KR102064134B1 - Novel Strain of Pediococcus acidilactici CACC 537, and feed composition using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 및 이를 유효성분으로 함유하는 반려동물용 사료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 가축 병원균에 대한 항균 활성이 있으며, 면역증진, 단백뇨 억제, 콜레스테롤 수치 정상화 및 간 기능 개선에 우수한 효과가 있는 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537와 이를 이용한 반려동물용 사료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a new strain pediococcus ecidyl lactic acid CACC 537 and a pet animal feed composition containing the same as an active ingredient, more specifically, has antimicrobial activity against livestock pathogens, immune enhancement, proteinuria suppression, cholesterol level The present invention relates to a new strain Pediococcus ecidyl lactic acid CACC 537 having an excellent effect on normalization and improving liver function and a feed composition for pets using the same.
현재 우리나라는 핵가족화로 인하여 1인 및 2인 가구가 급격하게 증가하고 있다. 이로 인해, 정서적 안정을 찾기 위해 반려동물을 키우고 있는 인구도 증가하고 있다. 반려동물 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것이 반려견으로, 일반적으로 반려견은 평균적으로 11~13년 정도 사는 것으로 알려져 있으나, 최근에는 공중보건 향상 및 의료 수준의 향상으로 15~20년 정도까지도 그 수명이 연장되었다. At present, the number of one- and two-person households is increasing rapidly due to the nuclear family. As a result, a growing population is growing pets to find emotional stability. Dogs account for the largest portion of pets, and dogs generally live on average for 11 to 13 years, but in recent years, their lives have been extended for 15 to 20 years due to improved public health and improved medical standards. It became.
그러나, 우리나라의 반려견은 대부분 주택 내에서 생활하기 때문에 운동이 부족하고 스트레스를 많이 받아 손쉽게 소화 및 대사 활성이 낮아지게 되고, 면역력이 낮아지는 경향이 있다. 이로 인해 사람과 유사하게 대사성 질환이나 면역 관련 질환이 발생하고, 향후 더욱 치명적인 내외과적 질환으로 악화되어 반려견과 견주의 삶의 질이 떨어지는 문제가 발생하고 있다.However, most domestic dogs live in homes, so they lack exercise and are stressed so that their digestion and metabolic activity is easily lowered and their immunity tends to be lowered. As a result, metabolic diseases and immune-related diseases occur similarly to humans, and worsen into more fatal internal and external medical diseases, resulting in a problem of poor quality of life of dogs and dogs.
현재 우리나라 동물 의료 및 복지에 대한 관심이 증가하고 있으나, 현실적인 치료 비용이 높아 의료비 부담이 크므로, 반려견의 운동 부족으로 인한 대사성 질환이나 면역 관련 질환의 발병을 손쉽게 예방할 수 있는 제제의 개발이 시급한 실정이다.At present, the interest in animal medical care and welfare in Korea is increasing, but since the cost of medical treatment is high due to the high cost of treatment, it is urgent to develop a drug that can easily prevent the development of metabolic or immune-related diseases caused by lack of exercise of dog to be.
한편, 살아있는 미생물인 프로바이오틱스(probiotics)는 장내에서 미생물의 기능을 활성화하여 동물의 건강을 증진한다(Fuller, 1989). 많은 연구자들이 락토바실러스와 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱스(probiotics) 균주가 설사 등과 같은 증상을 감소시키거나, 방어한다는 사실을 보고하였다(Gilliland, 1990). On the other hand, probiotics, living microorganisms, promote the health of animals by activating their function in the intestine (Fuller, 1989). Many researchers have reported that probiotics strains such as Lactobacillus and Bifidobacterium reduce or protect against symptoms such as diarrhea (Gilliland, 1990).
이들 프로바이오틱스 균주는 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용 등의 효능을 가지고 있다. 프로바이오틱스 균주가 장내에 유입되어 자체적인 대사활동을 통해 분비하는 물질은 숙주에 많은 이로움을 주기 때문에 프로바이오틱스 균주를 이용한 많은 연구가 진행되고 있다. 프로바이오틱스 균주는 대부분 동물의 장내에 정상적으로 존재하며 장내 미생물의 균형을 유지하고 숙주의 건강에 유익한 영향을 끼친다. These probiotic strains enter the intestine and enter the intestinal epithelial cells to prevent intestinal colonization of harmful microorganisms and secrete antimicrobial substances, thereby inhibiting the growth of harmful microorganisms and improving diarrhea and constipation. Has the effect of action. Probiotics strains are introduced into the intestine and secreted through its own metabolic activity, so many benefits to the host, many studies using the probiotic strains are in progress. Probiotic strains are most normally present in the intestines of animals and balance the intestinal microflora and have a beneficial effect on the health of the host.
