KR102059649B1 - PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY COMPRISING ENOblock - Google Patents

Abstract

본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ENOblock은 에놀라제 활성을 억제하여 당뇨와 고지혈증 증세를 개선시킬 뿐만 아니라, 당뇨 합병증으로서 진행되는 세포사멸(apoptosis)에 의한 조직 손상, 염증 진행 및 조직 섬유화를 막는 효과가 있다. ENOblock은 지방 생성 유전자의 발현을 억제하여 비만 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, ENOblock은 기존에 항당뇨제로 알려진 로지글리타존(rosiglitazone)에 비해 간, 신장 및 심장에서의 부작용이 적다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising ENOblock as an active ingredient. ENOblock according to the present invention has the effect of inhibiting enolase activity to improve the symptoms of diabetes and hyperlipidemia, as well as preventing tissue damage, inflammation progression and tissue fibrosis due to apoptosis that progresses as a diabetic complication. ENOblock can be usefully used as a therapeutic agent for obesity by inhibiting the expression of fat producing genes. In addition, ENOblock has fewer side effects in the liver, kidney, and heart than rosiglitazone, which is known as an antidiabetic agent.

Description

ENOblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY COMPRISING ENOblock}Pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising ENOblock as an active ingredient {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY COMPRISING ENOblock}

본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising ENOblock as an active ingredient.

비만은 에너지 밸런스 조절기능의 이상 혹은 과영양으로 지방조직이 과다하게 축적되어 각종 질병의 이환율과 사망률을 높이는 만성 질환이다. 비만은 비만 그 자체가 갖는 문제점뿐만 아니라, 고혈압, 고지혈증 및 심혈관계 질환이나 당뇨와 같은 질병의 원인으로 작용할 수 있다. 몸무게 1kg의 증가는 심혈관질환 위험도를 3.1%, 당뇨 위험도를 4.5-9% 증가시키며, 약 11% 몸무게의 감소는 상기 질환으로 인한 사망률을 25% 감소시키는 것으로 알려져 있어 비만의 효과적인 치료 방법이 긴급하게 요구되고 있다.Obesity is a chronic disease that increases the morbidity and mortality of various diseases due to excessive accumulation of fat tissue due to abnormal energy balance function or over nutrition. Obesity may act as a cause of diseases such as hypertension, hyperlipidemia and cardiovascular disease or diabetes, as well as problems with obesity itself. An increase in weight of 1 kg increases the risk of cardiovascular disease by 3.1% and increases the risk of diabetes by 4.5-9%, and a decrease of about 11% in weight is known to reduce the mortality caused by the disease by 25%. It is required.

비만에 의해 발생되는 만성 성인병의 하나인 당뇨병은, 인슐린을 분비하는 세포가 파괴되어 인슐린의 양이 절대적으로 부족한 제1형 당뇨병과 인슐린이 작용하는 장기에서 인슐린에 대한 저항성이 생긴 제2형 당뇨병으로 구분된다. 우리나라의 경우 제2형 당뇨병 환자가 약 90% 이상을 차지하고 있다. 또한, 우리나라 생활수준의 향상과 함께 생활양식이 서구화되면서 당뇨병 환자가 빠르게 증가하고 있고, 그로 인한 사망률 또한 빠르게 증가하여 OECD 국가 중 당뇨로 인한 사망률 1위를 기록했다. 이러한 당뇨병은 망막증, 신부전, 말초신경합병증 등 매우 심각한 합병증을 초래할 수 있어, 조기에 정확히 진단하고 관리하는 것이 필수적이다.Diabetes, one of the chronic adult diseases caused by obesity, is type 1 diabetes, in which insulin-secreting cells are destroyed and insulin is absolutely insufficient. Are distinguished. In Korea, type 2 diabetes patients account for more than 90%. In addition, with the improvement of the standard of living in Korea and the westernization of lifestyle, the number of diabetic patients is increasing rapidly, and the mortality rate is also increasing rapidly, making it the number one among diabetes among OECD countries. Such diabetes can cause very serious complications such as retinopathy, renal failure, and peripheral neuropathy. Therefore, it is essential to accurately diagnose and manage the disease early.

한편, 대한민국 등록공보 제10-1472083호에서는, 해당과정 경로(glycolysis pathway)의 한 구성요소인 에놀라제(enolase)에 직접 결합하여 이의 활성을 억제하는 최초의 비-기질성(non-substrate) 유사체인 작은 분자 'ENOblock'에 대해 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는, 트리아진계 화합물(triazine compound)인 ENOblock의 용도에 대해 구체적으로 언급하고 있지 않다.Meanwhile, Korean Patent Publication No. 10-1472083 discloses the first non-substrate that directly binds to enolase, a component of the glycolysis pathway, and inhibits its activity. A small molecule 'ENOblock' which is an analog is disclosed. However, the patent does not specifically mention the use of ENOblock, which is a triazine compound.

KR 10-1472083 B1KR 10-1472083 B1

이에, 본 발명자들은 에놀라제 조절 화합물인 ENOblock이 비만 및 당뇨 마우스 모델에서 항-비만, 항-염증 및 항-섬유증 효과를 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by confirming that the ENOblock, an enolase modulating compound, induces anti-obesity, anti-inflammatory and anti-fibrotic effects in obese and diabetic mouse models.

본 발명의 목적은 비만, 섬유증, 지방간, 당뇨 합병증, 고지혈증 및/또는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, fibrosis, fatty liver, diabetic complications, hyperlipidemia and / or degenerative brain disease.

본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver, comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 당뇨 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic complications comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease, comprising ENOblock as an active ingredient.

또한, 본 발명은 ENOblock을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만, 섬유증, 지방간, 당뇨 합병증, 고지혈증 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preventing or treating any one disease selected from the group consisting of obesity, fibrosis, fatty liver, diabetic complications, hyperlipidemia and degenerative brain diseases, comprising administering ENOblock to a subject.

본 발명에 따른 ENOblock은 에놀라제 활성을 억제하여 당뇨와 고지혈증 증세를 개선시킬 뿐만 아니라, 당뇨 합병증으로서 진행되는 세포사멸(apoptosis)에 의한 조직 손상, 염증 진행 및 조직 섬유화를 막는 효과가 있다. ENOblock은 지방 생성 유전자의 발현을 억제하여 비만 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, ENOblock은 기존에 항당뇨제로 알려진 로지글리타존(rosiglitazone)에 비해 간, 신장 및 심장에서의 부작용이 적다.ENOblock according to the present invention has the effect of inhibiting enolase activity to improve the symptoms of diabetes and hyperlipidemia, as well as preventing tissue damage, inflammation progression and tissue fibrosis due to apoptosis that progresses as a diabetic complication. ENOblock can be usefully used as a therapeutic agent for obesity by inhibiting the expression of fat producing genes. In addition, ENOblock has fewer side effects in the liver, kidney, and heart than rosiglitazone, which is known as an antidiabetic agent.

