KR102069184B1 - 신경줄기세포 추출물유래 bmp신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물 - Google Patents

신경줄기세포 추출물유래 bmp신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발모촉진 또는 탈모방지 조성물에 관한 것으로서, 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2에서 유래한 서열번호 1 내지 3으로 표현되는 펩타이드를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, TGFβ2-유래 펩타이드 및 상기 TGFβ2-유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물 및 화장료 조성물을 제공함으로써, 모발성장을 저해하는 BMP 신호전달경로를 억제하고 모낭줄기세포의 분화를 촉진시켜 다시 성장기(anagen)를 유도함으로써 발모촉진 또는 탈모방지를 하는 효과가 있다.

Description

신경줄기세포 추출물유래 BMP신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물 {A BMP signaling pathway inhibiting peptide derived from a neural stem cell extract and a hair growth promoting or hair loss preventing composition comprising the peptide as an active ingredient}
본 발명은 발모촉진 또는 탈모방지 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신경줄기세포 추출물에서 유래한 BMP신호전달 경로 억제 펩타이드를 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물에 관한 것이다.
머리털은 일정한 모주기(Hair cycle)를 가지며, 모유두 주위에 있는 모모세포(keratinocyte)가 분열 증식하여 모발이 성장하는 기간을 성장기(anagen stage)라 하며 모발의 성장이 멈추고 모유두에서 분리되어 퇴화가 시작되는 퇴하기(catagen stage)를 거치게 된다. 모주기는 이런 성장기, 퇴화기, 휴지기, 및 성장기 과정을 되풀이하게 된다. 개인차가 있지만 보통 성인의 모발 성장기는 일반적으로 남성이 3~5년, 여성이 4~6년이며 모발의 약 88%가 이에 해당된다. 나머지는 퇴화기와 휴지기에 속하는 것으로 알려져 있다. 두피의 모발은 각각 독립된 성장주기를 가지며, 한쪽에서는 모발이 빠지고 또 다른 쪽에서는 모발이 자라나서 전체적으로 동일한 모발수를 유지하고 있으나 탈모가 진행될수록 휴지기에 속하는 모발의 비율이 높게 된다. 이런 정상적인 성장주기의 휴지기 탈모 외에도 외부적인 요인, 예를 들면 헤어젤이나 헤어왁스 등과 같은 헤어제품 사용이나 과다한 스트레스 등으로 탈모현상이 높아지는 추세이나, 이러한 경우는 원인이 제거되면 그 증상이 다시 회복된다.
또한 신체적, 정신적 스트레스 후 발생하는 일시적인 나타나는 탈모(자가면역 질환으로 발생되는 국부적 탈모인 원형 탈모증, 내분비 질환, 영향 결핍, 약물, 출산 등)와 반대로, 흔히 알고 있는 대머리는 체내 혈중 남성 호르몬(안드로겐, androgen)과 관계가 있는 안드로겐성 탈모(AGA)로 유전되는 경향이 있으며, 발생빈도가 남성이 월등하게 높다.
현재 탈모현상을 치료하기 위해 가장 많이 사용되는 약물은 국소 도포제인 미녹시딜과 경구용 약제인 프로페시아(finasteroid 성분)이며 이를 사용하면 더 이상의 진행은 어느 정도 늦출 수 있는 것으로 알려져 있으나, 사용을 중지할 경우 효과가 지속되지 못하고 다시 문제가 발생되며 이미 진행된 탈모에 대해서는 정상으로 회복하는데 어려움이 있다.
BMP(bone morphogenetic protein) 신호전달경로(singnaling pathway)는 체내의 각 부위에서 세포 성장 및 분화를 조절하는 성장 인자로 알려져 있다. 또한 BMP(bone morphogenetic protein) 신호전달경로(singnaling pathway)는 두피에서는 모낭내 존재하는 줄기세포(Hair Follicle Stem Cells; HFSCs)의 분화를 억제하여 미분화 상태를 유지하게 한다. 그러나 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2는 이러한 BMP신호전달경로를 억제하여 줄기세포들이 모낭하부의 모구(bulb)로 이동하여 머리카락을 생성하게 하는 분화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
최근 성장인자를 통한 펩타이드를 이용하여 탈모 치료 방법이 개발되고 있지만, 새로운 모낭의 재생을 유도하여 신생 모발 생성을 촉진 시키지는 못했다. 본 발명의 배경이 되는 기술로 대한민국 등록특허 10-01600032(2016.02.26)에는 탈모의 원인이 되는 BMP신호전달경로를 억제하는 노긴-유래 펩타이드를 유효성분으로 베타-카트닌(beta-catenin)의 분해를 억제하여 모낭주기를 성장기로 만들어 발모를 촉진시키는 조성물에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 10-2017-0008501(2017.01.24.)에는 섬유아세포성장인자 변이체 및 노긴 펩타이드가 포함된 성장인자 콤플렉스를 함유한 조성물에 대해 기재되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 10-2017-0097830(2017.08.29.)에는 모낭세포 성장 촉진 및 발모관련 성장인자 및 관련 인자들의 발현을 증가시키는 펩타이드 조성물에 관해 기재되어 있다. 그러나 모발성장을 저해하는 BMP 신호전달경로를 억제하여 모낭줄기세포의 분화를 촉진시켜 머리카락의 생성을 유도하는 펩타이드에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에 본 발명은 신경줄기세포 추출물에서 유래한 BMP신호전달경로 억제 펩타이드를 인간의 모낭줄기세포 및 마우스의 모낭줄기세포에 적용하여 그 특징을 규명하고, 신경줄기세포 추출물에서 유래한 BMP신호전달경로 억제 펩타이드가 모발성장을 저해하는 BMP 신호전달 경로를 억제하여 모낭줄기세포 분화를 촉진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 10-01600032(2016.02.26.) 대한민국 공개특허 10-2017-0008501(2017.01.24.) 대한민국 공개특허 10-2017-0097830(2017.08.29.)
