KR102070217B1 - 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스 및 조류 종을 면역화하기 위한 백신 - Google Patents

다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스 및 조류 종을 면역화하기 위한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 조류 헤르페스 바이러스로서, 각각의 재조합 뉴클레오티드 서열이 구별되는 항원 펩티드를 인코딩하며, 상기 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열이 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 중에서 선택되는 바이러스 게놈의 구별되는 비-코딩 영역 내로 삽입되는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 관한 것이다.

Description

다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스 및 조류 종을 면역화하기 위한 백신{MULTIVALENT RECOMBINANT AVIAN HERPES VIRUSES AND VACCINES FOR IMMUNIZING AVIAN SPECIES}
본 발명은 일반적으로 백신 제제의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로는 2개 이상의 외래 유전자가 삽입된 다가 재조합 헤르페스 바이러스, 및 다수의 조류 병에 대항하여 보호 면역을 동시에 유도하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
가금류 고기 및 계란은 중요한 식품 공급원으로, 이의 소비는 인류의 성장 및 가금류의 좋은 품질-가격 비로 인해 지속적으로 증가하고 있다. 최근의 조류 인플루엔자의 유행으로 가금류 건강 뿐 아니라 식품 안정성 및 안전에 대한 여론이 집중되고 있다. 가금류 백신 기술은 전세계적인 관심사가 되었다.
병원체 단백질을 발현하는 바이러스 벡터는 통상 표적된 병원체에 대항하는 가금류 백신으로서 사용된다. 이러한 바이러스 벡터를 포함하는 백신은 감염된 세포 내에서 외래 병원체 단백질의 발현을 유도하고, 이에 의해 상응하는 T 세포 면역성을 유도한다.
칠면조의 헤르페스 바이러스(HVT) 및 마렉병 바이러스(MDV)를 비롯한 모든 헤르페스 바이러스가 잠복 또는 지속 감염 상태로 감염된 동물의 체내에서 영구적으로 살아남을 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 병원체로부터 유래된 외래 유전자가 통합된 재조합 헤르페스 바이러스는 면역화된 동물에게 면역성의 지속기간을 증가시키는 바이러스-벡터 백신으로서 사용되도록 개발되었다.
HVT의 게놈 구조, MDV에 대항하는 백신으로서의 이의 광범위한 용도 및 닭에 영구적으로 남아있는 이의 능력이 상기 바이러스를 재조합 가금류 백신을 제조하기 위한 매력적인 벡터로 만든다.
백신 제제는 외래 항원을 인코딩하는 유전자를 도입한 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 효과적인 조류 백신화를 달성하게 하도록 개발되었다. 이러한 백신 제제는 삽입된 외래 DNA 서열을 통해, MDV(벡터) 및 또다른 조류 병 둘다에 대항하는 백신화를 허용하도록 한다.
이러한 백신 제제가 많은 치명적인 질환에 대항하여 조류 종을 백신화하기 위해 효과적인 결과를 제공하기는 하지만, 새에게 각각 상이한 외래 항원 유전자를 가지고 있는 2개 이상의 재조합 헤르페스 바이러스를 주입하는 경우, 병원체 사이에 경쟁 및 면역억제가 일어날 수 있다.
그러므로, 상이한 질환에 대항하여 동시에 면역화하기 위한 다가 재조합 헤르페스 바이러스(즉, 2개 이상의 상이한 항원 유전자를 가짐)가 특별히 연구될 것이다. 그러나, 지금까지, 복합 외래 유전자를 발현하는 재조합 HVT(rHVT)는 불안정한 것으로 밝혀졌고, 외래 유전자의 모두 또는 일부가 배양 세포에서 반복되는 계대 동안 결실된다. 따라서, 이러한 불안정한 다가 바이러스 벡터는 효과적인 백신으로서 사용될 수 없다.
따라서, 감염된 세포 내에서 외래 유전자의 공-발현을 가능하게 하는, 안정적인 다가 재조합 바이러스-벡터에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
본 출원인에 의해 수행된 연구는 헤르페스 바이러스 게놈 내 특정 삽입 부위 세트가 2개 이상의 항원 유전자를 안정하게 삽입하고 발현하여, 조류 백신화를 위한 효과적인 다가 바이러스 벡터를 제공하기 위해 사용될 수 있다는 놀라운 발견을 야기하였다. 더욱 특히, 본 출원인은 몇몇 개의 삽입 부위가 구별되는 항원 유전자를 도입하여, 안정한 다가 재조합 바이러스-벡터를 제공하는데 동시에 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
그러므로, 본 발명은 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 조류 헤르페스 바이러스로서, 각각의 재조합 뉴클레오티드 서열이 조류 종의 세포에서 항원 펩티드를 인코딩하고 발현하며, 상기 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열이 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 중에서 선택되는 바이러스 게놈의 구별되는 비-코딩 영역 내로 삽입되는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 하나의 재조합 뉴클레오티드 서열은 UL45와 UL46 사이에 위치한 영역 내로 삽입되고, 하나의 재조합 뉴클레오티드 서열은 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 또는 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 내로 삽입된다. 본 출원에서 예증되는 바와 같이, 이러한 재조합 조류 헤르페스 바이러스 구축물은 감염된 조류 세포에서 2개의 상응하는 항원 펩티드의 특히 안정하고 효과적인 발현을 제공한다.
특히, 유리하게는, 2개 또는 그 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열은 심지어 10회 이상의 계대 후에도, 우선적으로는 심지어 15회 계대 후에도 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포에서 공발현된다.
본 발명에 따르면, 재조합 뉴클레오티드 서열은 유리하게는 특정 프로모터의 조절 하에 있다. 프로모터는 우선적으로는 닭 베타-액틴(Bac) 프로모터, Pec 프로모터, 뮤린 사이토메갈로바이러스(Murine Cytomegalovirus: Mcmv) 즉발성-초기 (ie)1 프로모터, 인간 사이토메갈로(Human Cytomegalovirus: Hcmv) 프로모터, 시미안 바이러스(Simian Virus: SV)40 프로모터, 및 라우스 사르코마 바이러스(Raus Sarcoma Virus: RSV) 프로모터, 또는 프로모터 활성을 보유하는 이의 임의의 단편 중에서 선택된다. 우선적으로는, 각각의 재조합 뉴클레오티드 서열은 구별되는 프로모터의 조절 하에 있다.
본 발명에 따르면, 외래 유전자는 유리하게는 조류 파라믹소바이러스 유형 1의 항원 펩티드, 및 우선적으로는 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus: NDV)의 F 단백질, 감보로병 바이러스의 항원 펩티드, 우선적으로는 전염성 점액낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus: IBDV)의 VP2 단백질, 전염성 후두기관염 바이러스(Infectious laryngotracheitis virus: ILTV)의 항원 펩티드, 우선적으로는 gB 단백질, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum)의 항원 펩티드, 우선적으로는 40K 단백질, 및 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 펩티드, 우선적으로는 표면 단백질 헤마글루티닌(HA) 중에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL44와 UL45 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 첫번째 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL45와 UL46 사이에, US10과 SORF3 사이에, 또는 SORF3과 US2 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 두번째 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 첫번째 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이에, 또는 SORF3과 US2 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 두번째 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 US10과 SORF3 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 첫번째 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 두번째 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 본 발명의 목적은 본 발명의 재조합 조류 헤르페스 바이러스를 면역화 유효량으로 포함하는, 조류 종, 예컨대 가금류를 면역화하기 위한 다가 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 조류 종, 예컨대 가금류를 면역화하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 본 발명의 목적은 조류 종을 유효량의 본 발명의 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 의해 면역화하고 새를 출혈시킨 후 항혈청을 회수함에 의해 수득된 조류 헤르페스 바이러스에 대항하도록 하는 항혈청에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 백신을 면역화 유효량으로 상기 조류에게 투여하는 것을 포함하는 조류를 면역화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 유효량의 본 발명의 백신, 및 상기 성분을 조류 종에 투여하기 위한 수단을 포함하는 조류 종을 면역화하기 위한 백신화 키트를 제공한다.
본 발명은 임의의 조류 병원체에 대항하는 백신화를 위해, 임의의 조류에서 사용될 수 있다.
도 1은 HVT 게놈의 도식을 보여준다. Unique Long(UL) 44, UL45 및 UL46의 위치 및 Unique Short(US)10, SORF3 및 US2의 위치가 표시된다. 재조합 뉴클레오티드 서열은 UL44와 UL45 사이에, 및/또는 UL45와 UL46 사이에, 및/또는 US10과 SORF3 사이에, 및/또는 SORF3과 US2 사이에 PCR 생성된 SfiI 부위에 삽입될 수 있다.
도 2A 및 2B는 본 발명의 특정 구현예에 따라, 뉴클레오티드 서열 및 프로모터의 상이한 클러스터를 통합하는 HVT 게놈의 도식을 보여준다.
도 3은 NDV-F 및 IBDV-VP2(rHVT/ND/IBD 감염된 세포)를 공-발현하는 본 발명의 구현예에 따른 이중 재조합 HVT(FW129 및 FW141)에 의해 감염된 CEF의 면역형광 염색을 보여준다. 단백질 VP2 발현은 항-VP2 Mab(R63) 및 Alexa Flour 546에 의해 검출되었다. 단백질 F 발현은 항-F #35 토끼 혈청 및 Alexa Flour 488에 의해 검출되었다. 그 결과는, FW129 또는 FW141에 의해 감염된 세포 모두가, 삽입된 NDV-F 단백질 및 삽입된 IBDV-VP2 단백질을 모두 발현한다는 것을 보여준다.
도 4A 및 4B는 본 발명의 rHVT에 의해 감염된 CEF 세포에서 VP2 단백질 및/또는 F 단백질의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯팅 분석이다. 도 4A에 제시되는 바와 같이, 60 킬로달톤(kDa)의 단백질 밴드는 rHVT/ND/IBD 감염된 세포에 의한 라인에서만 관찰되었고, 이것은 F 단백질의 예상된 크기였다(
Figure 112014104763662-pct00001
). rHVT/44-45BacVP2 (FW123)의 라인에서는 밴드가 없었다. 도 4B에 제시되는 바와 같이, VP2 단백질은 각각의 rHVT/ND/IBD의 라인에서 38-킬로달톤(kd)으로 관찰되었다(
Figure 112014104763662-pct00002
). 반면, rHVT/45-46 PecF (FW029)의 라인에서는 밴드가 없었다. 38-kd은 성숙 VP2 단백질이다(A. A. Azad et al., 1987, Virol. 161:145-152, K. J., Fahey et al., 1985 J. Gen. Virol. 66:1479-1488). 본 발명의 이중 rHVT는 NDV-F 및 IBDV-VP2 모두를 발현하였다.