따라서 장내 유용한 프로바이오틱스 균주를 선정하기 위해서는 다음의 몇 가지 중요한 성상을 확인하며 선정한다(Fuller, 1989; Garriga et al., 1998; Martin et al., 2006; Mishra and Prasad, 2005). 즉, 프로바이오틱스 균주가 소화관 내에서도 생존해야 하므로, 내산성이나 내담즙성을 가져야 하고, 장에 도달할 때까지 소화관에서 콜로니를 형성해야 한다. 또한, 식품이나 사료 또는 임상적으로 사용 시 안전해야 하며, 동시에 숙주에 유익한 영향을 줄 수 있어야 한다. 최근에는 많은 기능적인 특성이 있는 프로바이오틱스 균주들이 개발되고 있는데, 병원체의 증식을 억제하는 기능을 갖는 프로바이오틱스 균주가 있고, BSH 활성(Begley et al., 2006; Pereira et al., 2003) 또는 전분가수분해 활성(amylolytic activity, Lee et al., 2001; Vizoso Pinto et al., 2006)을 갖는 프로바이오틱스 균주 등이 있다.Therefore, in order to select useful strains of intestinal probiotics, several important features are identified and selected (Fuller, 1989; Garriga et al., 1998; Martin et al., 2006; Mishra and Prasad, 2005). That is, because the probiotic strain must survive in the digestive tract, it must have acid resistance or bile resistance, and form colonies in the digestive tract until reaching the intestine. In addition, it should be safe for food or feed or clinical use, while at the same time having a beneficial effect on the host. Recently, probiotic strains with many functional properties have been developed. There are probiotic strains that have a function of inhibiting the proliferation of pathogens, and BSH activity (Begley et al., 2006; Pereira et al., 2003) or starch hydrolysis. Probiotic strains having activity (amylolytic activity, Lee et al., 2001; Vizoso Pinto et al., 2006).
그러나, 프로바이오틱스 균주에 대한 연구는 사람의 건강이나 가축의 생산성 향상에 주로 초점을 맞추어 진행되고 있는 측면이 있었으며, 아직까지 반려견의 대사성 질환이나 면역 관련 질환의 발병을 효과적으로 억제할 수 있는 프로바이오틱스 균주의 개발은 부진한 실정이다. However, research on probiotic strains has been focused mainly on improving human health and livestock productivity, and has yet to develop probiotic strains that can effectively suppress the development of dog metabolic and immune related diseases. Is a sluggish situation.
이에, 본 발명자들은 반려견의 대사성 질환이나 면역 관련 질환에 효과적인 프로바이오틱스 균주를 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 반려견의 분변에서 분리된 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537이 내산성, 내담즙성, 및 장내부착능이 우수하여 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합한 동시에 가축 병원균에 대한 항균 활성이 있으며, 면역증진, 단백뇨 억제, 콜레스테롤 수치 정상화 및 간 기능 개선에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have diligently researched to find a probiotic strain effective for dog metabolism or immune-related diseases. As a result, the new strain Pediococcus esidilactici CACA 537 isolated from the feces of dogs was resistant to acid, bile, and Excellent intestinal adhesion, suitable for use as a probiotic strain and at the same time have antimicrobial activity against livestock pathogens, confirmed that it has an excellent effect on immune enhancement, inhibition of proteinuria, normalization of cholesterol levels and improvement of liver function, and completed the present invention. .
따라서, 본 발명의 주된 목적은 내산성, 내담즙성, 및 장내부착능이 우수한 프로바이오틱스 균주인 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537을 제공하는데 있다. Therefore, the main object of the present invention is to provide a new strain pediococcus ecidyl lactici CACC 537 which is a probiotic strain excellent in acid resistance, bile resistance, and intestinal adhesion.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537을 유효성분으로 함유한 반려동물용 사료 조성물을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a feed composition for pets containing the new strain Pediococcus ecidyl lactici CACC 537 as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537(Pediococcus acidilactici CACC 537)(수탁번호: KACC 81098BP)을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a new strain Pediococcus acidilactici CACC 537 (Accession No .: KACC 81098BP).