Reddy H. Cytokine & Growth Factor Reviews 8: 11-20 (1997) Blanpain C, Epidermal homeostasis: A balancing act of stem cells in the skin, Nature Reviewa Molecular Cell Biology 10(3):207-17 (2009) Oshimori N, Paracrine TGF-beta signaling counterbalances BMP-mediated repression in hair follicle stem cell activation, Cell Stem Cell, 10(1):63-75 (2012) Foitzik K, The TGF-beta2 isoform is both a required and sufficient inducer of murine hair follicle morphogenesis, Developmental Biology, 212(2):278-89 (1999)
본 발명의 목적은, 마우스 및 인간의 모낭줄기세포(mouse hair follicle stem cells ;mouse HFSCs and human hair follicle stem cells; human HFSCs)의 분화를 촉진시켜 모발생성 및 성장에 관련된 세포로의 분화를 유도하는 3종의 펩타이드를 선별하고 제조함으로써, 선택된 3 종의 팹타이드 중에서 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모방지 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 선택된 3 종의 팹타이드 중에서 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 또는 탈모방지 화장료 조성물을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 형태에 따라 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3으로 표현되는 TGFβ2-유래 펩타이드를 제공한다.
서열번호 1:　Ac-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-OH
서열번호 2:　Ac-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile_Asp-OH
서열번호 3 :　Ac-Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Pro-Tyr-Leu-Trp-Ser-Ser-OH
본 발명의 다른 형태에 따라 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 형태에 따라 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 화장료 조성물을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3으로 표현되는 TGFβ2-유래 펩타이드, 상기 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 조성물 및 화장료 조성물을 제공함으로써, 모발성장을 저해하는 BMP 신호전달경로를 억제하고 모낭줄기세포의 분화를 촉진시켜 다시 성장기(anagen)를 유도함으로써 발모촉진 또는 탈모방지를 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 의한 마우스 모낭줄기세포 complete growth medium(Celprogen, USA)넣고 배양하면서, 마우스 모낭줄기세포의 특성을 확인한 결과이고,
도 2는 본 발명에 의한 마우스 모낭줄기세포 분화미디어(Celprogen, USA)시 음성대조군으로 분화미디어만 넣은 것이고, 재조합 단백질 TGFβ2가 농도별로 첨가된 분화미디어 처리를 통해서 중간자인 Tmeff1 발현 및이를 통해 BMP 신호전달경로의 활성 억제를 확인한 도면이고,
도 3a 및 도3c는 본 발명에 의한 마우스 모낭줄기세포에 분화미디어(Celprogen, USA)만을 넣은 음성대조군, 재조합 단백질 TGFβ2 10nM을 양성대조군, TGFβ2 유래 펩타이드를 각각 1종 또는 2종 이상 복합으로 처리하고 2주동안 배양하였다. 선조세포로의 분화를 P-cadherin 및 LEF1으로 확인 하였고, 펩타이드가 첨가된 분화미디어 처리시 중간자인 Tmeff1 발현 및 이를 통해 BMP 신호전달경로의 활성 억제를 확인한 도면이고,
도 4는 본 발명에 의한 인간 모낭줄기세포 complete growth medium(Celprogen, USA)넣고 배양하면서, 인간 모낭줄기세포의 특성을 확인한 도면이고,
도 5a 및 도 5b는 본 발명에 의한 인간 모낭줄기세포에 분화미디어(Celprogen, USA)만을 넣은 음성대조군, 재조합 단백질 TGFβ2 10nM을 양성대조군, TGFβ2 유래 펩타이드를 각각 10nM, 20nM 및 40nM 처리하고 최대 4주동안 배양하였다. 펩타이드가 첨가된 분화미디어 처리 2주 및 4주에 선조세포로의 분화를 K35 및 LEF1로, BMP 신호전달경로의 활성 억제를 확인하였다. 또한, 처리 4주시 hair cortex 및 hair cuticle에서 발현되는 마커인 type 1 and 2 hair keratin (K81-K86; type 2 and K31-K40; type 1)를 확인한 도면이고,