도 5A 내지 5D는 정제된 FW129(rHVT/45-46 pecF/44-45 Rsv VP2)의 게놈 구조 확인을 위한 서던 블롯팅 분석 결과를 보여주며, 본 발명의 이중 재조합체 HVT/ND/IBD가 예상된 게놈 구조를 가졌다는 것을 나타낸다. 더욱 정확히는, 서던 블롯팅의 결과는 하기를 나타내었다:
- 2077-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT FW129로부터의 DNA 내의 VP2 프로브에 혼성화되었다(컬럼 1, 2 및 3, 도 5A). 반대로, p45/46Pec F에서는 밴드가 검출되지 않았다(도 5A).
- 2744-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT FW129로부터의 DNA 내의 F 프로브에 혼성화되었다(컬럼 1, 2 및 3, 도 5C). p45/46 SfiI에서는 밴드가 검출되지 않았다.
- 2077-bp 및 1228-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT FW129로부터의 DNA 내의 IS44/45 프로브에 혼성화되었다(컬럼 1, 2 및 3, 도 5B). 분자 마커 람다 HindIII 소화물에 대해서는 밴드가 검출되지 않았다(컬럼 M, 도 5B).
- 2744-bp 및 770-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT FW129로부터의 DNA 내의 IS45/46 프로브에 혼성화되었다(컬럼 1, 2 및 3, 도 5D).
도 6A 및 6B는 연속 계대에서 재조합체 HVT FW129의 안정성 확인을 위한 웨스턴 블롯팅 분석의 결과를 보여주며, 15회 계대 후 F 단백질 및 VP2 단백질이 본 발명의 rHVT FW129에 의해 감염된 CEF에서 안정하게 발현되었다는 것을 나타낸다.
도 7A 및 7D는 15회 계대 후 재조합체 HVT의 안정성 확인을 위한 서던 블롯팅 분석의 결과를 보여준다. (도 7A) 서던 블롯팅의 결과는 2077-bp 단편이 FW129로부터의 DNA 내의 VP2 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. 2334-bp 단편은 FW130로부터의 DNA 내의 VP2 프로브에 혼성화되었다. 반대로, p45/46Pec F에서는 밴드가 검출되지 않았다. (도 7C) 서던 블롯팅의 결과는 2744-bp 단편이 각각의 이중 재조합체 HVT FW129 및 FW130로부터의 DNA 내의 F 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. p45/46 SfiI에서는 밴드가 검출되지 않았다. (도 7B) 서던 블롯팅의 결과는 2077-bp 및 1228-bp 단편이 FW129로부터의 DNA 내의 IS44/45 프로브에 혼성화되었고, 2334-bp 및 1022-bp 단편이 FW130으로부터의 DNA 내의 IS44/45 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. 1350-bp 단편은 p45/46 PecF 내의 IS44/45 프로브에 혼성화되었고, 이것은 IS44/45 부위에 유전자를 함유하지 않았다. (도 7D) 서던 블롯팅의 결과는 2744-bp 및 770-bp 단편이 각각의 이중 재조합체 HVT FW129 및 FW130으로부터의 DNA 내의 IS45/46 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. 44/45 프로브 및 45/46 프로브에 의한 서던 블롯은 FW129 및 FW130 내에서 각각 삽입 부위 44/45 또는 45/46에서 안정하게 유지되는 VP2 유전자 또는 F 유전자를 보여주었다. 상기 결과는 15회 계대 후 F 단백질 및 VP2 단백질이 본 발명의 rHVT FW129에 의해 감염된 CEF에서 안정하게 발현되었다는 것을 나타낸다.
도 8A 및 8B는 단일 재조합체 HVT(FW029 및 FW023 각각)에 의해 접종된 닭으로부터 수득된 적정농도와 비교한, 이중 재조합체 HVT(FW122, FW137, FW129, FW130, FW135)에 의해 접종된 닭으로부터 수득된 항-NDV 적정농도(도 8A) 및 항-IBDV 적정농도(도 8B)의 비교 결과를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 일반적으로 다가 재조합 헤르페스 바이러스 및 동시에 2개 이상의 질환에 대항하여 조류 종을 면역화시키기 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 외래 DNA 서열은 rHV 게놈 내의 특정 삽입 부위에 삽입되어, 백신 조성물 또는 방법에서 사용하기에 적합한 안정하고 효과적인 구축물을 제공한다.
본 명세서는 하기 정의를 참조로 하여 최상으로 이해될 것이다:
정의
본 발명의 문맥에서, 용어 "재구축된" 또는 "재조합체"는 서열과 관련하여, 자연적으로는 존재하지 않고/거나 재조합체 DNA 기술(또한 유전자 클로닝 또는 분자 클로닝으로도 불림)을 사용하여 조작되는 서열, 핵산 또는 유닛을 지칭한다.
헤르페스 바이러스와 관련하여 용어 "재조합체"는 그의 게놈이 하나 이상의 이종 핵산, 즉, 헤르페스 바이러스의 게놈에서 자연적으로 발견되지 않는, 또는 상기 게놈에서 자연적으로 발견되나 상이한 형태 또는 상이한 위치에 있는 핵산(예를 들어, DNA)의 삽입에 의해 개질된 헤르페스 바이러스를 말한다. 재조합 헤르페스 바이러스가 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 한번 제조되면 추가의 재조합체 DNA 기술의 이용 없이 재현될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. "재조합 헤르페스 바이러스"의 구조는 그러므로 DNA 삽입의 용어로 기재된다.
본 명세서에서, 용어 "핵산" "핵 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 사용되며, 미리 결정된 서열을 갖는 핵산 분자를 언급하며, 이것은 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 먼저 예를 들어, 재조합, 효소적 및/또는 화학적 기법에 의해 제조될 수 있으며, 숙주 세포에서 또는 시험관 내 시스템에서 이어서 복제될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 우선적으로는 펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 부가적인 서열, 예컨대 전사 종결자, 단일 펩티드, IRES, 인트론 등을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 재조합체 핵산 내의 오픈 리딩 프레임은 인트론을 함유하지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "비번역 영역"은 ORF가 없고 번역에 의해 발현하고자 하는 단백질의 아미노산 서열, 또는 ORF가 전사, 번역, 또는 단백질 발현 중 임의의 것에 관여하지 않는 뉴클레오티드의 영역을 정의하지 않는 뉴클레오티드의 영역을 말한다.
용어 "조류 종"은 모든 종류의 조류, 예컨대 조류강(Aves)의 강의 새, 즉, 깃털이 있고, 날개가 있으며, 두 발로 보행하고, 온혈동물이며 알을 낳는 척추 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 문맥에서, 조류 또는 조류 종은 더욱 특히 경제적 및/또는 재배적 관심이 있는 새, 예컨대, 가금류(예컨대, 닭 및 칠면조), 물새 가금류(예컨대, 오리 및 거위) 및 관상용 새(예컨대, 백조 및 앵무새)를 말한다.
본원에 사용되는 용어 "백신"은 유기체에서 면역 반응을 야기, 자극 또는 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 제제를 지칭한다.
바이러스
본 발명에서 사용하기 위한 바이러스는 일반적으로 조류 헤르페스 바이러스의 속에 속하는 것이다.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 조류 헤르페스 바이러스에는 칠면조의 헤르페스 바이러스(HVT), 혈청형 2 마렉병 바이러스, 바람직하게는 혈청형 2 마렉병 바이러스의 SB1 균주, 또는 혈청형 1 마렉병 바이러스, 바람직하게는 혈청형 1 마렉병 바이러스의 CVI988/Rispens 균주가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 헤르페스 바이러스는 표적된 조류 종에 비-병원성인 혈청형 또는 균주로부터 유래된다.
다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스
본 발명의 목적은 계대를 통해 개선된 안정성을 가진, 2개 이상의 질환에 대항하여 조류 종을 면역화하는데 적합한 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 관한 것이다. 조합으로, 외래 항원 유전자에 대한 개선된 안정성을 제공하는, 특정 삽입 부위가 본 출원인에 의해 확인되었다.
그러므로 본 발명의 목적은 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 조류 헤르페스 바이러스로서, 각각의 재조합 뉴클레오티드 서열이 구별되는 항원 펩티드를 인코딩하며, 상기 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열이 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 중에서 선택되는 바이러스 게놈의 구별되는 비-코딩 영역 내로 삽입되는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 관한 것이다.
비-코딩 영역이라 불리는 위치는 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, Kingham et al.("The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses" - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135)에서 찾을 수 있다.
예를 들어, FC126 완전 게놈(GenBank: AF291866.1)을 참조하면, UL44와 UL45 사이에 위치한 영역은 HVT 게놈의 뉴클레오티드 94243-94683에 상응하고, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역은 HVT 게놈의 뉴클레오티드 95323-95443에 상응하고, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역은 HVT 게놈의 뉴클레오티드 138688-138825에 상응하고, SORF3과 US2 사이에 위치한 영역은 HVT 게놈의 뉴클레오티드 139867-140064에 상응한다.
헤르페스 바이러스의 게놈 내로 삽입을 위한 관심의 핵산은 헤르페스 바이러스와 관련하여 상동 또는 이종일 수 있다. 핵산은 전형적으로 병원체로부터의 항원을 인코딩하고 조류 종에서 감염을 야기할 수 있는 임의의 병원성 유기체로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 전형적으로, 클로닝된 핵산은 가금류 산업에 경제적인 영향을 주는 질환을 야기하는 병원체로부터 유래된다. 조류에서 감염을 야기하는 병원체의 예에는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 등이 포함된다.
바이러스 게놈 내로 삽입을 위한 상동 또는 이종 뉴클레오티드 서열은 그러므로 새 병원성 제제의 항원 펩티드를 코딩하는 임의의 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 임의의 공급원, 예를 들어, 바이러스, 원핵세포, 진핵세포 또는 합성으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로는, 뉴클레오티드 서열은 병원체의 면역원성 펩티드를 인코딩하고, 바람직하게는 상기 병원체의 표면 단백질, 분비된 단백질 또는 구조적 단백질, 또는 이의 단편을 나타낸다.
뉴클레오티드 서열은 예를 들어 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 파라믹소바이러스 유형 1(또한 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로도 불림), 조류 메타뉴모바이러스, 마렉병 바이러스, 감보로병 바이러스(또한 전염성 점액낭병 바이러스(IBDV)로도 불림), 전염성 후두기관염 바이러스(ILVT), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 종, 파스튜렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 리에메렐라 아나티페스티페르(Riemerella anatipestifer), 오르니토박테리움 리노트라케알(Ornithobacterium rhinotracheale), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라즈마 시노비아에(Mycoplasma synoviae), 조류 종을 감염시키는 마이코플라즈마 미생물 또는 콕시디아(coccidian)부터 유래된 항원 펩티드를 인코딩할 수 있다.
