KR102069726B1 - 세포 이동성 측정 방법 및 이를 이용한 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법 - Google Patents

세포 이동성 측정 방법 및 이를 이용한 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 형광 관측을 통하여, 마이크로필라 칩(micropillar chip) 상부의 구조체에서 3차원으로 배양된 세포가 마이크로필라 칩과 구조체의 접촉면으로 이동하여 부착 성장하는 빈도비(frequency ratio)를 이용한 세포의 이동성 측정 방법에 관한 것으로, 이와 동시에 세포 활성도를 관측하여 비교함으로써, 약물 농도에 따른 세포 이동성의 저해 정도, 약물의 독성 등을 총괄한 약물의 효용성을 판단하는 도구를 제공한다.

Description

세포 이동성 측정 방법 및 이를 이용한 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법{METHOD FOR MEASURING CELL MIGRATION AND METHOD FOR SCREENING CELL MIGRATION INHIBITORY COMPOSITION USING THE SAME}
본 발명은 3차원으로 배양된 세포의 형광 관측을 이용한 세포의 이동성 측정 방법 및 이를 이용한 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포 이동(cell migration)이란, 다양한 물리, 화학, 생물학적 자극에 의하여 일련 또는 개개의 세포가 이동하는 것을 지칭한다. 이러한 세포 이동은 신생혈관형성(angiogenesis), 암전이, 조직의 발생 및 분화, 손상조직 재생, 면역반응 등의 다양한 생물학적 현상과 다양한 질병의 치료에 깊게 연관되어 있다.
근래까지 세포　이동에 대한 연구는 대부분 체외 조직 배양 세포를 2차원 커버슬립(cover slip) 표면에 배양한 후 움직임을　관찰함으로써 수행되었다. 그러나 이러한 방법은 인체 등 생리적인 조건과는 상당히 차이가 있어 인체 내부 등에서 일어나는 현상을 예측하기 어려운 문제점이 있었다. 따라서, 생리적인 조건을 모사할 수 있는 장치, 기법 등이 요구되어 왔으며, 최근 3차원적인 체외 조직 배양 도구들이 사용이 활발해지고 있다.
또한, 한국 공개특허 제10-2014-0011325호는 균일한 두께를 갖는 나노섬유매트와 세포 형광 염색을 이용하여 세포의 3차원적 이동을 측정하는 세포이동 측정용 어세이 칩에 관하여 개시하고 있으나, 이는 유도 물질을 이용한 세포의 상하 이동 여부만을 확인할 수 있다는 점에서 한계가 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
한국 공개특허 제10-2014-0011325호
본 발명은 세포의 형광 관측을 통하여, 마이크로필라 칩 상부의 구조체에서 3차원으로 배양된 세포가 마이크로필라와 구조체의 접촉면으로 이동하여 부착 성장하는 빈도비를 이용한 세포의 이동성 측정 방법을 제공하며, 이와 동시에 세포활성도를 관측하여 비교함으로써, 약물 농도에 따른 세포 이동성의 저해 정도, 약물의 독성 등을 총괄한 약물의 효용성을 판단하는 도구를 제공한다.
본 발명의 일 양상은 (a) 마이크로필라 칩(micropillar chip)에 접촉되어 있고 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 3차원 구조체 내에서 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; 및 (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동 여부를 판단하는 단계를 포함하는 세포의 이동성 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (a) 내지 (c)를 2회 이상, 바람직하게는 10 내지 16회 수행하여 상기 부착된 세포의 빈도비(frequency ratio)를 측정함으로써 상기 세포의 이동 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포외 기질은 알지네이트(Alginate), 콜라겐(Collagen), 피브린(fibrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 자가조립 펩타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 양상은 (a) 마이크로필라 칩에 접촉되어 있고 세포 이동성 저해제의 후보 물질 및 세포외 기질을 포함하는, 3차원 구조체 내에서 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고, 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동성을 판단하는 단계; 및 (d) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포와 부착되지 않은 세포의 활성도 또는 세포의 골격을 측정하는 단계를 포함하는 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예는 상기 단계 (a) 내지 (d)를 2회 이상, 바람직하게는 10 내지 16회 수행하여 상기 부착된 세포의 빈도비 및 활성을 측정함으로써 상기 세포의 이동성 및 활성도를 판단할 수 있다.