도 6a 및 도 6c는 본 발명에 의한 인간 모낭줄기세포에 분화미디어(Celprogen, USA)만을 넣은 음성대조군, 재조합 단백질 TGFβ2 10nM을 양성대조군, TGFβ2 유래 펩타이드를 각각 10nM, 20nM 처리 또는 2종 복합군 (각각 10nM)또는 3종 복합군 (각각 10nM 및 20nM)으로 처리하고 4주동안 배양하였다. 펩타이드가 첨가된 분화미디어 처리 2주때 선조세포로의 분화를 K35, K85 및 LEF1로 확인하였다. 펩타이드에 의해 BMP 신호전달경로 억제의 중간자 Tmeff1 및BMP 신호전달경로 활성 억제를 p-Smad로 확인하였다. 또한, 모발(hair shaft)의 hair cortex 및 hair cuticle에서 발현되는 마커인 type 1 and 2 hair keratin (K81-K86; type 2 and K31-K40; type 1)를 확인한 도면이고,
도 7a ~ 도 7e는 본 발명에 의한 본 발명에 의한 인간 모낭줄기세포에 분화미디어(Celprogen, USA)만을 넣은 음성대조군, 재조합 단백질 TGFβ2 10nM을 양성대조군, TGFβ2 유래 펩타이드를 각각 10nM, 20nM 처리 또는 2종 복합군 (각각 10nM)또는 3종 복합군 (각각 10nM 및 20nM)으로 처리하고 4주동안 배양하였다. 펩타이드가 첨가된 분화미디어 처리 4주시 선조세포로의 분화를 K35, K85 및 LEF1로 확인하였다. 펩타이드에 의해 BMP 신호전달경로 억제의 중간자 Tmeff1 및BMP 신호전달경로 활성 억제를 p-Smad로 확인하였다. 또한, 모발(hair shaft)의 hair cortex 및 hair cuticle에서 발현되는 마커인 type 1 and 2 hair keratin (K81-K86; type 2 and K31-K40; type 1)를 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따라 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3으로 표현되는 TGFβ2-유래 펩타이드를 제공한다.
서열번호 1:　Ac-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-OH
서열번호 2: Ac-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile_Asp-OH
서열번호 3 :　Ac-Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Pro-Tyr-Leu-Trp-Ser-Ser-OH
상기 펩타이드는 모낭줄기세포가 모발을 구성하는 케라틴 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 3의 TGFβ2-유래 펩타이드는 아미노산 일부 부분을 선정하고 그 활성 및 안정성을 증가시키기 위해 C-말단 (C-terminal)에 amidation, AMC, NHS 등으로 변형할 수 있으며, 또한 N-말단 (N-terminal)에 acetylation, formylation, palmytolyl 등으로 변형을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 따라 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물을 제공한다.
상기 TGFβ2-유래 펩타이드는 TGFβ2 신호전달경로의　중간자인 Tmeff1을 유도하고, 상기 Tmeff1는 BMP 신호전달경로를 억제할 수 있다.
보통 마우스 및 인간 모낭줄기세포는 모발생성시 선조세포(progenitor cells)인 secondary hair germ cells(sHGs)이 되어 모유두세포 (dermal papilla cells)근처에서 매트릭스(matrix)를 이루게 된다. 이들은 외부 신호 (예; 성장인자, 사이토카인등)에 의해서 더 분화가 되어 모발(hair shaft)를 구성하는 세포로 최종 분화가 된다. 이때, BMP 신호전달경로는 모낭줄기세포의 분화를 억제하여 모발성장시 지연(telogen)을 시키는 역할을 하는데 TGFβ2 신호전달경로(signaling pathway)는 중간자인 Tmeff1를 통해 BMP 신호전달경로를 억제하고 이는 모낭줄기세포의 분화를 촉진시켜서 다시 성장기(anagen)를 유도하는 역할을 한다. 따라서 본 발명에서는 TGFβ2와 유사한 또는 동등한 역할을 하는 TGFβ2-유래 펩타이드를 통해서 발모촉진 또는 탈모방지를 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 형태에 따라 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 제1항의 TGFβ2-유래 펩타이드를 0.0001%(v/v)-0.002% (v/v)의 양을 함유하고, 또는 상기 화장료 조성물에 10nM 내지 20nM로 TGFβ2-유래 펩타이드를 함유될 수 있다.