우선적으로는, 바이러스 게놈 내로 삽입된 뉴클레오티드 서열은 NDV의 F 단백질, IBDV의 VP2 단백질, ILTV의 gB 단백질, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum)의 40K 단백질, 및 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 헤마글루티닌(HA) 중에서 선택된다.
항원 펩티드의 다양한 조합은 여러 인자, 예컨대 조류 종, 사육 국가, 사육 조건 등에 따라 큰 관심을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 구현예에서, 본 발명의 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 이의 게놈 내에 NDV의 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 IBDV의 VP2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입한다.
특정 구현예에 따르면, 3개 이상의 뉴클레오티드 서열이 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 동일한 병원체로부터 2개 이상의 항원을 발현할 수 있다.
관심의 항원을 코딩하는 상동 또는 이종 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 추가로 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 사용되는 프로모터는 합성 또는 천연, 내생 또는 이종 프로모터일 수 있다.
프로모터는 이것이 rHVT에 의해 감염된 새의 세포에서 효과적으로 작용할 수 있는 한 제한되지 않는다. 그러므로, 프로모터의 선택은 rHVT에 의해 감염된 조류 세포에서 유전자 전사를 지시할 수 있는 임의의 진핵세포, 원핵세포 또는 바이러스 프로모터로 확장된다.
우선적으로는, 프로모터는 닭 베타-액틴(Bac) 프로모터, Pec 프로모터, 뮤린 사이토메갈로바이러스(Mcmv) ie1 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(Hcmv) 프로모터, 시미안 바이러스(SV)40 프로모터, 및 라우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 프로모터 활성을 보유하는 이의 임의의 단편 중에서 선택된다.
닭 Bac 프로모터의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시되고, Pec 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시되고, Mcmv ie1 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시되고, Hcmv 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시되고, SV40 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시되고, RSV 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된다.
본 발명에서의 사용을 위해, 작용성 프로모터를 인코딩하는 이러한 서열의 변형이 공지되어 있고/거나 당업자에 의해 디자인/시험될 수 있다는 것을 유념해야만 한다.
본 발명의 바람직한 재조합 헤르페스 바이러스에서, 핵산 중 하나 이상은 항원 펩티드의 발현을 유도하기 위해 Pec 또는 Bac 프로모터를 포함한다.
다가 구축
유전자 클로닝 및 플라스미드 구축은 당업자에게 잘 알려져 있고, 표준 분자 생물학 기법(Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, N.Y. 2001)에 의해 본질적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 다가 재조합 헤르페스 바이러스를 구축하기 위해, 먼저, 헤르페스 바이러스를 적합한 숙주 세포에서 증식시키고 이후 게놈 DNA를 수득한다. 바이러스의 증식을 위한 숙주 및 조건은 적합하게 선택된다. 숙주 세포로서, 닭으로부터 유래된 세포가 바람직하고, CEF(닭 배아 섬유아세포: chick embryo fibroblast), 닭 신장 세포 등이 사용될 수 있다. 이들은 배양 배지, 예컨대 Eagle's MEM, Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1 혼합물) 배양 배지 내 약 37℃에서, 3 내지 4일 동안 배양될 수 있다.
통상의 방법에 따라 상기와 같이 배양된 바이러스-감염된 세포로부터 DNA를 추출한다. 용리 완충액에서 단백질을 변성시키고 제거한 후, DNA를 페놀 및 에탄올로 추출한다.
전형적으로는, 재조합 바이러스는 재조합을 가능하게 하는 삽입 부위로부터 뉴클레오티드가 측면에 위치한, 삽입하고자 하는 핵산을 포함하는 구축물(예를 들어, 플라스미드)과 바이러스 게놈 사이의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다.
삽입 부위 서열을 가진 플라스미드
본 발명에 따른 바이러스 게놈의 비번역 영역 중 하나에 외래 유전자를 삽입하기 위한 하나의 가능성은 표적된 비번역 영역을 함유하는 서열을 플라스미드, 또는 기타 적합한 벡터 내로 먼저 클로닝하는 것일 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 서열은 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역의 서열, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역의 서열, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역의 서열, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역의 서열 중에서 선택된다.
플라스미드의 예는 pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8, 및 pUC9를 포함하며, 파지의 예는 람다 파지 및 M13 파지를 포함하며, 코스미드의 예는 pHC79를 포함한다.
비번역 영역 서열은 통상의 클로닝 방법에 따라 플라스미드 내로 통합된다. 삽입 영역 서열은 바람직하게는 충분한 길이를 가져, 핵산의 삽입 시, 핵산의 측면에 있는 서열이 적합한 길이를 가져 바이러스 게놈과의 생체 내 상동 재조합을 가능하게 하도록 한다. 바람직하게는, 측면 서열은 대략 50 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 것이다.
하나 이상의 외래 서열(들)을 비번역 영역 내로 삽입하기 위해, 돌연변이는 제한 효소에 대해 새로운 분할 부위를 제조하기 위해 비번역 영역의 특이적 부위에서 실시될 수 있다. 돌연변이의 실시 방법은 통상의 방법일 수 있고, 당업자에 의해 통상 사용되는 방법, 예컨대 시험관 내 돌연변이생성 및 PCR이 사용될 수 있다. 그러므로, PCR 방법에서, 돌연변이, 예컨대 PCR 프라이머 내에 1 내지 2개의 뉴클레오티드의 결실, 대체, 또는 부가를 실시하고, 프라이머는 이후 돌연변이를 생성하기 위해 사용된다.
표적된 외래 뉴클레오티드 서열(들)을 추가로 함유하는 플라스미드
바이러스 내에 삽입을 위한 뉴클레오티드 및 프로모터 서열은 플라스미드 내 바이러스 게놈의 삽입 영역 내로 추가로 삽입된다.
더욱 정확하게는, 뉴클레오티드 및 프로모터 서열은 플라스미드 내로 서브클로닝되는, 삽입 영역 서열을 함유하는 게놈 헤르페스 바이러스 DNA의 단편 내로 도입된다.
원한다면, 예를 들어, 동일한 또는 상이한 병원체로부터 유래된 2개 이상의 외래 핵산 서열을 함유하는 플라스미드가 제조될 수 있으며, 상기 서열은 본원에 기재된 바와 같은 삽입 영역 서열이 측면에 있다.
삽입 부위 내에 외래 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 게놈
하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 상기와 같이 수득된 비번역 영역 내로 도입되는 플라스미드는 전기천공, 칼슘 포스페이트, 리포펙틴-기재 방법 등을 사용하여 HVT-감염된 세포 또는 HVT 게놈-트랜스펙션된 세포 내로 도입될 수 있다. 도입하고자 하는 플라스미드의 양이 0.1 내지 1000㎍의 범위인 경우, HVT-DNA의 상동 영역과 플라스미드 사이의 재조합에 의한 재조합 바이러스의 생성 효율은 세포에서 높아진다.
다가 재조합 헤르페스 바이러스의 제조
본 발명의 다가 재조합 헤르페스 바이러스는 동일한 세포 배양물 내에 상기 기재된 바와 같은, 외래 뉴클레오티드 서열이 통합된 삽입 부위 서열을 함유하는 플라스미드, 및 상기 기재된 바와 같은, 외래 뉴클레오티드 서열이 없는 동일한 삽입 부위를 함유하는 재조합 헤르페스 바이러스 및 구별되는 외래 뉴클레오티드 서열이 통합된 두번째 삽입 부위를 동시-트랜스펙션 함으로써 수득될 수 있다. 상기 동시-트랜스펙션은 플라스미드 DNA의 바이러스 게놈 내로의 재조합을 야기한다.
그렇지 않으면, 본 발명의 다가는 동일한 세포 배양물 내에 구별되는 외래 뉴클레오티드 서열이 통합된 구별되는 삽입 부위 서열을 각각 함유하는 2개의 플라스미드, 및 상기 기재된 바와 같은, 외래 뉴클레오티드 서열이 없는 동일한 삽입 부위를 함유하는 헤르페스 바이러스를 동시-트랜스펙션함으로써 수득될 수 있다. 상기 동시-트랜스펙션은 두 플라스미드 DNA의 바이러스 게놈 내로의 재조합을 야기한다.
산출되는 다가 재조합 바이러스는 예를 들어, 혼성화에 의해, 재조합체 핵산 서열과 함께 동시-통합된 유전자에 의해 인코딩된 효소 활성을 검출하거나 또는 면역학적으로 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 발현되는 항원 펩티드를 검출함으로써 공지된 선별 기술을 사용하여 유전자형으로 또는 표현형으로 선별될 수 있다. 선별된 재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물 내에 대규모로 배양될 수 있고 이후, 재조합 헤르페스 바이러스 함유 펩티드가 수집될 수 있다.
바람직한 다가 구축
본 발명의 목적은 조류 세포에서 상응하는 항원 펩티드를 인코딩하고 발현하기 위해 적합한 방식으로, 특정 삽입 부위 내에 각각 삽입된 2개 이상의 외래 뉴클레오티드 서열이 존재하는 다가 재조합 헤르페스 바이러스를 제안하는 것이다.
표적된 삽입 부위 및 바람직한 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 임의로 바람직한 프로모터의 조합에 근거한 다수의 가능한 구현예 중에서, 본 출원인은 놀랍게도 특정 조합이 높은 수준의 안정성을 나타내서, 개선된 다가 백신을 제조하기 위해 이들의 사용을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
상기 발견에 근거하여, 본 발명의 목적은 높은 수준의 안정성을 가진 특이적 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스를 제안하는 것이다.
본 발명의 바람직한 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 재조합 뉴클레오티드 서열이 구별되는 항원 펩티드를 인코딩하며, UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 중에서 선택되는 바이러스 게놈의 구별되는 비-코딩 영역 내로 삽입된다.
본 발명의 바람직한 항원 펩티드는 NDV의 F 단백질, IBDV의 VP2 단백질, ILTV의 gB 단백질, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum)의 40K 단백질, 및 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA 중에서 선택된다.