도 1은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 에놀라제 효소 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포주에서 핵 내 에놀라제를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 것이다.
도 3은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포주에서 핵 내 에놀라제를 정량한 것이다.
도 4는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 Huh7 간세포에서 핵 내 에놀라제를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 것이다.
도 5는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 Huh7 간세포에서 핵 내 에놀라제를 정량한 것이다.
도 6은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포주에서 에놀라제 결합 유전자인 c-Myc의 발현을 분석한 것이다.
도 7은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포에서 c-Myc 발현을 분석한 것이다.
도 8은 ENOblock을 처리된 3T3-L1 지방전구세포에서 에놀라제 결합 유전자인 Erbb2의 발현을 분석한 것이다.
도 9는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포에서 Erbb2 발현을 분석한 것이다.
도 10은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 Huh7 간 세포주에서 에놀라제 결합 유전자로 알려진 Erbb2 발현을 분석한 것이다.
도 11은 ENOblock을 처리한 Huh7 간 세포주에서 Erbb2 발현을 분석한 것이다.
도 12는 ENOblock 또는 NaF 처리된 Huh7 간 세포주에서 핵 내 에놀라제를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 것이다.
도 13은 ENOblock 또는 NaF 처리된 Huh7 간 세포주에서 핵 내 에놀라제를 정량한 것이다.
도 14, 도 15는 ENOblock을 처리한 후, 간세포(도 14) 또는 간조직(도 15)에서 세포질(cytosolic) 및 핵 내 에놀라제 단백질 발현을 분석한 것이다.
도 16은 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 화학 구조(분자량= 631.18)이다.
도 17은 db/db T2DM 마우스에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 항 당뇨병 효과를 평가하기 위한 동물 실험에 관한 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 18은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리한 db/db 마우스에서 24시간 동안의 혈당치를 측정한 것이다.
도 19는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 7주 이상 처리한 db/db 마우스의 혈당치를 나타낸 것이다.
도 20은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 7주 이상 처리한 후 db/db 마우스의 LDL/VLDL 콜레스테롤 수치를 측정한 것이다.
도 21은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 7주 이상 처리한 db/db 마우스의 HDL 콜레스테롤 수치를 나타낸 것이다.
도 22는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 혈청 내 유리지방산(FFA) 수준을 나타낸 것이다.
도 23은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 혈청에서의 알라닌 아미노기전달효소(ALT)의 활성을 나타낸 것이다.
도 24는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 간 조직에서의 에놀라제 활성을 나타낸 것이다.
도 25는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서의 에놀라제 활성을 나타낸 것이다.
이때, 도 20 내지 도 25에서 사용된 마우스는 모두 연령이 동일하고 같은 스크레인의 B6 마우스이다.
도 26 내지 도 28은 에놀라제 결합 유전자인 Cox-2, Erbb-2 및 c-Myc의 발현을 분석한 것이다.
도 29는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 7주간 처리된 db/db 마우스의 대표 간 사진이다.
도 30은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리한 지 7주 후에 db/db 마우스의 간 중량을 측정한 것이다.
도 31은 오일 레드 O 염색을 통해 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 간 조직의 지질 축적 정도를 나타낸 것이다.
도 32는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 지방 축적을 정량한 것이다.
도 33은 Masson-Trichrome 염색을 통해 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 마우스의 간 섬유화(청색으로 염색) 정도를 나타낸 것이다(스케일바= 100 μm).
도 34는 화학식 2로 표시되는 ENOblock으로 처리된 마우스의 간 섬유화를 정량화한 것이다.
도 35는 H&E 염색을 통해 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 간 미세지방증(liver microsteatosis) 정도를 나타낸 것이다.
도 36은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 간 미세지방증을 정량화한 것이다.
도 37은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 마우스의 간 조직에서 아폽토시스 세포(검은 핵)를 표시한 것이다(눈금 막대= 10 μm).
도 38은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 마우스의 간 조직에서 아폽토시스 세포를 정량화한 것이다.
도 39는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 마우스의 간 조직에서 카스파제-3, 절단된 카스파제-3(Asp175), PARP 및 절단된 PARP의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 이때, 연령이 같은 B6 마우스 스트레인을 비교군으로 사용하였다.
도 40은 α-tubulin 대비 cleaved caspase-3(Asp175)의 발현을 정량한 것이다.
도 41은 α-tubulin 대비 cleaved PARP 발현을 정량한 것이다.
도 42 및 도 43은 간 조직에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 염증 유전자 TNF-α와 IL-6를 분석한 것이다.
도 44는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 Pck -1(세포질 형태)의 발현을 나타낸 것이다.
도 45는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 Pck -2(미토콘드리아 형태)의 발현을 나타낸 것이다.
도 46 및 도 47은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 Srebp -1a 및 Srebp-1c의 발현을 나타낸 것이다.
도 48은 간 조직에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 Insig -2의 발현을 나타낸 것이다.
도 49 및 도 50은 db/db 마우스 간에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 LXR 표적 유전자인 Abcg -5 및 Scap의 발현을 평가한 것이다.
도 51 및 도 52는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 체중 및 생식선 지방 조직 중량을 나타낸 것이다.
도 53은 지방 세포 크기를 시각화하기 위해, 생식선 지방 조직을 H&E 염색한 것이다(스케일바= 200 μm).
도 54는 지방 세포 크기를 정량한 것이다(*: 처리하지 않은 것과 비교하여 감소된 크기에 대한 유의성 p <0.05; ** 치료되지 않은 로지글리타존에 비해 감소 된 크기에 대한 유의성 p <0.05).
도 55는 생식선 지방 조직을 Masson-trichrome 염색한 것이다. 섬유증 영역은 지방 세포 경계 주위에 비교적 진한 파란색 고리로 시각화되었다.
도 56은 각 그룹에 따른 마우스의 조직에서 섬유화를 정량한 것이다.
도 57은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 섬유증 마커 α-SMA의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 것이다.
도 58은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리에 따른 α-SMA 발현의 농도 계측 분석한 것이다.
도 59 및 도 60은 RAW 264.7 대식세포에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock 의 처리와 LPS 자극 유무에 따른 TNF-α 및 TLR-4의 발현을 확인 한 것이다.
도 61 내지 도 65는 지방 조직에서의 염증 유전자 TNF-α, Cd11c 및 Mcp-1, 지방 생성 마커 Pparγ, 및 지방 섬유아세포의 Col6a3의 발현을 확인한 것이다.
도 66은 로지글리타존 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 db/db 마우스의 심장 무게를 측정한 것이다.
도 67은 심장 중량 대 체중의 비(심장 비대증의 지표)를 나타낸 것이다.
도 68은 심근 조직의 Masson-trichrome 염색으로 심장 섬유화(청색으로 염색)를 검출한 것이다(스케일바= 100 μm).
도 69는 약물 처리에 따른 심장 섬유화를 정량한 것이다.
도 70은 H&E 염색에 의해 시각화된 심근 세포 이미지를 나타낸 것이다.
도 71은 약물 처리에 따른 심근 세포의 폭을 측정한 것이다.
도 72는 로지글리타존 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 마우스의 심장 조직에서 아폽토시스 핵을 염색한 것이다(스케일바= 100 μm).
도 73은 약물 처리에 따른 마우스 심장 조직의 아폽토시스 세포를 정량화한 것이다.
도 74는 로지글리타존 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 마우스의 심장 조직에서 카스파제-3, 절단된 카스파제-3(Asp175), PARP 및 절단된 PARP의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 이때, 연령과 일치하는 B6 마우스를 대조군으로 사용하였다.
도 75는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 심장 조직에서 α-tubulin 대비 절단된 카스파제-3(Asp175)의 발현을 정량한 것이다.
도 76은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 심장 조직에서 α-tubulin 대비 절단된 PARP 발현을 정량한 것이다.
도 77 내지 도80은 로지글리타존 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 마우스에서 심장 기능의 지표인 Gata-4, Glut-4, Irap 및 a-MHC의 mRNA를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 81 내지 도 84는 로지글리타존 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 마우스에서 심장 병리학적 마커들인 Kcnk-1, Asah-2, B4glant 및 MMP-3의 mRNA를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 85는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 무게를 나타낸 것이다.
도 86은 Masson-trichrome 염색으로 신장 조직을 염색하여 섬유화(청색으로 염색)를 측정한 것이다.
도 87은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스에서 간질 ECM 성분(interstitial ECM component)의 축적을 정량화한 것이다.
도 88은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 아폽토시스 핵을 염색한 것이다(스케일바= 100 μm).
도 89는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 아폽토시스 세포를 정량화한 것이다.
도 90은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 카스파제-3, 절단된 카스파제-3(Asp175), PARP 및 절단된 PARP의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 이때, 연령과 일치하는 B6 마우스를 대조군으로 사용하였다.
도 91은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 α-tubulin 대비 절단된 카스파제-3(Asp175)의 발현을 정량한 것이다.
도 92는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 α-tubulin 대비 절단된 PARP 발현을 정량한 것이다.
도 93 내지 도 96은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 아폽토시스 마커인 angiotensin, Bax 및 p53, 및 포도당 신생합성의 양성 조절과 관련된 Pck-1(세포질)의 발현량을 분석한 것이다.
도 97 내지 도 99는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 신장 조직에서 Col4a1, Col4a2 및 Col4a3의 발현을 측정한 것이다.
도 100은 화학식 2로 표시되는 ENOblock을 처리한 후, 간세포에서 세포질(cytosolic) 및 핵(nuclear) 내 에놀라제 단백질 발현을 분석한 것이다.
도 101a는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리된 db/db 마우스의 간 조직에서 α-SMA의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 이때, 연령과 일치하는 B6 마우스 스트레인을 대조군으로 사용하였다.
도 101b는 GAPDH로 표준화한 α-SMA의 발현을 정량한 것이다.
도 102는 백색 지방 조직 유래의 지방전구세포에서 화합물 처리 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 103은 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 지방생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 104는 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 산화 인산화 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 105는 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 열 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 106은 지방 세포 분화를 진행하는 백색 지방 조직의 지방전구세포에서 화합물 전처리 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 107은 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 지방전구세포를 분화시키는 지방 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 108은 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 산화 인산화 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 109는 forskolin, rapamycin 또는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 처리에 따른 열 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 110은 분화 중인 초대배양 백색 지방 세포에 화합물을 처리하는 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 111은 분화 중인 지방세포에 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF를 처리한 후, 지방생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 112는 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF를 처리에 따른 산화적 인산화 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 113은 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF를 처리에 따른 열 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 114는 갈색 지방 조직(BAT)에서 분리된 갈색 지방전구세포에 화합물을 처리하는 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 115는 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF의 처리에 따른 지방전구세포를 분화시키는 지방 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 116은 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF의 처리에 따른 산화 인산화 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 117은 forskolin, rapamycin, 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 NaF의 처리에 따른 열 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 118은 화학식 2로 표시되는 ENOblock, NaF, forskolin 또는 rapamycin 처리된 3T3-L1 지방전구세포와 갈색 지방전구세포의 미토콘드리아 막전위를 가시화하기 위해 TMRE를 사용하여 나타낸 것이다.
도 119는 화학식 2로 표시되는 ENOblock, NaF, forskolin 또는 rapamycin 처리된 3T3-L1 지방전구세포의 미토콘드리아 막전위 정량을 나타낸 것이다.
도 120은 화학식 2로 표시되는 ENOblock, NaF, forskolin 또는 rapamycin 처리된 3T3-L1 백색 지방전구세포의 미토콘드리아 막전위를 가시화하기 위해 TMRE를 사용하여 나타낸 것이다.
도 121은 화학식 2로 표시되는 ENOblock, NaF, forskolin 또는 rapamycin 처리된 백색 지방전구세포의 미토콘드리아 막전위를 정량한 것이다.
도 122는 화학식 2로 표시되는 ENOblock, NaF, forskolin 또는 rapamycin 처리된 갈색 지방전구세포의 미토콘드리아 막전위를 정량한 것이다.
도 123은 3T3-L1 백색 지방전구세포에 화학식 2로 표시되는 ENOblock, forskolin 또는 rapamycin을 처리하고 오일 레드 O 염색한 결과이다.
도 124는 화학식 2로 표시되는 ENOblock, forskolin 또는 rapamycin 처리된 백색 지방전구세포의 오일 레드 O 염색 결과의 정량을 나타낸 것이다.
도 125는 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 화학구조이다.
도 126은 HFD(high fat diet) 마우스에 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 127은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 8주간 처리한 HFD 마우스의 모습을 나타낸 것이다.
도 128은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리한 HFD 마우스의 내장 지방 조직을 보여주는 복부 해부 사진(흰색 화살표로 표시)이다.
도 129는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리한 HFD 마우스의 변화를 나타낸 것이다.
도 130은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리한 HFD 마우스의 사료 섭취량을 나타낸 것이다.
도 131은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리 도중 마우스의 직장(Rectum) 체온을 나타낸 것이다.
도 132는 화학식 2로 표시되는 ENOblock과 로지글리타존을 처리한지 4, 6 및 8주차에 HFD 마우스의 공복 혈중 포도당 수치를 나타낸 것이다.
도 133 및 도 134는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존으로 처리 4주 후, HFD 마우스에 대한 포도당 내성 검사(GTT) 및 곡선하면적(AUC)을 측정하여 나타낸 것이다.
도 135 및 도 136는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리 5주 후, HFD 마우스에 대한 인슐린 내성 검사(ITT) 및 AUC를 측정하여 나타낸 것이다.
도 137 및 도 138은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리 8주 후, HFD 마우스의 인슐린 혈청 농도와 인슐린 저항성 수준을 나타낸 것이다.
도 139 및 도 140은 포도당 신생합성 수준을 결정하기 위해 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리 7주 후, HPD 마우스에 대한 피루브산 저항성 테스트(PTT) 및 곡선하면적(AUC)을 나타낸 것이다.
도 141은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 사진을 나타낸 것이다. 대조군으로 같은 연령의 SFD(Standard fat diet) 간을 함께 나타내었다.
도 142는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 중량을 나타낸 것이다.
도 143은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 알라닌 아미노 전이 효소(ALT)의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 144는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 조직에서 지질 축적을 시각화하기 위해 오일 레드 O 염색한 것이다.
도 145는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 지질 축적을 정량화한 것이다.
도 146은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 지방증(steatosis)을 시각화 위해 H&E 염색한 것이다.
도 147은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 지방증을 정량화한 것이다.
도 148은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 조직 섬유화(청색)를 시각화하기 위해 Masson-Trichrome 염색한 것이다.
도 149는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 섬유화를 정량화한 것이다.
도 150은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 성상 세포 검출을 위해 α-SMA 면역 염색한 것이다.
도 151은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간 성상 세포 수를 정량화한 것이다.
도 152는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 α-SMA 발현을 qPCR 분석하여 나타낸 것이다.
도 153은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 간에서 α-SMA의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 154 및 도 155는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스 간에서 염증 마커인 TNF-α및 IL-6의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 156은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 염증 마커 IL-6, TNF-α 및 S100a9의 발현을 평가한 것이다.
도 157은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 지질 항상성 조절 인자인 Srebp-1a 및 Srebp-1c의 발현을 분석한 것이다.
도 158은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 Srebp 단백질을 조절하는 Amfr, Insig-1 및 Insig-2의 조절 인자의 발현을 분석한 것이다.
도 159는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 LXR 표적 유전자인 Scap 및 Abcg5의 발현을 나타낸 것이다.
도 160은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 글루코오스 신생 합성을 조절하는 Pck-1 및 Pck-2의 발현을 나타낸 것이다.
도 161은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 간 조직에서 지방 생성 조절 인자인 Adipoq, Ap2, Ppar-γ, Retn 및 Cebpa의 발현을 나타낸 것이다.
도 162는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 해마에서 염증 마커인 IL-6, TNF-α, Cd11c, Tlr-4 및 Nptx2의 발현을 나타낸 것이다.
도 163은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 해마에서 에너지 상태 센서인 Creb 및 미토콘드리아 생합성 조절자인 Tfam, Nrf1 및 Nrf2의 발현을 나타낸 것이다.
도 164는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스의 해마에서 미토콘드리아 DNA 함량을 나타낸 것이다.
도 165는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스 해마의 CA1, CA2 및 CA3 영역에서 뉴런의 Nissl 염색 결과를 나타낸 것이다. 이때, 로지글리타존 처리한 쥐의 CA1 영역에서 무질서하게 배열된 신경 구조를 주목해야 한다.
도 166 내지 도 168은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 HFD 마우스에서 트리글리세라이드, HDL 및 LDL 콜레스테롤의 혈청 수치를 측정한 것이다.
도 169는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 해부된 생식선의 백색 지방 조직을 나타낸 것이다.
도 170은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 생식선의 백색 지방 조직 무게를 나타낸 것이다.
도 171은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 지방 세포 크기를 시각화하기 위해 생식선의 지방 조직을 H&E 염색한 것이다.
도 172는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 지방 세포 폭을 측정한 것이다.
도 173은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 처리된 HFD 마우스(백색 화살표로 표시)로부터 H&E로 염색된 생식선의 백색 지방 조직에서 지방 세포 영역(베이지 색)을 표시한 것이다.
도 174는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 생식선의 백색 지방 조직에서 염증 마커 TNF-α, Cd11c 및 Mcp-1과 마스터 지방 생성 조절 인자인 Ppar-γ를 qPCR 분석한 것이다.
도 175는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 견갑골 사이의 갈색 지방 조직의 대표 사진이다.
도 176은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 견갑골 사이의 갈색 지방 조직(BAT) 무게를 나타낸 것이다.
도 177은 지방간 크기를 시각화하기 위해 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 견갑골 사이의 갈색 지방 조직을 H&E 염색한 것이다.
도 178은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존의 처리에 따른 염증 마커 및 지방전구세포를 분화시키는 지방 생성 조절 인자의 발현을 나타낸 것이다.
도 179 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존의 처리에 따른 열 생성 조절 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 180은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 마우스의 갈색 지방 조직에서 섬유화를 시각화하기 위해 Masson-Trichrome 염색한 것이다.
도 181은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스의 갈색 지방 조직에서 섬유화를 정량화한 것이다.
도 182는 HFD 마우스에서 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 183은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리된 HFD 마우스의 내장 지방 조직(흰색 화살표)을 표시한 해부 사진이다.
도 184는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 과정 동안의 마우스 체중을 나타낸 것이다.
도 185는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 4주 및 6주차에 HFD 마우스의 공복혈당치를 측정한 것이다.
도 186 및 도 187은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 4주 후, HFD 마우스에 대한 혈당 내성 테스트(GTT) 및 곡선하면적(AUC)을 측정하여 나타낸 것이다.
도 188 및 도 189는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 5주 후, 인슐린 내성 테스트(ITT) 및 곡선하면적(AUC)을 측정하여 나타낸 것이다.
도 190 및 도 191은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리 7주 후, 피루브산 내성 테스트(PTT) 및 곡선하면적(AUC)을 측정하여 나타낸 것이다.
도 192 및 도 193은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리된 HFD 마우스에서 인슐린 혈청 농도와 인슐린 저항성을 나타낸 것이다.
도 194는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리된 마우스의 해부된 생식선의 백색 지방 조직 사진이다.
도 195는 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리된 마우스에서 생식선의 백색 지방 조직 무게를 측정한 것이다.
도 196은 판 대식세포 마커인 CD68(macrosialin) 및 M2 항 염증성 대식세포 마커인 CD206(mannose receptor)에 대한 항체로 염색된 백색 지방 조직 -유도 염증 세포의 유동세포분석(FACs)을 나타낸 것이다.
도 197은 화학식 2로 표시되는 ENOblock 또는 metformin 처리된 마우스로부터 백색 지방 조직 염증 군에서 M2형 대식세포를 정량화한 것이다.
도 198 및 도 199는 고지방 식이에 의해 유발되는 비만의 진행에 대한 화학식 2로 표시되는 ENOblock의 치료 효과를 도식화한 것이다.Figure 1 shows the enolase enzyme activity according to the ENOblock treatment represented by the formula (2).
Figure 2 is a Western blot analysis of the enolase in the nucleus in the ENOblock-treated 3T3-L1 adipocyte cell line represented by the formula (2).
Figure 3 is a quantification of enolase in the nucleus in ENOblock-treated 3T3-L1 adipocyte cell line represented by the formula (2).
Figure 4 is a Western blot analysis of the enolase in the nucleus in ENOblock treated Huh7 hepatocytes represented by the formula (2).
5 is a quantification of enolase in the nucleus in ENOblock treated Huh7 hepatocytes represented by the formula (2).
Figure 6 is an analysis of the expression of the enolase binding gene c-Myc in ENOblock-treated 3T3-L1 adipocyte cell line represented by the formula (2).
FIG. 7 shows c-Myc expression in ENOblock-treated 3T3-L1 adipocytes represented by Formula 2. FIG.
Figure 8 is an analysis of the expression of the enolase binding gene Erbb2 in ENOblock-treated 3T3-L1 adipocytes.
9 is an analysis of Erbb2 expression in ENOblock-treated 3T3-L1 adipocytes represented by the formula (2).
Figure 10 is an analysis of Erbb2 expression known as enolase binding gene in ENOblock treated Huh7 liver cell line represented by the formula (2).
11 shows Erbb2 expression in Huh7 liver cell lines treated with ENOblock.
12 is a Western blot analysis of enolase in the nucleus in ENOblock or NaF treated Huh7 liver cell lines.
Figure 13 Quantify enolase in the nucleus in ENOblock or NaF treated Huh7 liver cell lines.
Figures 14 and 15 show the expression of enolase protein in the cytosolic and nucleus in hepatocytes (Fig. 14) or hepatic tissues (Fig. 15) after treatment with ENOblock.
16 is a chemical structure (molecular weight = 631.18) of the ENOblock represented by Chemical Formula 2. FIG.
Figure 17 depicts a protocol relating to animal experiments for evaluating the antidiabetic effect of ENOblock represented by Formula 2 in db / db T2DM mice.
FIG. 18 is a blood glucose level measured for 24 hours in ENOblock or rosiglitazone treated db / db mice represented by Formula 2. FIG.
19 shows blood glucose levels of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2 for 7 weeks or more.
FIG. 20 shows LDL / VLDL cholesterol levels of db / db mice after 7 weeks of treatment with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 21 shows HDL cholesterol levels of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone for 7 weeks or more.
FIG. 22 shows free fatty acid (FFA) levels in serum of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2.
Figure 23 shows the activity of alanine aminotransferase (ALT) in the serum of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by formula (2).
FIG. 24 shows enolase activity in liver tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 25 shows enolase activity in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
At this time, the mice used in Figures 20 to 25 are all the same age and the same strain of B6 mice.
26 to 28 analyze the expression of the enolase binding genes Cox-2, Erbb-2 and c-Myc.
29 is a representative liver picture of db / db mice treated for 7 weeks with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 30 shows liver weights of db / db mice 7 weeks after treatment with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
Figure 31 shows the degree of lipid accumulation of liver tissue of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by the formula (2) through oil red O staining.
FIG. 32 quantifies fat accumulation in db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
Figure 33 shows the degree of liver fibrosis (staining in blue) of mice treated with ENOblock or rosiglitazone via Masson-Trichrome staining (scale bar = 100 μm).
FIG. 34 quantifies liver fibrosis of mice treated with ENOblock represented by Formula 2. FIG.
35 shows the degree of liver microsteatosis of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2 through H & E staining.
FIG. 36 quantifies liver microlipidosis of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 37 shows apoptotic cells (black nuclei) in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2 (scale bars = 10 μm).
FIG. 38 quantifies apoptosis cells in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
39 shows the results of Western blot analysis of caspase-3, cleaved caspase-3 (Asp175), PARP, and cleaved PARP in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG. At this time, the same age B6 mouse strain was used as a comparison group.
40 quantifies the expression of cleaved caspase-3 (Asp175) relative to α-tubulin.
41 is a quantification of cleaved PARP expression compared to α-tubulin.
42 and 43 are analysis of the inflammatory genes TNF-α and IL-6 according to the ENOblock treatment represented by the formula (2) in liver tissue.
Figure 44 shows the expression of Pck- 1 (cytoplasmic form) following ENOblock treatment represented by formula (2).
Figure 45 shows the expression of Pck- 2 (mitochondrial form) following the ENOblock treatment represented by the formula (2).
46 and 47 shows the Srebp -1a and expression of Srebp-1c according to the ENOblock process represented by the following formula (2).
48 shows expression of Insig- 2 following ENOblock treatment represented by Formula 2 in liver tissue.
49 and 50 evaluate the expression of Abcg- 5 and Scap , which are LXR target genes, by ENOblock treatment represented by Formula 2 in db / db mice.
51 and 52 show the body weight and gonad adipose tissue weight of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by the formula (2).
FIG. 53 is H & E staining of gonad adipose tissue to visualize adipocyte size (scalebar = 200 μιη).
FIG. 54 quantifies adipocyte size (*: significance p <0.05 for reduced size compared to untreated; ** significance p for reduced size compared to untreated rosiglitazone).
55 shows Masson-trichrome staining of gonad adipose tissue. The fibrosis area was visualized with a relatively dark blue ring around the fat cell boundary.
Fig. 56 quantifies fibrosis in the tissues of mice according to each group.
Figure 57 shows the expression of the fibrosis marker α-SMA according to the ENOblock treatment represented by the formula (2) via Western blot.
58 is a concentration measurement analysis of α-SMA expression according to the ENOblock treatment represented by the formula (2).
59 and 60 confirm the expression of TNF-α and TLR-4 according to the treatment of the ENOblock represented by the formula (2) and the presence or absence of LPS stimulation in RAW 264.7 macrophages.
61 to 65 confirm the expression of inflammatory genes TNF-α, Cd11c and Mcp-1, adipogenic marker Pparγ, and Col6a3 in adipose fibroblasts in adipose tissue.
FIG. 66 shows the heart weight of rosiglitazone or ENOblock-treated db / db mice represented by Formula 2. FIG.
67 shows the ratio of heart weight to body weight (indicator of cardiac hypertrophy).
Figure 68 detects cardiac fibrosis (blue staining) by Masson-trichrome staining of myocardial tissue (scalebar = 100 μm).
69 Quantifies cardiac fibrosis following drug treatment.
70 shows myocardial cell images visualized by H & E staining.
71 is a measure of the width of myocardial cells following drug treatment.
FIG. 72 shows staining of apoptosis nuclei in cardiac tissues of rosiglitazone or ENOblock treated mice represented by Formula 2 (scalebar = 100 μm).
73 Quantify apoptotic cells of mouse heart tissue following drug treatment.
Figure 74 shows the results of Western blot analysis of caspase-3, cleaved caspase-3 (Asp175), PARP and cleaved PARP in the heart tissue of rosiglitazone or ENOblock treated mice represented by Formula 2. At this time, age-matched B6 mice were used as controls.
FIG. 75 quantifies the expression of cleaved caspase-3 (Asp175) versus α-tubulin in cardiac tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 76 quantifies the expression of cleaved PARP relative to α-tubulin in the heart tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2.
77 to 80 show the results of analyzing the mRNA of Gata-4, Glut-4, Irap, and a-MHC, which are indicators of cardiac function, in rosiglitazone or ENOblock-treated mice represented by the formula (2).
81 to 84 show the results of analyzing mRNAs of cardiac pathological markers Kcnk-1, Asah-2, B4glant and MMP-3 in rosiglitazone or ENOblock-treated mice represented by the formula (2).
FIG. 85 shows kidney weight of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
86 is a measurement of fibrosis (dyeing in blue) by staining kidney tissue by Masson-trichrome staining.
FIG. 87 quantifies the accumulation of interstitial ECM components in ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 88 shows staining of apoptotic nuclei in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2 (scalebar = 100 μm). FIG.
FIG. 89 quantifies apoptosis cells in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
90 shows the results of Western blot analysis of caspase-3, cleaved caspase-3 (Asp175), PARP, and cleaved PARP in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG. At this time, age-matched B6 mice were used as controls.
FIG. 91 quantifies the expression of cleaved caspase-3 (Asp175) versus α-tubulin in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 92 quantifies the cleaved PARP expression relative to α-tubulin in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2.
93 to 96 analyze the expression levels of angiotensin, Bax and p53 , which are apoptosis markers, and Pck-1 (cytoplasm) associated with positive regulation of glucose neosynthesis in renal tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2; It is.
97 to 99 are measured the expression of Col4a1 , Col4a2 and Col4a3 in the kidney tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by the formula (2).
FIG. 100 illustrates the analysis of enolase protein expression in cytosolic and nuclear cells in hepatocytes after treatment with the ENOblock represented by Formula 2. FIG.
Figure 101a shows the results of Western blot analysis of α-SMA in liver tissue of db / db mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2). At this time, age-matched B6 mouse strain was used as a control.
101B quantifies the expression of α-SMA normalized to GAPDH.
Figure 102 depicts a compound treatment protocol in adipose progenitor cells derived from white adipose tissue.
Figure 103 shows the expression of adipogenic regulatory genes following the treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by the formula (2).
Figure 104 shows the expression of oxidative phosphorylation regulatory genes following the treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by the formula (2).
105 shows expression of a gene for regulating heat production following treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by Formula 2. FIG.
106 depicts a compound pretreatment protocol in adipocytes of white adipose tissue undergoing adipocyte differentiation.
Figure 107 shows the expression of adipose-producing regulatory genes for differentiating adipocytes following treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by the formula (2).
108 shows expression of oxidative phosphorylation regulatory genes following treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by Formula 2. FIG.
Figure 109 shows the expression of heat production regulatory genes according to the treatment of forskolin, rapamycin or ENOblock represented by the formula (2).
110 depicts a protocol for treating compounds with differentiated supercultured white adipocytes.
111 shows the expression of adipogenic regulatory genes after treatment of differentiating adipocytes with forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by Formula 2. FIG.
112 shows expression of oxidative phosphorylation regulatory genes following treatment with forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by Formula 2. FIG.
113 shows the expression of a gene for regulating heat production following treatment with forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by formula (2).
114 depicts a protocol for treating compounds on brown adipocytes isolated from brown adipose tissue (BAT).
FIG. 115 shows the expression of adipose-producing regulatory genes for differentiating adipocytes following treatment of forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by Formula 2. FIG.
Figure 116 shows the expression of oxidative phosphorylation regulatory genes following the treatment of forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by the formula (2).
Figure 117 shows the expression of heat production regulatory genes according to the treatment of forskolin, rapamycin, ENOblock or NaF represented by the formula (2).
Figure 118 is shown using TMRE to visualize the mitochondrial membrane potential of ENOblock, NaF, forskolin or rapamycin-treated 3T3-L1 adipocytes and brown adipocytes represented by the formula (2).
Figure 119 shows the quantification of mitochondrial membrane potential of ENOblock, NaF, forskolin or rapamycin-treated 3T3-L1 adipocytes represented by the formula (2).
FIG. 120 shows the use of TMRE to visualize the mitochondrial membrane potential of ENOblock, NaF, forskolin or rapamycin-treated 3T3-L1 white adipocytes represented by Formula 2. FIG.
121 is a quantification of the mitochondrial membrane potential of ENOblock, NaF, forskolin or rapamycin-treated white adipose precursor cells represented by the formula (2).
122 is a quantification of the mitochondrial membrane potential of ENOblock, NaF, forskolin or rapamycin-treated brown fat precursor cells represented by the formula (2).
FIG. 123 shows the result of treatment of 3T3-L1 white adipose precursor cells with ENOblock, forskolin or rapamycin represented by Formula 2 and oil red O staining.
124 shows the quantification of the oil red O staining results of ENOblock, forskolin or rapamycin-treated white adipose precursor cells represented by Formula 2. FIG.
125 is a chemical structure of an ENOblock represented by Formula 2. FIG.
126 is a schematic diagram of an ENOblock treatment protocol represented by Formula 2 in high fat diet (HFD) mice.
127 shows the appearance of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2 for 8 weeks.
FIG. 128 is an abdominal anatomy photograph (indicated by a white arrow) showing visceral adipose tissue of an ENOblock or rosiglitazone treated HFD mouse represented by Formula 2. FIG.
129 shows changes in ENOblock or rosiglitazone treated HFD mice represented by Formula 2. FIG.
130 shows the feed intake of ENOblock or rosiglitazone treated HFD mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 131 shows rectum body temperature of a mouse during ENOblock or rosiglitazone treatment represented by Chemical Formula 2. FIG.
132 shows fasting blood glucose levels of HFD mice at 4, 6 and 8 weeks after treatment with ENOblock and rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
133 and 134 show measured glucose tolerance test (GTT) and area under curve (AUC) for HFD mice after 4 weeks of treatment with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2).
135 and 136 show the measurement of insulin resistance test (ITT) and AUC for HFD mice after 5 weeks of ENOblock or rosiglitazone treatment represented by the formula (2).
137 and 138 show insulin serum concentrations and insulin resistance levels of HFD mice after 8 weeks of ENOblock or rosiglitazone treatment represented by Formula 2.
139 and 140 show pyruvate resistance test (PTT) and area under curve (AUC) for HPD mice after 7 weeks of ENOblock or rosiglitazone treatment represented by Formula 2 to determine glucose neosynthesis levels.
141 is a liver photograph of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG. As a control, SFD (Standard fat diet) livers of the same age are shown together.
142 shows the liver weight of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
143 shows the serum concentration of alanine aminotransferase (ALT) of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
144 is oil red O staining to visualize lipid accumulation in liver tissue of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
145 is a quantification of lipid accumulation in HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 146 is H & E stained to visualize steatosis of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
147 is a quantification of liposis of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
148 is Masson-Trichrome stained to visualize liver tissue fibrosis (blue) of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
149 shows quantification of fibrosis of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 150 shows α-SMA immunostaining for detection of hepatic stellate cells of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone.
Figure 151 shows the quantification of hepatic stellate cell numbers in HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2).
152 shows qPCR analysis of α-SMA expression in HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
153 shows the expression of α-SMA in liver of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2 by Western blot analysis.
154 and 155 show the results of ELISA analysis of inflammatory markers TNF-α and IL-6 in livers of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
Figure 156 evaluates the expression of inflammatory markers IL-6, TNF-α and S100a9 in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2).
FIG. 157 analyzes the expression of Srebp-1a and Srebp-1c, which are lipid homeostatic regulators, in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 158 analyzes the expression of Amfr, Insig-1, and Insig-2 modulators that regulate Srebp protein in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
159 shows the expression of Scap and Abcg5, the LXR target genes, in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 160 shows expression of Pck-1 and Pck-2 that regulate glucose neosynthesis in liver tissue of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
161 shows the expression of Adipoq, Ap2, Ppar-γ, Retn, and Cebpa, which are fat production regulators, in liver tissues of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
162 shows expression of inflammatory markers IL-6, TNF-α, Cd11c, Tlr-4, and Nptx2 in the hippocampus of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
Figure 163 shows the expression of energy status sensors Creb and mitochondrial biosynthesis regulators Tfam, Nrf1 and Nrf2 in the hippocampus of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2).
Figure 164 shows the mitochondrial DNA content in the hippocampus of mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by formula (2).
165 shows Nissl staining results of neurons in CA1, CA2 and CA3 regions of mouse hippocampus treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG. At this time, attention should be paid to the disorderly arranged neural structure in the CA1 region of rosiglitazone treated mice.
166 to 168 measure the serum levels of triglycerides, HDL and LDL cholesterol in ENOblock or rosiglitazone treated HFD mice represented by formula (2).
FIG. 169 shows the white adipose tissue of the dissected germline of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
Figure 170 shows the white adipose tissue weight of the gonad of the ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by the formula (2).
171 shows H & E staining of adipose tissue of the gonad to visualize adipocyte size of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
172 is a measure of the fat cell width of the ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by the formula (2).
Figure 173 shows the fat cell area (beige) in white adipose tissue of the gonads stained with H & E from ENOblock treated HFD mice represented by Formula 2 (indicated by white arrows).
FIG. 174 shows qPCR analysis of inflammatory markers TNF-α, Cd11c and Mcp-1 and master fat production regulator Ppar-γ in the white adipose tissue of the gonad of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2.
175 is a representative photograph of brown adipose tissue between the scapula of the ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
176 shows the brown adipose tissue (BAT) weight between the scapula of the ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 177 is H & E staining of brown adipose tissue between scapula of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2 to visualize fatty liver size.
Figure 178 shows the expression of inflammatory markers and fat production regulators that differentiate differentiation progenitor cells according to the treatment of ENOblock or rosiglitazone represented by the formula (2).
179 illustrates expression of a heat generation regulatory gene following treatment with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
FIG. 180 is Masson-Trichrome stained to visualize fibrosis in brown adipose tissue of ENOblock or rosiglitazone treated mice represented by Formula 2. FIG.
FIG. 181 shows quantification of fibrosis in brown adipose tissue of HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone represented by Formula 2. FIG.
182 depicts the ENOblock or metformin treatment protocol represented by Formula 2 in HFD mice.
183 is an anatomical photograph showing visceral adipose tissue (white arrow) of an ENOblock or metformin-treated HFD mouse represented by Formula 2. FIG.
Figure 184 shows the mouse body weight during the ENOblock or metformin treatment represented by the formula (2).
Figure 185 shows the fasting blood glucose level of HFD mice at 4 and 6 weeks of ENOblock or metformin treatment represented by the formula (2).
186 and 187 show the blood glucose tolerance test (GTT) and the area under the curve (AUC) for HFD mice after 4 weeks of ENOblock or metformin treatment represented by Formula 2.
188 and 189 show the insulin resistance test (ITT) and the area under the curve (AUC) after 5 weeks of treatment with ENOblock or metformin represented by the formula (2).
190 and 191 show pyruvic acid resistance test (PTT) and area under curve (AUC) after 7 weeks of treatment with ENOblock or metformin represented by Formula 2.
192 and 193 show insulin serum concentration and insulin resistance in ENOblock or metformin-treated HFD mice represented by Formula 2. FIG.
194 is a photograph of white adipose tissue of the dissected germline of an ENOblock or metformin treated mouse represented by Formula 2. FIG.
Figure 195 is a measure of the white adipose tissue weight of the gonads in the ENOblock or metformin-treated mice represented by the formula (2).
196 shows flow cytometry (FACs) of white adipose tissue-induced inflammatory cells stained with antibodies to the plate macrophage marker CD68 (macrosialin) and the M2 anti-inflammatory macrophage marker CD206 (mannose receptor).
Figure 197 is a quantification of M2-type macrophages in the white adipose tissue inflammation group from ENOblock or metformin treated mice represented by the formula (2).
198 and 199 illustrate the therapeutic effect of ENOblock represented by Formula 2 on the progression of obesity caused by a high fat diet.