상기 “발모촉진”은 새로운 모발 생성주기가 단축되어 생성되는 모발의 양을 증가시키거나 수가 늘어나거나 모발 생성 속도를 증가시킴을 의미하며, 또한 생성된 모발의 굵기가 증가됨을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시 예에서는 마우스 모낭줄기세포 (mouse hair follicle stem cells, mouse HFSCs)의 특성을 확인하기 위해서 세포를 laminin-511이 코팅된 100mm 컬쳐디쉬에서 유지하였다. 이후 1x104 해당하는 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후 배양중에 세포가 약 90%가 되었을 때 4% 포름알데아하이드 용액으로 고정하였다. 모낭줄기세포 마커중에서 케라틴15 (K15)와 베타1-인테그린 (β1-integrin)안티바디를 사용하여 면역형광염색을 통해서 특성을 확인하였다. (도 1).
본 발명의 TGFβ2-유래 펩타이드 제1서열(서열번호 1), 제2서열(서열번호 2) 및 제3서열(서열번호 3)이 모낭줄기세포의 분화를 유도하여 발모촉진 기능을 활성화시키는가를 확인하기 위하여, 마우스 모낭줄기세포를1x105 세포에 해당하는 밀도로 6-well 플레이트에 시딩하였다. 다음날 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열 각각 1종 또는 2종 이상 복합적으로 함유한 분화미디어를 처리하여 2주동안 배양하였다. 이후 4-5일 간격으로 계대배양을 하면서 선조세포 (secondary hair germ cells)로 분화를 촉진시키는지를 웨스턴블롯을 통해서 확인하였다. (도 2).
본 발명의 TGFβ2-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 1종 또는 2종 이상 복합적으로 함유한 분화미디어를 마우스 모낭줄기세포에 처리하여 계대배양중에 24-well 플레이트에 시딩하고 펩타이드가 함유된 분화미디어를 2주동안 처리하였다. 2주째에 4% 포름알데하이드 용액으로 고정하여 모낭줄기세포가 선조세포 (secondary hair germ cells, sHGs)로 분화를P-cadherin, LEF1 안티바디로 확인하였다. 또한, BMP 신호전달의 억제 및 이때 신호전달의 중간자를 p-Smad 및 Tmeff1를 안티바디를 사용하여 면역형광염색을 통해서 확인하였다 (도 3a 내지 도 3c).
본 발명의 인간 모낭줄기세포 (human hair follicle stem cells. human HFSCs)의 특성을 확인하기 위해서 세포를 laminin511이 코팅된 100mm 컬쳐디쉬에서 유지하였다. 이후 1x104 해당하는 밀도로 24 well 플레이트에 시딩하였다. 이후 배양 과정중에 세포가 약 90%가 되었을 때 4% 포름알데아하이드 용액으로 고정하였다. 이후 모낭줄기세포 특성을 확인하기 위해 선택된 마커 케라틴15 (K15)와 베타1-인테그린 (β1-integrin)안티바디를 사용하여 면역형광염색을 통해서 확인하였다. (도 4).
본 발명의 인간모낭줄기세포에 TGFβ2-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 적용하였다. 마우스 모낭줄기세포에 사용한 농도(1x), 2배의 농도(2x) 및 4배의 농도(4x)를 적용하고, 분화미디어를 최대 4주동안 처리하고 계대배양을 하였다. 2주째 선조세포로의 분화 정도를 K35 및 LEF1 마커로 확인하였으며, 분화시 BMP 신호전달경로 억제를 p-Smad로 확인하였다. 또한, 4주째에는 선조세포로의 분화 정도를 K35, K85 및 LEF1 마커로 확인하였으며, 분화시 BMP 신호전달경로 억제를 p-Smad로 확인하였고, 이때 펩타이드가 TGFβ2 신호전달경로의 중간자 Tmeff1을 통해서 BMP 신호전달 억제하였는지도 확인하였다. 이를 통해서 모발형성세포로의 분화 정도는 케라틴 타입1과2 (케라틴 타입1은 케란틴 31-케란틴 40 및 케라틴 타입2는 케라틴 81-케라틴 86)마커로 웨스턴블롯을 통해서 확인하였다. (도 5a 및 도 5b).
본 발명의 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열에서 각각 효과가 높은 1x 및 2x(2배의 농도)를 각각 적용하고, 이들 3개의 펩타이드를 각각 1종 또는 복합적으로 함유한 분화미디어에 처리하였다. 최대 4주동안 계대배양 하면서 2주째 선조세포로의 분화 정도를 K35, K85 및 LEF1 마커로 확인하였으며, 분화시 BMP 신호전달경로 억제를 p-Smad로 확인하였고, 이때 펩타이드가 TGFβ2 신호전달경로의 중간자 Tmeff1을 통해서 BMP 신호전달경로를 억제하였는지도 확인하였다. 그 결과 대조군을 사용한 TGF-beta2 및 각각 1종의 펩타이드를 처리한 군과 달리 3종의 펩타이드를 복합적으로 넣은 처리군에서 선조세포로의 분화가 더욱 효율적으로 유도됨을 확인하였다 (도 6a ~ 도 7e).