본 발명의 용어 "페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537(Pediococcus acidilactici)"은 본 발명자들에 의해 반려견 분변에서 새롭게 분리 동정된 신규한 페디오코쿠스 에시딜락티시 균주로서, "CACC 537 균주" 또는 "CACC 537"과 혼용하여 사용할 수 있다. The term "Pediococcus ecidyl lactici CACC 537" (Pediococcus acidilactici) of the present invention is a novel pediococcus ecidyl lactici strain that has been newly identified in dog feces by the present inventors, "
본 발명자들은 반려견에 사용할 수 있는 프로바이오틱스의 개발을 위해 반려견에 유용한 미생물에 대해 수년간 조사 분석하였고, 그 결과 반려견의 분변에서 유래한 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 53 균주가 내산성, 내담즙성, 및 장내부착능이 우수하여 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합한 동시에 가축 병원균에 대한 항균 활성이 있으며, 면역증진, 단백뇨 억제, 콜레스테롤 정상화 및 간 기능 개선에 우수한 효과가 있음을 확인하였고, 저장시 안전성에도 문제가 없음을 확인하였다. The inventors have investigated and analyzed microorganisms useful for dogs for the development of probiotics that can be used in dogs for many years. It has excellent intestinal adhesion and is suitable for use as a probiotic strain, and also has antimicrobial activity against livestock pathogens, and has an excellent effect on immune enhancement, proteinuria suppression, normalization of cholesterol and improvement of liver function, and no safety problems during storage. It was confirmed.
본 발명의 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537(수탁번호: KACC 81098BP)는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.The new strain Pediococcus ecidyl lactyl CACC 537 (Accession Number: KACC 81098BP) of the present invention is characterized by having the 16s rRNA sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명자들은 상기 유전자 서열을 종래 공지된 균주들의 유전자 서열들과 비교 분석한 결과, 본 발명의 균주가 페디오코쿠스 에시딜락티시에 속하는 새로운 균주임을 확인하여 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537로 명명하였고, 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 2019년 7월 11일자로 기탁하고, 수탁번호 KACC 81098BP를 부여받았다.The present inventors compared the gene sequence with those of conventionally known strains, and as a result, the strain of the present invention was identified as a new strain belonging to pediococcus ecidyl lactici. It was deposited on July 11, 2019 at the National Institute of Agricultural Science, Agricultural Genetic Resource Information Center, and was assigned accession number KACC 81098BP.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537, 또는 그 배양액을 유효성분으로 하는 반려동물용 사료 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a feed composition for pets comprising the new strain Pediococcus ecidyl
본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 내산성, 내담즙성, 및 장내부착 활성이 우수하여 프로바이오틱 균주로 사용되기에 적합하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 CACC 537 균주가 pH 2.5의 강산성 조건에서도 생존율이 42%로 측정되어 우수한 내산성을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 담즙 조건에서도 99% 이상의 생존율을 보여 매우 우수한 내담즙성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 CACC 537 균주는 78.6%의 높은 장내부착 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조). The pet food composition of the present invention is excellent in acid resistance, bile resistance, and intestinal adhesion activity, suitable for use as a probiotic strain. In a preferred embodiment of the present invention, the
본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 가축 병원균에 대한 항균 활성이 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 상기 CACC 537 균주 또는 그 배양액은 그 자체로 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 상기 CACC 537 균주 또는 그 배양액은 다양한 가축 병원균에 항균 활성이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 CACC 537 균주 배양액이 다양한 가축 병원균에 대해 생장억제 효능이 있는 것을 확인하였다(도 3 참조). 구체적으로는 상기 가축 병원균은 살모넬라 더비(Salmonella Derby), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 및 대장균(Escherichia coli)에 대해 항균 활성이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pet food composition of the present invention is characterized by having antimicrobial activity against livestock pathogens. In the present invention, the
본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 저장 안정성이 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 CACC 537 균주는 4개월의 저장 기간 동안 생균 수에 크게 변화가 없음이 관찰되었고, 저장 안정성이 우수한 균주임을 확인할 수 있었다. The pet food composition of the present invention is characterized in that the storage stability. In the embodiment of the present invention, the
