝혀진 Class C GPCR 중에서 가장 상동성이 높은 수용체를 기반으로 구조를 예측해야 한다. 일반적으로는 T1R2-T1R3와 가장 높은 상동성을 보이는 mGluR(glutamate receptror)을 기준으로 단맛수용체의 구조를 예측한다. mGluR은 리간드 중 하나인 글루탐산이 결합하게 되면 N-말단 부위에 큰 구조적 변화가 일어나게 되어 활성화된다. 따라서, T1R2-T1R3의 세포 외부 영역 또한 이와 비슷하게 각각의 VFTM 영역이 두 개의 lobe로 이루어져 있고 이들이 열림 구조(open conformation) 및 닫힘 구조(closed conformation)의 두 형태를 형성한다고 추측되고 있다. 또한, T1R2, T1R3의 구조의 조합에 따라 단맛수용체는 두 가지 자유 형태인 ‘휴식 상태(resting state)’와 ‘활성 상태(active state)’가 동적 평형상태를 이루는 것으로 시사된다. 휴식 상태는 단맛수용체의 두 단량체인 T1R2와 T1R3가 열림 구조일 때 나타나는 반면, 활성 상태는 T1R2와 T1R3가 각각 열림-닫힘 혹은 닫힘-열림으로 다른 구조를 취하고 있을 때 나타난다. 두 상태는 평소 비슷한 비율로 존재하고 있다가, 리간드가 결합하게 되면 T1R2-T1R3의 열림-닫힘 구조에 따라 예측되는 메커니즘에 따라 리간드로 인한 활성 상태가 최대로 안정해 질 때까지 활성 상태 쪽으로 평형이 이동하게 된다.

단맛수용체를 포함한 GPCR은 다양한 신호전달에 관여하기 때문에, 신약 개발의 주요 목표가 되고 있다. 개발된 약과 목표 수용체의 상호작용을 이해하기 위해서는 목표 수용체의 구체적인 구조적, 기능적 지식이 필요하다. 그럼에도 불구하고 막 단백질의 구조적 연구는 일반적으로 단백질 발현, 가용화, 정제 그리고 결정화 등을 포함한 몇몇 근본적인 실험 장벽으로 인해 제한되었다. 로돕신과 같이 원래의 조직에서도 풍부하게 존재하는 단백질의 경우 정제와 결정화에 성공할 확률이 높아서 충분히 순도가 높고 기능적인 형태의 해당 GPCR의 3차 구조를 밝혀낼 수 있다. 그러나 대부분의 GPCR은 원래의 조직에서도 낮은 비율로 존재하기 때문에, 구조적, 기능적 연구를 위한 적절한 양의 단백질을 얻기 위한 이종 발현계의 도입은 반드시 필요하다[비특허문헌 1].

특히, 본 발명자들은 인간 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3 단백질의 고차 구조 분석을 위해 연구하던 중, 대장균에서 발현이 용이하도록 상기 T1R2 또는 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 염기서열의 코돈 선호도를 변형시키고, 막 통과 부위가 제거된 형태로 발현시키면, 단백질의 수용성이 증대되고 결정 성장이 유리한 인간 단맛 수용체를 성공적으로 발현 및 정제하여 특허 출원한 바 있다[특허문헌 1].

하지만, 막 통과 부위가 제거된 형태로 발현시킬 경우, 막 단백질에 비하여 발현 및 정제가 수월하다는 장점은 있으나 막 관통 부위가 없는 단맛수용체 T1R2 및 T1R3는 G-단백질이 결합할 수 없어 수용체에서 G-단백질로 이어지는 신호전달 체계의 확인이 불가능하다. 따라서 막 관통 부위를 포함하면 발현 및 정제가 매우 어려워지지만 단맛메커니즘의 신호전달 과정을 위해서도 단맛수용체의 막 관통 부위의 역할을 알기 위해서도 막통과 부위를 포함한 인간 단맛 수용체의 개발은 절실히 요구된다.

특허 공개 제10-2014-0025002호

Zhang, W., Zhao, H. L., Xue,C., Xiong, X. H., Yao, X. Q., Li, X. Y., Liu, Z. M. (2006). Enhanced secretion of heterologous proteins in Pichia pastoris following overexpression of Saccharomyces cerevisiae chaperone proteins. Biotechnology progress, 22(4), 1090-1095.

본 발명자들은 인간 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3 단백질의 특성 분석 연구를 위해 이 단백질의 안정적인 대량 발현 및 정제 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 효모에서 발현이 용이하도록 상기 T1R2 및 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 염기서열의 코돈 선호도를 변형시키고, 단백질을 발현시키면, 막통과 부위를 포함한 전장 형태의 단맛수용체를 성공적으로 발현 및 정제할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모에서 발현이 용이하도록 최적화된 막 통과 부위(transmembrane domain)가 포함된 형태의 전장 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3을 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 효모를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3를 발현 및 정제하는 방법을 제공하는데 있다

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 막 통과 부위(transmembrane domain)가 포함한 형태이며 효모 발현계에 최적화된 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 제공한다.

본 발명에서 “인간 단맛 수용체(human sweet receptor)”는 미세포에 존재하는 단맛을 감지하는 수용체로서, T1R2 및 T1R3의 서브 유닛으로 구성되는 이종이합체(heterodimeric) G-단백질 커플된 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)이다.

인간 단맛 수용체 T1R2와 T1R3은 지질막에 고정되어 있는 TMD [transmembrane domain, 막 통과 부위, 아미노산서열 575-815(T1R2), 590-817(T1R3)], 구조를 잡아주는 CRD [cysteine-rich domain; 시스테인 풍부 부위; 아미노산 서열 491-544(T1R2), 495-547(T1R3)], 및 감미료와 결합하는 VFTM [venus flying trap module; 아미노산서열 1-484(T1R2), 1-462(T1R3)]로 이루어져 있다.

본 발명에서 막 통과 부위가 포함한 형태의 전장 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질은 지질로 이루어지는 세포막 내에 고정되는 7개의 막 통과 부위(transmembrane domain, TMD)을 모두 포함하는 형태로, 효모 발현용으로 최적화된 서열로 구성된 단백질을 의미한다.

본 발명의 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, T1R3 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다.

서열번호 1 ( T1R2 아미노산 서열)

MGPRAKTISSLFFLLWVLAEPAENSDFYLPGDYLLGGLFSLHANMKGIVHLNFLQVPMCKEYEVKVIGYNLMQAMRFAVEEINNDSSLLPGVLLGYEIVDVCYISNNVQPVLYFLAHEDNLLPIQEDYSNYISRVVAVIGPDNSESVMTVANFLSLFLLPQITYSAISDELRDKVRFPALLRTTPSADHHIEAMVQLMLHFRWNWIIVLVSSDTYGRDNGQLLGERVARRDICIAFQETLPTLQPNQNMTSEERQRLVTIVDKLQQSTARVVVVFSPDLTLYHFFNEVLRQNFTGAVWIASESWAIDPVLHNLTELRHLGTFLGITIQSVPIPGFSEFREWGPQAGPPPLSRTSQSYTCNQECDNCLNATLSFNTILRLSGERVVYSVYSAVYAVAHALHSLLGCDKSTCTKRVVYPWQLLEEIWKVNFTLLDHQIFFDPQGDVALHLEIVQWQWDRSQNPFQSVASYYPLQRQLKNIQDISWHTINNTIPMSMCSKRCQSGQKKKPVGIHVCCFECIDCLPGTFLNHTEDEYECQACPNNEWSYQSETSCFKRQLVFLEWHEAPTIAVALLAALGFLSTLAILVIFWRHFQTPIVRSAGGPMCFLMLTLLLVAYMVVPVYVGPPKVSTCLCRQALFPLCFTICISCIAVRSFQIVCAFKMASRFPRAYSYWVRYQGPYVSMAFITVLKMVIVVIGMLATGLSPTTRTDPDDPKITIVSCNPNYRNSLLFNTSLDLLLSVVGFSFAYMGKELPTNYNEAKFITLSMTFYFTSSVSLCTFMSAYSGVLVTIVDLLVTVLNLLAISLGYFGPKCYMILFYPERNTPAYFNSMIQGYTMRRD

서열번호 2 ( T1R3 아미노산 서열)

MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPLCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCTRFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPVVAMKPSLMFLAKAGSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPQVSYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLGKVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGMAQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDVVGQRCPQCDCITLQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVGGLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRTERLKIRWHTSDNQKPVSRCSRQCQEGQVRRVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLAWGEPAVLLLLLLLSLALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPGQPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAMLVEVALCTWYLVAFPPEVVTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVRSQPGRYNRARGLTFAMLAYFITWVSFVPLLANVQVVLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCYLLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQ

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 핵산 분자는 효모에서의 발현을 최적화시키기 위해 효모에서의 코돈 선호도(codon usage)를 갖는 코돈으로 변형시킨 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 핵산 분자이다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 상기 막 통과 부위가 포함된 형태의 전장 인간 단맛 수용체 T1R2 단백질을 코딩하는 DNA 핵산 분자는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, T1R3 단백질을 코딩하는 DNA 핵산 분자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

서열번호 3( T1R2 염기서열)

ATGGGTCCAAGAGCTAAGACAATCTCCAGTTTGTTTTTCTTGTTATGGGTTTTAGCTGAACCAGCTGAAAATTCTGATTTCTATTTGCCAGGTGACTACTTGTTAGGTGGTTTGTTTTCATTGCATGCAAACATGAAGGGTATCGTCCACTTGAACTTCTTACAAGTTCCTATGTGTAAGGAATACGAAGTTAAAGTAATCGGTTACAATTTGATGCAAGCCATGAGATTCGCTGTAGAAGAAATTAATAACGATTCTTCATTGTTACCAGGTGTCTTGTTGGGTTACGAAATCGTTGATGTTTGTTACATCTCTAACAACGTTCAACCTGTATTGTACTTTTTGGCTCATGAAGATAATTTGTTGCCAATCCAAGAAGACTACTCCAACTACATCAGTAGAGTTGTAGCCGTTATTGGTCCTGATAATTCTGAATCAGTCATGACAGTTGCTAACTTTTTGTCATTATTCTTGTTGCCACAAATCACCTACTCAGCAATTTCCGATGAATTGAGAGACAAGGTTAGATTCCCTGCCTTGTTAAGAACCACTCCATCTGCCGATCATCACATTGAAGCTATGGTTCAATTGATGTTGCATTTCAGATGGAACTGGATCATCGTATTAGTCTCCAGTGATACTTATGGTAGAGACAACGGTCAATTGTTAGGTGAAAGAGTTGCAAGAAGAGATATTTGTATTGCCTTTCAAGAAACCTTGCCTACTTTACAACCAAATCAAAACATGACATCTGAAGAAAGACAAAGATTGGTAACCATAGTCGATAAATTACAACAATCTACTGCTAGAGTCGTTGTAGTCTTCTCACCTGACTTGACTTTGTACCATTTCTTTAACGAAGTCTTGAGACAAAACTTCACAGGTGCAGTTTGGATAGCCTCCGAAAGTTGGGCAATCGATCCAGTTTTGCATAATTTGACAGAATTGAGACACTTAGGTACATTTTTGGGTATAACAATCCAATCTGTTCCTATTCCAGGTTTTTCAGAGTTTAGAGAATGGGGTCCACAAGCTGGTCCACCTCCATTGTCAAGAACCTCTCAATCATACACTTGTAACCAAGAATGTGATAACTGCTTGAACGCTACATTATCCTTTAACACCATATTGAGATTAAGTGGTGAAAGAGTTGTATATAGTGTTTACTCTGCTGTTTATGCAGTAGCCCATGCTTTACACTCCTTGTTAGGTTGTGATAAGAGTACTTGCACAAAAAGAGTCGTTTACCCTTGGCAATTGTTAGAAGAAATATGGAAGGTTAACTTCACTTTGTTAGATCATCAAATCTTTTTCGATCCACAAGGTGACGTAGCTTTGCACTTAGAAATTGTCCAATGGCAATGGGACAGATCACAAAATCCTTTTCAATCAGTTGCATCCTATTACCCATTGCAAAGACAATTAAAGAACATCCAAGATATATCCTGGCATACAATTAATAACACCATCCCAATGAGTATGTGTTCTAAAAGATGCCAATCTGGTCAAAAGAAGAAACCTGTCGGTATCCATGTTTGTTGCTTCGAATGTATTGATTGCTTGCCAGGTACATTTTTGAATCACACAGAAGACGAATATGAATGTCAAGCATGTCCTAATAACGAATGGTCATACCAATCCGAAACCAGTTGTTTCAAGAGACAATTGGTCTTCTTAGAATGGCATGAAGCACCAACAATAGCAGTTGCCTTGTTAGCTGCATTGGGTTTCTTATCAACTTTGGCCATCTTGGTTATTTTCTGGAGACACTTCCAAACACCTATCGTCAGATCAGCTGGTGGTCCAATGTGTTTCTTGATGTTGACTTTGTTGTTGGTTGCATACATGGTAGTCCCTGTTTACGTAGGTCCTCCAAAGGTATCTACCTGTTTGTGCAGACAAGCATTGTTCCCATTGTGTTTCACTATTTGTATCTCTTGCATTGCCGTTAGATCATTTCAAATCGTATGCGCTTTCAAAATGGCTTCAAGATTTCCTAGAGCCTATTCATACTGGGTTAGATACCAAGGTCCATACGTATCAATGGCTTTTATTACAGTATTGAAGATGGTCATAGTTGTAATCGGCATGTTGGCTACAGGTTTATCCCCTACAACCAGAACCGATCCTGATGACCCAAAGATCACTATCGTTAGTTGTAACCCAAACTACAGAAATTCCTTGTTGTTTAACACTAGTTTAGACTTATTGTTATCTGTCGTTGGTTTTTCATTCGCTTACATGGGTAAAGAATTGCCAACAAACTACAACGAAGCAAAATTCATTACTTTGTCCATGACATTCTATTTCACCTCTTCAGTTAGTTTGTGTACTTTTATGTCTGCTTACTCAGGTGTCTTGGTTACCATCGTTGATTTGTTGGTAACTGTCTTGAATTTGTTAGCAATTTCTTTAGGTTACTTCGGTCCAAAATGCTACATGATCTTATTTTACCCTGAAAGAAACACACCAGCTTACTTCAACTCAATGATCCAAGGTTACACCATGAGAAGAGAT

서열번호 4( T1R3 염기서열)