유리하게는, UL44와 UL45 사이의 삽입 부위 내에 삽입된 뉴클레오티드 서열과 함께 사용되는 프로모터는 Pec 프로모터, Mcmv ie1 프로모터, Hcmv 프로모터, SV40 프로모터, 및 RSV 프로모터, 또는 프로모터 활성을 보유하는 이의 임의의 단편 중에서 선택된다. 실제로, 본 출원인은 놀랍게도 UL44와 UL45 사이에 삽입된 Bac 프로모터가 외래 유전자의 안정한 발현을 가능하게 하지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나, UL45와 UL46 사이의 영역 내에 삽입된 Bac 프로모터는 안정한 발현을 허용한다.
제 1 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이에 삽입된, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이에 삽입된, 우선적으로는 SV40 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW130).
제 2 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 RSV 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW129).
제 3 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW141).
제 4 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW144).
제 5 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW146).
제 6 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL44와 UL45 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW143).
제 7 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL44와 UL45 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW142).
제 8 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW147).
제 9 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW145).
제 10 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 SV40 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW149).
제 11 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 SV40 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW148).
제 12 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW153).
제 13 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW154).
제 14 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW155).
제 15 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW156).
제 16 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW157).
제 17 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW158).
제 18 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Bac 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW159).
제 19 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW160).
제 20 구현예에 따르면, 재조합 조류 헤르페스 바이러스는 UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Mcmv ie1 프로모터의 조절 하에 IBDV의 VP2 단백질, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이의 삽입 부위 내에, 우선적으로는 Pec 프로모터의 조절 하에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다(FW161).
세포 배양
본 발명의 산출된 재조합 바이러스는 상기 재조합 바이러스가 증식하고 성장할 수 있는 세포 배양물에서 증식될 수 있다. 바이러스의 요구되는 성장이 달성된 후, 세포를 스크래퍼(scraper)를 사용하여 또는 트립신에 의해 웰로부터 탈착시킬 수 있고 감염된 세포를 원심분리에 의해 상청액으로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, CEF, 부화란, 닭 신장 세포 등이 재조합 헤르페스 바이러스의 증식을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다가 재조합 바이러스는 배양 배지, 예컨대 Eagle's MEM, Leibowitz-L-15/McCoy 5A (1:1 혼합물) 배양 배지 내 약 37℃에서, 3 내지 4일 동안 배양될 수 있다. 그렇게 수득된 감염된 세포는 10% 디메틸 술폭시드(DMSO)를 함유하는 배양 배지에 현탁시키고 액체 질소 하에서 동결시켜 보관한다.
유리하게는, 본 발명의 재조합체 다가 헤르페스 바이러스는 계대를 통해 높은 수준의 안정성을 나타내고, 이것은 심지어 10회 이상 계대 후에도 조류 종의 세포에서의 재조합 뉴클레오티드 서열의 공발현에 상응한다. 본 발명의 문맥에서, "계대" 또는 "세포 계대"는 세포의 성장을 가능하게 하고 이들을 90% 내지 100% 컨플루언트(confluent)한 상태가 될 때까지 살아있도록 유지하기 위한 적합한 조건에서의 세포의 배양을 의미한다. 계대 단계는 이전의 컨플루언트한 상태의 배양물의 소수의 세포를 신규 배양 배지로 옮기는 것으로 이루어진다. 몇 개의 세포를 함유하고 있는 이전의 컨플루언트한 상태의 배양물의 분취액을 다량의 부피의 신선한 배지에 희석할 수 있다. 부착 배양의 경우, 트립신 및 EDTA, 또는 임의의 적합한 효소의 혼합물을 사용하여 세포를 먼저 탈착시킨 후 몇 개의 탈착된 세포를 신규 배양 배지 시딩을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 의해 트랜스펙션된 CEF 세포는 여전히 10회 이상 계대 후 상응하는 항원 펩티드를 공발현한다. 다른 말로는, 본 발명의 재조합 조류 헤르페스 바이러스에 의해 트랜스펙션된 CEF 세포의 10회 이상 계대로부터 산출된, 더욱 특히 15 계대로부터 산출된 CEF 세포는, 초기 세포 트랜스펙션에 사용된 재조합 조류 헤르페스 바이러스의 외래 뉴클레오티드 서열을 여전히 함유하고 2개 이상의 상응하는 항원 펩티드를 발현한다. 본 발명의 문맥에서, 생성 수준이 첫번째 계대의 생성 수준의 80% 초과, 우선적으로는 85% 초과인 경우에는 상기 계대의 세포가 항원 펩티드를 여전히 발현하는 것으로 고려한다.
다가 백신 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스를 면역화 유효량으로 포함하는, 조류 종, 예컨대 가금류를 면역화하기 위한 다가 백신에 관한 것이다.
우선적으로는, 본 발명의 백신은 조류 파라믹소바이러스 유형 1, 감보로병 바이러스, 전염성 후두기관염 바이러스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum), 및 조류 인플루엔자 바이러스 중에서 선택된 2개 이상의 병원체에 대항하여 면역성을 야기하거나 자극하거나 또는 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 약학적으로 허용가능한 비히클 내에 상기 기재된 바와 같은 다가 재조합 헤르페스 바이러스를 면역화 유효량으로 포함한다.
본 발명에 따른 다가 재조합 헤르페스 바이러스는 바람직하게는 생 백신으로서 사용될 수 있고, 불활성화된 백신 또는 약화된 백신과 같은 다른 대안도 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 백신은 추가로 적합한 용매, 예컨대 예를 들어 수성 완충액 또는 포스페이트 완충액을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 또한 첨가제를 포함한다. 본 발명의 첨가제는 면역 반응을 향상시키기에 충분한 양으로 백신과 함께 투여되는, 동물 유래의 다양한 단백질 및 펩티드(예를 들어, 호르몬, 사이토카인, 동시-자극성 인자), 및 바이러스 및 다른 공급원 유래의 신규 핵산(예를 들어, 이중 가닥 RNA, CpG), 등을 포함하는 임의의 수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 또한, 상기 언급된 성분의 임의의 수의 조합이 면역강화 효과를 제공할 수 있으며, 따라서 본 발명의 면역강화제를 형성할 수 있다.
본 발명의 백신은 추가로 등장성, 생리학적 pH 및 안정성을 유지하기 위한 하나 이상의 추가의 첨가제, 예를 들어, 생리학적 심염수(0.85%), 포스페이트-완충 식염수(PBS), 시트레이트 완충액, 트리스(히드록시메틸 아미노메탄)(TRIS), Tris-완충 식염수 등과 같은 완충액 또는 항생제, 예를 들어, 네오마이신 또는 스트렙토마이신 등과 함께 제형화될 수 있다.
투여 경로는 구강, 눈(예를 들어, 점안액에 의함), 에어로졸을 사용한 눈-코 투여, 비강내, 공급물 내 배설강, 물에, 또는 스프레이에 의해, 알 내에, 국소로 또는 주사(예를 들어, 정맥, 피하, 근육내, 안와내, 안내, 피내, 및/또는 복강내) 백신화를 포함하여 임의의 경로일 수 있다. 당업자는 각 유형의 투여 경로에 대해 백신 조성물의 제형을 쉽게 조절할 수 있을 것이다.
각각의 백신 투여량은 조류 종에서 보호 면역 반응을 도출하기에 충분한 적합한 투여량을 함유할 수 있다. 이러한 투여량의 최적화는 당업계에 잘 알려져 있다. 투여량 당 항원의 양은 항원/항체 반응을 사용하는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 ELISA 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 백신은 백신화 프로토콜에 따라, 단일 투여 또는 반복 투여로서 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 추가로 이들이 백신화 3주 후 표적된 조류 병원체에 대항하여 새에게 80% 이상의 보호를 부여한다는 점에서 유리하다.
본 발며은 추가로 조류 종, 예컨대 가금류의 면역화를 위해 상기 기재된 바와 같은 백신의 용도, 및 본 발명에 따른 백신을 면역화 유효량으로 투여함에 의한 조류 종의 면역화 방법에 관한 것이다. 백신은 유리하게는 피부내로, 피하로, 근육내로, 경구로, 알 내로, 점막 투여에 의해 또는 눈-코 투여를 통해 투여될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 기재된 바와 같은 유효량의 다가 백신 및 조류 종에게 상기 성분을 투여하기 위한 수단을 포함하는 조류 종을 면역화하기 위한 백신화 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 키트는 본 발명에 따른 다가 백신이 채워진 주사 장치 및 피내, 피하, 근육내, 또는 알 내 주입을 위한 지침을 포함한다. 대안적으로, 키트는 본 발명에 따른 다가 백신이 채워진 스프레이/에어로졸 또는 점안액 장치 및 눈-코 투여, 경구 또는 점막 투여를 위한 지침을 포함한다.
본 발명은 하기 실험 및 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 이것이 본 발명이 상기 실험 및 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실험
실험에서, 여러가지 재조합 헤르페스 바이러스(본 발명에 따른 1가 또는 다가)가 사용되었으며, 하기와 같이 지정되었다(HVT/첫번째 삽입 부위-첫번째 외래 유전자/두번째 삽입 부위-두번째 외래 유전자):
FW122: HVT/45-46 Hcmv VP2 Bac F
FW123: HVT/44-45 Bac VP2,
FW125: HVT/45-46 Bac F/44-45 Hcmv VP2
FW129: HVT/45-46 PecF/44-45 Rsv VP2
FW130: HVT/45-46 PecF/44-45 SV40 VP2
FW135: HVT/45-46 sv40 F/44-45 Bac VP2
FW137: HVT/45-46 Pec F sv40 VP2
FW141: HVT/45-46 PecF/44-45 Mcmv ie1VP2
FW142: HVT/45-46 Bac VP2/44-45 Mcmv ie1 F
FW144: HVT/45-46 Pec F/87-88 Mcmv ie1 VP2
FW145: HVT/45-46 Bac VP2/87-88 Mcmv ie1 F
FW023: HVT/45-46 Bac VP2
FW029: HVT/45-46 Pec F
실험 1: 상동 벡터의 구축
플라스미드 구축은 본질적으로 표준 분자 생물학 기법에 의해 수행되었다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001). DNA 제한 단편을 아가로오스 겔 상에 전기영동시키고, 플라스미드 플러스 Midi Kit(QIAGEN, Cat # 12945)에 의해 정제하였다.
p44 /45 d46Sfi 의 구축
MDV 혈청형 1의 gC 상동(gCh) 유전자(Coussens et al., J. Virol. 62:2373-2379, 1988) 및 그의 인접 BamHI-B 단편(일본 미공개 특허 공개 번호 H6-292583)에 대한 정보를 기반으로, 2개의 ORF UL44h와 UL45h 사이에 SfiI 부위를 갖는 DNA 단편을 PCR에 의해 제조하고 pUC18 내로 클로닝하였다. 먼저, HVT DNA를 Lee et al.(J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980)의 방법에 따라 HVT FC126 균주에 의해 감염된 CEF 세포로부터 제조하였다. 주형으로서 수득된 HVT DNA를 사용하여, PCR을 2쌍의 프라이머에 의해 수행하였다.