또한, 본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 면역증진 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 반려견에 본 발명의 CACC 537 균주를 투여하여 백혈구 수치가 16.7% 증가하였고, 혈소판 수치도 8.6% 증가하는 것을 관찰하였으며, 이러한 결과를 통해 본 발명의 CACC 537 균주가 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 면역기능을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조). In addition, the pet food composition of the present invention is characterized in that it has an immunostimulating activity. In a preferred embodiment of the present invention, the dog was administered the
또한, 본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 단백뇨 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 CACC 537 균주 투여를 통하여 반려견의 뇨 속에 함유된 단백질 함량을 매우 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인한 바 있다(도 6 참조). In addition, the pet food composition of the present invention is characterized by having proteinuria inhibitory activity. In a preferred embodiment of the present invention it was confirmed that the administration of the
또한, 본 발명의 상기 반려동물용 사료 조성물은 반려견에 직접 투여되어 콜레스테롤 저감 활성을 통해 콜레스테롤 수치 정상화 효과 및 간 기능 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 CACC 537 균주를 설사환자견에 1달간 투여한 결과, 높은 콜레스테롤 수치 및 간 기능과 관련된 혈액인자의 수치들을 효과적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 본 발명의 반려동물용 사료 조성물이 반려견의 콜레스테롤 저감을 통한 콜레스테롤 수치 정상화 및 간 기능 개선에 효과적임을 확인할 수 있었다. In addition, the pet food composition of the present invention is directly administered to the dog is characterized by having a cholesterol level normalizing effect and liver function improving activity through cholesterol reducing activity. In a preferred embodiment of the present invention, the
본 발명의 상기 사료 조성물은 반려견이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식, 간식 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.The feed composition of the present invention may mean any natural or artificial diet, meal, snack or ingredient of the meal for dogs to eat, ingest, digest, or suitable for dogs, various known in the art It can be manufactured in the form.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 더 추가하여 사용할 수 있으며, 이 경우 본 발명의 사료 조성물은 사료 첨가제로서 역할을 한다. 상기 추가될 수 있는 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.The type of the feed is not particularly limited, and may be used in addition to the feed commonly used in the art, in which case the feed composition of the present invention serves as a feed additive. Non-limiting examples of feeds that can be added include, but are not limited to, vegetable feeds such as cereals, fruits, food processing by-products, algae, fibres, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds or grain by-products; And animal feeds such as proteins, minerals, fats and oils, minerals, fats and oils, single cell proteins, zooplankton or foods. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
다른 일 예로, 상기 사료 조성물은 투여될 반려견의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있다.In another embodiment, the feed composition may be appropriately used depending on the type of dog, age, and other types of feed ingredients to be administered.
본 발명의 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다. The feed composition of the present invention may further include substances exhibiting various effects such as supplementation of nutrients and prevention of weight loss, enhancement of digestive availability of fiber in the feed, improvement of oil quality, prevention of reproductive disorders and improvement in conception, and prevention of high temperature stress in summer. For example, mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, complex minerals, mineral preparations such as trace minerals such as zinc, copper, cobalt, and selenium, keratin, vitamin E, vitamin A, D, E, nicotinic acid , Vitamins such as vitamin B complex, protective amino acids such as methionine, lyric acid, protective fatty acids such as fatty acid calcium salt, yeast culture, fungi such as fungi fermentation, yeasts and the like may be further included.