기존의 세포 이동/침윤 실험(migration/invasion assay)이 세포의 움직임을 2차원으로 배양 및 분석함과 달리, 본 발명은 세포의 3차원에서의 움직임을 측정하는 것을 기본으로 하여, 인체 등 생물 환경을 보다 흡사하게 모사하는 모델을 제공한다. 또한, 기존에 1개의 웰에서만 측정했던 것과 달리, 수 개, 바람직하게는 14개의 복제된 웰에서의 세포 이동여부를 관찰하여 세포가 이동하여 마이크로필라 바닥에 부착되는 세포의 빈도비를 계산하므로, 세포 이동도 측정의 정확성과 정밀도를 높일 수 있다. 살아 있는 세포를 염색하기 때문에 세포의 이동도 뿐만 아니라 세포의 활성도 동시에 측정이 가능하다.
본 발명은 세포의 이동도 및 세포 활성도를 관측하여 비교함으로써, 약물 농도에 따른 세포 이동성의 저해 정도, 약물의 독성 등을 총괄한 약물의 효용성을 판단할 수 있으며, 약물의 고속대량/고집적 스크리닝(high throughput/high contents screening) 분야에 적용 가능할 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포 이동성 측정 방법에 따른 세포 형광 이미지의 예시를 나타낸다.
도 2는 마이크로필라 칩에 포함된 약물((a) 오아바인(Ouabain) 및 (b) 겔다나마이신(Geldanamycin)에 따른 세포활성도 및 세포 이동성 측정 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명에 따른 세포의 이동성 측정 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양상은 (a) 마이크로필라 칩에 접촉되어 있고 세포외 기질을 포함하는 3차원 구조체 내에서 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고, 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; 및 (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동 여부를 판단하는 단계를 포함하는 세포의 이동성 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포의 이동성 측정 방법은 (a) 마이크로필라 칩 상단에 접촉되어 있고 세포외 기질을 포함하는 3차원 구조체 내에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 명세서 사용되는 용어 "세포"는 이동이 가능한 동물세포, 바람직하게는 포유류 세포를 지칭하며, 보다 바람직하게는 원발성 종양　세포, 침습성　세포 및 전이성　세포를 포함하는 암세포일 수 있다. 상기 암은 전이성 암 또는　전이성 유발가능한 암인 것일 수 있으며, 구체적으로는 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 세포는 녹색형광단백질(GFP) 등 형광단백질로 표지된 것이 바람직하며, 상기 표지는 형광단백질의 유전자를 프로모터 등에 삽입하여 이식하거나 항체염색법에 의하여 수행될 수 있다.
본 명세서 사용되는 용어 "배양"은 사용되는 세포에 따라 당업계에 공지된 적절한 조건(세포의 밀도, 세포 외부의 pH 및 산소 농도 등) 하에서 실험에 사용된 세포를 성장, 증식, 분화 또는 유지시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 세포의 배양은 세포외 기질을 포함하는 3차원 구조체 내에서 24시간 내지 60시간, 바람직하게는 36시간 내지 54시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 진행될 수 있다.