또한, 상기 기본 조성물에는 0.0001%(v/v)-0.002% (v/v)의 TGFβ2-유래 펩타이드를 각각 1종 이상 내지 바람직하게는 3종을 포함하는 것이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 모낭줄기세포 분화 배지에 각각 1종이상의 TGFβ2-유래 펩타이드가 첨가된 배지를 이용하여 모발성장효과를 측정하였다.
본 발명에 있어, '펩타이드를 유효성분으로 함유하는 발모촉진 또는 탈모방지용 조성물'은 TGFβ2-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 1종 또는 2종 이상 펩타이드가 복합적으로 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예로 상기 발모촉진 또는 탈모방지용 조성물을 이용하여 제조된 형태는 용액, 현탁액, 유탁액, 겔, 크림류, 로션류, 파우더, 화장수류, 스프레이 및 고체화된 비누류 등일 수 있다. 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 본 발명의 발모촉진 또는 탈모방지용 조성물에 포함되는 성분은 펩타이드 유효 성분 이외에 발모촉진 또는 탈모방지용 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 성분등 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 발모촉진 또는 탈모방지를 나타내는 TGFβ2-유래 펩타이드를 유효성분으로 각각 1종 또는 2종 이상 복합적으로 함유하는 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발모촉진" 또는 "탈모방지"는 당업계에서 이용되는 다른 용어 양모 또는 육모 촉진을 포함하는 의미하며, 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 부위는 두피뿐만 아니라 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전등 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 TGFβ2-유래 펩타이드를 각각 또느 복합적으로 함유하는 조성물은 발모를 촉진하거나 탈모를 예방 내지 치료할 수 있는 의약(외)품 개발의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
준비예 1.
Rink amide AM resin (GL biochem, 1g 0.4mmol/g)을 반응용기에 넣고, N,N-Dimethylformamide (DMF)를 30ml 넣고 30분간 용매로 부풀린다. 진공펌프 (vacuum pump)로 용매 제거 후 9-fluoreylmethoxycarbonyl (Fmoc)로 보호된 Rink amide AM resin(1g 0.4mmol/g))을 20% piperidine in DMF(200ml piperidine/ 8000ml DMF)로 Fmoc를 제거하기 위해 30분간 흔들어 준다. 충분히 흔들어 준 후 DMF로 3회 (3분/1회), dichloromethane (DCM)로 3회 (3분/1회) 세척한 후. 용매를 다 제거한 후에 resin소량을 취하여 카이저테스트（kaiser test)를 이용하여 점검한다.
실시예 1. TGFβ2-유래 펩타이드의 합성 1
제1서열(MCT-oligopeptide-H1 제 1서열이라 명명)을 갖는 펩타이드 제작을 위해, 제 1서열의 첫 번째 아미노산인 Fmoc-Arg(PBF)-OH 0.80mmol, HoBt 0.80mmol 및 PyBOP 0.80mmol을 넣은 후, 교반하여 잘 용해시킨다. 반응 용기에 N,N-Diisopropyl ethylamine (DIPEA) 1.60mmol 넣고 이것을 Fmoc를 제거한 Rink amide AM resin에 가하여 2시간 짝지음(coupling) 반응을 수행한다. 반응 후 DMF와 DCM으로 세척한 후 카이저테스를 하여 이용하여 점검한 결과 밝은노란색이 나옴을 확인한다. 반응이 완료된 Fmoc-arg-Rink amide AM resin의 Fmoc 그룹은 20% piperidine in DMF로 30분간 제거한다. 그리고 DMF와 DCM으로 세척한 후 카이저테스트로 점검한다.
상기와 동일하게 하기의 아미노산 부착 실험을 수행하되, 상기의 아미노산인 Fmoc-arg(PBF)-OH 대신, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys (TRT)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH 및 Fmoc-Ala-OH순으로 아미노산 부착 실험을 수행하고 짝지음 반응을 시킨다.
반응이 완료된 Fmoc-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Rink made AM resin의 Fmoc 그룹은 20% piperidine in DMF로 30분간 제거하고, DMF와 DCM으로 세척하여 질소 공기를 흘려 건조한 후, 탈루용액 (Trifluoro acetic acid (TFA) 8.25ml, 증류수 0.5ml, thioanisole 0.5ml, 1,2-Ethanedithiol (EDT) 0.25ml)을 20ml 넣고 상온에서 2시간동안 흔들어주며 반응시켰다. 감압 증류를 이용하여 전체 볼륨이 절반정도 남도록 증류하고 50ml의 차가운 에테르를 통해 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 차가운 에테르를 통한 침전 유도 및 원심분리하여 침전하는 과정을 2회 반복하여 고형화된 침전물을 얻었다.