첫번째 쌍은 SEQ NO: 7 (5'-CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC-3') 및 SEQ NO: 8 (5'-CGCGGGCCAATAAGGCCAACATCGGGACGTACATC-3') 였다.
두번째 쌍은 SEQ NO: 9 (5'-GCGCGGCCTTATTGGCCTTAAATACCGCGTTTGGAG-3') 및 SEQ NO: 10 (5'-CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA-3') 였다.
주형으로서 수득된 2개의 PCR 생성물의 혼합물을 사용하여, 또다른 PCR를 SEQ NO.7 및 SEQ NO.10로 수행하여 2개의 ORF, UL44h 및 UL45h 사이에 SfiI 부위를 갖는 단편을 생성하였다.
이후 산출된 단편을 EcoRI 및 HindIII로 소화시키고, EcoRI 및 HindIII로 소화되었던 pUC18에 라이게이션시켰다. 수득된 플라스미드를 p44/45Sfi로 지정하였다.
2개의 유전자가 UL44/45 및 UL45/46에서 각각 삽입된 이중 재조합체 HVT의 구축을 위해, UL46 유전자를 p44/45Sfi로부터 결실시켰다. EcoRI 및 SfiI로 소화된 p45/46Sfi(US 7569365)를 dSfiI-EcoRI 링커에 의해 라이게이션하여, 플라스미드 p44/45d46를 산출하였다. SphI 및 PstI로 절단된 p44/45Sfi를 동일한 효소로 절단된 p44/45d46에 의해 라이게이션하여, 플라스미드 p44/45d46Sfi를 산출하였다.
pHVT 87-88의 구축
HVT DNA를 Lee et al.(J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980)의 방법에 따라 HVT FC126 균주에 의해 감염된 CEF 세포로부터 제조하였다. 주형으로서 수득된 HVT DNA를 사용하여, PCR를 2쌍의 프라이머에 의해 수행하였다. 각각의 프라이머는 Genbank X68653.1의 정보에 따라 디자인되었다. 2개의 ORF, US2(HVT088) 및 SORF3(HVT087) 사이에 SfiI 부위를 갖는 DNA 단편을 PCR에 의해 제조하고 pUC18 내로 클로닝하였다.
첫번째 쌍은 SEQ NO.11 (5'-GGGAATTCGAAGAGCCCCCGCGGACGCATG-3') 및 SEQ NO. 12 (5'-CCGCTAGCGGCCGCAAGTTCCTTCACCATGACCAG-3') 였다.
두번째 쌍은 SEQ NO.13 (5'-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTAGCATAAAGACGCAGG-3') 및 SEQ NO.14 (5'-CCAAGCTTCTAGTACATATATATACATGAC-3') 였다.
첫번째 수득된 단편을 EcoRI 및 NheI로 소화시켰다. 두번째 수득된 단편을 NheI 및 HindIII로 소화시켰다. 상기 절단된 단편을 EcoRI 및 HindIII로 절단된 pUC18 내로 통합시켜, 플라스미드 pHVT 87-88을 산출하였다.
pHVT 86-87의 구축
HVT DNA를 Lee et al.(J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980)의 방법에 따라 HVT FC126 균주에 의해 감염된 CEF 세포로부터 제조하였다. 주형으로서 수득된 HVT DNA를 사용하여, PCR를 2쌍의 프라이머에 의해 수행하였다. 각각의 프라이머는 Genbank X68653.1의 정보에 따라 디자인되었다. 2개의 ORF, US10(HVT086) 및 SORF3(HVT087) 사이에 SfiI 부위를 갖는 DNA 단편을 PCR에 의해 제조하고 pUC18 내로 클로닝하였다.
첫번째 쌍은 SEQ NO.15 (5'-GGGGGAATTCATTATCCCATCTAACAGTTATATACG-3') 및 SEQ NO.16 (5'-GCCGCTAGCGGCCGCCTTTATTAACAACCTTAC-3') 였다.
두번째 쌍은 SEQ NO.17 (5'-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCC GTTTATTCTATGTAAGAC-3') 및 SEQ NO.18 (5'-CCCAAGCTTAAGTTCCTTCACCATG-3') 였다.
첫번째 수득된 단편을 EcoRI 및 NheI로 소화시켰다. 두번째 수득된 단편을 NheI 및 HindIII로 소화시켰다. 상기 절단된 단편을 EcoRI 및 HindIII로 절단된 pUC18 내로 통합시켜, 플라스미드 pHVT 86-87을 산출하였다.
상동 벡터의 구축
화학적 합성된 Mcmv ie1 프로모터
Mcmv ie1 프로모터(SEQ NO.19)를 Koszinowski, U. H.에 의해 보고된 Gene Bank L06816.1에서 4191-4731bp의 정보에 대해 합성하였다. 합성된 Mcmv ie1 프로모터는 BglI-PstI 부위를 그 앞에 부가하고 XbaI-NotI 부위를 말단에 부가하는 식으로 디자인하였다.
SEQ NO.19: GGCCAATAAG GCTGCAGTAC TGAGTCATTA GGGACTTTCC AATGGGTTTT GCCCAGTACA TAAGGTCAAT AGGGGTGAAT CAACAGGAAA GTCCCATTGG AGCCAAGTAC ACTGAGTCAA TAGGGACTTT CCATTGGGTT TTGCCCAGTA CAAAAGGTCA ATAGGGGGTG AGTCAATGGG TTTTTCCCAT TATTGGCACG TACATAAGGT CAATAGGGGT GAGTCATTGG GTTTTTCCAG CCAATTTAAT TAAAACGCCA TGTACTTTCC CACCATTGAC GTCAATGGGC TATTGAAACT AATGCAACGT GACCTTTAAA CGGTACTTTC CCATAGCTGA TTAATGGGAA AGTACCGTTC TCGAGCCAAT ACACGTCAAT GGGAAGTGAA AGGGCAGCCA AAACGTAACA CCGCCCCGGT TTTCCCCTGG AAATTCCATA TTGGCACGCA TTCTATTGGC TGAGCTGCGT TCTACGTGGG TATAAGAGGC GCGACCAGCG TCGGTACCGT CGCAGTCTTC GGTCTGACCA CCGTAGAACG CAGAGCTCCT CGCTGCAGGC GGCCGCTCTA GA
p44/45 Mcmv ie1 VP2 SPA의 구축
SfiI-분할된 p44-45d46Sfi를 알칼리 포스페이트 슈와넬라 종(Alkaline Phosphatase Shewanella sp.) S1B1 재조합체 (PAP)(Funakoshi #DE110)를 사용하여 탈인산화시켰다. 단편을 BglI-분할된 p45/46BacVP2에 의해 라이게이션하여, 플라스미드, p44/45d46 BacVP2를 산출하였다. 합성된 Mcmv ie1 프로모터(BglI/XbaI)를 EcoRV 및 XbaI에 의해 분할된 p44/45d46 BacVP2, 및 EcoRV 및 BglI에 의해 분할된 p44/45d46 Bac VP2에 의해 라이게이션하여, p44/45d46 Mcmv ie1 VP2를 산출하였다. 합성된 짧은 polyA 신호(SPA: SEQ NO.20: CTGCAGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCCAATAAGGCC)를 SalI 및 SfiI에 의해 분할된 p44/45d46 Mcmv ie1 VP2 내로 통합시켜, 상동 플라스미드, p44/45d46 Mcmv ie1 VP2 SPA를 산출하였다.
실험 2: 각각의 전달 벡터에 의해 트랜스펙션된 CEF에서의 재조합체 HVT의 정제
HVT 야생형, FC126 균주(wt-HVT)의 바이러스 DNA를 Morgan et al.(Avian Diseases, 34:345-351, 1990)에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. FW029 (rHVT/45-46PecF) 및 FW023 (rHVT/45-46BacVP2)의 바이러스 DNA를 유사한 방법으로 제조하였다. 첫번째 이중 rHVT 패턴은 CEF 세포를 제조된 wt-HVT DNA 및 p45/46sv40VP2 PecF에 의해 트랜스펙션시키는 것이었다(ex. FW137). 두번째 패턴은 CEF 세포를 제조된 FW029 DNA 및 p44/45 Mcmv ie1 VP2에 의해 트랜스펙션시키는 것이었다(ex. FW141). 세번째 패턴은 CEF 세포를 제조된 FW023 DNA 및 p44/45 Mcmv ie1 F에 의해 트랜스펙션시키는 것이었다(ex. FW142). 네번째 패턴은 CEF를 제조된 FW029 DNA 및 pHVT87-88Bac VP에 의해 트랜스펙션시키는 것이었다(ex. FW144). 다섯번째 패턴은 CEF를 제조된 FW023 및 pHVT87-88Pec F에 의해 트랜스펙션시키는 것이었다(ex. FW145). 상기 산출된 재조합 바이러스를 항-NDV-F 항체 및 항-IBDV-VP2 항체에 의한 염색 플라크에 의해 플라크 정제하였다.
요약하면, 107개의 1차 CEF 세포를 100㎕의 MEF-1(Lonza LNJVD-1004)에 현탁시키고, 1㎍의 상동 벡터, 예를 들어, p44/45 Mcmv ie1 F 및 pHVT Bac VP2, 및 2㎍의 HVT DNA, 예를 들어, FC126, FW029 및 FW023에 의해, 전기천공에 의해 동시-트랜스펙션시켰다. 전기천공을 Nucleofector II에서 수행하였다. 트랜스펙션된 세포를 20ml의 Leibovitz's L-15(GIBCO BRL, Cat. #41300-39), McCoy's 5A Medium (GIBCO BRL, Cat. #21500-061) (1:1) 및 4% 송아지 혈청(용액 LM (+) 배지라고 명명됨)에 희석시키고, 96웰 플레이트의 웰 당 100ul으로 스프레딩하였다.