본 명세서 사용되는 용어 "3차원 구조체"는 세포가 배양 및 이동되는 3차원 공간을 지칭한다. 상기 3차원 구조체는 세포의 배양에 적합한 배지(medium)일 수 있고, 구체적으로 고체 배지 또는 반고체 배지인 것이 바람직하며, 이는 외부 환경 요인의 영향이 배제된 채 세포 자체의 이동성을 관찰하기 위함이다. 상기 3차원 구조체는 정상　세포　대사에 필수적인 특정 벌크 무기 이온 및 물과 함께　세포를 제공하고　세포 내외의 삼투압 균형을 유지하는 염 및 다른 구성요소의 수용액 또는 기본 염 영양소를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 상기 3차원 구조체는 에너지 공급원으로서 적어도 하나의 탄수화물 및/또는 생리적 pH 범위 내에서 배지를 유지하기 위한 완충 시스템을 포함한다. 3차원 구조체로 사용 가능한, 상업적으로 입수가능한 배지의 예는 인산염 완충 식염수(PBS), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 이글(Basal Medium Eagle: BME), RPMl 1640, 함(Ham)의 F-10, 함의 F-12, α-최소 필수 배지(αMEM), 글래스고(Glasgow)의 최소 필수 배지(G-MEM), 이스코브 변형 둘베코 배지, 또는 만능　세포와 함께 사용하기 위해 변형된 일반적 목적의 배지, 예컨대 X-VIVO (Lonza) 또는 조혈 기본 배지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 3차원 구조체는 세포외 기질을 포함한다. 본 명세서 사용되는 용어 "세포외 기질"은 생체 내의 포유동물 조직에서 발견되는,　세포를 지지해 주는　세포　주변의 복잡한 구조체를 지칭하며, 흔히 결합 조직이라 불린다.　천연적인 세포외 기질은 주로 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin) 등의 구조 단백질, 피브릴린(fibrillin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 엔탁틴(entactin) 및 프로테오글리칸 등의 분화 단백질을 비롯한 주요한 3가지 부류의 생체분자로 이루어진다. 이러한 세포외 기질들을 이용하여 생체 유사의 3차원 스캐폴드를 실험실에서 제작할 수 있으며, 주로 사용되고 있는 자연적 스캐폴드는 제1형 콜라겐(type 1 collagen), 제4형 콜라겐(type Ⅳ collagen), 라미닌, 피브로넥틴 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 천연물질의 하이드로겔(hydrogel)이며, 매트리젤(Matrigel), 알지네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 자가조립 펩타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 알지네이트이다. 상기 3차원 구조체는 이 외에 세포의 배양에 필요한 보충 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 3차원 구조체는 스크리닝의 대상이 되는 세포 이동성 저해제의 후보 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포의 이동성 및 활성도를 측정 및 분석함으로써, 여러 후보 물질 중 세포에 대한 독성이 낮으면서 효과적으로 세포의 이동을 억제할 수 있는 물질을 선정할 수 있다. 상기 3차원 구조체에 포함된 세포 이동성 저해제에 의하여 세포의 이동이 중단된 경우, 세포는 3차원 구조체 내에서 3차원적으로만 성장하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 3차원 구조체는 형상 및 크기에 영향을 받지 않으나, 바람직하게는 반구, 원기둥, 정육면체, 직육면체, 원뿔, 다각뿔 등의 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 반구 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 사용되는 용어 "마이크로필라 칩"은 3차원 구조체의 하부에 위치하여 지지체의 역할을 하며, 3차원 구조체와 달리 마이크로필라 칩 내부에서는 세포의 이동이 불가능하다. , 마이크로필라 상에 세포가 형성된 후에 마이크로필라 칩을 배양액 및 약물에 담구어 마이크로필라 상에 형성된 세포를 배양하거나 약물과 반응시키는 역할을 할 수도 있다. 상기 마이크로필라 칩은 몰딩 성형을 이용하여 제조된 것으로, 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 또는 폴리우레탄 아크릴레이트(polyurethane acrylate, PUA)으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로필라 칩은 형상 및 크기에 영향을 받지 않으나, 바람직하게는 원기둥, 다각기둥, 원뿔, 다각뿔 등의 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 원기둥 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광염색"은 살아있는 세포를 육안으로 확인할 수 있도록 녹색, 적색 등의 형광을 띄는 염색시약을 사용하여 세포를 염색하는 면역형광염색을 포함하는 것으로, 이를 촬영함으로써 수득한 세포의 형광 이미지를 통하여 세포의 활성도, 골격 등을 확인할 수 있다. 상기 형광염색을 위하여, 형광물질, (칼세인 AM(Calcein AM), FITC(Fluorescein isothiocuanate), 팔로딘(Phalloidin), 플루오레세인(fluorescein), 로다민, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, 텍사스레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 코마린(Coumarin)],　형광　염료(Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647(Life Technology 사), DyLight 633, DyLight 650, DyLight 680(Thermo Fisher 사), TF5, TF6, TF7(ACZO Biotech) 등) 및　형광　염료를 내포한 입자(Flash Red(Bangs Labs 사), Dark Red, Infrared(Invitrogen 사), Sky Blue(Sperotech 사) 등) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이와 동일한 효과를 수득하기 위하여, 세포를 배양 후 형광염색을 수행하는 대신, 세포 자체가 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 세포를 사용하여 배양할 수도 있다. 이를 위하여, GFP를 암호화하는 유전자를 세포에 도입시킬 수 있다(문헌[Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92:11899-11903] 참조).