실시예 2. TGFβ2-유래 펩타이드의 합성 2
상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 제2서열(MCT-oligopeptide-H1 제2서열이라 명명)을 갖는 펩타이드 제작을 위해, 상기 아미노산 부착 실험은 Fmoc-Arg-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Ile-OH 및 Fmoc-Asp-OH 순으로 아미노산 부착 실험을 수행하고 짝지음 반응을 시킨다.
실시예 3. TGFβ2-유래 펩타이드의 합성 3
상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 제3서열(MCT-oligopeptide-H1 제3서열이라 명명)을 갖는 펩타이드 제작을 위해, 상기 아미노산 부착 실험은 Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ser-OH 및 Fmoc-Ser-OH 순으로 아미노산 부착 실험을 수행하고 짝지음 반응을 시킨다.
상기 실시예 1 내지 3에서 제작된 펩타이드는 MCT-oligopetide H1 펩타이드 범주내에 상기 실시예 1 내지 3에서 제작된 각각의 1,2,3서열 펩타이드를 포함하는 것으로, 상기 실시예 1 내지 3에서 제작된 펩타이드의 명칭과 아미노산 서열은 하기 표 1에 도시하였다.
서열
번호		 펩타이드 명칭 아미노산 서열
1 MCT-oligopeptide-H1 Ac-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-OH
2 MCT-oligopeptide-H1 Ac-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys
-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile_Asp-OH
3 MCT-oligopeptide-H1 Ac-Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Pro-Tyr-Leu
- Trp-Ser-Ser-OH
확인예 1. 마우스 모낭줄기세포의 배양 및 특성 확인
마우스 모낭줄기세포(Celprogen, USA)를 구매하고 마우스 모낭줄기세포 배양액(Celprogen, USA)을 통해 T75플라스크에서 배양한다. 이후, 계대배양과정에서 laminin-511 (iMatrix-511, Nippi)이 코팅된 24-웰플레이트(24-well plate)에 웰(well)당 1x104 개의 세포를 접종하고, 세포가 90%가 될 때까지 배양하고, 이후, 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 0.1% 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 5분동안 처리하고 정상당나귀혈청(nomal donkey serum)으로 10분간 블록킹(blocking)을 거치고 1차 항체 keratin 15 (K15; 1:250), β1-integrin (1:250)으로 24시간 처리한다. 이후 2차 항체(Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies)를 1시간 동안 처리하고 DAPI 염색을 5분간 진행하였다. 벡타실드 마운팅 (vectashield mounting medium)제를 이용하여 슬라이드에 고정하고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 결과를 확인하였다.
결과는 도 1에 도시하였다.
도 1을 참조하면, 마우스 모낭줄기세포 특성을 나타내는 마커인 K15와 β1-integrin이 정상적으로 발현되었음을 확인할 수 있었다.
확인예 2. 마우스 모낭줄기세포의 선조세포로의 분화시 효율적인 농도
TGFβ2-유래 펩타이드를 마우스 모낭줄기세포 분화에 적용시 보다 효율적인 농도를 찾고자 재조합 단백질(recombinant protein) TGFβ2를 첨가하여 실험을 진행하였다. laminin-511이 코팅된 6-웰플레이트(6-well plate)에 웰(well)당 3x104 개의 마우스 모낭줄기세포를 접종하고, 그 다음날 마우스 모낭줄기세포 분화미디어(Celprogen, USA) 및 재조합 단백질 TGFβ2을 10pM, 50pM, 100pM, 1nM, 10nM, 20nM 및 30nM로 각각의 농도별로 첨가된 분화미디어를 처리하였다. 계대배양을 하면서 최대 2주까지 분화를 진행하였다. 이후, 6-웰플레이트 세포는 수득한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 넣은 50μl의 RIPA buffer (Thermo Fisher Scientic)넣고, 세포 lysate를 원심분리기 (13,000g, 4℃)로 10분간 원심분리하였다. 이후 상층액(supernatant)을 얻은 후에 단백질농도를 Bradford protein assay로 측정을 하였다. 동량의 단백질을 웨스턴블롯으로 분석을 수행하였다.
분석 결과는 도 2에 도시하였다.
도 2를 참조하면, 10nM의 재조합 단백질 TGFβ2 처리군에서 BMP 신호전달경로의 활성을 나타내는 p-Smad 및 TGFβ2에 의해 유도되어 BMP 신호전달경로 억제에 관여하는 Tmeff1가 효율적임을 확인하였다.