본 명세서에서 언급하고 있는 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진계 화합물이다:ENOblock referred to herein is a triazine-based compound represented by Formula 1:

<화학식 1><Formula 1>

이는 해당과정 경로의 한 구성요소인 에놀라제에 직접 결합하여 이의 활성을 감소시키는 비-기질성 유사체이다. 상기 화학식 1에서, R1은 H이고; R2는 H, -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 1-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 1-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p 및 q는 각각 0-5의 정수이고, 상기 m은 1-5의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 q는 각각 1-5의 정수이고, 상기 p는 0-5의 정수이다)이다.It is a non-substrate analog that binds directly to enolase, a component of the glycolytic pathway, and reduces its activity. In Formula 1, R 1 is H; R2 is H,-(CH2) q- (CONH) -C1-5 linear or branched alkyl (where q is an integer of 1-5),-(CH2) q- (CONH) -C1-5 linear or Branched alkyl alcohols (where q is an integer of 1-5),-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p and q are respectively) Is an integer of 0-5, and m is an integer of 1-5) or-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-CH3 (where m, n and q are Each is an integer of 1-5, and p is an integer of 0-5).

또한, 상기 ENOblock은 하기 화학식 2로 표시되는 트리아진계 화합물(N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[[4-[(cyclohexylmethyl)amino]-6-[[(4-fluorophenyl)methyl]amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-benzeneacetamide hydrochloride)일 수 있다:In addition, the ENOblock is a triazine-based compound represented by the following formula (N- [2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] -4-[[4-[(cyclohexylmethyl) amino] -6-[[ (4-fluorophenyl) methyl] amino] -1,3,5-triazin-2-yl] amino] benzenebenzenetamide hydrochloride):

<화학식 2><Formula 2>

본 발명은 일 측면으로, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention in one aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity comprising ENOblock as an active ingredient.

비만은 체내에 지방 조직이 과다하게 축적된 상태를 의미한다. 본 발명의 일실시 예에서는, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 지질 축적, 지방 세포 크기, 내장 지방 및 체중의 감소를 확인함으로써, ENOblock의 비만 치료 가능성을 확인하였다.Obesity is a condition in which the body has an excessive accumulation of adipose tissue. In one embodiment of the present invention, by confirming the reduction of lipid accumulation, adipocyte size, visceral fat and weight in ENOblock treated T2DM and HFD mice, the possibility of treating obesity of ENOblock was confirmed.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis comprising ENOblock as an active ingredient.

섬유증은 재생(reparative)이나 반응 과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것을 의미한다. 상기 섬유증은 간섬유증, 신장섬유증, 심근섬유증 및 심장섬유증으로 구성된 항목으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 섬유화 관련 유전자의 발현이 감소됨을 확인함으로써, ENOblock의 섬유증 치료 가능성을 확인하였다.Fibrosis refers to the formation of excess fibrous connective tissue in organs or tissues during reparative or reaction processes. The fibrosis may be any one selected from the items consisting of liver fibrosis, kidney fibrosis, myocardial fibrosis and cardiac fibrosis. By confirming the decreased expression of fibrosis related genes in ENOblock treated T2DM and HFD mice, the possibility of treating fibrosis of ENOblock was confirmed.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver, comprising ENOblock as an active ingredient.

지방간은 간 세포 속에 지방이 축적된 상태를 의미한다. 본 발명은 일 실시예에서, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스의 간에서 지방증이 감소됨을 확인함으로써, ENOblock의 지방간 치료 가능성을 확인하였다.Fatty liver refers to the accumulation of fat in liver cells. In one embodiment, the present invention confirmed the possibility of treatment of fatty liver of ENOblock by confirming that the fatosis in the liver of ENOblock-treated T2DM and HFD mice was reduced.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, comprising ENOblock as an active ingredient.

상기 당뇨병은 제2형 당뇨병(diabetes mellitus type 2, T2DM)일 수 있다. 제2형 당뇨병은 충분한 양의 인슐린이 체내에서 분비되지 않거나, 세포가 인슐린에 반응하지 않는 인슐린 저항성으로 인해 발생하는 질병이다. 본 발명의 일 실시예에서는, ENOblock 처리된 당뇨 마우스(T2DM)와 비만 마우스(HFD)에서 인슐린 저항성이 억제되어 체내 혈당이 감소됨을 확인함으로써, ENOblock의 당뇨병 치료 가능성을 확인하였다.The diabetes may be diabetes mellitus type 2 (T2DM). Type 2 diabetes is a disease caused by insulin resistance in which a sufficient amount of insulin is not secreted in the body or the cells do not respond to insulin. In one embodiment of the present invention, ENOblock-treated diabetic mice (T2DM) and obese mice (HFD) by inhibiting the insulin resistance was confirmed that the body blood glucose is reduced, thereby confirming the possibility of ENOblock diabetes treatment.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 당뇨 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic complications comprising ENOblock as an active ingredient.

당뇨 합병증은 혈당 농도가 정상보다 높게 유지됨으로 인해 체내에 여러 대사 장애를 유발하여 발생할 수 있다. 상기 당뇨 합병증은 당뇨성 신장병, 당뇨성 간 장애, 당뇨성 심장질환, 당뇨성 뇌병증, 당뇨성 혈관합병증, 및 당뇨성 신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스의 간, 심장, 신장 및 해마 조직에서 조직의 손상, 섬유화 및 아폽토시스의 감소를 확인함으로써, ENOblock의 당뇨 합병증 치료 가능성을 확인하였다. Diabetes complications can occur due to various metabolic disorders in the body due to the maintenance of blood glucose levels above normal. The diabetic complication may be at least one selected from the group consisting of diabetic nephropathy, diabetic liver disorder, diabetic heart disease, diabetic encephalopathy, diabetic angiopathy, and diabetic neuropathy. In one embodiment of the present invention, the possibility of treating diabetic complications of ENOblock was confirmed by identifying tissue damage, fibrosis and reduced apoptosis in liver, heart, kidney and hippocampal tissues of ENOblock treated T2DM and HFD mice.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia comprising ENOblock as an active ingredient.

고지혈증은 필요 이상으로 많은 지방 성분 물질이 혈액 내에 존재하면서 혈관벽에 쌓여 염증을 일으키고 심혈관계 질환을 일으키는 상태를 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 지질 축적이 억제되고 트리글리세리드 및 LDL 콜레스테롤 수치가 감소됨을 확인함으로써, ENOblock의 고지혈증 치료 가능성을 확인하였다.Hyperlipidemia is a condition in which more fatty substances are present in the blood and accumulated on the walls of blood vessels, causing inflammation and cardiovascular disease. In one embodiment of the present invention, the possibility of treating hyperlipidemia of ENOblock was confirmed by confirming that lipid accumulation is suppressed and triglyceride and LDL cholesterol levels are reduced in ENOblock treated T2DM and HFD mice.

또한, 본 발명은 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease, comprising ENOblock as an active ingredient.

퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 피크(Pick) 질환 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob) 질환을 포함한다. 본 발명은 일 실시예에서, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 해마 염증 마커의 발현이 감소됨을 확인함으로써, ENOblock의 퇴행성 뇌질환 치료 가능성을 확인하였다.Degenerative brain diseases include stroke, stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease or Creutzfeld-Jakob's disease. In one embodiment, the expression of hippocampal inflammatory markers was reduced in ENOblock-treated T2DM and HFD mice, thereby confirming the possibility of treatment of degenerative brain disease of ENOblock.

본 발명에 따른 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 조성물은 c-Myc, Erbb2, Cox-2, α-SMA, Col6a3, cleaved-caspase-3, cleaved PARP, angiotensin, Bax, p53, IL-6, TNF-α, Mcp-1, Cd11c, Tlr4, Nptx2, Pck-1, Scap, Abcg5, Ap2, Agt, Adipoq, Ppar-γ, Retn, Cebpa, Cebpb, Kcnk1, Asah2, B4glant, Mmp-3, Col4a3, Nrf1, Cpt1b, Cox8b, Srebp-1a, Srebp-1c 또는 Insig-2로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자를 하향 조절할 수 있다.The composition comprising the ENOblock according to the invention as an active ingredient c-Myc, Erbb2, Cox-2, α-SMA, Col6a3, cleaved-caspase-3, cleaved PARP, angiotensin, Bax, p53, IL-6, TNF- α, Mcp-1, Cd11c, Tlr4, Nptx2, Pck-1, Scap, Abcg5, Ap2, Agt, Adipoq, Ppar-γ, Retn, Cebpa, Cebpb, Kcnk1, Asah2, B4glant, Mmp-3, Col4a3, Nrf1, At least one gene selected from the group consisting of Cpt1b, Cox8b, Srebp-1a, Srebp-1c or Insig-2 can be down regulated.