본 명세서 사용되는 용어 "접촉면"은 상기 3차원 구조체의 일면과 마이크로필라 칩의 일면이 접합되는 평면을 지칭한다. 세포는 중력에 의하여 3차원 구조체의 하부로 이동하게 되며, 상기 접촉면에 도달한 이후에는 마이크로필라 칩 내부로 이동하지 못하고 접촉면에 부착되어 성장하게 된다.
본 발명에 따른 세포의 이동성 측정 방법은 (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; 및 (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동 여부를 판단하는 단계를 포함한다.
상기 배양된 세포는 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 부착면에 평행한 방향으로 형광 이미지 촬영시 결합된 형광 단백질 또는 별도 살아있는 세포의 형광 염색에 의하여 식별이 가능하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 형광단백질로 GFP를 사용한 경우, 3차원 구조체 내에 3차원적으로 배양 중인 세포는 밝은 형광을 나타내며, 부착면에 부착된 세포는 탁한 형광을 나타낸다. 따라서, 상기 형광 이미지 상의 탁한 형광을 보이는 개체의 존재를 통하여 세포의 이동을 확인할 수 있다. 또한, 밝은 형광은 원형을 띄는 반면, 탁한 형광은 세포가 마이크로필라의 바닥에 부착되어 자라기 때문에 넓게 펴진 타원 형상을 가진다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (a) 내지 (c)를 2회 이상, 바람직하게는 10 내지 16회, 보다 바람직하게는 14회 수행하여 상기 부착된 세포의 빈도비를 측정할 수 있다. 상기 세포의 빈도비는 전체 측정 횟수에 대하여 접촉면에 부착된 세포가 존재하는 횟수의 비율로 결정된다. 상기 2회 이상의 측정은 동시에 일어나거나 순차적으로 일어날 수 있다. 종래 1회의 시료에서 세포의 이동 여부를 확인했던 것과 달리, 바람직하게는 동일 또는 유사한 조건 하에서 배양된, 수개의 독립된 시료에서의 결과값을 통계냄으로써, 실험 결과의 정확도 및 정밀도를 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 양상은 (a) 마이크로필라 칩에 접촉되어 있고 세포 이동성 저해제의 후보 물질 및 세포외 기질을 포함하는, 3차원 구조체 내에서 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고, 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동성을 판단하는 단계; 및 (d) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포와 부착되지 않은 세포의 활성도를 측정하는 단계를 포함하는 세포 이동성 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 세포의 활성은 세포의 IC50 값을 관찰함으로써 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 무처리된 마이크로필라 칩을 이용한 세포의 배양
세포를 배양하기 위하여, ATCC로부터 구매한 A549(상용 세포주)와 및 RPMI 배양액(10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)를 준비하였다.
상기 세포가 포함되어 있는 배양액(4×106cells/㎖)과 1.5중량%의 알지네이트 용액을 혼합하였다. 웰(well)에 상기 세포 혼합액 40nl 내지 1㎕를 분주하고, 수면에 맞추어 마이크로필라 칩을 올렸다. 알지네이트가 굳은 후(gelation), 상기 마이크로필라를 미디어 또는 약물이 들어있는 웰에 담구어서 이를 37℃, 5% CO2　농도의 배양기에 넣고 72시간 동안 세포를 배양 또는 약물 반응시켰다.
실시예 2. 오와바인이 포함된 마이크로필라 칩을 이용한 세포의 배양
배양액에 오와바인을 최고농도 20μM에서 3배씩 희석하여 총 12개의 농도(0.11nM, 0.34nM, 1nM, 3nM, 9nM, 27nM, 82nM, 247nM, 741nM, 2.22μM, 6.67μM 및 20μM)로 각 웰에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 조합된 구조체를 제조하고 세포를 배양하였다.
실시예 3. 겔다나마이신이 포함된 마이크로필라 칩을 이용한 세포의 배양
배양액에 겔다나마이신을 최고농도 20μM에서 3배씩 희석하여 총 12개의 농도(0.11nM, 0.34nM, 1nM, 3nM, 9nM, 27nM, 82nM, 247nM, 741nM, 2.22μM, 6.67μM 및 20μM)로 각 웰에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 조합된 구조체를 제조하고 세포를 배양하였다.