플라크가 가시화될 때까지 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션하고, 세포를 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 탈락시키고, 신선하게 제조된 이차 CEF 세포에 희석하고, 2개의 96-웰 플레이트로 동일하게 옮기고, 플라크를 가시화하기 위해 3일 동안 인큐베이션하였다. 2개의 플레이트 증 하나를 일차 항체로서 항-VP2 단일클론 항체 R63(ATCC #: HB-9490)에 의해 염색하였다. 염색된 재조합체 플라크를 함유하는 웰을 검출한 후, 다른 플레이트의 상응하는 웰의 세포를 회수하고, 신선한 2차 CEF 세포에 희석하고 2개의 96-웰 플레이트로 동일하게 옮겨 첫번째 정제 차례를 완료하였다. 모든 수득된 플라크가 단일클론 항체 R63에 의해 양성으로 염색될 때까지 정제 절차를 반복하였다. 이후, 이중 rHVT 후보를 항-NDV-F 항체 3-1G/5 (Morrison, T. G., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 1020-1024, 1987) 또는 항 F 토끼 혈청에 의해 염색하였다. 마지막으로, 후보 rHVT의 모든 플라크의 단백질의 발현을 이중 IFA 염색에 의해 확인하였다. 각각의 rHVT에 의해 감염된 CEF를 냉각 아세톤-메탄올(2:1)에 의해 고정시키고, PBS에 의해 세정하고, 항체 혼합물(1:1000 희석된 항 F 토끼 혈청 #35 및 항-VP2 마우스 Mab R63)과 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. PBS에 의한 3회 세정 후, 세포를 형광 항체 혼합물(Invitrogen에 의해 제공된, 1:1000 희석된 Alexa Fluor488 항 토끼 및 Alexa Fluor546 항 마우스)과 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. PBS에 의한 3회 세정 후, 이들을 400배 확대에서 형광 현미경에 의해 관찰한다.
단백질 VP2 발현을 항-VP2 Mab(R63) 및 Alexa Flour 546에 의해 검출하였다. 단백질 F 발현을 항-F #35 토끼 혈청 및 Alexa Flour 488에 의해 검출하였다. 모든 플라크가 F 및 VP2 모두를 발현하는 경우, 정제가 완료되었다고 결론지었다. 도 3은 이중 IFA의 일부 예를 나타내었다.
정제된 재조합체 HVT를 rHVT/ND/IBD라고 지정하였다.
하기 표 1은 상이한 rHVT/ND/IBD로부터 수득된 VP2 및 단백질 F의 발현을 나타낸다. 균주 FW023(HVT/45-46 Bac VP2)은 VP2 발현에 대해 대조군으로서 사용되는 1가 재조합 헤르페스 바이러스에 상응하고, FW029(HVT/45-46 PecF)는 단백질 F 발현에 대해 대조군으로서 사용되는 1가 재조합 헤르페스 바이러스에 상응한다.
rHVT/ND/IBD에 의한 삽입된 NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자의 발현(형광의 검출)


바이러스		 1차 항체
항-F
항혈청		 항-VP2 단일클론 항체 (R63) 토끼 PBS
FW137 +w +w -
FW129 + + -
FW130 + + -
FW141 + + -
FW142 + + -
FW144 + + -
FW145 + + -
FW029 + - -
FW023 - + -
FC126 - - -
없음 - - -
+: 검출됨, +w: 약하게 검출됨, -: 검출되지 않음.
실험 3: 이중 재조합체 HVT에 의해 감염된 CEF에서의 2개의 단백질의 공-발현
2X105개의 CEF 세포를 함유하는 2 ml을 재조합체 HVT에 의해 감염시키고, 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
이후 배양액을 300 g에서 3분 동안 원심분리하고, 침전된 세포를 100ul에 재현탁시켰다. Laemmli 완충액(100ul)을 세포 현탁액에 첨가하였다. 산출된 혼합물을 이후 5분 동안 끓이고, 이의 5 ul를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용시켰다. 전기영동된 단백질을 SDS-GEL로부터 PVDF 멤브레인(Immobilon-P, Millipore)으로 이동시켰고, 이것을 PBS 중의 1% w/v 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다.
F 검출을 위해(도 4A), 처리된 멤브레인을 500-배 희석의 항-F 토끼 항혈청 #35과 실온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS에 의해 3회 세정하고, 비오티닐화 항-토끼 염소 항혈청과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다.
VP2 검출을 위해(도 4B), 처리된 멤브레인을 500-배 희석의 항-VP2 Mab R63과 실온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS에 의해 3회 세정하고, 비오티닐화 항-마우스 염소 항혈청과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다.
PBS에 의해 3회 세정 후, 멤브레인을 아비딘-알칼리 포스파타아제 복합체와 1시간 동안 인큐베이션시키고, PBS에 의해 3회 및 TBS(Tris Buffered Saline: Tris 완충 식염수)에 의해 1회 세정하고, BCIP-NBT(알칼리 포스파타아제의 기질)와 반응시켰다. 도 4A에 제시된 바와 같이, 60 킬로달톤(kDa)의 단백질 밴드는 오직 rHVT/ND/IBD 감염된 세포가 있는 라인에서만 관찰되었고, 이것은 F 단백질의 예상된 크기였다(
Figure 112014104763662-pct00003
). rHVT/44-45BacVP2 (FW123)의 라인에서는 밴드가 없었다.
도 3B는 VP2 단백질이 각각의 rHVT/ND/IBD의 라인에서 38-킬로달톤(kd)으로 관찰되었다는 것을 보여주었다(
Figure 112014104763662-pct00004
). 반면, rHVT/PecF (FW029)의 라인에서는 밴드가 없었다(도 1 B). 38-kd은 성숙 VP2 단백질이다(A. A. Azad et al., 1987, Virol. 161:145-152, K. J., Fahey et al., 1985 J. Gen. Virol. 66:1479-1488).
본 발명에 따른 이중 재조합체 HVT는 NDV-F 및 IBDV VP2를 모두 발현하였다.
실험 4: 게놈 구조의 입증
서던 블롯팅 분석
정제된 rHVT/ND/IBD를 컨플루언트한 상태의 플라크를 수득하기 위해 1개의 25-cm2 플라스크의 CEF 세포에 대해 증식시켰다. 세포를 디쉬로부터 스크래핑(scraping)에 의해 제거하고, Falcon 튜브로 옮기고, 300 xg에서 5분 동안의 원심분리에 적용하였다. 수확된 세포를 PBS에 의해 세정하고, 0.6 ml의 PBS 및 0.4 ml의 용리 완충액(PBS 중의 1.25% TritonX-100, 250 mM 2-ME, 및 50 mM EDTA)에 재현탁하고, 보르텍스(vortexing)에 의해 3분 동안 용해하였다. 용리액을 이후 600 xg에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 15 ml Falcon 튜브로 옮겼다. 바이러스를 20,400 xg에서 20분 동안의 원심분리에 의해 수집하였다. 산출된 펠릿을 이후 0.33 ml의 뉴클레아제 용액(12.5 mM Tris-Cl (pH7.5), 1 ㎍/ml DNase I 및 1 ㎍/ml RNase A)에 현탁시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 55℃에서 30분 동안 83㎕의 SDS-프로테아제 용액(50 mM EDTA, 5% SDS, 0.5mg/ml 프로테아제 K, 및 28.5 mM 2-메르캅토에탄올)과의 인큐베이션에 의해 파괴하였다. 수득된 혼합물을 페놀-클로로포름에 의해 2회 처리하고, NaCl을 0.2 M의 최종 농도로 수성상에 첨가하였다. 바이러스 DNA를 2.5부피의 빙냉 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 70% 에탄올에 의해 세정하고, 20,400 xg에서 20분 동안 4℃에서의 원심분리에 적용하였다. 공기-건조 후, 펠릿을 TE 완충액(10 mM Tris-Cl (pH8.0), 1 mM EDTA)에 용해시켰다.
TE 완충액 중의 바이러스 DNA를 XhoI, SphI 및 SmaI에 의해 소화시키고, 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 적용하였다. 단일 겔 상의 전기영동된 DNA 단편을 동시에 2개의 나일론 멤브레인(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, 6.35, Sambrook, J., and Russell, D.W. Cold Spring Harbor Laboratory)에 옮겼다. 베이킹(baking)에 의한 DNA의 고정 후에, 부동화된 DNA를 DIG-표지된 프로브, "VP2 프로브", 또는 "IS44/45 프로브"(이것은 PCR DIG Probe Synthesis Kit (ROCHE DIAGNOSTICS, Cat. #1636090)에 의해 제조됨)와 함께 혼성화시켰다. 또한, TE 완충액 중의 바이러스 DNA를 XhoI 및 SphI에 의해 소화시키고, 상기 언급된 동일한 절차에 의해 DIG-표지된 프로브, "F 프로브", "IS45/46 프로브"와 함께 혼성화시켰다. VP2 프로브를 프라이머로서 VP2 STC-F (SEQ ID NO.21) 및 VP2 STC-R (SEQ ID NO.22) 및 주형으로서 p45/46bacVP2-STC에 의해 제조하였다. F 프로브를 프라이머로서 F-F (SEQ ID NO.23) 및 F-R (SEQ ID NO.24) 및 주형으로서 p45/46PecF에 의해 제조하였다. IS45/46 프로브를 프라이머로서 45/46-F (SEQ ID NO.25) 및 45/46-R (SEQ ID NO.26) 및 주형으로서 pNZ45/46Sfi에 의해 제조하였다. IS44/45 프로브를 프라이머로서 44/45-F (SEQ ID NO.27) 및 44/45-R (SEQ ID NO.28) 및 주형으로서 pNZ44/45d46Sfi에 의해 제조하였다.
VP2 STC-F (SEQ ID NO.21) 5'-CACCGTCCTCAGCTTACCCACATC-3'
VP2 STC-R (SEQ ID NO.22) 5'-ACGACGGATCCTGTTGCCACTCT-3'
NDV-F-F (SEQ ID NO.23) 5'-CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT-3'
NDV-F-R (SEQ ID NO.24) 5'-GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT-3'
45/46-F (SEQ ID NO.25) 5'-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3'
45/46-R (SEQ ID NO.26) 5'-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3'
44/45-F (SEQ ID NO.27) 5'-GTACTATAGAATGTGTTCC-3'
44/45-R (SEQ ID NO.28) 5'-GTATCCAACGCCTCAAGATC-3'
서던 블롯팅의 결과는 (도 5A-5D) 2077-bp 단편이 FW129로부터의 DNA 중의 VP2 프로브에 혼성화되었다는 것을 나타내었다. 반대로, p45/46Pec F에서는 밴드가 검출되지 않았다.
또한 2744-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT로부터의 DNA 중의 F 프로브에 혼성화되었다. p45/46 SfiI에서는 밴드가 검출되지 않았다.
2077-bp 및 1228-bp 단편은 FW129로부터의 DNA 중의 IS44/45 프로브에 혼성화되었다. 1350-bp 단편은 p45/46 PecF 중의 IS44/45 프로브에 혼성화되었다(IS44/45 부위에는 유전자가 삽입되지 않았음).