본 발명의 일 실시예에서는, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 에놀라제 타겟 유전자인 c-Myc, Erbb2 또는 Cox-2의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 에놀라제 활성을 감소시킴을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, by confirming that the expression of the enolase target genes c-Myc, Erbb2 or Cox-2 is suppressed in ENOblock treated T2DM and HFD mice, it was confirmed that ENOblock reduced enolase activity. It was.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 섬유화 관련 유전자인 α-SMA 또는 Col6a3의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 조직의 섬유화를 억제함을 확인하였다.In addition, it was confirmed that the expression of fibrosis-related genes α-SMA or Col6a3 was suppressed in ENOblock-treated T2DM and HFD mice, thereby confirming that ENOblock inhibited fibrosis of tissues.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 아폽토시스 유전자인 cleaved-caspase-3, cleaved PARP, angiotensin, Bax 또는 p53와 산화적 인산화 유전자인 Nrf1, Cpt1b 또는 Cox8b의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 세포의 사멸을 억제함을 확인하였다.In addition, ENOblock inhibited the expression of apoptosis genes cleaved-caspase-3, cleaved PARP, angiotensin, Bax or p53 and oxidative phosphorylation genes Nrf1, Cpt1b or Cox8b in ENOblock treated T2DM and HFD mice. It was confirmed to inhibit death.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 염증 유전자인 IL-6, TNF-α, Mcp-1, Cd11c, Tlr4 또는 Nptx2의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 조직의 염증을 억제함을 확인하였다.In addition, it was confirmed that the expression of the inflammatory genes IL-6, TNF-α, Mcp-1, Cd11c, Tlr4 or Nptx2 is suppressed in ENOblock-treated T2DM and HFD mice, thereby inhibiting tissue inflammation.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 글루코오스 신생 합성 유전자인 Pck-1의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 혈당 증가를 억제함을 확인하였다.In addition, it was confirmed that ENOblock inhibited the increase in blood glucose by confirming that the expression of Pck-1, a glucose neosynthesis gene, was inhibited in ENOblock-treated T2DM and HFD mice.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 스테롤 조절 유전자인 Scap 또는 Abcg5와 지질 합성 유전자인 Srebp-1a, Srebp-1c 또는 Insig-2의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock의 지질 생성 및 축적 감소와 간지방증 및 고지혈증 치료 가능성을 확인하였다.In addition, ENOblock-treated T2DM and HFD mice inhibited the expression of the sterol regulatory gene Scap or Abcg5 and the lipid synthesis genes Srebp-1a, Srebp-1c or Insig-2, thereby reducing lipid production and accumulation of ENOblock and The possibility of treatment of proof and hyperlipidemia was confirmed.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 지방 생성 유전자인 Ap2 , Agt, Adipoq , Ppar -γ, Retn , Cebpa 또는 Cebpb의 발현이 억제됨을 확인함으로써, ENOblock이 지방 생성을 억제함을 확인하였다.In addition, it was confirmed that ENOblock inhibited fat production by confirming that the expression of the apoptosis genes Ap2 , Agt, Adipoq , Ppar- γ, Retn , Cebpa or Cebpb in ENOblock-treated T2DM and HFD mice was suppressed.

또한, ENOblock 처리된 T2DM 및 HFD 마우스에서 심장질환 관련 유전자인 Kcnk1, Asah2 , B4glant 또는 Mmp - 3와 사구체 신염 유전자인 Col4a3의 발현이 억제됨을 확인함으로서, ENOblock의 심장질환 및 신장 질환의 치료 가능성을 확인하였다.In addition, it was confirmed that the expression of Kcnk1, Asah2 , B4glant or Mmp - 3 and glomerulonephritis gene Col4a3 , which is a cardiac disease related gene, was suppressed in T2DM and HFD mice treated with ENOblock . It was.

또한, 본 발명에 따른 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 조성물은 지방 세포 분화를 억제할 수 있고, 인슐린 저항성 및 과인슐린혈증을 억제할 수 있다.In addition, the composition comprising the ENOblock according to the present invention as an active ingredient can inhibit fat cell differentiation, and can inhibit insulin resistance and hyperinsulinemia.

한편, 본 발명에 따른 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 조성물은 열 생성 유전자인 Ucp-1 또는 Ucp-3의 발현을 상향 조절할 수 있다.On the other hand, the composition comprising the ENOblock according to the invention as an active ingredient can upregulate the expression of heat generating genes Ucp-1 or Ucp-3 .

본 발명의 ENOblock을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 ENOblock을 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.Compositions comprising the ENOblock of the present invention as an active ingredient, containing 0.1 to 99.9% by weight of the ENOblock as an active ingredient relative to the total weight of the composition, may comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다.The compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.

경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내로 투여될 수 있다.The compositions of the present invention may be administered orally or parenterally, and may be administered externally or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrauterine dural or cerebrovascular.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 ENOblock의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.The dosage of the composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient, the daily dosage is based on the amount of ENOblock It is preferably 0.01 to 1000 mg / kg, preferably 0.1 to 100 mg / kg, it may be administered 1 to 6 times a day.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.

또한, 본 발명은 ENOblock을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만, 섬유증, 지방간, 당뇨 합병증, 고지혈증 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preventing or treating any one disease selected from the group consisting of obesity, fibrosis, fatty liver, diabetic complications, hyperlipidemia and degenerative brain diseases, comprising administering ENOblock to a subject.

또한,　본 발명은 비만,　섬유증,　지방간,　당뇨 합병증,　고지혈증 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하기 위한 상기　ENOblock을 유효성분으로 포함하는 약학적　조성물의 용도를 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the above-mentioned ENOblock as an active ingredient for preventing or treating any one disease selected from the group consisting of obesity, fibrosis, fatty liver, diabetes complications, hyperlipidemia and degenerative brain disease. to provide.

또한,　본 발명은 비만,　섬유증,　지방간,　당뇨 합병증,　고지혈증 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적　조성물의 제조하는데 있어서,　ENOblock의　용도를 제공한다.The present invention also provides the use of ENOblock in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating any one disease selected from the group consisting of obesity, fibrosis, fatty liver, diabetic complications, hyperlipidemia and degenerative brain diseases. .

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples and Experimental Examples. However, the following Examples and Experimental Examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

I. 제2형 당뇨병 마우스 모델에서 I. In Type 2 Diabetic Mouse Models ENOblock의Of ENOblock 효과 확인 Check the effect

실시예Example 1. 시약 및 항체 1. Reagents and Antibodies

화학식 2로 표시되는 ENOblock (N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[[4-[(cyclohexylmethyl)amino]-6-[[(4-fluorophenyl)methyl]amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-benzeneacetamide hydrochloride)는 포항공과대학교의 장영태 교수와 광주과학기술원의 안진희 교수가 제공하였다. 로지글리타존(Rosiglitazon)은 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하였다. NaF, oil red O 및 lipopolysaccharide(LPS)와 α-smooth muscle actin(카탈로그 번호 A5228)은 Sigma-Aldrich(MO, USA)에서 구입하였다.ENOblock (N- [2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] -4-] [[4-[(cyclohexylmethyl) amino] -6-[[(4-fluorophenyl) methyl] amino ] -1,3,5-triazin-2-yl] amino] -benzeneacetamide hydrochloride was provided by Professor Jang Young-tae of Pohang University of Science and Technology and Jin-hee Ahn of Gwangju Institute of Science and Technology. Rosiglitazon was purchased from Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). NaF, oil red O and lipopolysaccharide (LPS) and α-smooth muscle actin (catalog number A5228) were purchased from Sigma-Aldrich (MO, USA).

Cilostazol은 Enzo Life Science(NY, USA)에서 구입하였다. enolase(카탈로그 번호 sc271384), lamin B(카탈로그 번호 sc374015), pro-caspase-3(카탈로그 번호 sc7148) 및 α-tubulin(카탈로그 번호 sc53646)에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. histone H3, cleaved caspase-3(카탈로그 번호 cs-#9661) 및 PARP/cleaved PARP(카탈로그 번호 cs-#9542)에 대한 항체는 Cell Signaling(카탈로그 번호 #9715)에서 구입하였다. 또한, Nonident-P40(IGEPAL CA-630)은 Generay Biotech에서 구입하였다.Cilostazol was purchased from Enzo Life Science (NY, USA). Antibodies against enolase (catalog number sc271384), lamin B (catalog number sc374015), pro-caspase-3 (catalog number sc7148) and α-tubulin (catalog number sc53646) were purchased from Santa Cruz Biotechnology. Antibodies against histone H3, cleaved caspase-3 (catalog number cs- # 9661) and PARP / cleaved PARP (catalog number cs- # 9542) were purchased from Cell Signaling (catalog number # 9715). In addition, Nonident-P40 (IGEPAL CA-630) was purchased from Generay Biotech.

실시예Example 2. 세포배양 2. Cell Culture

NIH/3T3 생쥐의 섬유아세포, Huh7 인간 간세포, 3T3-L1 생쥐 지방선구세포 및 RAW 264.7 생쥐 대식세포는 한국 세포주 은행(KCLB)(서울대학교, 한국)에서 수득하였다. 상기 세포를 10% FBS, 50 units mL¹ 페니실린 및 50 mg mL¹ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 증식 배지에서 유지하였다.Fibroblasts, Huh7 human hepatocytes, 3T3-L1 mouse adipocytes and RAW 264.7 mouse macrophages from NIH / 3T3 mice were obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB) (Seoul National University, Korea). The cells were maintained in DMEM growth medium supplemented with 10% FBS, 50 units mL ¹ penicillin and 50 mg mL ¹ streptomycin.

실시예Example 3. 3. 동물 준비Animal preparation

실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 실험 동물 연구소 지침에 따라 동물 연구를 수행하였다. 또한, 동물 연구는 광주 과학 기술 연구소 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: GIST-2016-33)의 승인을 받았다. 생후 5주된 수컷 C57BL/Ksj-db/db 마우스를 Damool Science(대전, 한국)에서 구입하였다.Animal studies were performed according to the Laboratory Animal Laboratory Guidelines on the Care and Use of Laboratory Animals. In addition, animal studies were approved by the Gwangju Institute of Science and Technology Animal Care and Use Committee (approval number: GIST-2016-33). Five-week-old male C57BL / Ksj-db / db mice were purchased from Damool Science (Daejeon, Korea).

상기 마우스는 12h/12h light cycle로 유지하였다. 음식과 물은 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 환경 적응 기간 1주 후, 마우스를 실험에 사용하였다. 정상 배경 균주와 비교하기 위해서, 수컷 C57BL/6J 마우스를 Damool Science에서 구입하였고, 약물 처리된 C57BL/Ksj-db/db 마우스와 비교하기 위해서 연령을 일치시켰다.The mice were maintained at 12h / 12h light cycle. Food and water were free to eat. One week after the environmental adaptation period, mice were used for the experiment. Male C57BL / 6J mice were purchased from Damool Science for comparison with normal background strains and age matched for comparison with drug treated C57BL / Ksj-db / db mice.

ENOblock의 항-고혈당 효과를 평가하기 위한 단기 시험을 위해, 쥐를 무작위적으로 10마리씩 3그룹으로 나누었다. 10% DMSO를 함유한 식염수, rosiglitazone(8 mg/kg의 농도, 10% DMSO를 함유한 식염수), ENOblock(8 mg/kg의 농도, 10% DMSO를 함유한 식염수)를 복강 내 주사(용액 용량= 10 μL/g)로 주입하고, 혈당 수준을 0 시간 시점에서 즉시 측정 하였다. 1, 3, 6, 12 및 24시간 후 모든 쥐의 혈당 수치를 측정하였다.For short-term trials to evaluate the anti-hyperglycemic effect of ENOblock, rats were randomly divided into three groups of ten animals. Intraperitoneal injection of saline with 10% DMSO, rosiglitazone (concentration of 8 mg / kg, saline containing 10% DMSO), and ENOblock (concentration of 8 mg / kg, saline containing 10% DMSO) (solution dose) = 10 μL / g) and blood glucose levels were measured immediately at the 0 hour time point. Blood glucose levels of all mice were measured after 1, 3, 6, 12 and 24 hours.

ENOblock 처리 7주 후의 연구를 위해, db/db 마우스를 무작위로 10마리씩 3그룹으로 나누었다. 10% DMSO를 함유한 식염수, rosiglitazone(8 mg/kg의 농도, 10% DMSO를 함유한 식염수), ENOblock(8 mg/kg, 12 mg/kg의 농도, 10% DMSO를 함유한 식염수)를 복강 내 주사(용액 용량 = 10 μL/g)로 매 24시간 마다 주입했다. 7주간의 약물 처리기간도안 매 48시간마다 혈당 모니터링을 수행했다(약물 처리 6시간 후 수행). OneTouch Ultra (LifeScan, CA, USA)를 사용하여 혈당을 측정했다.For the study 7 weeks after ENOblock treatment, db / db mice were randomly divided into 3 groups of 10 animals. Intraperitoneally with saline containing 10% DMSO, rosiglitazone (concentration of 8 mg / kg, saline containing 10% DMSO), ENOblock (concentration of 8 mg / kg, 12 mg / kg, saline containing 10% DMSO) Inject every 24 hours by intra injection (solution dose = 10 μL / g). Blood glucose monitoring was performed every 48 hours during the 7 week drug treatment period (6 hours after drug treatment). Blood glucose was measured using OneTouch Ultra (LifeScan, CA, USA).

7주 후, 쥐는 diethyl ether로 마취하여 심장에서 혈액을 채취했고 신장, 간, 지방 조직을 수확했다. 수집된 혈액은 응고시키기 위해 15분간 1.5 mL 튜브에 보관하였다. 4℃에서 10분 동안 1500 g에서 원심 분리하여 혈병(blood clot)을 제거하였다. 상등액을 50 μL씩 나누어 -80℃에서 보관하였다. 수확된 조직은 PBS로 2회 세척하고 -80℃에서 보관했다. 블라인드 테스트 방식으로 Real-time PCR, 섬유증 염색법, 세포 사멸 분석 및 에놀라제 활성 분석과 같은 조직 분석을 수행하였다.Seven weeks later, rats were anesthetized with diethyl ether to draw blood from the heart and harvested kidney, liver and adipose tissue. Collected blood was stored in 1.5 mL tubes for coagulation for 15 minutes. Blood clot was removed by centrifugation at 1500 g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was stored at −80 ° C. in 50 μL portions. Harvested tissues were washed twice with PBS and stored at -80 ° C. Tissue analyzes such as real-time PCR, fibrosis staining, apoptosis assay and enolase activity assay were performed by blind test method.

실시예Example 4. 4. 조직 group 포매Embedding (embedding) 및 절단(embedding) and cutting

조직을 PBS로 2회 세척하고 건조시킨 후 cryo-mold에 넣고 OCT(Leica, Germany)로 완전히 덮었다. OCT 포매된 샘플을 액체 질소상에서 부유시켜 급속 동결시키고 이소프로판올 슬러리에 넣었다. 동결된 블록을 절편까지 -80℃에서 더 보관하였다. 모든 섹션은 -25℃에서 라이카 CM 1850 저온 유지 장치를 이용하여 제작하였다.The tissues were washed twice with PBS, dried and then placed in cryo-mold and completely covered with OCT (Leica, Germany). The OCT embedded sample was suspended on liquid nitrogen and rapidly frozen and placed in an isopropanol slurry. Frozen blocks were further stored at −80 ° C. until sections. All sections were made using Leica CM 1850 cryostat at -25 ° C.

실시예Example 5. 5. 심장 Heart 근세포Myocytes 폭의 평가 Evaluation of width

각 처리군의 5마리 생쥐의 냉동 심장 조직을 8 μm 깊이로 절단하고, 3.7% 포름 알데히드 용액을 사용하여 고정시켰다. 심장 근세포의 폭을 측정하기 위해 Hematoxylin과 eosin(H & E) 염색을 시행하였다. 근세포 폭은 Aperio ImageScope(Leica Biosystems, Germany)를 사용하여 평행 근세포 덩어리가 있는 심근 부위에서 측정하였다. 각 심장에서 30 내지 47개의 근육 세포가 측정되었다.Frozen cardiac tissue from 5 mice of each treatment group was cut to 8 μm depth and fixed using 3.7% formaldehyde solution. Hematoxylin and eosin (H & E) staining were performed to measure the width of heart muscle cells. Myocyte width was measured in the myocardium region with parallel myocyte masses using Aperio ImageScope (Leica Biosystems, Germany). 30-47 muscle cells were measured in each heart.

실시예Example 6. 6. 핵 단백질의Nuclear protein 추출 extraction

세포를 배양하고 10 cm 접시에서 관심 화합물로 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 세포질 추출 완충액(10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5% nonident-P40(핵 막을 파괴하지 않는 IGEPAL CA-630) 및 프로테아제 억제제 칵테일). 얼음으로 5분 인큐베이션한 후 4℃에서 3000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 세포를 긁어서 수거 하였다. 상등액을 버리고 세포 펠렛을 세제가 함유되지 않은 세포질 추출 완충액으로 2회 세척하였다.Cells were cultured and treated with compounds of interest in 10 cm dishes. After treatment, cells were washed with PBS and cytoplasmic extraction buffer (10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5% nonident-P40 (IGEPAL CA-630, which does not destroy nuclear membrane) and protease inhibitor cocktails). After 5 minutes incubation with ice, the cells were collected by scraping the cells by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded and the cell pellet was washed twice with detergent-free cytoplasmic extraction buffer.

핵 추출 버퍼(20 mM Hepes pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 25 % 글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일)의 펠렛 만큼의 볼륨을 가한 후, 얼음에 15분간 담가놓았다. 핵 단백질을 4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하고 상등액을 수집하였다. 핵/세포질 분획화 키트(# K266-25, BioVision Incorporated, CA 95035, USA)를 사용하여 세포 및 조직으로부터 핵 단백질을 정제하였다.Volumes of pellets of nuclear extraction buffer (20 mM Hepes pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 25% glycerol and protease inhibitor cocktail) were added and then soaked in ice for 15 minutes. Nuclear proteins were centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. and supernatants were collected. Nuclear proteins were purified from cells and tissues using the Nuclear / Cytoplasmic Fractionation Kit (# K266-25, BioVision Incorporated, CA 95035, USA).

실시예Example 7. 7. 일차 배양 마우스 간세포 정제Primary Cultured Mouse Hepatocyte Purification

일차배양 마우스 간세포는 에놀라제 핵 내 전위 분석을 위해 10주령 수컷 C57BL/6J 마우스로부터 분리하였다. 간세포를 분리하기 위한 2단계 콜라게나제의 관류를 통한 효소분해 과정 거쳐 퍼콜 구배 방법을 추가하여 분리하였다. 10 mm FBS, 10 μM 덱사메타손, 100 nM 인슐린 및 1% Penicillin/Streptomycin이 보충된 DMEM 배지에 세포를 100 mm 직경 세포 배양 플레이트에서 2 x 10⁶의 밀도로 도말하였다.Primary culture mouse hepatocytes were isolated from 10 week old male C57BL / 6J mice for translocation analysis in enolase nuclei. After enzymatic digestion through perfusion of two-stage collagenase to separate hepatocytes, percol gradient was added. Cells were plated at a density of 2 × 10 ⁶ in a 100 mm diameter cell culture plate in DMEM medium supplemented with 10 mm FBS, 10 μM dexamethasone, 100 nM insulin and 1% Penicillin / Streptomycin.

실시예Example 8. 8. 에놀라제Enolase 활성 분석 Activity analysis

에놀라제 활성은 2-포스포-글리세레이트의 포스포-에놀-피루베이트(Enolase Activity Colorimetric Assay Kit, Biovision, CA, USA)로의 변형을 검출함으로써 시험하였다. 처리군당 6마리의 동물에서 3회씩 균질화된 간 조직(10 mg)을 조직-기반 분석에 사용하였다. 세포(2×10⁵)를 세포-기반 분석을 위해 3중으로 처리 하였다. 에놀라제 활성은 20분 후에 570 nm의 흡광도로 측정하였다.Enolase activity was tested by detecting the modification of 2-phospho-glycerate to phospho-enol-pyruvate (Enolase Activity Colorimetric Assay Kit, Biovision, CA, USA). Three homogenized liver tissues (10 mg) in 6 animals per treatment group were used for tissue-based analysis. Cells (2 × 10 ⁵ ) were treated in triplicate for cell-based analysis. Enolase activity was measured after 20 minutes with an absorbance of 570 nm.