ATGTTGGGTCCTGCTGTTTTGGGTTTATCTTTGTGGGCATTGTTACATCCAGGTACTGGTGCCCCTTTGTGTTTGTCACAACAATTGAGAATGAAGGGTGACTACGTTTTAGGTGGTTTGTTCCCTTTAGGTGAAGCCGAAGAAGCTGGTTTGAGATCAAGAACTAGACCATCCAGTCCTGTCTGTACAAGATTTTCTTCAAACGGTTTGTTATGGGCATTAGCCATGAAGATGGCTGTTGAAGAAATTAATAACAAGTCTGATTTGTTACCAGGTTTAAGATTGGGTTATGATTTGTTCGACACATGTTCTGAACCAGTTGTAGCTATGAAGCCTTCATTGATGTTCTTGGCTAAGGCAGGTTCCAGAGACATTGCTGCATATTGTAATTACACCCAATATCAACCAAGAGTTTTAGCCGTAATAGGTCCTCATTCCAGTGAATTGGCTATGGTAACTGGTAAATTTTTCTCTTTCTTTTTGATGCCACAAGTCTCATACGGTGCTTCTATGGAATTGTTAAGTGCAAGAGAAACCTTTCCATCTTTCTTTAGAACTGTTCCTTCAGATAGAGTACAATTAACTGCTGCTGCTGAATTGTTACAAGAATTTGGTTGGAATTGGGTTGCCGCTTTGGGTTCAGATGACGAATACGGTAGACAAGGTTTGAGTATCTTTTCTGCATTGGCAGCCGCTAGAGGTATTTGTATAGCTCATGAAGGTTTGGTTCCATTACCTAGAGCAGATGACTCAAGATTAGGTAAAGTCCAAGATGTTTTGCACCAAGTCAACCAATCTTCAGTTCAAGTCGTTTTGTTATTCGCCTCTGTTCATGCAGCCCACGCTTTGTTTAATTACTCAATATCCAGTAGATTGTCCCCAAAGGTCTGGGTTGCAAGTGAAGCCTGGTTAACATCTGATTTGGTTATGGGTTTACCTGGTATGGCTCAAATGGGTACTGTATTGGGTTTCTTACAAAGAGGTGCACAATTGCATGAATTTCCACAATACGTTAAGACTCACTTAGCCTTGGCTACAGATCCTGCATTTTGCTCTGCCTTAGGTGAAAGAGAACAAGGTTTGGAAGAAGATGTAGTCGGTCAAAGATGTCCACAATGTGACTGCATTACTTTACAAAACGTCTCTGCTGGTTTGAATCATCACCAAACATTTTCCGTTTACGCTGCTGTTTATAGTGTCGCACAAGCCTTGCATAACACATTACAATGTAATGCCTCTGGTTGCCCAGCTCAAGATCCAGTTAAGCCTTGGCAATTGTTAGAAAACATGTACAACTTAACTTTCCACGTTGGTGGTTTACCTTTGAGATTTGACTCTTCAGGCAACGTAGATATGGAATACGACTTAAAGTTGTGGGTATGGCAAGGTTCAGTCCCAAGATTGCATGATGTAGGTAGATTCAATGGTTCCTTGAGAACCGAAAGATTAAAAATAAGATGGCACACTAGTGACAATCAAAAGCCAGTTTCAAGATGTTCCAGACAATGCCAAGAAGGTCAAGTTAGAAGAGTAAAGGGTTTCCATAGTTGTTGCTACGATTGTGTTGACTGCGAAGCTGGTTCTTATAGACAAAATCCAGATGACATCGCATGTACCTTTTGCGGTCAAGATGAATGGAGTCCTGAAAGATCAACTAGATGTTTCAGAAGAAGATCAAGATTTTTGGCATGGGGTGAACCAGCCGTTTTGTTATTATTGTTGTTGTTGTCATTAGCTTTGGGTTTGGTTTTGGCCGCTTTAGGTTTGTTTGTACATCACAGAGATTCACCATTAGTCCAAGCCTCCGGTGGTCCTTTGGCTTGTTTCGGTTTAGTTTGCTTAGGTTTAGTATGTTTGAGTGTCTTATTGTTTCCAGGTCAACCATCTCCTGCTAGATGCTTGGCACAACAACCATTATCACATTTGCCTTTGACAGGTTGTTTATCCACCTTATTCTTGCAAGCAGCCGAAATTTTTGTTGAATCAGAATTACCATTGTCCTGGGCTGATAGATTGTCTGGTTGCTTAAGAGGTCCTTGGGCATGGTTGGTTGTATTATTGGCAATGTTGGTAGAAGTCGCCTTATGTACTTGGTACTTGGTTGCTTTTCCACCTGAAGTCGTTACAGATTGGCACATGTTACCTACCGAAGCATTGGTTCATTGTAGAACAAGAAGTTGGGTATCTTTCGGTTTAGCTCATGCAACCAACGCTACTTTGGCATTTTTATGTTTCTTGGGTACATTTTTGGTTAGATCACAACCAGGTAGATACAATAGAGCTAGAGGTTTAACATTTGCCATGTTGGCTTATTTCATCACCTGGGTCTCTTTTGTTCCATTATTGGCTAACGTCCAAGTAGTCTTAAGACCTGCTGTTCAAATGGGTGCATTATTGTTGTGCGTTTTGGGTATTTTGGCTGCATTCCATTTGCCAAGATGTTATTTGTTGATGAGACAACCAGGTTTGAATACTCCTGAATTTTTCTTGGGTGGTGGTCCAGGTGACGCTCAAGGTCAA

본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 막 통과 부위가 포함된 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 상기 본 발명의 T1R2 및 T1R3를 코딩하는 핵산 분자에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA를 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 단백질 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

상기 용어 “작동 가능하게 연결된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예컨대 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명에서의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 재조합 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있으며, 효모를 숙주로 하여 구축될 수 있으며, 바람직하게는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 숙주로 하여 구축된다.

본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 특히 숙주 세포로서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 이용되는 경우, AOX1(Alcohol oxidase 1) 프로모터[서열번호 5]가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pPIC9K, pHIL-D2, pPIC3.5K, pHIL-S1 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 효모, 특히 세포로서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 벡터는 상기 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질에 융합되는 스트렙-탁틴(strep-tactin)에 대한 높은 친화성을 갖는 트윈-스트렙 태그(Twin-strep tag)[서열번호 6]를 포함할 수 있다. 이로서 정제 수율을 높일 수 있다. 또한, 정제 시 상기 태그를 제거하기 위해 TEV 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 벡터는 도 4에 개시된 구조를 갖는 pPIC9K-T1R2 또는 도 5에 개시된 구조를 갖는 pPIC9K-T1R3 벡터이다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 제공한다.

본 발명의 벡터를 숙주세포인 효모 내로 운반하는 방법은 LiAc 방법(Gietz RD. et. al., Nature Protocol., 2007;2(1):31-4), 전기 천공 방법(Shixuan Wu. et al., BioTechniques., Vol.36, No.1 (2004)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공한다: (a) 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주세포의 배양물로부터 발현된 상기 막 통과 부위가 포함된 형태의 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 정제하는 단계.

막 통과 부위가 포함된 형태의 효모 발현으로 최적화된 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 효모를 T1R2 또는 T1R3의 발현을 유도할 수 있는 적절한 배지를 사용하여 적합한 배양 조건 하에서 배양한다. 효모 배양을 위한 배지 및 배양 조건은 당업자에 공지되어 있으며, 당업자는 공지된 배지 및 배양 조건을 본 발명에 적합하게 변형하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 발현 벡터 및 효모에 대한 내용은 상술된 본 발명의 발현 벡터 및 숙주 세포에 대한 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 형질전환 효모를 15~20 ℃에서 60 ~ 80시간 1~5%의 DMSO가 포함된 배지에서 배양하여 인간 단맛 수용체를 발현시키는 것을 포함한다.

이렇게 발현된 효모 균체를 파쇄하고 원형질 막을 분리한다. 이때 가용화 단계를 통해 인간 단맛 수용체를 용해시키는 과정에서 DDM(n-Dodecyl β-D-glucopyranoside)를 사용할 경우 가용화가 현저히 잘되었음을 확인하였다.

상기 막 통과 부위가 포함된 형태의 최적화된 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 단백질은 단백질 분리 및 정제 방법을 통해 정제한다. 예를 들어, 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 방법을 단독 또는 조합하여 분리 및 정제할 수 있다.