2744-bp 및 770-bp 단편은 각각의 이중 재조합체 HVT로부터의 DNA 중의 IS45/46 프로브에 혼성화되었다. 도 5A-5D는 수득된 이중 재조합체 HVT/ND/IBD가 예상된 게놈 구조를 갖는다는 것을 나타냈다.
실험 5: 계대 중 재조합체 HVT의 안정성
웨스턴 블롯팅 분석
이중 재조합체 HVT를 닭 배아 섬유아세포(CEF)에 대해 연속으로(15회까지) 계대하였다. 이후 세포 용리액을 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 첫번째 패널에서(도 6A), 블롯은 항-F 토끼 항체(#35)와 반응하였다. 두번째 패널에서(도 6B) 블롯은 항-VP2 Mab(R63)와 반응하였다. Mock: 비-감염된 CEF
M: Precision Plus Protein Standards Bio Rad #161-0374
15회 계대 후, F 및 VP2가 이중 재조합체 HVT에 의해 감염된 CEF에서 안정하게 발현되었다. 그러나, FW137은 15회 계대 후에 F 및 VP2 항원의 신호를 발현하지 않아, 단일 부위에 2개의 유전자를 가진 재조합체 HVT는 불안정하다는 것을 나타냈다.
서던 블롯팅 분석
M: 분자 마커 람다 HindIII 소화물
TP-24: 전달 플라스미드 p44-45d46SV40VP2
TP-25: 전달 플라스미드 p44-45d46RsvVP2
각각의 rHVT/ND/IBD를 CEF 세포에서 15회 계대하고, 실험 4에 기재된 바와 같이 서던 블롯 분석에 적용하였다. 결과는 실험 4에서 수득된 결과와 동일하였고, 재조합 바이러스가 심지어 15회 계대 후에도 안정하였음을 나타낸다.
서던 블롯팅의 결과는 2077-bp 단편이 FW129로부터의 DNA 중의 VP2 프로브에 혼성화되었던 도 7A를 보여주었다. 2334-bp 단편은 FW130로부터의 DNA 중의 VP2 프로브에 혼성화되었다. 반대로, p45/46Pec F에서는 밴드가 검출되지 않았다.
도 7C는 2744-bp 단편이 각각의 이중 재조합체 HVT로부터의 DNA 중의 F 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. p45/46 SfiI에서는 밴드가 검출되지 않았다.
도 7B는 2077-bp 및 1228-bp 단편이 FW129로부터의 DNA 중의 IS44/45 프로브에 혼성화되었고, 2334-bp 및 1022-bp 단편이 FW130로부터의 DNA 중의 IS44/45 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다. 1350-bp 단편은 p45/46 PecF 중의 IS44/45 프로브에(IS44/45 부위에는 유전자가 삽입되지 않았음) 혼성화되었다.
도 7D는 2744-bp 및 770-bp 단편이 각각의 이중 재조합체 HVT로부터의 DNA 중의 IS45/46 프로브에 혼성화되었다는 것을 보여준다.
44/45 프로브 및 45/46 프로브에 의한 서던 블롯은 VP2 유전자 또는 F 유전자가 FW129 및 FW130 내 삽입 부위 44/45 또는 45/46 각각에서 안정하게 유지되었다는 것을 보여주었다.
실험 6: 이중 재조합체 HVT에 의해 접종된 닭에서의 항-NDV 및 IBDV ELISA 적정농도
각각의 rHVT/ND/IBD를 3,000 PFU/200㎕/새로, 10마리의 1일령 SPF 닭(LineM, Japan Biological Laboratories)의 등 내로 20Gauge 주사기를 사용하여 피하 접종하였다. 백신화 이후 3주부터, 백신화된 새로부터 혈청을 수집하였다. 항-NDV 항체 적정농도를 시판 ELISA 키트(IDEXX, 뉴캐슬병을 진단하기 위한 ELISA 키트)에 의해 측정하였다. 항-IBDV 항체를 시판 ELISA 키트, Flock Check Infectious Bursal Disease Antibody Test Kits(IDEXX Laboratory, Inc.)에 의해 적정하였다. 음성 대조군의 닭(non-immun)에는 임의의 백신을 투여하지 않았다.
도 8A는 항-NDV 적정농도의 변화를 보여준다. 도 8B는 항-IBDV 적정농도의 변화를 보여준다.
2개의 부위를 사용하는 이중 재조합체 HVT는 항-NDV 및 항-IBDV 적정농도 모두를 안정하게 유도하였다.
실험 7: NDV에 대항하는 SPF 닭에서의 rHVT/ND/IBD의 효능
ND 백신으로서 rHVT/ND/IBD(FW130, FW135, FW137, FW129)의 효능을 뉴캐슬병 백신으로서 효능 시험을 사용하여 평가하였다.
rHVT/ND를 3,000 PFU/200㎕/새로, 10마리의 1일령 SPF 닭(LineM, Japan Biological Laboratories)의 등 내로 20Gauge 주사기를 사용하여 피하 접종하였다. 백신화 이후 3주부터, 백신화된 새로부터 혈청을 수집하고 항-NDV 항체 적정농도를 시판 ELISA 키트(IDEXX, 뉴캐슬병을 진단하기 위한 ELISA 키트)에 의해 측정하였다.
양성 대조군의 닭을 14일령에, 공급자의 권고에 따라 시판 NDV 생 백신에 의해 백신화하였다. 음성 대조군의 닭에는 임의의 백신을 투여하지 않았다.
43일령(백신화 후 42일)에, 모든 7개 그룹의 닭을 대퇴부 영역에 근육내에 의해, 미국에서 표준 유발 균주인 NDV-TexasGB, 103EID50으로 유발시켰다. 유발된 닭을 폐사율을 확인하고 임의의 뉴캐슬병의 증상을 검출하기 위해 매일 관찰하였다.
맹독성 NDV에 의한 rHVT/ND/IBD-백신화된 SPF 닭의 유발 실험(challenge experiments)
백신화 투여량(PFU/닭) 닭의 수 증상의 수/총 수 (%) 부화시 HI (ELISA) 적정농도 유발시 ELISA 적정농도
FW130 3000 10 0/10 (0) 0 0.649
FW135 3600 10 2/10(20) 0.085
FW137 3600 10 3/10(30) 0.050
FW129 3000 10 0/10(0) 0.233
FW029 4000 10 0/10(0) 0.544
시판 NDV 생 백신 라벨에 표시 10 0/10 (0) 1.089
유발 대조군 N/A 10 11/12 (92) 0.089
비-유발 대조군 N/A 10 0/5 (0) N/A
표 2에 제시된 바와 같이, 본 발명의 rHVT/ND/IBD에 의해 백신화된 닭은 임의의 임상적 징후를 보이지 않았으며, 유발일에 ELISA 적정농도는 유의하게 상승되었다. 예상되는 바와 같이, FW137(2개의 재조합 뉴클레오티드 서열이 동일한 삽입 부위 내로 삽입됨) 또는 FW135(Bac 프로모터가 UL44와 UL45 사이에 삽입됨)에 의해 백신화된 닭 모두가 임상적 징후를 보였으며, ELISA 적정농도는 약했다.
실험 8: IBDV에 대항하는 SPF 닭에서의 rHVT/ND/IBD의 효능
IBD 백신으로서 FW129 및 FW141(HVT/45-46 PecF/44-45 Mcmv ie1VP2)의 효능을 유발 IBDV STC에 의해 평가하였다.
먼저, 2,000 pfu의 rHVT/ND/IBD를 18일자에 SPF 부화란 내로 또는 1일령 SPF 닭의 등 내에 피하로 접종하였다. 3주령에, 백신화된 닭을 103.5EID50/새의 IBDV STC에 의해 경구 유발시켰다. 1주 후에, 모든 닭을 칭량하고, 부검하여 파브리키우스 소낭(Bursa of Fabricius)을 회수하고, 이것을 전염성 점액낭병에 의해 야기된 임의의 병반에 대해 관찰하였다.
보호는 하기와 같은 2가지 범주에 의해 평가하였다. (1) 점액낭 대 신체의 중량비(B/B 지수)가 비-백신화된, 비-유발된 닭과 통계적으로 상이하지 않았다. (2) 파브리키우스 소낭(Bursa of Fabricius)의 기형, 예컨대 부종화, 출혈, 황색 삼출물, 변색, 위축 또는 젤라틴화 삼출물이 검출되지 않았다. 결과를 표 3에 요약하였다.
맹독성 IBDV에 의한 rHVT/ND/IBD-백신화된 SPF 닭의 유발 실험
백신화 # 보호된/총
백신 경로 (%)
FW129 SQ 7/8 (88%)
FW141 SQ 8/8 (100%)
FW023 SQ 8/8 (100%)
FW129 알 내(in ovo) 8/10 (80%)
FW141 알 내 9/10 (90%)
FW023 알 내 9/10 (90%)
없음 N/A 0/4 (0%)
없음 N/A 5/5 (100%)
모든 백신화된 닭의 80% 초과가 IBDV STC 균주에 의한 유발에 대항하여 보호되었고, rHVT/ND/IBD가 맹독성 IBDV에 대항하여 닭에서 보호 면역을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실험 9: MDA+ 닭에서 8주에 IBDV 유발 시험
그룹:
G1: NINC (백신화되지 않고 유발되지 않음)
G2: NICC (백신화되지 않고 유발됨)
G3: FW141
G4: FW144
G5: FW 023 (양성 대조군)
병아리
MDA+ 새(산란용 암탉), 각 그룹내 16 내지 17마리의 새/그룹.
3,000 pfu의 백신을 16 내지 17마리의 1일령 MDA+ 닭의 등 내에 피하로 접종하였다. 8주령에, 백신화된 닭을 103 TCID50/새의 IBDV STC에 의해 경구 유발시켰다. 1주 후에, 모든 닭을 칭량하고, 부검하여 파브리키우스 소낭(Bursa of Fabricius)을 회수하고, 이것을 전염성 점액낭병에 의해 야기된 임의의 병반에 대해 관찰하였다.
보호는 하기와 같은 2가지 범주에 의해 평가하였다. (1) 점액낭 대 신체의 중량비(B/B 지수); (2) 파브리키우스 소낭(Bursa of Fabricius)의 기형, 예컨대 부종화, 출혈, 황색 삼출물, 변색, 위축 또는 젤라틴화 삼출물이 검출되지 않았다. 결과는 하기 표에 요약한다.
n B/B 지수 페사 병반 % 보호
NINC 16 1.00 0 0/16 -
NICC 16 0.44 1 16/16 0
FW141 16 0.94 0 2/16 88
FW144 16 0.93 1 5/16 69
FW023 17 0.98 0 3/17 82
상기 결과는 본 발명의 다가 백신이 IBDV에 대항하여 생체 내에서 효과적인 보호를 야기한다는 것을 보여준다.