확인예 3. 마우스 모낭줄기세포에 펩타이드의 처리를 통한 선조세포로의 분화 실험
laminin-511이 코팅된 6-웰플레이트(6-well plate)에 웰(well)당 3x104 개의 마우스 모낭줄기세포를 접종하고, 그 다음날 마우스 모낭줄기세포 분화미디어(Celprogen, USA) 및 각각 1종 또는 복합의 펩타이드가 10nM 첨가된 분화미디어를 처리하였다. 계대배양을 하면서 최대 2주까지 분화를 진행하였다. 6-웰플레이트 세포는 수득한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 넣은 50μl의 RIPA buffer (Thermo Fisher Scientic)넣고, 세포 용해물(lysate)를 원심분리기 (13,000g, 4℃)로 10분간 원심분리하였다. 이후 상층액(supernatant)을 얻은 후에 단백질농도를 Bradford protein assay로 측정을 하였다. 동량의 단백질을 웨스턴블롯으로 분석을 수행하였다.
또한, 선조세포로의 분화정도를 면역형광염색으로 관찰하기 위해 계대배양중에 24-웰플레이트에도 세포를 접종하였다. 2주째 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 확인예 1과 같이 공초점 현미경으로 결과를 관찰하였다.
웨스턴블롯 분석 결과는 도 3a에, 공초점 현미경 관찰 결과는 도 3b 내지 도 3c에 도시하였다.
도 3a 내지 도 3c을 참조하면, TGFβ2-유래 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 1종 또는 2종 내지 3종을 복합적으로 10nM 처리시 마우스 모낭줄기세포가 선조세포로 분화시에 발현되는 마커인 P-cadherin은 큰 차이가 없는듯하나, LEF1은 3종의 펩타이드 각각 10nM복합 처리군에서 높게 발현됨을 확인하였다. 또한, 3종의 펩타이드 각각 10nM 복합 처리군에서 BMP 신호전달경로의 활성을 나타내는 p-Smad가 크게 억제되었고, TGFβ2에 의해 유도되어 BMP 신호전달경로 억제에 관여하는 Tmeff1도 높게 발현됨을 확인하였다.
확인예 4. 인간 모낭줄기세포의 배양 및 특성 확인 실험
인간 모낭줄기세포(Celprogen, USA)를 구매하고 인간 모낭줄기세포 배양액(Celprogen, USA)을 통해 T75플라스크에서 배양을 하였다. 이후, 실시예 2와 같이 계대배양과정에서 laminin-511 (iMatrix-511, Nippi)이 코팅된 24-웰플레이트(24-well plate)에 웰(well)당 1x104 개의 인간 모낭줄기세포를 접종하고, 세포가 90%가 될 때까지 배양하였다. 이후, 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 0.1% 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 5분동안 처리하고 정상당나귀혈청(nomal donkey serum)으로 10분간 블록킹(blocking)을 거치고 1차 항체 keratin 15 (K15; 1:250), β1-integrin (1:250)으로 24시간 처리하였다. 이후 2차 항체(2차항체는 무엇인가요?)를 1시간 동안 처리하고 DAPI 염색을 5분간 진행하였다. 벡타실드 마운팅 (vectashield mounting medium)제를 이용하여 슬라이드에 고정하고 공초점 현미경(confocal microscope)으로 결과를 확인하였다.
결과는 도 4에 도시하였다.
도 4을 참조하면, 인간 모낭줄기세포 특성을 나타내는 마커인 K15와 β1-integrin이 정상적으로 발현됨을 확인하였다.
확인예 5. 인간 모낭줄기세포에 펩타이드의 처리를 통한 선조세포로의 분화 실험
확인예 2와 확인예 3에서 확인한 결과를 바탕으로 하여 10nM TGFβ2-유래 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 1종을 10nM, 20nM 및 40nM로 함유한 분화미디어(Celprogen, USA)를 최대 4주동안 처리하면서 선조세포로의 분화정도를 확인하였다. laminin-511이 코팅된 6-웰플레이트(6-well plate)에 웰(well)당 3x104 개의 세포를 접종하고, 계대배양하면서 2주와 4주에 세포를 수득한 후, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 넣은 50μl의 RIPA buffer 넣고, 세포 lysate를 원심분리기 (13,000g, 4℃)로 10분간 원심분리하였다. 이후 상층액(supernatant)을 얻은 후에 단백질농도를 Bradford protein assay로 측정을 하였다. 동량의 단백질을 웨스턴블롯으로 분석을 수행하였다.
2주간 배양 후 웨스턴블롯 분석한 결과는 도 5a에 도시하고, 4주간 배양 후 웨스턴블롯 분석한 결과는 도 5b에 도시하였다.
도 5a과 도5b를 참조하면, 도5a는 각각 10nM과 20nM의 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3에서 선조세포로 분화시 나타나는 마커인 human hair keratin K35 (Ha35) 및 LEF1의 발현이 대부분 높게 나타났으며, BMP 신호전달경로의 활성을 나타내는 p-Smad를 가장 크게 억제됨을 보였다.
도5b는 모발의 hari cortex 및 hair cuticle에서 발현되는 최종분화세포의 마커인 type 1 and 2 hair keratin (K81-K86; type 2 and K31-K40; type 1)도 가장 높게 나타나는 결과를 확인하였다.