실시예Example 9. 9. 세포 수준의 At the cellular level 에놀라제Enolase 핵 전위 분석 Nuclear potential analysis

100 mm 직경 세포 배양 플레이트(2×10⁶ 세포/플레이트)에 일차 배양 마우스 간세포는 72시간 동안 10 μM ENOblock 또는 0.1% DMSO와 DMEM 매체를 유지했다. Nuclear/Cytosol Fractionation Kit(Biovision Inc.)를 사용하여 핵 및 세포질 단백질을 분리하였다. 단백질 샘플을 웨스턴 블롯 분석을 위해 3개씩 준비하였다.Primary cultured mouse hepatocytes in 100 mm diameter cell culture plates (2 × 10 ⁶ cells / plate) retained 10 μM ENOblock or 0.1% DMSO and DMEM medium for 72 hours. Nuclear and cytoplasmic proteins were isolated using Nuclear / Cytosol Fractionation Kit (Biovision Inc.). Three protein samples were prepared for Western blot analysis.

실시예Example 10. 10. 생체 내 In vivo 에놀라제Enolase 핵 전위 분석 Nuclear potential analysis

C57BL/6J 마우스(8주령)에게 12 mg/kg ENOblock 포함된 식염수 + 10% DMSO 또는 식염수 + 10% DMSO 를 복강 내 주사 하였다(처리군 당 5마리). 24시간 후, 마우스를 희생시키고 간 조직을 적출하였다. Nuclear/Cytosol Fractionation Kit(Biovision Inc.)를 사용하여 핵 및 세포질단백질을 간 조직으로부터 분리하였다.C57BL / 6J mice (8 weeks old) were injected intraperitoneally with saline plus 10% DMSO or saline plus 10% DMSO containing 12 mg / kg ENOblock (5 per treatment group). After 24 hours, mice were sacrificed and liver tissue was removed. Nuclear and cytosolic proteins were separated from liver tissue using the Nuclear / Cytosol Fractionation Kit (Biovision Inc.).

실시예Example 11. 11. 웨스턴Weston 블롯Blot

30 내지 40 μg 단백질 샘플의 추출물을 10% 폴리 아크릴 아미드 겔에 로딩하고 전기 영동 후 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 사용된 1차 항체의 세부 사항은 실시예 1에 제공되었다. 검출은 HRP-접합 2차(항-마우스 IgG-HRP, sc2031, Santa Cruz Biotech)를 사용하여 수행하였다. 모든 1차 항체는 5% 탈지유가 함유된 TBS-T에서 1:1000 희석하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 2차 항체를 1:10,000으로 희석하여 실온(RT)에서 30분 동안 배양하였다.Extracts of 30-40 μg protein samples were loaded onto 10% polyacrylamide gels and transferred to nitro cellulose membranes after electrophoresis. Details of the primary antibody used are provided in Example 1. Detection was performed using HRP-conjugated secondary (anti-mouse IgG-HRP, sc2031, Santa Cruz Biotech). All primary antibodies were diluted 1: 1000 in TBS-T containing 5% skim milk and incubated overnight at 4 ° C. The secondary antibody was diluted 1: 10,000 and incubated for 30 minutes at room temperature (RT).

단백질의 농도는 Bradford 분석을 사용하여 측정하였다. 발현 신호는 ECL 솔루션 (RPN2232, GE Healthcare Life Science, UK)을 사용하여 시각화하였다. 밴드 Intensity는 ImageJ 1.45 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)로 측정하였고, 세포질 단백질에 대해서는 α- tubulin으로, 핵 추출에 대해서는 lamin-B를 사용하여 표준화하였다. 각 처리 그룹에서 5마리의 마우스의 조직으로부터의 단백질 샘플을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.Protein concentration was measured using Bradford assay. Expression signals were visualized using ECL solution (RPN2232, GE Healthcare Life Science, UK). Band Intensity was measured by ImageJ 1.45 software (National Institutes of Health, USA) and normalized using α-tubulin for cytoplasmic protein and lamin-B for nuclear extraction. Protein samples from the tissues of five mice in each treatment group were used for western blot analysis.

실시예Example 12. 12. 세포 및 조직으로부터 RNA의 분리Isolation of RNA from Cells and Tissues

제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 RNA를 수득하였다. 액체 질소로 동결된 조직을 RNA 추출 전에 유리 모르타르를 사용하여 분말로 분쇄하여 진행하였다.RNA was obtained using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. Tissue frozen with liquid nitrogen proceeded by grinding into powder using free mortar prior to RNA extraction.

실시예Example 13. 13. RT-RT- PCRPCR 및 정량 실시간  And quantitative real time PCRPCR

RNA는 제조사의 지시(Sigma-Aldrich, MO, USA)에 따라 TRI 시약을 사용하여 세포 또는 조직으로부터 추출하였다. 조직에서의 PCR 분석을 위해, 각 처리군에서 5마리의 마우스로부터 RNA를 분리하였다. RT-PCR을 위해 역전사(AccuPower® RT PreMix, Bioneer)에는 1 μg RNA와 100 pmole oligo dT16을 사용하였다. 2.5 μL RT 생성물을 PCR(AccuPower® PCR PreMix, Bioneer)에 사용하였다. 농도계 분석은 Scion Image 프로그램(Scion Corporation, USA)을 사용하여 수행하였다.RNA was extracted from cells or tissue using TRI reagents according to manufacturer's instructions (Sigma-Aldrich, Mo., USA). For PCR analysis in tissues, RNA was isolated from five mice in each treatment group. Reverse transcription (AccuPower® RT PreMix, Bioneer) used 1 μg RNA and 100 pmole oligo dT16 for RT-PCR. 2.5 μL RT product was used for PCR (AccuPower® PCR PreMix, Bioneer). Densitometer analysis was performed using the Scion Image program (Scion Corporation, USA).

정량 실시간 PCR의 경우, 관심 유전자의 전사체 수준을 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, UK)을 사용하여 분석하였다. 전체 RNA를 역전사하여 AccuPower® RT PreMix(Bioneer Corporation)를 사용하여 cDNA를 준비하였다. 얻은 cDNA는 다음의 변경을 통해 제조업자의 지시에 따라 실시간 PCR에 적용하였다.For quantitative real time PCR, transcript levels of genes of interest were analyzed using the StepOnePlus real time PCR system (Applied Biosystems, UK). Total RNA was reverse transcribed to prepare cDNA using AccuPower® RT PreMix (Bioneer Corporation). The obtained cDNA was subjected to real time PCR according to the manufacturer's instructions through the following changes.

특정 프라이머 각각의 200 nM(최종 농도)과 1 μg 의 total RNA로부터 합성된 cDNA의 1 μL를 함유하는 20 μL 2X Power SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, UK)의 총 부피에서 PCR을 3회 수행하였다. PCR 증폭은 혼합물을 95℃에서 10분간 인큐베이션한 후 증폭 단계를 40 사이클의 변성, 어닐링 및 연장으로 구성하였다. 변성은 95℃에서 15초 동안 수행하였고, 어닐링은 60 ℃에서 1분 동안 수행하였으며, 연장은 각 사이클 후에 72℃에서 형광 검출을 사용하여 72℃에서 20초 동안 수행하였다. 최종 사이클 후, 모든 샘플의 융점 분석은 연속 형광 검출을 사용하여 60 내지 95℃의 범위 내에서 수행하였다.Three PCRs were performed at a total volume of 20 μL 2X Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK) containing 200 nM (final concentration) of each of the specific primers and 1 μL of cDNA synthesized from 1 μg of total RNA. Was performed. PCR amplification consisted of incubating the mixture for 10 min at 95 ° C. and then amplifying the step with 40 cycles of denaturation, annealing and extension. Denaturation was performed at 95 ° C. for 15 seconds, annealing was performed at 60 ° C. for 1 minute, and extension was performed at 72 ° C. for 20 seconds using fluorescence detection at 72 ° C. after each cycle. After the last cycle, melting point analysis of all samples was performed in the range of 60-95 ° C. using continuous fluorescence detection.

특정 cDNA 샘플은 각 실행에 포함되어 실행간 비교를 위한 참조 자료로 사용하였다. β- actin 또는 18s rRNA의 발현 수준은 다른 모든 유전자의 발현 수준을 계산하여 표준화하는데 사용하였다. 결과는 각 유전자에 대한 상대적 발현 수준으로 표현하였다. 합성된 cDNA는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 또는 표준 PCR에 의해 증폭되었다. 이 실험에서 사용된 PCR 프라이머를 하기 표 1(서열번호 1 내지 70)에 나타내었다.Specific cDNA samples were included in each run and used as a reference for comparison between runs. Expression levels of β-actin or 18s rRNA were used to calculate and normalize the expression levels of all other genes. Results were expressed as relative expression levels for each gene. Synthesized cDNA was amplified by quantitative real time PCR (qRT-PCR) or standard PCR. PCR primers used in this experiment are shown in Table 1 (SEQ ID NOS: 1-70).

<표 1>TABLE 1

각각의 실험에서 mRNA 발현의 상대적 양을 측정하기 위해, 먼저 각 유전자의 ΔCT 값을 β-actin 또는 18S rRNA의 CT 값에 대비로 표준화하였다. 다음으로, 약물 처리된 샘플에서 각 유전자의 ΔCT 값을 비-처리 db/db 샘플 또는 정상 건강 대조군(B6, 실험군과 동일한 연령)에서 동일한 유전자의 ΔCT 값으로 추가로 정규화하여 ΔΔCT 값은 약물 처리된 샘플에서 대조군의 것과 비교된 각각의 유전자의 상대적인 발현을 계산하였다. 상대적 mRNA 발현 변화율은 최종적으로 2^{- 2ΔΔCT} 방법을 사용하여 계산하였다. 각 실험에서 최종 mRNA 발현은 3가지 독립적인 실험 세트의 평균값으로 계산하였다.To determine the relative amount of mRNA expression in each experiment, first the ΔCT values of each gene were normalized against the CT values of β-actin or 18S rRNA. Next, the ΔΔCT values were further normalized to the ΔCT values of the same genes in the non-treated db / db sample or normal health control group (B6, same age as the experimental group) in the drug-treated samples. Relative expression of each gene compared to that of the control in the sample was calculated. Relative mRNA expression rate of change is finally 2 ^were calculated using the method ^2ΔΔCT. Final mRNA expression in each experiment was calculated as the mean of three independent experimental sets.

실시예Example 14. 14. 혈청 유리 지방산(Serum free fatty acids ( FFAFFA ) 정량Quantification

혈액 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심 분리하고 혈청(상등액)을 새로운 튜브에 수집하고 FFA 분석 시점까지 -80℃에서 동결시켰다. FFA의 농도는 색도 검정 (OD 570 nm)을 사용하여 키트(카탈로그 #K612, BioVision, Inc.)를 사용하여 측정하였고, nmol/μl 또는 mM로 표시하였다. 처리군 당 6마리의 동물에서 혈청 샘플을 3번씩 사용하였다.Blood samples were centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes and serum (supernatant) collected in new tubes and frozen at −80 ° C. until the FFA assay. The concentration of FFA was measured using a kit (Catalog # K612, BioVision, Inc.) using the chromaticity assay (OD 570 nm) and expressed in nmol / μl or mM. Serum samples were used three times in 6 animals per treatment group.

실시예Example 15. 15. 혈청 알라닌 아미노 전이 효소(ALT) 활성 분석Serum Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Assay

혈청은 FFA 정량화에 대해 기술된 대로 준비하였다. 효소 활성은 nmol/mon/mL(=mU/mL)로 표시하였고, 키트(카탈로그 번호 #K752, BioVision, Inc.)에 의해 제공된 방법에 따라 분석하였다. 처리군 당 6마리의 동물에서 혈청 샘플을 3번씩 사용 하였다.Serum was prepared as described for FFA quantification. Enzyme activity was expressed in nmol / mon / mL (= mU / mL) and analyzed according to the method provided by the kit (Cat. No. # K752, BioVision, Inc.). Serum samples were used three times in six animals per treatment group.

실시예Example 16. 16. 혈청 HDL 및 LDL 콜레스테롤 수치 측정Determination of Serum HDL and LDL Cholesterol Levels

혈청 고밀도 지질단백질(HDL)과 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤은 HDL 및 LDL/VLDL 콜레스테롤 정량 색도 측정/형광 측정 키트(BioVision, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 비색 분석을 사용하였다. 처리군 당 5마리의 동물에서 혈청 샘플을 3번씩 사용하였다.Serum high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) cholesterol were measured using HDL and LDL / VLDL cholesterol quantitative chromatographic / fluorescence measurement kit (BioVision, CA, USA). Colorimetric analysis was used. Serum samples were used three times in five animals per treatment group.

실시예Example 17. 17. 간장의 지질 축적 및 지방증 측정Hepatic Lipid Accumulation and Lipidosis Measurement

간 지방 지질 축적은 육안으로 확인하였고, 오일 레드 O 염색법과 ImageJ 1.45s 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 오일 레드 O 염색을 위한 간 조직은 -25℃에서 저온 유지 장치(라이카 CM 1850)를 사용하여 8 μm 두께로 절편을 만들었다. 동결박편은 10분 동안 공기 건조시킨 다음 10% 포르말린 용액으로 고정시켰다. 이어서, 슬라이드를 흐르는 수돗물로 헹구고 60% 이소프로판올로 세척 하였다.Liver fat lipid accumulation was visually confirmed and measured using Oil Red O staining and ImageJ 1.45s software. Liver tissue for oil red O staining was sectioned to 8 μm thickness using a cryostat (Leica CM 1850) at -25 ° C. The frozen slices were air dried for 10 minutes and then fixed with 10% formalin solution. The slides were then rinsed with running tap water and washed with 60% isopropanol.

그 후, 새롭게 준비된 오일 레드 오 염색 용액(3 g/L)(Sigma-Aldrich)으로 15분 동안 절편을 염색한 다음 60% 이소프로판올로 헹구고 수용액(Sigma-Aldrich)으로 장착하였다. 처리된 모든 마우스 간에서 30개의 무작위로 선택된 지질액 샘플을 지질 축적을 평가하기 위한 정량에 사용하였다. H&E 염색법을 사용하여 미세지방증을 평가하였다. 각 간장의 10개의 상이한 영역을 측정하여 간 지방증을 정량화하였다.The sections were then stained with freshly prepared oil red o stain solution (3 g / L) (Sigma-Aldrich) for 15 minutes, then rinsed with 60% isopropanol and mounted with an aqueous solution (Sigma-Aldrich). Thirty randomly selected lipid fluid samples from all treated mouse livers were used for quantification to assess lipid accumulation. Microfatosis was assessed using H & E staining. Hepatic steatosis was quantified by measuring ten different regions of each liver.

실시예Example 18. 18. 조직에서의 In the organization 아폽토시스Apoptosis 측정 Measure

아폽토시스(apoptosis) 분석은 TACS® 2 TdT-DAB In Situ Apoptosis Detection Kit(Trevigen, MD, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하였다. 심장, 신장 및 간 조직에서의 아폽토시스 핵의 시각화는 처리군 당 5마리의 마우스로부터의 조직을 사용하여 최종 배율 400배로 수행하였다. 아폽토시스 핵을 계산하기 위해 각 마우스에서 3개의 염색된 절편 중에서 9개의 시야를 무작위로 선택하여 시각화하였다. Apoptosis assays were determined according to the manufacturer's protocol using a TACS® 2 TdT-DAB In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen, MD, USA). Visualization of apoptosis nuclei in heart, kidney and liver tissues was performed at a final magnification of 400 × using tissue from 5 mice per treatment group. To visualize the apoptosis nuclei, nine fields of vision were randomly selected from three stained sections in each mouse.

실시예Example 19. 19. 지방 세포 크기 측정Fat cell size measurement

지방 조직 절편을 H&E로 염색하였다. 지방 조직에서 지방 세포의 크기 분포는 Image J 1.48v 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 처리군 당 8마리의 마우스로부터의 지방 조직을 염색하고 각 마우스로부터 무작위로 선택된 40개의 지방 세포 크기를 측정하였다.Adipose tissue sections were stained with H & E. The size distribution of fat cells in adipose tissue was measured using Image J 1.48v software. Adipose tissue from 8 mice per treatment group was stained and 40 fat cell sizes randomly selected from each mouse were measured.

실시예Example 20. 20. 조직 섬유의 측정Measurement of tissue fibers

섬유증의 평가를 위해 조직 절편을 Trichrome Stain(Masson)키트 (Sigma-Aldrich, MO, USA)로 염색하였다. 심근 간질 섬유증, 신장 섬유증 및 간 섬유증의 평가를 위해 Image J 1.48v 소프트웨어를 사용하여 청색으로 염색된 염색 부위를 측정함으로써 정량화하였다. 지방 조직 섬유화는 지방 세포 주변의 파란색으로 염색된 영역을 정량화함으로써 평가하였다. 섬유화 백분율은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산된 전체 조직 절편 내의 파란색 염색의 백분율로서 계산하였다.Tissue sections were stained with Trichrome Stain (Masson) kit (Sigma-Aldrich, Mo., USA) for the evaluation of fibrosis. For evaluation of myocardial interstitial fibrosis, renal fibrosis and liver fibrosis were quantified by measuring the blue stained staining site using Image J 1.48v software. Adipose tissue fibrosis was assessed by quantifying blue stained areas around adipocytes. The percentage of fiberization was calculated as the percentage of blue staining in the total tissue sections calculated using ImageJ software.

10마리의 마우스/처리군을 간 섬유화 분석에 사용하였다. 5마리의 마우스/투여 그룹에 해당하는 심장, 지방 및 신장 조직 섬유화 분석에 사용하였다. 각 동물로부터 3개의 염색된 섹션을 사용하여 섬유증 정도를 평가하였다.Ten mice / treatment groups were used for liver fibrosis analysis. It was used for heart, adipose and kidney tissue fibrosis analysis corresponding to five mouse / administration groups. Three stained sections from each animal were used to assess the degree of fibrosis.