분리 및 정제된 T1R2 또는 T1R3 단백질의 최종 확인은 공지된 단백질 분석 방법을 사용하여 행할 수 있으며, 예를 들어, SDS-PAGE 및 단백질의 아미노산 서열 분석 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 막 통과 부위(transmembrane domain)가 포함한 전장 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3 및 이의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 인간 단맛 수용체 T1R2 또는 T1R3의 막 통과부위를 포함한 상태로 효모 발현계에서 고순도로 발현시킴으로써, 수월한 시료 확보가 가능할 뿐만 아니라 정제에 유리하여, 단백질의 특성 분석에 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 인간 단맛 수용체 T1R2 및 T1R3의 구조를 보여준다.
도 2는 T1R2의 코돈-최적화된 DNA 서열 및 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 T1R3의 코돈-최적화된 DNA 서열 및 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 pPIC9K-T1R2 발현 플라스미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 pPIC9K-T1R3 발현 플라스미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 pPIC9K-T1R2 및 pPIC9K-T1R3 발현 벡터에 대하여 DNA 아가로스 겔 전기영동법으로 인간 단맛 수용체 발현을 확인한 것이다[레인 M, λ-Hind Ⅲ 분해(dissociate) DNA 마커; 레인 1, pPIC9K hT1R2 플라스미드; 레인 2, SacⅠ 분해된(dissociated) pPIC9K hT1R2 플라스미드; 레인 3, pPIC9K hT1R3 플라스미드; 레인 4, SacⅠ 소화된(digested) pPIC9K hT1R3 플라스미드].
도 7은 SDS-PAGE에 의한 막 제조에서 T1R2 및 T1R3 서브유닛의 발현 확인을 나타낸 것이다[레인 M, BIOFACT 트리플 컬러 단백질 마커; 레인 1, T1R2의 50배 농축 배양 상등액; 레인 2, T1R3의 50배 농축 배양 상등액; 레인 3, T1R2 의 멤브레인 크루드; 레인 4, T1R3 의 멤브레인 크루드; 레인 5, T1R2의 세포 용해; 레인 6, T1R3의 세포 용해].
도 8은 SDS-PAGE에 의한 T1R2 및 T1R3 서브유닛의 최적화 발현 효율을 나타낸 것이다[레인 M, BIOFACT 트리플 컬러 단백질 마커; 레인 1, GS115의 멤브레인 크루드(crude), 30 ℃; 레인 2, GS115의 멤브레인 크루드, 20 ℃; Lane 3, T1R2 서브유닛의 멤브레인 크루드, 30 ℃, 2.5% DMSO; 레인 4, T1R2 서브유닛의 멤브레인 크루드, 30 ℃; 레인 5, T1R2 서브유닛의 멤브레인 크루드, 20 ℃, 2.5% DMSO; 레인 6, T1R2 서브유닛의 멤브레인 크루드, 20 ℃; 레인 7, T1R3 서브유닛의 멤브레인 크루드, 30 ℃, 2.5% DMSO; 레인 8, T1R3 서브유닛의 멤브레인 크루드, 30 ℃; 레인 9, T1R3 서브유닛의 멤브레인 크루드, 20 ℃, 2.5% DMSO; 레인 10, T1R3 서브유닛의 멤브레인 크루드, 20 ℃.)
도 9는 SDS-PAGE에 의한 β-OG(Octyl β-D-glucopyranoside)와 DDM(n-Dodecyl β-D-glucopyranoside)을 이용한 T1R2와 T1R3의 용해도를 확인한 것이다[레인 M, BIOFACT 트리플 컬러 단백질 마커; 레인 1, T1R2의 멤브레인 크루드; 레인 2, T1R3의 멤브레인 크루드; 레인 3, 20 mM DDM에서 T1R2; 레인 4, 20 mM DDM에서 T1R3; 레인 5, 280 mM β-OG에서 T1R2; 레인 6, 280 mM β-OG에서 T1R3].

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

I. 기기 및 시약

1. 기기

균을 다루기 위한 무균작업대는 Vision Biotech. (Incheon, Korea)의 VB-700H1 Clean bench를 이용하였고, 고압멸균을 위해 VB-125A60 Autoclave를 이용하였다. 균을 배양하기 위해 Vision Scientific (Daejeon, Korea)사의 VS-1203P3N Incubator와 LAB house (Gyeonggi, Korea)사의 SI-220R Shaking incubator를 사용하였다. 균체 집균을 위한 원심분리기는 Hanil (Seoul, Korea)사의 Supra 22K, Micro-12, Smart-R17 을 이용하였고, 막 단백질 정제를 위한 초원심 분리기는 Beckman Coulter (Indianapolis, IN, USA)사의 Optima L-100K를 이용하였다. pH 측정은 Thermo Scientific (Pittsburgh, PA, USA)사의 ORION STAR A211 pH meter를 사용하였다. Vortex Mixer는 Barnsted-Thermolyne (Dubuque, IA, USA) 사의 Maxi Mix Ⅱ를 이용하였고, 교반기는 MTOPS사의 MS300 Hotplate & Magnetic Stirrer를 이용하였다. 저울은 Sartorius (Goettingen, Germany)사의 Analytical Balance CPA224S를 이용하였다. 단백질 정제를 위한 연동펌프로는 Pharmacia Biotech. (Uppsala, Sweden) Pump P-1를 사용하였고, 분별 수집기는 Fraction Collector FRAC-100를 이용하였다. 콜드 챔버는 Vision Scientific (Daejeon, Korea)사의 KMC-1302L를 이용하였고, 동결건조기와 초저온냉동고는 Ilshin Lab Co. (Gyeonggi, Korea)의 TFD5505 Freeze Dryer와 DF8503S Ultra Low Temperature Freezer를 이용하였다. 유전자의 Agarose gel 전기영동(electrophoresis) 장치는 Takara (Tokyo, Japan)의 mupid-2plus를 이용하였고, 단백질 전기영동 장치는 EIDO (Tokyo, Japan) NA-1010 Protein Electrophoresis를 이용하였다. 단백질 열 안정성 실험을 위한 Dry Bath Heating Block은 대한과학(Seoul, Korea)의 MaXtableTMH10을 사용하였다. PCR과 real time PCR 장치는 Bio-Rad (Berkeley, CA, USA)사의 Gene Cycler^TM와 CFX96을 이용하였고, 유전자 합성은 GenScript(Piscataway, NJ, USA)사에 의뢰하였다. 단백질 정량과 세포 수 측정을 위해 UV/VIS Spectrophotometer는 MECASYS (Daejeon, Korea)사의 OPTIZEN POP을 이용하였고, 단백질 2차 구조 분석을 위한 원편광 이색성 분광기(Circular Dichroism)는 Jasco (Easton, MD, USA)사의 J-815를 이용하였다. 항온조는 대한과학 (Seoul, Korea)사의 DH.WB000106을 사용하였다.

2. 시약

DNA 정제를 위한 Plasmid miniprep kit와 Gel extraction kit는 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)사의 CMG 0112, CMP 0112를 이용하였다. DNA 절단 과정은 제한효소 Sac Ⅰ, Sac Ⅱ와 Takara (Shiga, Japan)사에서 제공된 완충용액을 이용하였고, 유전자의 크기를 확인하기 위한 DNA marker는 Doctor protein (Seoul, Korea)사의 1kb Plus DNA Ladder Marker를 사용하였다. 대장균과 효모균을 배양하기 위한 yeast extract, Bacto peptone, Bacto tryptone, Bacto agar는 Difco laboratories(Sparks, NV, USA)의 제품을 사용하였다. P. pastoris 효모 균주의 형질전환을 위한 시약으로 Pichia EasyComp^TM Kit, G418은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)의 제품을 사용하였다. 그 외 Yeast nitrogen base, Tris-base, agarose, ampicillin, TEMED, sodium dodecyl sulfate(SDS), glass beads, sucrose,dimethyl sulfoxide(DMSO)등은 Sigma Chemical co.(St. Louis, USA)의 제품을 사용하였다. 30%, 40%-Acryl amide solution과 polypeptide protein marker, coomassie brilliant blue R-250은 Bio-Rad (CA, USA)사의 제품을, Real-time PCR에 사용되는 SYBR은 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA USA)사의 SYBR® Green Real-Time PCR Master Mixes를 사용하였다. 단백질 정제 시 사용한 CM Sepharose Fast flow는 GE healthcare (Buckinghamshire, UK)의 제품을 사용하였다. Butanol, acetic acid, sodium chloride는 Duksan Pure Chemical co.(Gyeonggi, Korea)의 제품을 사용하였으며 potassium chloride, L-ascorbic acid는 Daejung(Incheon, Korea)의 제품을, sodium phosphate, sodium acetate, sodium hydroxide, D-galactose, methanol, ethanol, glycine, tricine은 Samchun(Seoul, Korea)의 제품을 사용하였다. 그 외 완충용액을 만들기 위한 시약과 사용한 모든 시약은 일급 및 특급 시약을 사용하여 실험하였다.

3. 사용 균주와 발현 벡터

유전자 복제를 위해 Escherichia coli 균주인 TOP10을 Novagen (Madison, WI, USA)사에서 구입하였다. 감미단백질 브라제인을 발현하기 위한 균주 Kluyveromyces lactis GG799와 pKLAC2 벡터(vector)는 New England Biolab. (Ipswich, MA, USA)사로부터 구입하였다. 단맛 수용체 T1R2, T1R3의 발현 균주 Pichia pastoris GS115는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사로부터, pPIC9K 벡터는 GenScript(Piscataway, NJ, USA)사로부터 구입하였다.