실험예 1. 배양된 세포의 형광 이미지 촬영을 통한 세포 이동성 및 활성 측정
실시예 1 내지 3에서 각각 배양시킨 조합된 구조체로부터 마이크로필라 칩을 제거한 후, 형광 현미경을 이용하여 접착면에 평행한 방향으로 형광 이미지를 촬영하였다(도 1 참조).
특히, 오와바인 및 겔다나마이신, 두 약물을 12개의 농도로 마이크로필라 칩에 첨가하여 칼세인 AM을 이용하여 세포의 활성과 이동을 동시에 측정하여 비교하였다 세포의 활성은 각 마이크로필라 칩에서 살아있는 세포(녹색 형광)의 강도를 측정하여 정량화하였고, 세포의 이동성은 14개의 동일 조건을 가진 마이크로필라 칩에서 세포가 부착면에 부착이 일어난 마이크로필라 칩의 수를 측정하여 정량화하였다.
상기 실험을 통하여, 오와바인을 첨가한 실시예 2에서는 세포 이동성을 기준으로 하는 IC50 값이 세포 활성을 기준으로 하는 IC50 값보다 100배 작게 나와, 세포가 약물에 의해 괴사되기 전에 세포의 이동성이 감소한다는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 (a) 참조). 이에 비하여, 겔다나마이신을 첨가한 실시예 3에서는 세포 이동성을 기준으로 하는 IC50 값이 세포 활성을 기준으로 하는 IC50 값의 약 1/2에 해당하여, 세포가 약물에 의해 괴사되기 전에 세포의 이동성이 감소하기는 하나, 그 농도차이가 크지 않음을 확인할 수 있었다(도 2의 (b) 참조).
실험예 2. 배양된 세포의 형광 이미지 촬영을 통한 세포 골격 측정
형광 염색 시약으로서 팔로딘을 사용할 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 형광염색으로 수행하여, 접착면에 평행한 방향으로 형광 이미지를 촬영하였다.
실험 결과, 이동 후 세포의 골격을 확인하였으며, 이를 통하여 세포 형상을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 마이크로필라 칩(micropillar chip)에 접촉되어 있고 세포외 기질(extracellular matrix)을 포함하는 10 내지 16개의 3차원 구조체를 제조하고, 3차원 구조체에 접촉되어 있는 마이크로필라를 배지에 담구어서 3차원 구조체 내에서 세포를 각각 배양하는 단계;
    (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고, 마이크로필라 칩의 부착면에 평행한 방향으로 형광 이미지를 촬영하여 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계; 및
    (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동 여부를 판단하는 단계
    를 포함하고,
    상기 확인은 3차원 구조체 내의 세포 및, 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면으로 이동하여 붙은 세포의 빈도비를 측정하여 이루어지는 것인
    세포의 이동성 측정 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포외 기질은 알지네이트(Alginate), 콜라겐(Collagen), 피브린(fibrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 자가조립 펩타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포의 이동성 측정 방법.
  5. (a) 마이크로필라 칩에 접촉되어 있고 세포 이동성 저해제의 후보 물질 및 세포외 기질을 포함하는 3차원 구조체를, 상기 후보 물질의 농도별로 각각 10 내지 16개씩 제조하고, 3차원 구조체에 접촉되어 있는 마이크로필라를 배지에 담구어서 3차원 구조체 내에서 세포를 각각 배양하는 단계;
    (b) 상기 3차원 구조체 내 세포를 형광염색하고, 마이크로필라 칩의 부착면에 평행한 방향으로 형광 이미지를 촬영하여 세포의 형광 이미지를 획득하는 단계;
    (c) 상기 획득한 형광 이미지로부터 후보 물질의 농도에 따라 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포를 확인함으로써 상기 세포의 이동성을 판단하는 단계; 및
    (d) 상기 획득한 형광 이미지로부터 후보 물질의 농도에 따라 상기 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면에 부착된 세포와 부착되지 않은 세포의 활성도 또는 세포의 골격을 측정하는 단계
    를 포함하고,
    상기 확인은 3차원 구조체 내의 세포 및, 3차원 구조체와 마이크로필라 칩의 접촉면으로 이동하여 붙은 세포의 빈도비를 측정하여 이루어지는 것인
    세포 활성 및 이동성 저해제의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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