실시예Example 21. 21. 대식세포에서 염증 반응의 평가Evaluation of Inflammatory Responses in Macrophages

대식세포 세포 라인인 RAW 264.7를 2.5×10⁵ 세포/웰의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 접종 하였다. 12시간 후, 대식세포를 16시간 동안 관심 화합물로 처리하였다. 그 다음, 대식세포를 3시간 동안 100 ng/mL LPS의 존재 또는 부재 하에 처리하고 세포를 수확하여 유전자 발현 분석을 위해 RNA를 분리하였다. 분석을 2회 더 반복하여 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 3개의 샘플을 수득하였다.Macrophage cell line RAW 264.7 was inoculated into six well plates at a density of 2.5 × 10 ⁵ cells / well. After 12 hours, macrophages were treated with the compound of interest for 16 hours. Macrophages were then treated for 3 hours in the presence or absence of 100 ng / mL LPS and the cells harvested to separate RNA for gene expression analysis. The assay was repeated two more times to obtain three samples for quantitative real time PCR analysis.

실험예Experimental Example 1.  One. ENOblock의Of ENOblock 에놀라제Enolase 효소 활성 조절 Enzyme activity regulation

에놀라제 효소 활성에 대한 ENOblock의 기능을 확인하기 위해, ENOblock 10 μm 또는 에놀라제 효소 억제제로 알려진 NaF 2 mM를 48시간 동안 NIH/3T3 섬유아세포에 처리하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리된 세포에서 에놀라제 활성이 감소되었다.To confirm the function of ENOblock on enolase enzyme activity, 10 μm of ENOblock or 2 mM NaF, also known as enolase enzyme inhibitor, were treated with NIH / 3T3 fibroblasts for 48 hours. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, enolase activity was reduced in ENOblock treated cells.

실험예Experimental Example 2.  2. ENOblock의Of ENOblock 에놀라제Enolase 타겟target 유전자 조절 및  Gene regulation and 에놀라제Enolase 핵  nucleus 국소화Localization 유도 Judo

에놀라제 및 이의 핵 유사형태인 Myc-결합 단백질-1(MBP-1)은 DNA에 결합할 수 있고, 전사 억제자로서 기능할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 10 μM의 ENOblock을 3T3-L1 지방전구세포주 및 Huh7 간세포에 48시간 동안 처리하여 에놀라제의 핵 내로의 전위를 측정하였다. 또한, ENOblock을 처리한 각 세포에서 에놀라제 결합 유전자의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 2 내지 도 11에 나타내었다.Enolase and its nuclear analogue, Myc-binding protein-1 (MBP-1), can bind DNA and function as transcription inhibitors. Therefore, the inventors treated 48 μM of ENOblock with 3T3-L1 adipocyte cell lines and Huh7 hepatocytes for 48 hours to determine the translocation of enolase into the nucleus. In addition, the expression of the enolase binding gene was evaluated in each cell treated with ENOblock. The results are shown in FIGS. 2 to 11.

도 2 내지 도 11에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리된 3T3-L1 지방전구세포 또는 Huh7 간세포는 핵에서 에놀라제의 발현이 증가하였다(도 2 내지 도 5). 또한, ENOblock 처리는 지방 세포에서 핵 에놀라제/MBP-1의 타겟 유전자로 알려진 c- Myc의 발현을 감소시켰다(도 6 및 도 7). 에놀라제 타겟 유전자로 알려진 Erbb2(HER2/neu)는 ENOblock 처리된 간세포 및 지방세포 모두에서 발현이 감소되었다(도 8 내지 도 11).As shown in Figures 2 to 11, ENOblock treated 3T3-L1 adipocytes or Huh7 hepatocytes increased the expression of enolase in the nucleus (Figures 2-5). In addition, ENOblock treatment reduced the expression of c- Myc , known as the target gene of nuclear enolase / MBP-1, in adipocytes (FIGS. 6 and 7). Erbb2 (HER2 / neu), known as the enolase target gene, had reduced expression in both ENOblock treated hepatocytes and adipocytes (FIGS. 8-11).

ENOblock이 효소 당분해 활성의 조절을 통해 에놀라제 핵 국소화(nuclear localization)를 유도하는지 평가하기 위해, ENOblock 10 μM 또는 에놀라제 촉매 활성을 억제하는 NaF 2 mM을 48시간 동안 Huh7 간 세포주에 처리하였다. 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다. 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, NaF는 핵 국소화를 유도하지 않았고, ENOblock에 의해 핵 국소화가 증가하였다.To assess whether ENOblock induces enolase nuclear localization through regulation of enzymatic glycolysis activity, 10 μM of ENOblock or 2 mM NaF inhibiting enolase catalytic activity was treated in Huh7 liver cell lines for 48 hours. It was. The results are shown in FIGS. 12 and 13. As shown in FIGS. 12 and 13, NaF did not induce nuclear localization and increased nuclear localization by ENOblock.

72시간 동안 10 μM의 ENOblock을 Huh7 간세포주에 처리한 후, 일차 배양 마우스의 간세포에서 세포질 및 핵 내 에놀라제 단백질 발현을 분석하였다. 이때, cytoplasmic 에놀라제는 α-tubulin으로 평준화하였고, nuclear 에놀라제는 12 mg/kg의 ENOblock으로 24시간 처리한 후 C57BL/6J 마우스 간 조직 추출 단백질을 분석하여 lamin B를 통해 평준화하였다. 그 결과를 도 100, 도 14 및 도 15에 나타내었다. 이때, 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 테스트로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 대조군 (DMSO (0.1 %) - 치료군)과 유의하게 다름; 오차= SEM).After 72 hours of treatment with 10 μM of ENOblock in Huh7 hepatocytes, the expression of enolase protein in the cytoplasm and nucleus was analyzed in hepatocytes of primary cultured mice. At this time, cytoplasmic enolase was leveled with α-tubulin, and nuclear enolase was treated with 12 mg / kg of ENOblock for 24 hours, followed by analysis of C57BL / 6J mouse liver tissue extract protein and leveling with lamin B. The results are shown in FIGS. 100, 14 and 15. At this time, statistical analysis was performed by a one-way ANOVA test (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, respectively, corresponding control group ( Significantly different from DMSO (0.1%)-treatment group; error = SEM).

에놀라제의 핵 전위를 유도하는 ENOblock의 기능은 일차 배양 마우스의 간세포 및 ENOblock을 처리한 마우스의 간 조직을 사용하여 입증하였다.The function of ENOblock to induce nuclear translocation of enolase was demonstrated using hepatocytes of primary cultured mice and liver tissues of mice treated with ENOblock.

실험예Experimental Example 3.  3. ENOblock의Of ENOblock 항 당뇨병Antidiabetic 효과 평가 Effect evaluation

6주령된 db/db 마우스에게 8 mg/kg ENOblock 또는 8 mg/kg 로지글리타존(rosiglitazone)을 24시간 이상 처리하였다. 이어서, db/db 마우스에서 ENOblock 및 로지글리타존을 7주간 처리하였다. 이때, ENOblock의 화학구조는 도 16에 나타내었고, 실험 과정을 도식화하여 도 17에 나타내었다. 이후, 각 마우스의 혈당 수치, 혈청 수치 및 에놀라제 활성을 측정하였다.Six-week old db / db mice were treated with 8 mg / kg ENOblock or 8 mg / kg rosiglitazone for at least 24 hours. Subsequently, ENOblock and rosiglitazone were treated for 7 weeks in db / db mice. In this case, the chemical structure of the ENOblock is shown in FIG. 16, and the experimental procedure is shown in FIG. Thereafter, blood glucose levels, serum levels and enolase activity of each mouse were measured.

그 결과를 도 18 내지 도 28에 나타내었다. 이때, 상기 도 18 및 도 19, 및 도 26 내지 도 28에 대한 통계 분석은 Student 's t test를 사용하여 수행하였다(오차= SEM; * 처리되지 않은 db/db 마우스와 비교하여 ENOblock 8 mg/kg에 대한 유의성 p <0.05).The results are shown in FIGS. 18 to 28. At this time, the statistical analysis for FIGS. 18 and 19, and 26 to 28 was performed using the Student 'st test (error = SEM; * ENOblock 8 mg / kg compared to untreated db / db mice) Significance for p <0.05).

또한, 도 20 내지 도 25의 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 테스트와 Dunnett's mutiple 비교 테스트 및 unpaired t-test로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 db- 대조군과 유의하게 다름; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 db-Rosi와 유의하게 다름).In addition, the statistical analysis of FIGS. 20 to 25 was performed by one-way ANOVA test, Dunnett's mutiple comparison test and unpaired t-test (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001; #, ## or ###: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, significantly different from the corresponding db-control, respectively; *, ** or ** *: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, significantly different from the corresponding db-Rosi respectively).

도 18 내지 도 28에 나타난 바와 같이, ENOblock 및 로지글리타존 처리된 마우스에서 혈당 수치가 상당히 감소하였다(도 18). 또한, 8 mg/kg 또는 12 mg/kg ENOblock, 또는 8 mg/kg 로지글리타존을 7주간 처리한 db/db 마우스에서는 혈당 수치가 상당히 감소하였다(도 19). 로지글리타존은 ENOblock 보다 더 효과적으로 혈당 수치를 감소시켰다.As shown in FIGS. 18-28, blood glucose levels were significantly reduced in ENOblock and rosiglitazone treated mice (FIG. 18). In addition, blood glucose levels were significantly reduced in db / db mice treated with 8 mg / kg or 12 mg / kg ENOblock, or 8 mg / kg rosiglitazone for 7 weeks (FIG. 19). Rosiglitazone reduced blood glucose levels more effectively than ENOblock.

7주 후, ENOblock 처리는 혈청 LDL 수치를 상당히 감소시킨 반면, HDL 수치에는 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해 영향을 끼치지 않았다(도 20 및 도 21). 12 mg/kg ENOblock 처리된 db/db 마우스는 유리지방산(FFA)의 혈청 수치가 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해 감소되었다(도 22).After 7 weeks, ENOblock treatment significantly reduced serum LDL levels, while not affecting HDL levels as compared to untreated db / db mice (FIGS. 20 and 21). 12 mg / kg ENOblock treated db / db mice had reduced serum levels of free fatty acids (FFA) compared to untreated db / db mice (FIG. 22).

알라닌 아미노기전달효소(ALT)의 혈청 수치는 ENOblock 처리된 마우스에서 비처리된 db/db 마우스에 비해 유의하게 변하지 않았다. 이는 ENOblock 처리가 간세포 독성을 생산하지 않았다는 것을 의미한다(도 23). ENOblock 처리된 마우스의 신장 및 간에서, 에놀라제 활성은 상당히 감소되었다(도 24 및 도 25). ENOblock 처리된 T2DM 마우스의 간에서 에놀라제/MBP-1 결합 유전자인 COX-2, Erbb2 및 c-Myc 모두 전사 억제를 나타내었다(도 26 내지 도28).Serum levels of alanine aminotransferase (ALT) did not change significantly in ENOblock treated mice compared to untreated db / db mice. This means that ENOblock treatment did not produce hepatotoxicity (FIG. 23). In the kidney and liver of ENOblock treated mice, enolase activity was significantly reduced (FIGS. 24 and 25). Enolase / MBP-1 binding genes COX-2, Erbb2 and c-Myc all showed transcriptional inhibition in the liver of ENOblock treated T2DM mice (FIGS. 26-28).

실험예Experimental Example 4.  4. T2DMT2DM 마우스에서  In the mouse ENOblock의Of ENOblock 간 섬유화 및  Liver fibrosis and 아폽토시스Apoptosis 조절 control

12 mg/kg의 ENOblock 또는 8 mg/kg의 로지글리타존 처리 7주 후, db/db 마우스로부터 간을 적출하였다. 이후, 간 중량을 측정하였고, 간을 육안적으로 평가하였다. 또한, 여러 염색법과 마커 발현 측정을 통해 지질 축적 및 간 섬유화를 측정하였다. 또한, 마우스 간세포의 아폽토시스를 측정하였다. 이를 도 29 내지 도 34에 나타내었다.After 7 weeks of treatment with 12 mg / kg ENOblock or 8 mg / kg rosiglitazone, livers were extracted from db / db mice. The liver weight was then measured and the liver was visually evaluated. In addition, lipid staining and liver fibrosis were measured through various staining and marker expression measurements. In addition, apoptosis of mouse hepatocytes was measured. This is illustrated in FIGS. 29 to 34.

도 29 내지 도 34에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리는 간 중량 또는 외관에 영향을 끼치지 않은 반면, 로지글리타존 처리는 간 중량을 상당히 증가시켰다(도 29 및 도 30). Oil red O 염색을 통해, 12 mg/kg ENOblock 처리된 마우스의 간에서 지질 축적이 유도됨을 알 수 있었다(도 31 및 도 32). Masson-Trichrome 염색을 통해, ENOblock 처리가 간 섬유화를 유의하게 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 33 및 도 34). 로지글리타존 처리된 마우스의 간에서 섬유화는 많은 양의 지질 축적 때문에 평가할 수 없었다.As shown in FIGS. 29-34, ENOblock treatment did not affect liver weight or appearance, while rosiglitazone treatment significantly increased liver weight (FIGS. 29 and 30). Oil red O staining showed that lipid accumulation was induced in the liver of 12 mg / kg ENOblock treated mice (FIGS. 31 and 32). Masson-Trichrome staining confirmed that ENOblock treatment significantly reduced liver fibrosis (FIGS. 33 and 34). Fibrosis in the liver of rosiglitazone treated mice could not be assessed due to the accumulation of large amounts of lipids.

간 섬유화에서 ENOblock의 효과를 확인하기 위해, 섬유화 마커인 α-smooth muscle actin(α-SMA)의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 101a, 도 101b, 및 도 35 내지 도 41에 나타내었다.To confirm the effect of ENOblock on liver fibrosis, the expression of the fibrotic marker α-smooth muscle actin (α-SMA) was evaluated. The results are shown in FIGS. 101A, 101B, and 35 to 41.

도 101a, 도 101b, 및 도 35 내지 도 41에 나타난 바와 같이, α-SMA 발현은 ENOblock 처리된 마우스에서 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해 통계학적으로 유의하게 감소하였다(도 101). ENOblock 처리는 로지글리타존 처리보다 지방증을 유의하게 감소시켰다(도 35 및 도 36). 또한, ENOblock 처리시 간세포 아폽토시스를 감소시켰고, 로지글리타존에 비해 아폽토시스를 더 효과적으로 억제하였다(도 37 및 도 38). 아울러, ENOblock 처리시 간세포 아폽토시스 억제 효과는 두 아폽토시스 마커, 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 39 내지 도 41).As shown in FIGS. 101A, 101B, and 35-41, α-SMA expression was statistically significantly reduced in untreated db / db mice in ENOblock treated mice (FIG. 101). ENOblock treatment significantly reduced steatosis than rosiglitazone treatment (FIGS. 35 and 36). In addition, ENOblock treatment reduced hepatocyte apoptosis and inhibited apoptosis more effectively compared to rosiglitazone (FIGS. 37 and 38). In addition, hepatocellular apoptosis inhibitory effects upon ENOblock treatment were confirmed by Western blot analysis of two apoptosis markers, cleaved caspase-3 and cleaved PARP (FIGS. 39-41).

실험예Experimental Example 5.  5. T2DMT2DM 마우스의 간에서 염증  Inflammation in the liver of the mouse 마커의Of marker 발현 및 간 지질 항상성과 글루코오스 신생합성의 중요 조절자에 대한  Expression and important regulators of hepatic lipid homeostasis and glucose neosynthesis ENOblock의Of ENOblock 기능 확인 Functional check

염증, 간 지질 항상성 및 글루코오스 신생합성에 대한 ENOblock의 기능을 확인하기 위해, T2DM 마우스에게 ENOblock을 7주 동안 처리하였다. 그 결과를 도 42 내지 도 50에 나타내었다.To confirm the function of ENOblock on inflammation, hepatic lipid homeostasis and glucose neosynthesis, T2DM mice were treated with ENOblock for 7 weeks. The results are shown in FIGS. 42 to 50.

한편, 실험예 4 및 5에 있어서, 도 29 내지 도 50에 대한 통계 분석 값은 (도 30, 도 32, 도 34, 도 36 및 도 38)에 대한 평균 ± SD 및 도 40 내지 도 50에 대한 ± SE로 표시하였다. 모든 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)과 Dunnett's multiple comparison test로 수행되었다(ns: 크게 다르지 않음을 의미; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 대조군(B6)과 유의하게 다름을 의미; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 db-대조군과 유의하게 다름을 의미).Meanwhile, in Experimental Examples 4 and 5, the statistical analysis values for FIGS. 29 to 50 are mean ± SD for (FIGS. 30, 32, 34, 36, and 38) and for FIGS. 40 to 50. ± SE. All statistical analyzes were performed with one-way ANOVA test and Dunnett's multiple comparison test (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p < 0.001, which is significantly different from the corresponding control (B6); #, ## or ###: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, which is significantly different from the corresponding db-control, respectively).

도 42 내지 도 50에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리는 염증 마커인 IL-6 및 TNF-α의 발현을 억제하였고, B6 strain에 비해 db/db 마우스에서 발현이 증가하였다(도 42 및 도 43). ENOblock은 로지글리타존보다 TNF-α 발현을 감소시키는데 더 효과적으로 나타났다. Phosphoenolpyruvate carboxykinase-1(Pck-1 cytoplasmic form) 글루코오스 신생 합성의 양성 조절과 관련이 있다.42 to 50, ENOblock treatment inhibited the expression of inflammatory markers IL-6 and TNF-α and increased expression in db / db mice compared to B6 strain (FIGS. 42 and 43). ENOblock was shown to be more effective in reducing TNF-α expression than rosiglitazone. Phosphoenolpyruvate carboxykinase-1 (Pck-1 cytoplasmic form) is associated with positive regulation of glucose angiogenesis.

Pck-1 발현은 ENOblock 처리에 의해 하향-조절된 반면, 글루코오스 신생 합성 조절과 관련 없는 Phosphoenolpyruvate carboxykinase-2(Pck-2; mitochondrial form)의 발현은 증가하였다(도 44 및 도 45). Sterol regulatory element-binding protein인 Srebp-1a 및 Srebp-1c는 지질 항상성의 주요 조절자이다.Pck-1 expression was down-regulated by ENOblock treatment, whereas the expression of Phosphoenolpyruvate carboxykinase-2 (Pck-2; mitochondrial form) unrelated to glucose neosynthesis regulation was increased (FIGS. 44 and 45). Sterol regulatory element-binding proteins Srebp-1a and Srebp-1c are major regulators of lipid homeostasis.