II. 실험방법

1. P. pastoris 에서 재조합 인간 단맛 수용체의 발현 및 정제

1.1 막통과 부위 포함한 인간 단맛 수용체 유전자 합성

효율적인 정제를 위해 단맛 수용체의 N-말단 부분에 Twin-strep tag(Schmidt, T. G., & Skerra, A. (2007). The Strep-tag system for one-step purificationand high-affinity detection or capturing of proteins. Nature protocols , 2(6), 1528-1535; Schmidt, T. G., Batz, L., Bonet, L., Carl, U., Holzapfel, G., Kiem, K., Stanar, K. (2013). Development of the Twin-Strep-tag® and its application for purification of recombinant proteins from cell culture supernatants. Protein Expression and Purification,92(1), 54-61)[Genscript에서 제작]를 도입하였고, 정제 후 Twin-strep tag를 제거하기 위해 Twin-strep tag와 단맛 수용체의 유전자 서열 사이에 TEV protease cleavage site(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, Gln과 Gly 사이 절단)를 도입하였다. 사용되는 AcTEV Protease는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사로부터 구매하였다. 단맛 수용체의 아미노산 서열은(hT1R2:AH011576.2, hT1R3:BV725444.1) National Center for Biotechnology Information의 정보를 참고하였으며, Pichia pastoris로의 발현 효율을 높이기 위해 삽입할 모든 유전자 서열의 코돈 최적화를 진행하였다(도 2, 3). 코돈 최적화된 유전자 서열은 분비 발현을 유도하기 위해 pPIC9K의 BamHⅠ, NotⅠ 제한효소 자리에 삽입되도록 디자인하여 GenScript(Piscataway, NJ, USA)에 주문 제작하였다.

1.2 재조합 발현벡터 제작

상기 1.1에서 합성된 유전자(Twin-strep tag, TEV site, T1Rs 순서의 유전자)를 pPIC9K 벡터(GenScript, Piscataway, NJ, USA)에 도입하기 위해 BamHⅠ, NotⅠ 제한효소를 pPIC9K 벡터와 혼합하여 제한효소 자리를 분해하였다. BamHⅠ자리를 분해할 때는 30도에서 해당 활성 버퍼를 이용하여 4시간, NotⅠ자리를 분해할 때는 37도에서 해당 활성 버퍼를 이용하여 4시간 동안 반응을 진행하였다. 제한효소 자리가 분해된 선형의 pPIC9K는 0.8% agarose gel을 이용하여 확인하였다. 상기 1.1에서 합성한 유전자를 선형의 pPIC9K와 혼합하여 DNA Ligation Kit(Takara, Tokyo, Japan)를 이용해 16도에서 30분간 반응하여 삽입하였다.

단맛 수용체 유전자가 삽입된 pPIC9K-T1R2, pPIC9K-T1R3을 각각 제작하였다[도 4 및 도 5].

1.3 Pichia pastoris 로의 형질전환 및 재조합 T1R2와 T1R3 발현

단맛 수용체 유전자가 삽입된 pPIC9K-T1R2, pPIC9K-T1R3는 SacⅠ 제한효소 처리를 통해 선형화시킨 후 페놀 추출법으로 순수한 유전자만을 분리해내고, 에탄올 침전을 통해 600 ng/μL의 농도가 되도록 농축시켰다. 상기 1.2에서 제작한 재조합 발현벡터를 P. pastoris 균주인 GS115에 Pichia easy comp. Kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 형질전환을 하였다. 먼저, YPD에 30℃, 200rpm 으로 overnight하여 세포를 키운 후 OD600 값이 0,1 ~ 0.2 사이에 들어오도록 YPD로 희석하였다. 그 다음 다시 OD600 값이 0.6 ~ 1.0이 될 때까지 약 4 ~ 6시간 배양 후 세포만을 원심분리기를 이용해 500 x g로 5분간 처리해 분리하였다. 그 후 세포를 10ml의 Solution 1 용액으로 재현탁하며 다시 세포만을 분리해 1ml의 Solution 1 용액으로 재현탁하였다. 3μg의 재조합 유전자가 포함된 선형 벡터를 첨가하고 1ml의 Solution 2 용액을 섞어주었다. 30℃에서 1시간 동안 두면서 15분마다 voltexing을 진행하였으며, 42℃에서 열 충격을 10분간 처리하여 유전자가 세포 안에 들어갈 수 있도록 한 후 3000 x g에서 5분간 원심분리하여 세포를 취하였다. 1ml의 Solution 3 용액으로 세포를 재현탁하고 다시 3000 x g에서 5분간 원심분리하여 세포를 취해, 100 μl의 Solution 3 용액으로 재현탁 후 RDB(-His) 배지에 도말하고 30 ℃에서 3-4일간 배양 후 colony를 96개 선택하여 well마다 200 μL의 YPD(1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose)가 담긴 96 well plate에 계대 배양하였다. 계대 배양이 완료된 배양액은 well마다 10 μL씩 취하여 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 1.75, 2, 3, 4 mg/mL의 G418이 포함된 YPD에 각각 분주하였다. 이를 30 ℃에서 3-4일간 배양 후 가장 높은 농도의 G418이 포함된 YPD 배지에서 자란 colony를 선별하여 qPCR을 통해 유전자가 가장 다중으로 삽입된 colony를 최종적으로 선택하였다.

선택된 단일 colony는 5 mL의 BMGY(1% (w/v) Yeast extract, 2% (w/v) peptone, 1.34% (w/v) Yeast nitrogen base without amino acids, 0.00004% (w/v) biotin, 1% (w/v) glycerol, 0.1M potassium phosphate buffer at pH 6.0)에 접종하여 30 ℃에서 OD₆₀₀값이 2~6이 될 때까지 250 rpm으로 진탕 배양하고, 50 mL의 BMGY에 접종하여 같은 방법으로 배양하였다. 배양이 완료되면 5000g, 4 ℃의 조건에서 15분간 원심분리하여 glycerol이 포함된 배지를 제거하고 집균하였다. 발현을 유도하기 위해 모아진 세포 펠렛(pellet)은 2.5% (w/v)의 DMSO를 포함한 500 mL의 BMMY(1% (w/v) Yeast extract, 2% (w/v) peptone, 1.34% (w/v) Yeast nitrogen base without amino acids, 0.00004% (w/v) biotin, 1% (w/v) methanol, 0.1M potassium phosphate buffer at pH 6.0)에 접종하여 20 ℃에서 250 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양하며, 24시간마다 0.5% (w/v)의 methanol을 접종하여 단백질 발현 유도를 유지하였다. 배양이 완료되면 원심분리를 통해 세포만을 얻어내고, -80 ℃에서 보관하였다.

1.4 재조합 T1R2와 T1R3 정제

세포막을 얻어내기 위해, 세포 습중량 1 g 당 4 mL의 파쇄 완충용액(50 mM sodium phosphate buffer,pH 7.4, 100 mM NaCl, 5% (v/v) glycerol, 2 mM EDTA)을 넣어 재현탁하였다. 이 현탁 용액과 동일한 부피의 0.5 mm glass beads를 넣고 30 초간 voltexing, 30초간 얼음에 보관을 10회 반복하여 세포를 파쇄하였다. 온전한 세포와 세포 잔여물은 5000g, 4 ℃의 조건에서 10분 간 저속 원심분리를 하여 분리하였다. 이때 얻은 상층액은 150,000g, 4 ℃의 조건에서 45분간 초원심분리(ultracentrifuge)하여 상층액을 제거하고, 막 완충용액(50 mM Tris at pH 8.0, 120 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF)에 재현탁하여 같은 조건으로 초원심분리를 진행하였다. 세포막 펠렛은 막 완충용액에 재현탁하여 -80 ℃에 보관하였다. 세포막 용액은 1 mg/mL의 농도가 되도록 가용화 완충용액(최종 농도: 50 mM sodium phosphate at pH 7.4; 10% glycerol; 400 mM NaCl)에 희석시켰다. 희석 용액에 계면활성제 n-dodecyl β-D-maltopyranoside (DDM)를 최종 농도가 20 mM가 되도록 넣은 후, 상온에서 15분간 저어준 뒤 150,000g, 4 ℃의 조건에서 45분간 초원심분리(ultracentrifuge)하여 상층액을 취하였다.