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 사료 조성물을 반려견에 투여하는 단계를 포함하는, 반려견의 면역증진, 단백뇨 억제, 콜레스테롤 수치 저하 및 간 기능 개선 방법을 제공한다.In still another aspect, the present invention provides a method of improving the dog's immunity, inhibiting proteinuria, lowering cholesterol and improving liver function, comprising administering the feed composition to a dog.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 동물에 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 사료 조성물을 경구 투여하더라도 급성 독성이 나타나지 않는다.The administration means introducing the composition of the present invention to the animal in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention may be administered via various routes orally or parenterally as long as the target tissue can be reached. The inventors do not show acute toxicity even when orally administering the feed composition of the present invention.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(1) 본 발명은 반려견의 분변에서 유래한 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 및 이를 유효성분으로 함유하는 반려동물용 사료 조성물을 제공한다.(1) The present invention provides a feed strain for a new animal strain Pediococcus ecidyl
(2) 본 발명의 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537은 내산성, 내담즙성, 및 장내부착능이 우수하여 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합하며, 가축 병원균에 대한 우수한 항균 활성을 갖고, 면역증진, 단백뇨 억제, 콜레스테롤 수치 저감 및 간 기능 개선에 우수한 효과가 있다.(2) The new strain Pediococcus ecidyl lactyl
도 1은 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 내산성 및 내담즙성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 장내부착능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 가축 병원균에 대한 항균 활성을 측정하기 위하여 Disk diffusion method 방법으로 실험한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 장기 보관시 생균 수의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 면역증진 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 단백뇨 억제 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537 균주의 계통도를 모식화하여 나타낸 모식도이다. Figure 1 is a graph showing the measurement of acid resistance and bile resistance of pediococcus ecidyl lactici
Figure 2 is a graph showing the measurement of intestinal adhesion of the pediococcus ecidyl lactici
Figure 3 is a photograph of the results of experiments by the Disk diffusion method to measure the antimicrobial activity against livestock pathogens of the Pediococcus ecidyl lactici
Figure 4 is a graph showing the measurement of the change in viable cell count during long-term storage of the Pediococcus ecidyl lactici
Figure 5 is a graph showing the measurement of the immunostimulating effect of the pediococcus ecidyl lactici
Figure 6 is a graph showing the measurement of the proteinuria inhibitory effect of pediococcus ecidyl lactici
Figure 7 is a schematic diagram showing the schematic diagram of the pedeococcus ecidyl lactici
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1. 반려견 분변 유래 미생물의 내산성, 내담즙성, 및 장내부착 활성 검증Example 1 Validation of Acid Resistance, Bile Resistance, and Intestinal Attachment Activity of Dog Feces-Derived Microorganisms
가축 병원균에 대한 항균 및 면역증진 활성을 갖는 프로바이오틱스(probiotics)의 후보군을 선별하기 위해서 반려견의 분변 시료에서 채취된 미생물들의 생균제 특성을 검증하였다. In order to select candidates for probiotics having antimicrobial and immunostimulating activity against livestock pathogens, the probiotic characteristics of microorganisms collected from fecal samples of dogs were verified.
1-1. 내산성 및 내담즙성1-1. Acid and Bile Resistance
반려견 분변으로부터 분리한 균주의 내산성 및 내담즙 특성 연구를 위해 분리 균주들을 MRS broth((BD Difco™, USA)를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다. 내산성은 1N HCl을 이용하여 pH2.5로 조정된 MRS broth에서, 내담즙성은 0.3%, 1%(w/v) Oxgall(BD Difco™, USA)이 첨가된 MRS배지에 접종하여 2시간 동안 배양한 후, 0시간과 2시간 후의 생균수를 측정하여 생존율(%)을 측정하여 하기 [표 1] 나타내었다.To study the acid resistance and bile characteristics of the strains isolated from dog feces, the isolated strains were used for the experiment by incubating for 24 hours at 37 ° C. using MRS broth ((BD Difco ™, USA). In MRS broth adjusted to pH 2.5, bile resistance was inoculated in MRS medium containing 0.3%, 1% (w / v) Oxgall (BD Difco ™, USA) and incubated for 2 hours, followed by 0 and 2 hours. The viable cell count after time was measured and the survival rate (%) was measured.