실험 10: MDA+ 닭에서 8주에 NDV 유발 시험
그룹
G1: 유발 대조군
G2: FW141
G3: FW144
G4: FW145
G5: FW 029 (양성 대조군)
병아리
MDA+ 새(산란용 암탉), 각 그룹내 17마리의 새/그룹.
3,000 PFU의 백신을 17마리의 1일령 MDA+ 닭의 등 내에 피하로 접종하였다. 8주령에, 백신화된 닭을 대퇴부 영역에 근육내에 의해, 미국에서 표준 유발 균주인 NDV-TexasGB, 103 EID50으로 유발시켰다. 유발된 닭을 폐사율을 확인하고 임의의 뉴캐슬병의 증상을 검출하기 위해 매일 관찰하였다. 결과를 하기에 제시한다.
면역화됨 유발됨 폐사 증상* % 보호
유발 대조군 17 13 13 0 0.0
FW141 17 15 1 0 93.3
FW144 17 15 3 1 73.3
FW145 17 13 0 0 100.0
FW029 17 16 3 0 81.3
* 폐사가 없는 일부 NDV 증상
상기 결과는 본 발명의 다가 백신이 NDV 및 IBDV에 대항하여 생체 내에서 효과적인 보호를 야기한다는 것을 보여준다. 보호는 강하고 안정하다.
SEQUENCE LISTING <110> CEVA SANTE ANIMALE <120> Multivalent recombinant avian herpes viruses and vaccines for immunizing avian species <130> IP20142568FR <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Bac promoter <400> 1 tgcagctcag tgcatgcacg ctcattgccc atcgctatcc ctgcctctcc tgctggcgct 60 ccccgggagg tgacttcaag gggaccgcag gaccacctcg ggggtggggg gagggctgca 120 cacgcggacc ccgctccccc tccccaacaa agcactgtgg aatcaaaaag gggggagggg 180 ggatggaggg gcgcgtcaca cccccgcccc acaccctcac ctcgaggtga gccccacgtt 240 ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 300 ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg 360 ggcggggcca ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg 420 gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc 480 gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 540 ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 600 gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt 660 ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 720 ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg 780 cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc 840 gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa 900 ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg 960 ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg aagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 1020 cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 1080 tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 1140 gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat 1200 ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat 1260 ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca 1320 ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 1380 tccagcctcg gggctgtccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg 1440 ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgggg tttatatctt 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gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc cattattggc 180 acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt aattaaaacg 240 ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa cgtgaccttt 300 aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc aatacacgtc 360 aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc tggaaattcc 420 atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga ggcgcgacca 480 gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct cctcgctgca 540 g 541 <210> 4 <211> 589 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Hcmv promoter <400> 4 gagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 120 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 180 tgggtggagt atttacggta aactgcccat tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 240 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcgcgc ctggcattat gcccagtaca 300 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 360 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 420 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 480 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 540 ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcct 589 <210> 5 <211> 646 <212> DNA <213> artificial <220> <223> SV40 promoter <400> 5 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60 gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaccgcctc ggcctctgag 360 ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagcttgat 420 tcttctgaca caacagtctc gaacttaagc cgcagaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 480 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 540 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 600 tttctctcca caggtgtcca ctccagttca attacagctc ttaagg 646 <210> 6 <211> 534 <212> DNA <213> artificial <220> <223> RSV promoter <400> 6 tgcatctgct ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta gtgcgcgagc aaaatttaag 60 ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt 120 ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgtat ctgaggggac tagggtgtgt 180 ttaggcgaaa agcggggctt cggttgtacg cggttaggag tcccctcagg atatagtagt 240 ttcgcttttg catagggagg gggaaatgta gtcttatgca atactcttgt agtcttgcaa 300 catggtaacg atgagttagc aacatgcctt acaaggagag aaaaagcacc gtgcatgccg 360 attggtggaa gtaaggtggt acgatcgtgc cttattagga aggcaacaga cgggtctgac 420 atggattgga cgaaccactg aataccgcat tgcagagata attgtattta agtgcctagc 480 tcgatacaat aaacgccatt tgaccattca ccacattggt gtgcacctgg ctag 534 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 ccccgaattc atggaagaaa tttcc 25 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 cgcgggccaa taaggccaac atcgggacgt acatc 35 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 9 gcgcggcctt attggcctta aataccgcgt ttggag 36 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 10 ccccaagctt tcaagtgata ctgcgtga 28 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 11 gggaattcga agagcccccg cggacgcatg 30 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 12 ccgctagcgg ccgcaagttc cttcaccatg accag 35 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 13 gcggccgcta gcggccttat tggccgtagc ataaagacgc agg 43 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 14 ccaagcttct agtacatata tatacatgac 30 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 15 gggggaattc attatcccat ctaacagtta tatacg 36 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 16 gccgctagcg gccgccttta ttaacaacct tac 33 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 17 gcggccgcta gcggccttat tggccgttta ttctatgtaa gac 43 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 18 cccaagctta agttccttca ccatg 25 <210> 19 <211> 572 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Mcmv ie1 promoter <400> 19 ggccaataag gctgcagtac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 60 taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 120 tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 180 tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 240 ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc tattgaaact 300 aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc 360 tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt 420 tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg 480 tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg 540 cagagctcct cgctgcaggc ggccgctcta ga 572 <210> 20 <211> 87 <212> DNA <213> artificial <220> <223> SPA <400> 20 ctgcaggcgg ccgctctaga gtcgacaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 60 ttggtttttt gtgtggccaa taaggcc 87 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VP2 STC-F <400> 21 caccgtcctc agcttaccca catc 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VP2 STC-R <400> 22 acgacggatc ctgttgccac tct 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> NDV-F-F <400> 23 ctagcagtgg cagttgggaa gat 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> NDV-F-R <400> 24 gttaaggcag gggaagtgat ttgt 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 45/46-F <400> 25 ggggaagtct tccggttaag ggac 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 45/46-R <400> 26 ggtgcaattc gtaagaccga tggg 24 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 44/45-F <400> 27 gtactataga atgtgttcc 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 44/45-R <400> 28 gtatccaacg cctcaagatc 20

Claims (24)

  1. 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 조류 헤르페스 바이러스로서,
    각각의 재조합 뉴클레오티드 서열은 구별되는 항원 펩티드를 인코딩하며, 상기 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열은 UL44와 UL45 사이에 위치한 영역, UL45와 UL46 사이에 위치한 영역, US10과 SORF3 사이에 위치한 영역, 및 SORF3과 US2 사이에 위치한 영역 중에서 선택되는 바이러스 게놈의 구별되는(distinct) 비-코딩 영역 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스에 의한 닭 배아 섬유아세포(Chicken Embryo Fibroblast: CEF) 세포의 감염시, 2개 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열이 10회 이상의 계대 후에 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포에서 공발현되는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    재조합 뉴클레오티드 서열은 조류 병원체로부터의 항원 펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    재조합 뉴클레오티드 서열은 조류 파라믹소바이러스 유형 1의 항원 펩티드, 감보로병 바이러스의 항원 펩티드, 전염성 후두기관염 바이러스(infectious laryngotracheitis virus: ILTV)의 항원 펩티드, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum)의 항원 펩티드, 및 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 펩티드 중에서 선택되는 항원 펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    항원 펩티드가 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus: NDV)의 F 단백질, 전염성 점액낭병 바이러스(Infectious bursal disease virus: IBDV)의 VP2 단백질, 전염성 후두기관염 바이러스(infectious laryngotracheitis virus: ILTV)의 gB 단백질, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma galisepticum)의 40K 단백질, 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 헤마글루티닌(HA), 또는 이들의 면역원성 단편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL44와 UL45 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 첫번째 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL45와 UL46 사이에, US10과 SORF3 사이에, 또는 SORF3과 US2 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 두번째 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 첫번째 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 US10과 SORF3 사이에, 또는 SORF3과 US2 사이에 위치한 비-코딩 영역 내에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 두번째 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  8. 제1항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 위치한 영역 내에 삽입된 재조합 뉴클레오티드 서열이 UL45의 전사 방향과 반대이고 UL46과 동일한 전사 방향으로 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    각각의 재조합 뉴클레오티드 서열은 구별되는 프로모터의 조절 하에 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  10. 제9항에 있어서,
    재조합 뉴클레오티드 서열을 조절하는 프로모터가 닭 베타-액틴(Bac) 프로모터, Pec 프로모터, 뮤린 사이토메갈로바이러스(Murine Cytomegalovirus: Mcmv) 즉발성-초기(immediate-early: ie)1 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(Human Cytomegalovirus: Hcmv) 프로모터, 시미안 바이러스(Simian virus: SV)40 프로모터 및 라우스 사르코마 바이러스(Raus Sarcoma virus: RSV) 프로모터, 또는 프로모터 활성을 보유한 이들의 임의의 단편 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드 서열 중 하나는 Pec 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 2개의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 중 하나는 UL45와 UL46 사이에 위치한 바이러스 게놈의 비-코딩 영역 내에 삽입되고, 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 중 하나는 Pec 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 삽입된 Pec 프로모터의 조절 하에 첫번째 항원 펩티드를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이에 삽입된 두번째 항원 펩티드를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 삽입된 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이에 삽입된 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 삽입된 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 UL44와 UL45 사이에 삽입된 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이에 삽입된 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이에 삽입된 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    UL45와 UL46 사이의 삽입 부위 내에 IBDV의 VP2 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 SORF3과 US2 사이의 삽입 부위 내에 NDV의 F 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  18. 제1항에 있어서,
    칠면조의 재조합 헤르페스 바이러스(recombinant herpes virus of turkeys: rHVT)인 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  19. 제1항의 재조합 조류 헤르페스 바이러스를 면역화 유효량으로 포함하는 다가 백신.
  20. 제1항에 있어서,
    병원체에 대항하여 조류를 면역화하는데 사용하기 위한 재조합 조류 헤르페스 바이러스.
  21. 제19항의 다가 백신을 조류에게 투여하는 단계를 포함하는, 2개 이상의 병원체에 동시에 대항하여 조류를 백신화시키는 방법.
  22. 하기 성분을 포함하는, 조류 종을 면역화하기 위한 백신화 키트:
    a. 유효량의 제19항의 백신; 및
    b. 상기 백신을 상기 종에게 투여하기 위한 수단.
  23. 삭제
  24. 삭제
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