최종적으로 얻어진 상층액은 Strep-Tactin Sepharose Column을 이용하여 정제하였다. 우선, 2 CV(column bed volume)의 세척 완충용액(100 mM Tris/HCl at pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)로 column을 평형상태로 만들었다. 그 후. 0.5~10 CV에 해당하는 세포막 용액을 준비하였다. column에 loading하기 전, 녹지 않은 불순물 등을 15000g, 4 ℃의 조건으로 5분간 원심분리를 진행하여 제거하였다. 세포막 용액을 column에 모두 loading 하고 나면, 1 CV의 Buffer W를 5회 넣어줌으로써 column을 세척하였다. 세척이 완료되면 3 CV의 용출 완충용액(100 mM Tris/HCl at pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM desthiobiotin)를 넣고 용출액을 받았다. 이후 15 CV 만큼의 재생(Regeneration) 완충용액(100 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM HABA(hydroxy-azophenyl-benzoic acid), pH 8.0)을 넣어 column 기능의 재생을 진행허였다. 그 후, column의 붉은색이 사라질 때까지 4 CV의 세척 완충용액을 흘려줌으로써 재생 완충용액에 포함된 HABA를 제거하였다.

정제가 완료된 T1Rs는 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM DDM 용액에 투석하여 용출 완충용액에 포함된 염 및 desthiobiotin을 제거하였다. 그 후 3 ㎍의 단백질에 1 unit의 TEV protease가 포함되도록 계산하여 21 ℃에서 6시간 동안 incubation시켜 twin-strep tag의 절단을 유도하였다. T1Rs, twin-strep tag, TEV protease의 혼합용액은 Sephacryl S-300 크기배제 크로마토그래피에 로딩하였다. 그 후 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM DDM 버퍼를 0.3 mL/min의 유속으로 흘려주고 분획용출을 받아 분리해내어 결과적으로 고순도의 재조합 T1Rs를 얻어냈다. 각각 발현, 정제된 T1R2, T1R3는 VFTM 간의 수소결합을 형성하여 스스로 이합체를 형성하기 때문에 1 : 1 몰 비율로 혼합하여 12시간 동안 상온에 방치하였다. 이합체를 형성하지 못한 T1R2, T1R3 단량체는 Sephacryl S-300 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

2. 단백질 정량

모든 정제된 단맛수용체 단량체들은 205 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 대부분의 단백질은 1 mg/mL 용액 기준으로 205 nm 에서 고유의 흡광 계수를 가지고 있으며, 이 흡광 계수는 단백질 측정을 위한 최적의 파장이 205 nm가 되도록 한다(Scopes, R. (1974). Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry , 59(1), 277-282).

UV/Vis 흡광 광도계의 기준 흡광도는 단맛수용체 단량체를 용해시킨 용매로 측정하여 고정시켰다. 각 단백질 샘플은 미광 효과(stray effect)를 최소화시키기 위해 205 nm 에서의 흡광도 값이 0.3에 근접할 때까지 점차적으로 희석시켰다. 희석시킨 단백질 용액은 205 nm 와 280 nm에서의 흡광도를 각각 3회 측정하여 평균값을 구한다. 그 후, 식 ε₂₀₅ ^1mg/mL=120×(A₂₈₀/A₂₀₅)+27을 이용하여 각 단백질 샘플의 고유 몰 흡광계수를 구하였다. 본래의 단백질 샘플 농도는 Concentration(mg/mL) = A₂₀₅/ε₂₀₅ ^1mg/mL의 식을 이용하여 구한 값에 희석배수를 곱하여 구하였다.

III. 결 과

1. P. pastoris 에서 재조합 인간 단맛 수용체의 발현 및 정제

단맛수용체 유전자가 삽입된 pPIC9K-T1R2, pPIC9K-T1R3는 SacⅠ 제한효소 처리를 통해 선형화시킨 후 페놀 추출법으로 순수한 유전자만을 분리해내고, 에탄올 침전을 통해 농축시킨 결과 고농도의 선형 pPIC9K-T1Rs 유전자를 얻어낼 수 있었다(도 6). 이 유전자를 형질전환 GS115 균주는 RDB(-His) 배지에서 1차 선별, 농도 별 G418이 포함된 YPD 배지에서 2차 선별을 진행하였다. 선별이 완료된 균주는 50 mL scale로 배양하여 발현양상을 탐색한 결과 membrane crude에서 단맛 수용체가 발현됨을 확인하였다(도 7). 또한, 단맛수용체의 과발현 최적화를 위하여 BMMY 배지에서의 배양온도, 시간, DMSO의 첨가여부를 기준으로 발현량을 비교하였다. 배양온도는 20 ℃와 30 ℃를 비교하였으며, 2.5%(w/v)의 DMSO를 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지를 구별하여 균주를 접종한 뒤 96시간 동안 배양하고 24시간 간격으로 발현량을 확인하였다. 그 결과 20 ℃에서 72시간 동안 2.5% DMSO가 포함된 BMMY 배지에서 배양했을 때의 발현량이 가장 많은 것으로 나타났다(도 8). 즉, 막통과부위가 포함된 인간 단맛 수용체 발현을 도 8로 확인하였다(재조합 벡터가 형질전환되지 않은 균주에서는 수용체의 크기인 100kDa 크기에 밴드가 나오지 않지만 재조합 벡터가 형질전환된 균주에서는 나오는 것으로 보아 수용체 발현이 된 것으로 확인 가능함)

발현이 완료된 P. pastoris 균체는 Glass bead를 이용하여 파쇄하고 원심분리를 이용하여 plasma membrane을 분리하였다. 가용화 단계를 통해 T1Rs를 용매화 시키는 과정에서 적절한 계면활성제를 찾기 위해 일반적으로 막 단백질에 주로 쓰이는 Octyl β-D-glucopyranoside(β-OG)와 n-Dodecyl β-D-glucopyranoside(DDM)을 비교하였다. 막 단백질 용해에 적합한 β-OG의 농도는 120 mM 이며, DDM의 농도는 20 mM가 적합하다고 알려져 있기 때문에 해당 농도에 맞추어 가용화를 진행하였다. 그 결과 β-OG에 비하여 DDM의 경우 가용화가 월등히 잘 되었음을 확인하였다(도 9). 가용화가 완료된 T1Rs 용액은 친화성 크로마토그래피인 Strep-tactin gravity flow column을 이용하여 T1Rs의 정제를 진행하고, TEV protease 처리하여 Sephacryl S-300 크기배제 크로마토그래피로 분리하였다. 각각의 정제 수율을 계산한 결과 1 L의 배양액에서의 최종 정제 수율은 T1R2가 0.17 mg/L인 것으로 나타났고, T1R3는 0.11 mg/L 임을 확인하였다. 고순도로 정제된 T1Rs는 몰 흡광 계수를 정확히 구하기 위해 205 nm 에서의 흡광도(A205)가 0.3 에 근접하도록 희석하였다. 그 후 희석된 단백질 용액을 280 nm에서의 흡광도(A280)를 측정하였다. 모든 흡광도 측정은 최소 3회 이상 반복 측정하여 평균값을 구하였고, A205및 A280값을 통해 T1Rs의 고유 몰 흡광계수를 구하였다(표 1). T1R2의 분자량은 95,183.43 Da 이며, T1R3의 분자량은 93,439.09 Da인 것으로 알려져 있다. 따라서, 두 분자의 이합체는 약 188,622.52 Da일 것으로 예상하고 이합체 형성 후 Sephacryl S-300 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 단량체와 이합체를 분리하였다.

인간 감미 수용체의 추정된 몰 흡광 계수 (ε205).

Subunit	Abs205	Abs280	ε205
T1R2	0.311	0.026	37.03
T1R3	0.326	0.025	36.20

IⅤ. 고 찰

1. P. pastoris를 이용한 인간 단맛 수용체의 발현 및 정제 연구

P. pastoris는 세포가 고밀도로 성장하고, 강력하게 조절되는 프로모터를 가지고 있으며 과발현이 용이하여 재조합 단백질 생산에 주로 쓰이는 균주이며, 그 중에서도 GPCR의 발현계로 그 효율성이 입증되었다. 하지만 인간 단맛 수용체가 속해 있는 C타입 GPCR은 세포 밖으로 돌출된 부분이 존재하여 단백질 분해효소에 민감한 특징을 가지고 있어 발현이 매우 어려우며, 효모균주에서 C타입 GPCR의 안정적인 발현이 확립된 결과는 아직까지 확인되지 않고 있다.