[표 1]TABLE 1
그 결과, 분리된 후보군 중에서 CACC 537 균주가 pH 2.5의 강산성 조건에서도 생존율이 42%로 측정되어 우수한 내산성을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 담즙 조건에서도 99% 이상의 생존율을 보여 매우 우수한 내담즙성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. As a result, the
1-2. 장내부착능1-2. Intestinal adhesion
장상피세포 HT-29 세포주는 10% fecal calf serum(Gibdo-BRL, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/ml, Gibdo-BRL, USA)이 첨가된 DMEM(Gibdo-BRL, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. HT-29 세포 단일층(monolayer)이 형성된 24-well plate에 1.0×108 CFU/mL 이상의 후보 균주들을 접종하였고, 2시간 배양 후, 0.1% triton X 100을 사용하여 HT-29 세포와 상기 균주를 떼어낸 후 생균수를 측정하였다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 균주를 대조군 균주로 사용하였고, 하기 [표 2]에 나타내었다. Intestinal epithelial HT-29 cell line with 10% fecal calf serum (Gibdo-BRL, USA) and 1% penicillin / streptomycin (10,000 U / ml, Gibdo-BRL, USA) added DMEM (Gibdo-BRL, USA) The medium was incubated at 37 ° C., 5% CO 2 . Candidate strains of 1.0 × 10 8 CFU / mL or more were inoculated into a 24-well plate on which a HT-29 cell monolayer was formed, and after 2 hours of incubation, HT-29 cells and the strain were used using 0.1
[표 2]TABLE 2
그 결과, 분리된 후보군 중에서 CACC 537 균주의 장내 부착능은 78.6%로 측정되었으며, 이러한 CACC 537 균주의 장내 부착 효과는 프로바이오틱스 균주 중 장내 부착능이 우수한 것으로 종래 알려진 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 균주와 비교해도 더 우수한 것으로 측정되었다. As a result, the intestinal adhesion capacity of the
실시예 2. 가축 병원균에 대한 항균 활성 검증Example 2. Validation of antimicrobial activity against livestock pathogens
가축 병원균에 대한 항균 활성을 검증하기 위하여 Disk diffusion method 방법으로 항균 활성을 검증하였다. 병원균은 Salmonella Derby NCCP 12238, Salmonella Enteritidis NCCP 14546, Salmonella Typhimurium NCCP 10328, 및 Escherichia coli KCTC 2617의 4종 균주를 사용하였다. 상기 4종 병원균을 BHI 배지(Becton, Dickinson and Company)를 사용하여 37℃에서 24시간 배양하였다. In order to verify the antimicrobial activity against livestock pathogens, the antimicrobial activity was verified by the Disk diffusion method. Pathogens include
반려견 분변으로부터 분리한 균주들을 MRS broth에 접종한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 0.22㎛ pore size 막 필터로 제균한 배양 상등액 80㎕를 8mm paper disc에 접종하여 clear zone의 지름을 재어 항균력을 평가하였다. Strains isolated from dog feces were inoculated on MRS broth, incubated for 24 hours at 37 ° C, and 80 µl of the culture supernatant sterilized with 0.22㎛ pore size membrane filter was inoculated on 8mm paper disc to measure the antimicrobial activity. Evaluated.
[표 3]TABLE 3
그 결과, 분리된 후보군 중에서 CACC 537 균주는 가축 병원균인 Salmonella Derby NCCP 12238 및 Salmonella Enteritidis NCCP 14546 균주에 대해 11-12mm의 clear zone을 형성하는 것으로 관찰되었고, Salmonella Typhimurium NCCP 10328, 및 Escherichia coli KCTC 2617 균주에 대해 9-10mm의 clear zone을 형성하여 매우 우수한 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다(도 3 참조). As a result, among the isolated candidates, the
실시예 3. 저장 안정성 평가Example 3. Storage Stability Assessment
상기 CACC 537 균주를 MRS broth를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하고, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 균체만을 수집하였다. 수집된 균체는 유산균 생균제 분말 동결건조보호제(10% skim milk, 15% trehalose)를 첨가하여 동결건조하였다. 동결건조된 균체를 분쇄하여 분말화한 후, 1포에 0.2g(5 x 109 CFU/g)씩 소포장을 하여 5℃에서 4개월 저장하였다. 저장 기간 중 생균 수를 측정하여 제형 안정성을 확인하였다.The
그 결과, 상기 CACC 537 균주는 저장기간 동안 생균 수에 크게 변화가 없음이 관찰되었고, 저장 안정성이 우수한 균주임을 확인할 수 있었다. As a result, the
실시예 4. 면역증진 효과에 대한 임상시험 Example 4 Clinical Trials on Immunostimulating Effects
반려견 5마리를 대상으로 하여 보호자 동의하에 실시예 1 및 2를 통해 생균제 활성이 검증된 CACC 537 균주의 면역증진 효과에 대한 임상시험을 실시하였다. Five dogs were subjected to clinical trials on the immune-promoting effects of
실험은 CACC 537 균주를 실시예 3과 같이 분말 형태로 제제화하여 1달 동안 하루 1회 0.2g(5 x 109 CFU/g)씩 급여한 후, 미생물제제 급여 전후의 혈액을 채취하여 혈액 검사를 실시하였다.In the experiment, the