확인예 6. 인간 모낭줄기세포에 각각 1종 및 복합 펩타이드 처리를 통한 선조세포로의 분화 실험
확인예 5에서 확인된 결과를 바탕으로 하여 펩펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 10nM과 20nM로 최대 4주동안 처리하고, 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 2종 또는 3종의 복합 펩타이드로 10nM과 20nM로 최대 4주동안 처리 처리하면서 선조세포로의 분화정도를 2주와 4주에 웨스턴블롯 및 면역형광염색 분석을 통해서 확인하였다.
2주간 배양 후 웨스턴블롯 분석한 결과는 도 6a, 면역형광염색 분석한 결과는 도 6b 내지 도 6c에 도시하고, 4주간 배양 후 웨스턴블롯 분석한 결과는 도 7a, 면역형광염색 분석한 결과는 도 7b 내지 7e에 도시하였다.
도 6a 내지 도 6c을 참조하면, 2주 배양 후 분석시 각각 10nM의 3종 복합펩타이드에서 선조세포로 분화시 나타나는 마커인 human hair keratin K35 (Ha35), human hair keratin K85 및 LEF1의 발현이 높게 나타났다. 또한, BMP 신호전달경로의 활성을 나타내는 p-Smad는 가장 크게 억제되었고, TGFβ2에 의해 유도되어 BMP 신호전달경로 억제에 관여하는 Tmeff1가 가장 높게 발현됨을 보였다. 모발의 hari cortex 및 hair cuticle에서 발현되는 마커인 type 1 and 2 hair keratin (K81-K86; type 2 and K31-K40; type 1)도 가장 높게 나타나는 결과를 확인하였다. 또한, 선조세포의 마커중의 하나인 K85로 면역형광염색을 진행한 결과도 동일하게 각각 10nM의 3종 복합 펩타이드에서 효과가 높음을 확인하였다.
도 7a 내지 도 7e를 참조하면, 4주 분석시에는 더욱 명확하게 type 1 and 2 hair keratin의 발현이 높아짐을 확인하였다. BMP 신호전달경로인 p-Smad가 크게 억제 및 Tmeff1가 높게 발현됨을 확인하였다. 또한, 선조세포의 마커중의 하나인 K85 및 로 hari cortex 및 hair cuticle마커인 type 1 and 2 hair keratin 면역형광염색을 진행한 결과도 동일하게 각각 10nM의 3종 복합 펩타이드에서 효과가 높음을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> Mirae CT Co.,Ltd <120> A BMP signaling pathway inhibiting peptide derived from a neural stem cell extract and a hair growth promoting or hair loss preventing composition comprising the peptide as an active ingredient <130> P19-E287 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifficial sequence <400> 1 Ala Ala Tyr Cys Phe Arg 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificail sequence <400> 2 Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificail sequence <400> 3 Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser 1 5 10

Claims (7)

  1. 모유두세포에서 방출되는 TGFβ2에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 어느 하나로 표현되는 TGFβ2-유래 펩타이드.
    서열번호 1:　Ac-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-OH
    서열번호 2:　Ac-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile_Asp-OH
    서열번호 3 :　Ac-Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Pro-Tyr-Leu-Trp-Ser-Ser-OH
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TGFβ2-유래 펩타이드는 모낭줄기세포가 모발을 구성하는 케라틴 세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 TGFβ2-유래 펩타이드.
  3. 제1항의 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TGFβ2-유래 펩타이드는 TGFβ2 신호전달경로의　중간자인 Tmeff1을 유도하는 것을 특징으로 하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 Tmeff1는 BMP 신호전달경로를 억제하는 것을 특징으로 하는　발모촉진 또는 탈모방지 조성물.
  6. 제1항의 TGFβ2-유래 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 제1항의 TGFβ2-유래 펩타이드를 0.0001%(v/v)-0.002% (v/v)의 양을 함유하는 것을 특징으로 하는 발모촉진 또는 탈모방지 화장료 조성물.
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KR1020190078069A KR102069184B1 (ko) 2019-06-28 2019-06-28 신경줄기세포 추출물유래 bmp신호전달경로 억제 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모촉진 또는 탈모방지 조성물

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KR102298460B1 (ko) 2021-01-27 2021-09-08 주식회사 에피바이오텍 콜라겐 유전자 또는 단백질을 포함하는 탈모의 예방 또는 개선용 조성물
KR20220105426A (ko) 2021-01-20 2022-07-27 주식회사 바이오에프디엔씨 세포투과형 혈소판 유래 성장인자의 융합 단백질 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 조성물

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KR20170008501A (ko) 2015-07-14 2017-01-24 (주)피앤피바이오팜 모낭 세포의 재생과 성장을 촉진하는 성장인자, 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 노긴 펩타이드를 함유한 헤어케어 화장품 조성물
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