이러한 연구 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 효모 P. pastoris를 이용하여 막 통과부위를 포함한 전장 단맛 수용체(full length sweet taste receptor)의 발현계를 작성하였다. 또한, 배양온도, 배양 시간 및 DMSO 첨가 여부 등을 조절하여 재조합 단백질의 발현 최적화와 정제를 진행하였다. 그 결과 평균 1.82 ~ 2.14 mg/L의 수율로 고순도의 전장 단맛수용체를 얻었다. 이는 동일한 종류의 친화성 tag를 이용하여 GPCR을 정제한 결과와 비교해 보았을 때, 1 L의 유도배지 당 평균 약 0.35 mg로 얻어지는 정제된 GPCR의 수율에 비하여 상대적으로 높음을 알 수 있었다(Magnin T et al., Protein expr Purif, 2009 Mar;64(1):1-7). 또한 일반적으로 수용체 정제에는 Histidine tag를 선호하지만, 본 발명에서는 다른 tag에 비해 상대적으로 높은 친화성을 가지고 있어 정제 수율이 높은 twin-Strep tag를 이용하여 정제를 진행하였다(Lichty et al., 2005; Magnin et al., 2009; Routledge et al., 2016). 그 결과 막 단백질의 특성으로 인하여 수율은 낮지만 약 446.7배, 약 360.4배의 높은 정제도로 95% 이상의 높은 순도의 T1R2, T1R3 단량체를 얻어낼 수 있었다(표 2 및 표 3).

상대적으로 낮은 수율은 세부적인 최적화를 통한 발현율 증대연구로 개선할 수 있을 것으로 기대되며, P. pastoris 발현계를 통해 얻어진 단맛수용체의 단량체 및 이합체를 이용하여 초저온 전자현미경 측정 및 X-선 구조결정 분석을 진행하여 단맛수용체의 구조를 파악하는 데 본 발현계가 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

T1R2 정제

Purification of step	Fraction volume (mL)	Total protein (mg)
Crude cellular extracts	1000	956
Membrane preparation	30	23.90
Strep-tactin	10	4.78
Sephacryl S-300	1	2.14

T1R3 정제

Purification of step	Fraction volume (mL)	Total protein (mg)
Crude cellular extracts	1000	656
Membrane preparation	300	21.30
Strep-tactin	10	3.97
Sephacryl S-300	1	1.82