[표 4]TABLE 4
그 결과, CACC 537 균주의 투여를 통하여 반려견의 백혈구 수치가 16.7% 증가하였고, 혈소판 수치도 8.6% 증가하는 것으로 관찰되었다. 또한, 적혈구 및 헤모글로빈 수치도 4%대로 증가하는 현상이 관찰되었다. As a result, the dog's leukocyte level increased by 16.7% and platelet level increased by 8.6% through the administration of the
상기와 같은 결과를 통해 CACC 537 균주가 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 면역기능을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. Through the above results, it was confirmed that the
실시예 5. 단백뇨 억제 효과에 대한 임상시험 Example 5 Clinical Trials on Proteinuria Inhibitory Effects
반려견 5마리를 대상으로 하여 보호자 동의하에 실시예 1 및 2를 통해 생균제 활성이 검증된 CACC 537 균주의 단백뇨 억제 효과에 대한 임상시험을 실시하였다. Five dogs were subjected to clinical trials on the proteinuria inhibitory effects of
먼저, CACC 537 균주를 분말 형태로 제제화하여 1달 동안 급여한 후, 미생물제제 급여 전후의 반려견 뇨를 채취하여 뇨에 함유된 단백질 함량을 검사하였다.First, the
[표 5]TABLE 5
그 결과, CACC 537 균주의 투여를 통하여 반려견의 뇨 속에 함유된 단백질 함량이 70.5% 감소한 것으로 관찰되었다.As a result, it was observed that the protein content in the dog's urine decreased by 70.5% through the administration of the
상기와 같은 결과를 통해 CACC 537 균주가 반려견의 단백뇨를 매우 효과적으로 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. Through the above results, it was confirmed that the
실시예 6. 간 기능 개선 효과Example 6 Liver Function Improvement Effect
간 질환, 자가면역질환 등 다양한 원인으로 간 기능이 저하될 수 있다. 본 발명의 CACC 537 균주가 콜레스테롤 정상화 및 간 기능 개선에 미치는 영향을 평가하기 위해 하기 실험을 수행하였다. Liver function may decrease due to various causes such as liver disease and autoimmune diseases. The following experiment was performed to evaluate the effect of the
먼저, 설사환자견 5마리를 대상으로 하여 보호자 동의하에 면역증진 활성이 검증된 CACC 537 균주 투여 전후로 혈액 면역화학적 변화를 조사하여 동 균주가 갖는 콜레스테롤 수치 저하 및 간 기능 개선 효과를 검증하였다.First of all, 5 dogs with diarrhea patients were examined with blood immunochemical changes before and after
실험은 CACC 537 균주를 분말 형태로 제제화하여 설사환자견에 1달 동안 급여한 후, 미생물제제 급여 전후의 혈액을 채취하여 혈액 검사를 실시하였고, 정상견의 혈액과 비교하여 분석하였다. In the experiment, the
[표 6]TABLE 6
그 결과, 급여 전에 상당히 높았던 콜레스테롤(cholesterol, CHOL) 수치가 CACC 537 균주의 급여로 인하여 정상범위로 크게 감소하여 본 발명의 CACC 537 균주가 높은 콜레스테롤 수치 저감 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, ALP(alkaline phosphatase) 및 ALT(alanine amino-trasferase), GGT(Gamma glutamyl transferase), B/C 비율(blood urea nitrogen/creatinine ratio)은 급여 후에 정상범위 보다는 다소 높았으나, CACC 537 균주를 1달 동안 급여 후에 크게 감소하여 간 기능 개선에 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 CACC 537 균주가 반려견의 장내 환경 개선을 통해 간 기능 개선에도 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다. As a result, the cholesterol (cholesterol, CHOL) levels significantly higher before feeding was significantly reduced to a normal range due to the feeding of the
실시예Example 7. 균주 동정 7. Strain Identification
상기 실시예 1 내지 5에서 생균제 활성이 검증된 CACC 537 균주를 동정하기 위해 16S rRNA gene sequencing 분석을 실시하였다. 16S rRNA gene sequencing analysis was performed to identify
프라이머는 27F 및 1492R 프라이머를 사용하였고, PCR 기기를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 후 inter-primer인 785F, 907R 프라이머로 약 1,400bp 이상의 염기서열을 확보하였다. 확보된 염기서열은 Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net)의 16S-based ID를 통해 16S rRNA 분석한 결과, P. acidilactici DSM 20284T(accession number, GL397069)와 99.8% 상동성을 보이는 신규한 페디오코쿠스 에시딜락티시(P. acidilactici) 균주로 동정되었다. As primers, 27F and 1492R primers were used and 16S rRNA genes were amplified using a PCR instrument, and nucleotides of about 1,400bp or more were obtained using 785F and 907R primers, which are inter-primers. The obtained sequence was analyzed by 16S rRNA using 16S-based ID of Ezbiocloud (https://www.ezbiocloud.net), and showed a new 99.8% homology with P. acidilactici DSM 20284T (accession number, GL397069). It was identified as P. acidilactici strain.