ENOblock 처리는 Srebp-1a 발현을 정상 B6 마우스에서 관찰된 수준까지 정상화하였고, Srebp-1c의 발현을 감소시켰다(도 46 및 도 47). Srebp-1 단백질 활성을 조절하는 Insig-2는 ENOblock 처리에 의해 감소되지 않았다(도 48). Liver X receptor(LXR)은 Srebp-1가 억제될 때 간지방증 및 고중성지질혈증을 일으키는 sterol 조절된 전사 인자이다). 그러나, ENOblock 처리 이후, db/db 마우스 간에서 LXR 타겟 유전자인 Scap 및 Abcg5의 발현이 감소되었다(도 49 내지 도 50).ENOblock treatment normalized Srebp-1a expression to the levels observed in normal B6 mice and reduced the expression of Srebp-1c (FIGS. 46 and 47). Insig-2, which regulates Srebp-1 protein activity, was not reduced by ENOblock treatment (FIG. 48). Liver X receptor (LXR) is a sterol regulated transcription factor that causes hepatic steatosis and hypertriglyceridemia when Srebp-1 is inhibited). However, after ENOblock treatment, expression of the LXR target genes Scap and Abcg5 in db / db mice liver was reduced (FIGS. 49-50).

실험예Experimental Example 6.  6. T2DMT2DM 마우스의 지방 조직 섬유화, 염증 및 지방세포 크기에 대한 ENOblock의 기능 Function of ENOblock on Adipose Tissue Fibrosis, Inflammation and Adipocyte Size in Mice

지방 조직의 섬유화 및 염증, 및 지방세포 크기에 대한 ENOblock의 기능을 확인하기 위해, 12 mg/kg의 ENOblock 또는 8 mg/kg의 로지글리타존을 db/db 마우스에게 7주간 처리하였다. 그 결과를 도 51 내지 도 58에 나타내었다.To confirm the function of ENOblock on fibrosis and inflammation of adipose tissue, and adipocyte size, 12 mg / kg ENOblock or 8 mg / kg rosiglitazone were treated for 7 weeks in db / db mice. The results are shown in FIGS. 51 to 58.

도 51내지 도 58에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리는 로지글리타존 처리에 비해 전체 몸무게를 증가시키지 않았다. 또한, ENOblock 처리된 마우스는 로지글리타존 처리된 마우스에 비해 생식선의 지방 조직 무게에 차이가 없었다(도 51 및 도 52).As shown in FIGS. 51-58, the ENOblock treatment did not increase overall weight as compared to rosiglitazone treatment. In addition, ENOblock treated mice did not differ in the weight of the adipose tissue of the gonad compared to rosiglitazone treated mice (Figs. 51 and 52).

db/db 마우스는 비당뇨병 마우스인 C57BL/6J(B6)에 비해 증가된 지방세포 크기 및 지방 섬유화를 나타내었다. 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해, ENOblock은 지방세포 크기 및 지방 조직 섬유화가 유의하게 감소하였다(도 53 내지 도 56). ENOblock 처리는 섬유화 마커인 α-smooth muscle actin의 발현을 감소시켰다(도 57 및 도 58).db / db mice showed increased adipocyte size and fat fibrosis compared to non-diabetic mice, C57BL / 6J (B6). Compared to untreated db / db mice, ENOblock significantly reduced adipocyte size and adipose tissue fibrosis (FIGS. 53-56). ENOblock treatment reduced the expression of the fibrosis marker α-smooth muscle actin (FIGS. 57 and 58).

지방 조직에서 염증을 억제시키는 화합물을 평가하기 위해, RAW 264.7 대식세포를 3시간 동안 100 ng/mL의 LPS로 처리하기 전에 16시간 동안 5 또는 10 μM ENOblock으로 처리하였다. 양성 대조군으로서, 대식세포는 만성 염증을 억제함으로써 인슐린 저항성을 개선시키는 항 혈소판 약물로 알려진 Cilostazol을 10 또는 25 μM의 농도로 전처리하였다. 그 결과를 도 59 내지 도 65에 나타내었다.To evaluate compounds that inhibit inflammation in adipose tissue, RAW 264.7 macrophages were treated with 5 or 10 μM ENOblock for 16 hours before treatment with 100 ng / mL LPS for 3 hours. As a positive control, macrophages were pretreated with a concentration of 10 or 25 μM of Cilostazol, an antiplatelet drug known to improve insulin resistance by inhibiting chronic inflammation. The results are shown in FIGS. 59 to 65.

이때, 통계 분석 값은 도 51, 도 52, 도 54, 도 56, 도 59 및 도 60에 대한 평균 ± SD 및 도 61 내지 도 65에 대한 ± SE로 표시하였다. 도 59 및 도 60의 통계 분석은 양 방향 ANOVA 테스트와 Sidak의 mutiple 비교 테스트로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p 0.01, p <0.001로 각각 해당 DMSO- 대조군과 유의하게 다름; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 Cilo 5(=Cilostazol 5 μM)와 유의하게 다름; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 Cilo 10(=Cilostazol 10 μM)과 유의미한 차이가 있음; ¶, ¶¶ 또는 ¶¶¶: ENO5(=ENOblock 10 μM)와는 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 유의미한 차이가 있음).In this case, the statistical analysis values are expressed as mean ± SD for FIGS. 51, 52, 54, 56, 59, and 60 and ± SE for FIGS. 61 to 65. The statistical analysis of FIGS. 59 and 60 was performed by a bidirectional ANOVA test and a mutiple comparison test of Sidak (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p 0.01, p <0.001, respectively) Significantly different from the corresponding DMSO- control; #, ## or ###: significantly different from the corresponding Cilo 5 (= Cilostazol 5 μM), respectively, with p <0.05, p <0.01 or p <0.001; *, ** or ***: significant differences from Cilo 10 (= Cilostazol 10 μM), respectively, with p <0.05, p <0.01 or p <0.001; ¶, ¶¶ or ¶¶¶: p with ENO5 (= ENOblock 10 μM) respectively Significant difference of <0.05, p <0.01 or p <0.001).

도 51 내지 도 56 및 도 61 내지 도 65의 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)과 Dunnett's multiple comparison으로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: P <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 B6 대조군과 유의하게 다름; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 db- 대조군과 유의하게 다름; 오차= SEM).The statistical analysis of FIGS. 51-56 and 61-65 was performed by one-way ANOVA test and Dunnett's multiple comparison (ns: not significantly different; *, ** or ***: P < 0.05, p <0.01 or p <0.001 significantly different than B6 control; #, ## or ###: significantly different than db- control with p <0.05, p <0.01 or p <0.001 respectively; error = SEM ).

도 59 내지 도 65에 나타난 바와 같이, ENOblock은 염증 유전자인 TNF-α를 억제하였고, toll-like receptor 4(TLR4)는 전염증성 LPS가 자극된 대식세포에 존재한다. TLR4 발현에서 ENOblock의 억제 효과는 cilostazol 보다 더 크다(도 59 내지 도 60). 이때, cilostazol은 T2DM 지방 조직에서 만성 염증을 억제하여 인슐린 저항을 개선시키는 phosphodiesterase 3B의 억제자이다.59-65, ENOblock inhibited TNF-α, an inflammatory gene, and toll-like receptor 4 (TLR4) was present in proinflammatory LPS-stimulated macrophages. The inhibitory effect of ENOblock on TLR4 expression is greater than cilostazol (FIGS. 59 to 60). In this case, cilostazol is an inhibitor of phosphodiesterase 3B which suppresses chronic inflammation in T2DM adipose tissue and improves insulin resistance.

생식선의 지방 조직에서, 실시간 PCR은 ENOblock 처리가 염증성 유전자인 TNF-α, monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1) 및 전염증성 대식세포 마커 CD11c의 발현을 하향 조절함을 나타내었다(도 61 내지 도 63). T2DM 지방 조직에서 증가된 지질생성의 마커인 핵수용체 퍼옥시좀 증식 인자 활성화 수용체 -γ(Ppar)는 ENOblock 처리 후 감소된 발현을 나타내었다(도 64). 대사 조절곤란 및 지방 조직 섬유화와 연관된 Col6a3는 ENOblock 처리에 의해 하향 조절되었다(도 65).In adipose tissue of the gonads, real-time PCR showed that ENOblock treatment downregulated the expression of the inflammatory genes TNF-α, monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) and proinflammatory macrophage marker CD11c (FIGS. 61-63). ). Nuclear receptor peroxysome growth factor activating receptor -γ (Ppar), a marker of increased lipidogenesis, in T2DM adipose tissue showed reduced expression after ENOblock treatment (FIG. 64). Col6a3 associated with metabolic dysregulation and adipose tissue fibrosis was downregulated by ENOblock treatment (FIG. 65).

실험예Experimental Example 7.  7. T2DMT2DM 마우스의 심장 비대, 섬유화 및  Cardiac hypertrophy, fibrosis and 아폽토시스에In apoptosis 대한  About ENOblock의Of ENOblock 기능 function

T2DM 마우스에서 심장 비대, 섬유화 및 아폽토시스에 대한 ENOblock의 기능을 확인하기 위해, 8 mg/kg의 로지글리타존 또는 12 kg/mg의 ENOblock을 db/db 마우스에게 7주간 처리하였다. 그 결과를 도 66 내지 84에 나타내었다. 이때, 통계 분석 값은 도 66, 도 67, 도 69 및 도 71에 대한 평균 ± SD로 나타내었다.To confirm the function of ENOblock on cardiac hypertrophy, fibrosis and apoptosis in T2DM mice, 8 mg / kg rosiglitazone or 12 kg / mg ENOblock were treated for 7 weeks in db / db mice. The results are shown in FIGS. 66 to 84. In this case, the statistical analysis values are expressed as the mean ± SD for FIGS. 66, 67, 69, and 71.

도 73 및 도 75 내지 도84에 대해서는 ± SE이다. 모든 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)과 Dunnett's multiple comparison test로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 대조군(B6)과 유의하게 다름; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 db- 대조군과 유의하게 다름; 오차= SEM).73 and 75 to 84 are ± SE. All statistical analyzes were performed by one-way ANOVA test and Dunnett's multiple comparison test (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001) Significantly different from the corresponding control (B6); #, ## or ###: significantly different from the corresponding db- control, with p <0.05, p <0.01 or p <0.001, respectively; error = SEM).

도 66 내지 84에 나타난 바와 같이, 심장 중량은 ENOblock 처리에 의해 영향을 받지 않았다(도 66). 심장 비대 표시자인 심장 중량: 체중의 비는 ENOblock 처리에 의해 감소하였다(도 67). Masson-Trichrome 염색은 ENOblock 처리가 심장 섬유화를 감소시킴을 나타내었다(도 68 및 도 69). 또한, H&E 염색은 ENOblock 처리가 심장근육세포 비대(도 70 및 도 71)를 감소시킴을 나타내었다.As shown in Figures 66-84, heart weight was not affected by ENOblock treatment (Figure 66). The ratio of heart weight: body weight, an indicator of cardiac hypertrophy, was reduced by ENOblock treatment (FIG. 67). Masson-Trichrome staining showed that ENOblock treatment reduced cardiac fibrosis (FIGS. 68 and 69). In addition, H & E staining showed that ENOblock treatment reduced cardiomyocyte hypertrophy (FIGS. 70 and 71).

또한, 아폽토시스를 증가시키는 로지글리타존과는 대조적으로, ENOblock은 심장 조직에서 아폽토시스를 감소시켰다(도 72 및 도 73). 로지글리타콘에 비해 ENOblock 처리된 심장 조직에서 낮은 수치의 아폽토시스는 아폽토시스 마커인 절단된 PARP 및 절단된 카스파제-3의 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 74 내지 도 76).In addition, in contrast to rosiglitazone, which increases apoptosis, ENOblock reduced apoptosis in cardiac tissue (FIGS. 72 and 73). Low levels of apoptosis in ENOblock treated heart tissue compared to rosiglitacon were confirmed by Western blot of cleaved PARP and cleaved caspase-3, which are apoptosis markers (FIGS. 74-76).

Gata-4, glucose transporter-4(Glut-4), insulin-regulated aminopeptidase(Irap) 및 α-myosin heavy chain(α-MHC)는 심장 기능의 마커이다. ENOblock 처리는 Gata-4, Irap 및 α-MHC의 발현을 증가시켰다(도 77 내지 도 80).Gata-4, glucose transporter-4 (Glut-4), insulin-regulated aminopeptidase (Irap) and α-myosin heavy chain (α-MHC) are markers of cardiac function. ENOblock treatment increased the expression of Gata-4, Irap and α-MHC (FIGS. 77-80).

Potassium two pore domain channel subfamily K member 1(Kcnk1), N-acylsphingosine amidohydrolase 2(Asah2), beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 1(B4glant) 및 matrix metalloproteinase 3(MMP-3)는 심장 질병의 마커이다. 로지글리타존 처리는 상기 마커들의 발현을 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해 증가시켰다. ENOblock 처리는 처리되지 않은 db/db 마우스에 비해 Kcnk1의 발현을 감소시켰고, 로지글리타존 처리된 마우스에 비해 Asah2, B4glant 및 MMP-3의 발현을 감소시켰다(도 81 내지 도 84).Potassium two pore domain channel subfamily K member 1 (Kcnk1), N-acylsphingosine amidohydrolase 2 (Asah2), beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 1 (B4glant), and matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) are heart diseases Is a marker. Rosiglitazone treatment increased the expression of these markers compared to untreated db / db mice. ENOblock treatment reduced the expression of Kcnk1 compared to untreated db / db mice and decreased the expression of Asah2, B4glant and MMP-3 compared to rosiglitazone treated mice (FIGS. 81-84).

실험예Experimental Example 8.  8. T2DMT2DM 마우스의 신장 조직 섬유화 및  Renal tissue fibrosis in mice and 아폽토시스에In apoptosis 대한  About ENOblock의Of ENOblock 기능 function

T2DM 마우스에서 신장 조직 섬유화 및 아폽토시스에 대한 ENOblock의 기능을 확인하기 위해, 12 kg/mg의 ENOblock 또는 8 mg/kg의 로지글리타존을 db/db 마우스에게 7주간 처리하였다. 그 결과를 도 85 내지 도 99에 나타내었다.To confirm the function of ENOblock on renal tissue fibrosis and apoptosis in T2DM mice, 12 kg / mg ENOblock or 8 mg / kg rosiglitazone were treated for 7 weeks in db / db mice. The results are shown in FIGS. 85 to 99.

이때, 통계 분석 값은 도 85의 경우 평균 ± SD로, 도 87, 도 89 및 도 91 내지 도 96의 경우 ± SE로 나타내었다. 모든 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)과 Dunnett's multiple comparison test로 수행하였다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 대조군(B6)과 유의하게 다름; #, ## 또는 ###: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 각각 해당 db- 대조군과 유의하게 다름; 오차= SEM).In this case, the statistical analysis values are represented as the average ± SD in FIG. 85 and ± SE in FIGS. 87, 89 and 91 to 96. All statistical analyzes were performed by one-way ANOVA test and Dunnett's multiple comparison test (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001) Significantly different from the corresponding control (B6); #, ## or ###: significantly different from the corresponding db- control, with p <0.05, p <0.01 or p <0.001, respectively; error = SEM).

도 85 내지 도 99에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리는 신장 중량에 유의하게 영향을 끼치지 않았다(도 85). Masson-trichrome 염색은 ENOblock이 신장 섬유화를 감소시킴을 나타내었다(도 86 및 도 87). 또한, ENOblock 처리는 아폽토시스를 감소시켰던 반면, 로지글리타존 처리는 아폽토시스를 증가시켰다(도 88 및 도 89).As shown in Figures 85-99, ENOblock treatment did not significantly affect kidney weight (Figure 85). Masson-trichrome staining showed that ENOblock reduced kidney fibrosis (FIG. 86 and FIG. 87). In addition, ENOblock treatment reduced apoptosis, while rosiglitazone treatment increased apoptosis (FIGS. 88 and 89).

신장 세포에서 ENOblock 처리에 따른 아폽토시스 억제 효과는 아폽토시스 마커인 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 90 내지 도 92). 유전자 angiotensin, Bax 및 p53를 T2DM 신장에서 아폽토시스의 마커로서 사용하였다. 실시간 PCR 분석을 통해 ENOblock 처리는 처리되지 않은 마우스에 비해 상기 세 유전자의 발현을 감소시킴을 나타내었다(도 93 내지 도 95).Apoptosis inhibitory effects following ENOblock treatment in renal cells were confirmed by Western blot analysis of the apoptosis markers cleaved caspase-3 and cleaved PARP (FIGS. 90-92). The genes angiotensin, Bax and p53 were used as markers of apoptosis in T2DM kidneys. Real-time PCR analysis showed that ENOblock treatment reduced the expression of these three genes as compared to untreated mice (FIGS. 93-95).

신장은 글루코오스 신생 합성의 주요 장소이다. ENOblock은 글루코오스 신생 합성의 양성 조절과 연관된 Pck-1(세포질 형태)의 발현을 하향 조절하였다(도 96). Collagen 4a3는 사구체 특이적이며, 과잉 수치는 사구체신염과 연관되어 있다. 반면, collagen 4a1 및 collagen 4a2는 기저막에서 흔하게 발현된다. ENOblock 처리는 collagen 4a3의 발현을 감소시켰고 collagens 4a1 및4a2의 발현을 증가시켰다(도 97 내지 도 99).Kidneys are a major site of glucose neosynthesis. ENOblock downregulated the expression of Pck-1 (cytoplasmic form) associated with positive regulation of glucose neosynthesis (FIG. 96). Collagen 4a3 is glomerular specific and excess levels are associated with glomerulonephritis. In contrast, collagen 4a1 and collagen 4a2 are commonly expressed in the basement membrane. ENOblock treatment decreased the expression of collagen 4a3 and increased the expression of collagens 4a1 and 4a2 (FIGS. 97-99).

II. 비만 마우스 모델에서 II. In obese mouse model ENOblock의Of ENOblock 효과 확인 Check the effect

실시예Example 1. 시약 및 항체 1. Reagents and Antibodies

Dexamethasone, forskolin, rapamycin, rosiglitazon는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하였다. Metformin(1,1-dimethylbiguanide hydrochloride), 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), sodium fluoride(NaF), oil red O 및 α-smooth muscle actin(카탈로그 번호 A5228)에 대한 항체는 Sigma-Aldrich(MO, USA)에서 구입하였다. 또한, Tetramethylrhodamine, ethyl ester 및 perchlorate (TMRE)는 Thermo Fisher Scientific(MA, USA)에서 구입하였다. Dexamethasone, forskolin, rapamycin and rosiglitazon were purchased from Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antibodies to metformin (1,1-dimethylbiguanide hydrochloride), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), sodium fluoride (NaF), oil red O and α-smooth muscle actin (catalog number A5228) were identified as Sigma-Aldrich (MO). , USA). Tetramethylrhodamine, ethyl ester and perchlorate (TMRE) were also purchased from Thermo Fisher Scientific (MA, USA).