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for expression and purification of human sweet taste receptor <130> P17U21C0352 <150> KR 10-2017-0025517 <151> 2017-02-27 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 839 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1R2 <400> 1 Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp 1 5 10 15 Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile 35 40 45 Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val 50 55 60 Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu 65 70 75 80 Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr 85 90 95 Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu 100 105 110 Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr 115 120 125 Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser 130 135 140 Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro 145 150 155 160 Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg 165 170 175 Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Ile Glu 180 185 190 Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val 195 200 205 Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly 210 215 220 Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg 245 250 255 Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val 260 265 270 Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val 275 280 285 Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp 290 295 300 Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Arg His Leu Gly 305 310 315 320 Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser 325 330 335 Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg 340 345 350 Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn 355 360 365 Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val 370 375 380 Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His 385 390 395 400 Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr 405 410 415 Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu 420 425 430 Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu 435 440 445 Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser 450 455 460 Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp 465 470 475 480 Ile Ser Trp His Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser 485 490 495 Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val 500 505 510 Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His 515 520 525 Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser 530 535 540 Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu 545 550 555 560 Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly 565 570 575 Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln 580 585 590 Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu 595 600 605 Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro 610 615 620 Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys 625 630 635 640 Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val 645 650 655 Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp 660 665 670 Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu 675 680 685 Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro 690 695 700 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys 705 710 715 720 Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu 725 730 735 Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu 740 745 750 Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe 755 760 765 Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser 770 775 780 Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu 785 790 795 800 Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu 805 810 815 Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln 820 825 830 Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp 835 <210> 2 <211> 840 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1R3 <400> 2 Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His 1 5 10 15 Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys 20 25 30 Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu 35 40 45 Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg 50 55 60 Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val 65 70 75 80 Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly 85 90 95 Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro 100 105 110 Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr 115 120 125 Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro 130 135 140 His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe 145 150 155 160 Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala 165 170 175 Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val 180 185 190 Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp 195 200 205 Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu 225 230 235 240 Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val 245 250 255 Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu 260 265 270 Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile 275 280 285 Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu 290 295 300 Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr 305 310 315 320 Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln 325 330 335 Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser 340 345 350 Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln 355 360 365 Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly 370 375 380 Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val 385 390 395 400 Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro 405 410 415 Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn 420 425 430 Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly 435 440 445 Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser 450 455 460 Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr 465 470 475 480 Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val 485 490 495 Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys 500 505 510 Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser 515 520 525 Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp 530 535 540 Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg 545 550 555 560 Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 565 570 575 Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His 580 585 590 His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys 595 600 605 Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe 610 615 620 Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser 625 630 635 640 His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala 645 650 655 Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu 660 665 670 Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala 675 680 685 Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro 690 695 700 Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val 705 710 715 720 His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr 725 730 735 Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg 740 745 750 Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met 755 760 765 Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn 770 775 780 Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu 785 790 795 800 Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu 805 810 815 Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly 820 825 830 Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln 835 840 <210> 3 <211> 2517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T1R2 <400> 3 atgggtccaa gagctaagac aatctccagt ttgtttttct tgttatgggt tttagctgaa 60 ccagctgaaa attctgattt ctatttgcca ggtgactact tgttaggtgg tttgttttca 120 ttgcatgcaa acatgaaggg tatcgtccac ttgaacttct tacaagttcc tatgtgtaag 180 gaatacgaag ttaaagtaat cggttacaat ttgatgcaag ccatgagatt cgctgtagaa 240 gaaattaata acgattcttc attgttacca ggtgtcttgt tgggttacga aatcgttgat 300 gtttgttaca tctctaacaa cgttcaacct gtattgtact ttttggctca tgaagataat 360 ttgttgccaa tccaagaaga ctactccaac tacatcagta gagttgtagc cgttattggt 420 cctgataatt ctgaatcagt catgacagtt gctaactttt tgtcattatt cttgttgcca 480 caaatcacct actcagcaat ttccgatgaa ttgagagaca aggttagatt ccctgccttg 540 ttaagaacca ctccatctgc cgatcatcac attgaagcta tggttcaatt gatgttgcat 600 ttcagatgga actggatcat cgtattagtc tccagtgata cttatggtag agacaacggt 660 caattgttag gtgaaagagt tgcaagaaga gatatttgta ttgcctttca agaaaccttg 720 cctactttac aaccaaatca aaacatgaca tctgaagaaa gacaaagatt ggtaaccata 780 gtcgataaat tacaacaatc tactgctaga gtcgttgtag tcttctcacc tgacttgact 840 ttgtaccatt tctttaacga agtcttgaga caaaacttca caggtgcagt ttggatagcc 900 tccgaaagtt gggcaatcga tccagttttg cataatttga cagaattgag acacttaggt 960 acatttttgg gtataacaat ccaatctgtt cctattccag gtttttcaga gtttagagaa 1020 tggggtccac aagctggtcc acctccattg tcaagaacct ctcaatcata cacttgtaac 1080 caagaatgtg ataactgctt gaacgctaca ttatccttta acaccatatt gagattaagt 1140 ggtgaaagag ttgtatatag tgtttactct gctgtttatg cagtagccca tgctttacac 1200 tccttgttag gttgtgataa gagtacttgc acaaaaagag tcgtttaccc ttggcaattg 1260 ttagaagaaa tatggaaggt taacttcact ttgttagatc atcaaatctt tttcgatcca 1320 caaggtgacg tagctttgca cttagaaatt gtccaatggc aatgggacag atcacaaaat 1380 ccttttcaat cagttgcatc ctattaccca ttgcaaagac aattaaagaa catccaagat 1440 atatcctggc atacaattaa taacaccatc ccaatgagta tgtgttctaa aagatgccaa 1500 tctggtcaaa agaagaaacc tgtcggtatc catgtttgtt gcttcgaatg tattgattgc 1560 ttgccaggta catttttgaa tcacacagaa gacgaatatg aatgtcaagc atgtcctaat 1620 aacgaatggt cataccaatc cgaaaccagt tgtttcaaga gacaattggt cttcttagaa 1680 tggcatgaag caccaacaat agcagttgcc ttgttagctg cattgggttt cttatcaact 1740 ttggccatct tggttatttt ctggagacac ttccaaacac ctatcgtcag atcagctggt 1800 ggtccaatgt gtttcttgat gttgactttg ttgttggttg catacatggt agtccctgtt 1860 tacgtaggtc ctccaaaggt atctacctgt ttgtgcagac aagcattgtt cccattgtgt 1920 ttcactattt gtatctcttg cattgccgtt agatcatttc aaatcgtatg cgctttcaaa 1980 atggcttcaa gatttcctag agcctattca tactgggtta gataccaagg tccatacgta 2040 tcaatggctt ttattacagt attgaagatg gtcatagttg taatcggcat gttggctaca 2100 ggtttatccc ctacaaccag aaccgatcct gatgacccaa agatcactat cgttagttgt 2160 aacccaaact acagaaattc cttgttgttt aacactagtt tagacttatt gttatctgtc 2220 gttggttttt cattcgctta catgggtaaa gaattgccaa caaactacaa cgaagcaaaa 2280 ttcattactt tgtccatgac attctatttc acctcttcag ttagtttgtg tacttttatg 2340 tctgcttact caggtgtctt ggttaccatc gttgatttgt tggtaactgt cttgaatttg 2400 ttagcaattt ctttaggtta cttcggtcca aaatgctaca tgatcttatt ttaccctgaa 2460 agaaacacac cagcttactt caactcaatg atccaaggtt acaccatgag aagagat 2517 <210> 4 <211> 2520 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T1R3 <400> 4 atgttgggtc ctgctgtttt gggtttatct ttgtgggcat tgttacatcc aggtactggt 60 gcccctttgt gtttgtcaca acaattgaga atgaagggtg actacgtttt aggtggtttg 120 ttccctttag gtgaagccga agaagctggt ttgagatcaa gaactagacc atccagtcct 180 gtctgtacaa gattttcttc aaacggtttg ttatgggcat tagccatgaa gatggctgtt 240 gaagaaatta ataacaagtc tgatttgtta ccaggtttaa gattgggtta tgatttgttc 300 gacacatgtt ctgaaccagt tgtagctatg aagccttcat tgatgttctt ggctaaggca 360 ggttccagag acattgctgc atattgtaat tacacccaat atcaaccaag agttttagcc 420 gtaataggtc ctcattccag tgaattggct atggtaactg gtaaattttt ctctttcttt 480 ttgatgccac aagtctcata cggtgcttct atggaattgt taagtgcaag agaaaccttt 540 ccatctttct ttagaactgt tccttcagat agagtacaat taactgctgc tgctgaattg 600 ttacaagaat ttggttggaa ttgggttgcc gctttgggtt cagatgacga atacggtaga 660 caaggtttga gtatcttttc tgcattggca gccgctagag gtatttgtat agctcatgaa 720 ggtttggttc cattacctag agcagatgac tcaagattag gtaaagtcca agatgttttg 780 caccaagtca accaatcttc agttcaagtc gttttgttat tcgcctctgt tcatgcagcc 840 cacgctttgt ttaattactc aatatccagt agattgtccc caaaggtctg ggttgcaagt 900 gaagcctggt taacatctga tttggttatg ggtttacctg gtatggctca aatgggtact 960 gtattgggtt tcttacaaag aggtgcacaa ttgcatgaat ttccacaata cgttaagact 1020 cacttagcct tggctacaga tcctgcattt tgctctgcct taggtgaaag agaacaaggt 1080 ttggaagaag atgtagtcgg tcaaagatgt ccacaatgtg actgcattac tttacaaaac 1140 gtctctgctg gtttgaatca tcaccaaaca ttttccgttt acgctgctgt ttatagtgtc 1200 gcacaagcct tgcataacac attacaatgt aatgcctctg gttgcccagc tcaagatcca 1260 gttaagcctt ggcaattgtt agaaaacatg tacaacttaa ctttccacgt tggtggttta 1320 cctttgagat ttgactcttc aggcaacgta gatatggaat acgacttaaa gttgtgggta 1380 tggcaaggtt cagtcccaag attgcatgat gtaggtagat tcaatggttc cttgagaacc 1440 gaaagattaa aaataagatg gcacactagt gacaatcaaa agccagtttc aagatgttcc 1500 agacaatgcc aagaaggtca agttagaaga gtaaagggtt tccatagttg ttgctacgat 1560 tgtgttgact gcgaagctgg ttcttataga caaaatccag atgacatcgc atgtaccttt 1620 tgcggtcaag atgaatggag tcctgaaaga tcaactagat gtttcagaag aagatcaaga 1680 tttttggcat ggggtgaacc agccgttttg ttattattgt tgttgttgtc attagctttg 1740 ggtttggttt tggccgcttt aggtttgttt gtacatcaca gagattcacc attagtccaa 1800 gcctccggtg gtcctttggc ttgtttcggt ttagtttgct taggtttagt atgtttgagt 1860 gtcttattgt ttccaggtca accatctcct gctagatgct tggcacaaca accattatca 1920 catttgcctt tgacaggttg tttatccacc ttattcttgc aagcagccga aatttttgtt 1980 gaatcagaat taccattgtc ctgggctgat agattgtctg gttgcttaag aggtccttgg 2040 gcatggttgg ttgtattatt ggcaatgttg gtagaagtcg ccttatgtac ttggtacttg 2100 gttgcttttc cacctgaagt cgttacagat tggcacatgt tacctaccga agcattggtt 2160 cattgtagaa caagaagttg ggtatctttc ggtttagctc atgcaaccaa cgctactttg 2220 gcatttttat gtttcttggg tacatttttg gttagatcac aaccaggtag atacaataga 2280 gctagaggtt taacatttgc catgttggct tatttcatca cctgggtctc ttttgttcca 2340 ttattggcta acgtccaagt agtcttaaga cctgctgttc aaatgggtgc attattgttg 2400 tgcgttttgg gtattttggc tgcattccat ttgccaagat gttatttgtt gatgagacaa 2460 ccaggtttga atactcctga atttttcttg ggtggtggtc caggtgacgc tcaaggtcaa 2520 2520 <210> 5 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AOX1 promoter <400> 5 gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga catccacagg 60 tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca gcagaccgtt 120 gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat cgaaaaacca 180 gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa 240 caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat 300 ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 360 gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt ttaaacgctg 420 tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt 480 tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcgccat accgtttgtc 540 ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta gcgcagtctc 600 tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa acacccgctt 660 tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt gggaatactg 720 ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt gacagcaata 780 tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat tattagctta 840 ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac ttttaacgac 900 aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaa 936 <210> 6 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-strep tag <400> 6 tggagccatc cgcagtttga aaaaggcggc ggcagcggcg gcggcagcgg cggcagcgct 60 tggagccatc cgcagtttga aaaa 84 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-strep tag <400> 7 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25

Claims (5)

1. 서열번호 3으로 표시되는 인간 단맛 수용체 T1R2 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 서열번호 5로 표시되는 AOX1(Alcohol oxidase 1) 프로모터; 및 서열번호 6으로 표시되는 트윈-스트렙 태그(Twin-strep tag)를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및
   상기 효모의 배양물로부터 발현된 인간 단맛 수용체 T1R2 단백질을 정제하는 단계;
   를 포함하는 인간 단맛 수용체 T1R2 단백질의 발현 및 정제 방법.
   
2. 서열번호 4로 표시되는 인간 단맛 수용체 T1R3 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 서열번호 5로 표시되는 AOX1(Alcohol oxidase 1) 프로모터; 및 서열번호 6으로 표시되는 트윈-스트렙 태그(Twin-strep tag)를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및
   상기 효모의 배양물로부터 발현된 인간 단맛 수용체 T1R3 단백질을 정제하는 단계;
   를 포함하는 인간 단맛 수용체 T1R3 단백질의 발현 및 정제 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 재조합 발현벡터는 도 4의 개열지도로 표시되는 pPIC9K-T1R2인, 방법.
   
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 재조합 발현벡터는 도 5의 개열지도로 표시되는 pPIC9K-T1R3인, 방법.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 형질전환된 효모를 15~20 ℃에서 60 ~ 80시간 1~5%의 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 포함된 배지에서 배양하는 방법.

Images