Phylogenetic tree는 Mega 7 program을 사용하여 neighbor joining method를 기반으로 [도 7]에 나타내었다.The phylogenetic tree is shown in FIG. 7 based on the neighbor joining method using a
본 발명자들은 우수한 생균제 활성을 갖는 본 발명의 균주를 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537로 명명하고, 2019년 7월 11일 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호(KACC 81098BP)로 기탁하였다. The present inventors named the strain of the present invention having excellent probiotic activity as pediococcus ecidyl lactyl
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
[수탁번호][Accession number]
기탁기관명 : 농업생명공학연구원Depositary Name: Institute of Agricultural Biotechnology
수탁번호 : KACC81098BPAccession number: KACC81098BP
수탁일자 : 20190711Deposit Date: 20190711
<110> Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms
<120> Novel Strain of Pediococcus acidilactici CACC 537, and feed
composition using thereof
<130> PN190061AN
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1499
<212> DNA
<213> Pediococcus acidilactici
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaacttccgt taattgatca 60
ggacgtgctt gcactgaatg agattttaac acgaagtgag tggcggacgg gtgagtaaca 120
cgtgggtaac ctgcccagaa gcaggggata acacctggaa acagatgcta ataccgtata 180
acagagaaaa ccgcctggtt ttcttttaaa agatggctct gctatcactt ctggatggac 240
ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgatgat gcgtagccga 300
cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 360
gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag 420
aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt aaagaagaac gtgggtgaga gtaactgttc 480
acccagtgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540
tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtcttt 600
taagtctaat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg cattggaaac tgggagactt 660
gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa 720
gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg 780
ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgat tactaagtgt 840
tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agtaatccgc ctggggagta 900
cgaccgcaag gttgaaactc aaaagaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960
ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcttct gccaacctaa 1020
gagattaggc gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattact agttgccagc 1140
attcagttgg gcactctagt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg 1200
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg 1260
agtcgcgaaa ccgcgaggtt tagctaatct cttaaaacca ttctcagttc ggactgtagg 1320
ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1380
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa 1440
agccggtggg gtaacctttt aggagctagc cgtctaaggt gggacagatg attagggtg 1499
<110> Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms
<120> Novel Strain of
Claims (10)
상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 신균주 페디오코쿠스 에시딜락티시 CACC 537(수탁번호: KACC 81098BP).The method of claim 1,
The strain is a new strain pediococcus ecidyl lactici CACC 537 (Accession No .: KACC 81098BP), characterized in that it has a 16s rRNA sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 조성물은 내산성, 내담즙성, 및 장내부착 활성이 있는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is a pet food composition, characterized in that the acid resistance, bile resistance, and intestinal adhesion activity.
상기 조성물은 살모넬라 더비(Salmonella Derby), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 가축 병원균에 항균 활성이 있는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is characterized in that it has antimicrobial activity to at least one livestock pathogen selected from the group consisting of Salmonella Derby, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, and Escherichia coli . Feed composition for pets.
상기 조성물은 면역증진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is a pet food composition, characterized in that it has an immunostimulating activity.
상기 조성물은 단백뇨 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is a pet food composition, characterized in that it has a proteinuria inhibitory activity.
상기 조성물은 콜레스테롤 저감 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is a pet food composition, characterized in that it has a cholesterol reducing activity.
상기 조성물은 간 기능 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 반려동물용 사료 조성물. The method of claim 3,
The composition is a pet food composition, characterized in that it has a liver function improving activity.
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2019
- 2019-09-10 KR KR1020190112013A patent/KR102064134B1/en active IP Right Grant
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