실시예Example 2. 세포배양 2. Cell Culture

3T3-L1 쥐의 전 지방 세포를 한국 세포주 은행(서울대학교 병원, 한국)에서 수득하였다. 이후, 상기 세포를 10% 송아지 혈청(calf serum), 50 units mL^-1 페니실린 및 50 μg mL^-1 스트렙토마이신(PenStrep)이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 3T3-L1 세포를 하기와 같이 지방 세포로 분화시켰다: 48시간 post-confluent 세포(0일로 명시)를 10% FBS, 0.5 mM IBMX, 2 ㎍/ml dexamethasone, 1 ㎍/ml의 인슐린 및 PenStrep을 함유하는 DMEM에서 2일 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포를 10% FBS 및 1 ㎍/㎖의 인슐린이 첨가된 새로운 DMEM에서 배양하였다.Whole adipocytes of 3T3-L1 mice were obtained from the Bank of Korea Cell Line (Seoul National University Hospital, Korea). The cells were then incubated in DMEM with 10% calf serum, 50 units mL- ¹ penicillin and 50 μg mL- ¹ streptomycin (PenStrep). 3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes as follows: 48 h post-confluent cells (specified as day 0) contained 10% FBS, 0.5 mM IBMX, 2 μg / ml dexamethasone, 1 μg / ml insulin and PenStrep Incubated for 2 days in DMEM. The cells were then incubated in fresh DMEM with 10% FBS and 1 μg / ml insulin.

실시예Example 3. 일차  3. Primary 지방전구세포의Fat precursor cell 분리 Separation

8주된 수컷 C57BL/6J 마우스는 Damool Science(한국)에서 구입하였다. 일차 지방전구세포를 분리하는 프로토콜은 하기와 같다. 마우스를 희생시키고, 전체 흰 생식소 조직 또는 견갑골 갈색 지방 조직을 절개하여 0.5% BSA를 함유하는 1 mL의 DPBS에서 균질화시켰다.Eight week old male C57BL / 6J mice were purchased from Damool Science (Korea). The protocol for separating primary adipocytes is as follows. Mice were sacrificed and whole white gonad tissue or scapula brown adipose tissue was excised and homogenized in 1 mL of DPBS containing 0.5% BSA.

그 후, 조직을 37℃에서 30분 동안 배양하면서 3 mL의 소화 배지에서 0.8 U/mL collagenase와 2.7 U/mL의 dispase로 처리하였다. 최종 농도 10 mM의 EDTA와 소화 배지의 부피를 10 mL로 조정하였다. 그리고, 현탁액을 70 ㎛ 필터를 통해 새로운 50 mL 튜브로 모았다. 4℃에서 500 g의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 지질 부분을 제거하였다.Thereafter, the tissues were treated with 0.8 U / mL collagenase and 2.7 U / mL dispase in 3 mL of digestion medium while incubating for 30 minutes at 37 ° C. The volume of the digestion medium with EDTA at a final concentration of 10 mM was adjusted to 10 mL. The suspension was then collected through a 70 μm filter into a fresh 50 mL tube. Lipid fractions were removed by centrifugation at 500 g at 4 ° C. for 10 minutes.

펠렛의 기질 혈관 부분 내 지방전구세포를 얼음 위에서 RBC 용해 완충액으로 5분 동안 처리하여 분리하였다. 용해를 MACs 완충액(2% FBS 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS)으로 중단시켰다. 지방전구세포를 PBS 용액으로 한번 더 세척하고 계수하여 배양 접시에 접종하였다. 분화를 유도하기 위해, 지방전구세포를 지방세포화 인자인 0.5 mM IBMX, 2 μg/mL dexamethasone, 10 μM rosiglitazone 및 1 μg/mL 인슐린으로 처리하였다.Adipose progenitor cells in the stromal vascular portion of the pellet were isolated by treatment for 5 minutes with RBC lysis buffer on ice. Lysis was stopped with MACs buffer (PBS containing 2% FBS and 1 mM EDTA). Adipose progenitor cells were washed once more with PBS solution and counted to inoculate the culture dish. To induce differentiation, the progenitor cells were treated with adipocytic factor 0.5 mM IBMX, 2 μg / mL dexamethasone, 10 μM rosiglitazone and 1 μg / mL insulin.

실시예Example 4. 세포와 조직에서 RNA 추출 4. RNA Extraction from Cells and Tissues

RNA는 제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA 추출 전, 조직을 액체 질소에서 얼렸고, 유리 막자 사발에서 가루로 갈았다.RNA was extracted using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. Prior to RNA extraction, tissue was frozen in liquid nitrogen and ground in a glass mortar.

실시예Example 5. 정량적 RT- 5. Quantitative RT- PCRPCR

StepOnePlus Real Time PCR System(Applied Biosystems, UK)을 사용하여 관심 있는 유전자의 전사체의 양을 측정하였다. AccuPower® RT PreMix (Bioneer Corporation)를 사용하여 전체 RNA를 cDNA로 역전사하였다.The amount of transcript of the gene of interest was measured using a StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystems, UK). Total RNA was reverse transcribed into cDNA using AccuPower RT PreMix (Bioneer Corporation).

cDNA는 제조자의 지침에 따라 실시간 PCR에 사용하였으며, 하기와 같은 변형이 있었다: PCR은 세 구간반복으로 최종 농도가 200 nM인 특정 프라이머 및 1 μL cDNA를 포함하는 총 부피 20 μL의 2X Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK)로 수행하였다. 혼합물은 변성, 어닐링(annealing) 및 연장의 40 사이클로 구성된 PCR 증폭 전에 95℃에서 10분 동안 배양하였다. 변성은 95℃에서 15초 동안 수행하였고, 어닐링은 60℃에서 1분 동안 수행하였으며, 연장은 72℃에서 20초 동안 수행하였고 각각의 사이클은 72℃에서 형광으로 검출하였다.cDNA was used for real-time PCR according to the manufacturer's instructions, with the following modifications: PCR was repeated in three intervals with a total volume of 20 μL of 2X Power SYBR® containing 1 μL cDNA and specific primer with a final concentration of 200 nM. Performed with Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK). The mixture was incubated at 95 ° C. for 10 minutes before PCR amplification consisting of 40 cycles of denaturation, annealing and extension. Denaturation was performed at 95 ° C. for 15 seconds, annealing was performed at 60 ° C. for 1 minute, extension was performed at 72 ° C. for 20 seconds, and each cycle was detected by fluorescence at 72 ° C.

최종 사이클 후, 샘플의 용융점 분석은 60 내지 95℃의 범위 내에서 연속 형광 검출과 함께 수행하였다. 특정 cDNA 샘플을 각 반응에 포함하였고, 반응 간 비교를 위한 기준으로 사용하였다. 18S rRNA 또는 actin의 발현 수준은 다른 유전자의 발현 수준을 계산하는 동안 표준화에 사용하였다. 결과는 각 유전자의 상대적 발현 수준으로 나타났다.After the last cycle, melting point analysis of the samples was performed with continuous fluorescence detection in the range of 60-95 ° C. Specific cDNA samples were included in each reaction and used as a reference for comparison between reactions. Expression levels of 18S rRNA or actin were used for normalization while calculating expression levels of other genes. The result was the relative expression level of each gene.

본 발명의 실험예에서 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다. mRNA 발현의 상대적인 양을 측정하기 위해, 각 시료의 β- actin 또는 18S rRNA (내부 대조군)의 CT 값에 대해 각 유전자의 ΔCT 값을 계산하였다.Primers used in the experimental examples of the present invention are shown in Table 1. To determine the relative amounts of mRNA expression, the ΔCT values of each gene were calculated against the CT values of β-actin or 18S rRNA (internal control) of each sample.

다음으로, 컴CT 값을 계산하기 위해 약물 처리된 시료의 각 유전자의 ΔCT 값을 아무것도 처리하지 않은 HFD 시료 또는 SFD 시료에서 동일한 유전자의 ΔCT 값으로 더 정규화하였고, 대조군과 비교하여 약물 처리된 샘플에서 각 유전자의 상대적인 발현을 나타내었다. 상대적 mRNA 발현 변화는 2^{- 2컴CT} 방법을 사용하여 계산하였다. 각 실험에서 최종 mRNA 발현은 세 가지 독립적인 실험의 평균값으로 계산하였다.Next, to calculate the ComCT value, the ΔCT value of each gene in the drug-treated sample was further normalized to the ΔCT value of the same gene in the HFD sample or the SFD sample that did not process anything, and in the drug-treated sample compared to the control group. Relative expression of each gene is shown. Relative mRNA expression change is 2 ^were calculated using the ^{two compartment CT} method. Final mRNA expression in each experiment was calculated as the average of three independent experiments.

실시예Example 6.  6. 웨스턴Weston 블롯Blot

1 ml의 cold homogenization buffer 용액(20 mM Tris-Cl (pH 7.4), 0.32 M의 설탕용액 및 단백질분해효소 저해제를 포함하는 1 mM의 EGTA)과 Wheaton® Potter-Elvehjem Tissue Grinder(NJ, USA)를 사용하여 10 내지 30 mg 조직 샘플로부터 단백질을 수득하였다. 단백질은 Bradford assay를 사용하여 정량화하였다.1 ml cold homogenization buffer solution (20 mM Tris-Cl, pH 7.4), 1 mM EGTA with 0.32 M sugar solution and protease inhibitors and Wheaton® Potter-Elvehjem Tissue Grinder (NJ, USA) Protein was obtained from 10 to 30 mg tissue sample. Proteins were quantified using the Bradford assay.

30 또는 40 μg의 단백질 샘플은 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하였고, 전기영동 후 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 1차 항체는 TBS-T + 5% 탈지분유에서 1:1000으로 희석하여 사용하였고, 막과 함께 4℃에서 밤새 보관하였다. HRP와 연결된 2차항체(anti-mouse IgG-HRP, sc2031, Santa Cruz Biotech, CA, USA)와 함께 실온에서 30분간 배양하여 1차 항체 탐지를 수행하였다. 이때, 상기 2차 항체는 1:10000으로 희석하여 사용하였다. ECL 용액(RPN2232, GE Healthcare Life Science, UK)을 통해 발현 신호를 시각화하였다.30 or 40 μg of protein samples were loaded onto 10% polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes after electrophoresis. Primary antibodies were used diluted 1: 1000 in TBS-T + 5% skim milk powder and stored at 4 ° C. overnight with membrane. Primary antibody detection was performed by incubating with HRP-associated secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP, sc2031, Santa Cruz Biotech, CA, USA) for 30 minutes at room temperature. In this case, the secondary antibody was used by diluting to 1: 10000. Expression signals were visualized through ECL solution (RPN2232, GE Healthcare Life Science, UK).

실시예Example 7. 미토콘드리아 막 전위 측정 7. Mitochondrial membrane potential measurement

살아있는 세포의 미토콘드리아 막 전위는 TRME 탐침을 사용하여 측정하였다. 세포들을 96 웰 플레이트에 시딩하였고 관심 있어 하는 화합물을 72시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포들을 37℃에서 20분간 1 μM TMRE으로 처리하였다. 그리고, 세포들을 0.2%의 소 혈청 알부민(BSA)가 포함된 PBS 용액으로 세척하였고, 형광 정도를 마이크로플레이트 리더(l_ex=549 nm, l_em=575 nm; SpectraMax, Molecular Devices, CA, USA)로 측정하였다.Mitochondrial membrane potential of living cells was measured using a TRME probe. Cells were seeded in 96 well plates and the compounds of interest were treated for 72 hours. Cells were then treated with 1 μM TMRE at 37 ° C. for 20 minutes. Cells were then washed with a PBS solution containing 0.2% bovine serum albumin (BSA), and the fluorescence level was determined by microplate reader (l _ex = 549 nm, l _em = 575 nm; SpectraMax, Molecular Devices, CA, USA). Was measured.

살아있는 세포의 이미징(imaging)을 위해, 세포들을 바닥이 깨끗한 검은색 폴리스타이렌 96-웰 마이크로플레이트(Corning™, catalog no. 07-200-565)에 5 x 10³의 밀도로 시딩하였고, 관심 있어 하는 화합물을 72시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포들을 37℃에서 20분간 200 nM TMRE으로 처리하였고, 0.2% BSA가 담긴 PBS로 세척하였다.For imaging of living cells, the cells were seeded at a density of 5 × 10 ^{3 in} a clear black polystyrene 96-well microplate (Corning ™, catalog no. 07-200-565) and of interest. The compound was treated for 72 hours. Cells were then treated with 200 nM TMRE for 20 minutes at 37 ° C. and washed with PBS containing 0.2% BSA.

이후, Lionheart FX automated microscope(BioTek, VT, USA)를 통해 TMRE가 처리된 세포의 시각화와 정량화를 수행하였다. 549 nm(excitation) 및 575 nm(emission)(Texas-Red filter)의 파장에서 형광 정도를 측정하였다. 웰에서 세포 위치의 다양한 변화를 측정하기 위해, 형광 정도를 2x2 영역에서 스캔하였고, 결과는 평균을 측정하였다. 평균 objective intensity는 각 웰에 존재하는 세포수를 Gen5TM 3.0 software(BioTek, VT, USA)를 사용하여 측정 및 정상화하였다. 데이터는 9개의 측정 값 중 평균으로 나타내었다.Subsequently, visualization and quantification of TMRE-treated cells were performed using a Lionheart FX automated microscope (BioTek, VT, USA). Fluorescence levels were measured at wavelengths of 549 nm (excitation) and 575 nm (emission) (Texas-Red filter). To measure various changes in cell location in the wells, the fluorescence intensity was scanned in the 2 × 2 region and the results were averaged. Average objective intensity was measured and normalized to the number of cells present in each well using Gen5TM 3.0 software (BioTek, VT, USA). Data is shown as the average of nine measurements.

실시예Example 8. 8. Oil Red O staining Oil Red O staining

지방 축적 정도를 시각화하기 위해, 12웰 배양접시에 있는 분화중인 3T3-L1 지방세포를 Oil Red O 시료로 염색하였다. Oil Red O staining은 세포를 1 ml 100% 이소프로판올(isopropanol) 5분 동안 실온에서 녹이고 살짝 흔들어줌으로써 정량화하였다. 96 웰 플레이트에 200 μL씩 소량 옮긴 후 l= 492 nm(SpectraMax, Molecular Devices, CA, USA)의 파장에서 흡광도를 측정하였다.To visualize the degree of fat accumulation, differentiated 3T3-L1 adipocytes in 12 well culture dishes were stained with Oil Red O samples. Oil Red O staining was quantified by lysing the cells at room temperature for 5 minutes with 1 ml 100% isopropanol and shaking gently. Small amounts of 200 μL were transferred to 96 well plates, and the absorbance was measured at a wavelength of l = 492 nm (SpectraMax, Molecular Devices, Calif., USA).

실시예Example 9. 9. HFDHFD 마우스의 준비 Preparation of the mouse

실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 실험 동물 연구소 지침에 따라 동물연구를 수행하였다. 또한, 동물연구는 광주 과학 기술 연구소 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: GIST-2017-079)의 승인을 받았다. 고지방 사료(high fat diet, HFD)를 먹인 수컷 C57BL/6J 마우스는 일본의 Charles River에서 구입하였다. 마우스는 생후 4주부터 HFD를 먹였고 생후 14주에 공급되었다. 마우스를 받은 후, 마우스에게 HFD를 계속 먹였다.Animal studies were conducted according to the Laboratory Animal Laboratory Guidelines on the Care and Use of Laboratory Animals. In addition, animal research has been approved by the Gwangju Institute of Science and Technology Animal Care and Use Committee (approval number: GIST-2017-079). Male C57BL / 6J mice fed a high fat diet (HFD) were purchased from Charles River, Japan. Mice received HFD from 4 weeks of age and were fed at 14 weeks of age. After receiving the mice, the mice continued to receive HFD.

동물시설에서 5일간 마우스는 안정화하였고, 한 cage당 3마리의 밀도로 12h/12h light cycle을 유지하였다. 미리 무게를 측정한 마우스에게 HFD를 자유롭게 먹였다. 케이지는 단식 실험을 하기 전 매주 청소하였다. 안정화한 후, 약물 처리를 시작하였다.Mice were stabilized for 5 days in the animal facility and maintained a 12h / 12h light cycle at a density of 3 per cage. Pre-weighed mice were fed free of HFD. The cages were cleaned weekly before the fasting experiment. After stabilization, drug treatment was started.

첫 번째 실험에서, 마우스를 6마리의 세 그룹으로 나누고 8주간 약물을 하기와 같이 처리하였다: 그룹 1) 8 mg/kg 로지글리타존; 그룹 2) 12 mg/kg ENOblock; 그룹 3) 용매만 처리(10% DMSO 를 포함한 saline). 로지글리타존의 마이크로몰 투여량이 22.4 Mm 및 20.2 mM 각각의 ENOblock 보다 높은 것을 유의하였다.In the first experiment, mice were divided into three groups of six and the drug was treated for 8 weeks as follows: group 1) 8 mg / kg rosiglitazone; Group 2) 12 mg / kg ENOblock; Group 3) solvent only treatment (saline with 10% DMSO). It was noted that the micromolar dose of rosiglitazone was higher than the ENOblock of 22.4 Mm and 20.2 mM, respectively.

약물은 10 μL/g의 용액 부피로 24시간마다 복강 내 주사를 통해 투여하였다. 음식 섭취와 체중은 약물 투여 1주부터 매주 모니터링 하였다. 공복 혈당은 4주, 6주 및 8주에 측정하였다. 혈당은 OneTouch Ultra(LifeScan, CA, USA)로 측정하였다. 인슐린 저항성 검사(ITT), 포도당 내성 검사(GTT) 및 피루브산 저항성 검사(PTT)는 Yale School of Medicine(MMPC; https: //www.mmpc. org /)의 Mouse Metabolic Phenotyping Center에서 제공받은 가이드라인에 따라 수행하였다. GTT, ITT 및 PTT는 각각 약물처리 4주, 5주 및 7주에 수행하였다. The drug was administered via intraperitoneal injection every 24 hours in a solution volume of 10 μ L / g. Food intake and body weight were monitored weekly from 1 week of drug administration. Fasting blood glucose was measured at 4, 6 and 8 weeks. Blood glucose was measured by OneTouch Ultra (LifeScan, CA, USA). Insulin resistance test (ITT), glucose tolerance test (GTT) and pyruvate resistance test (PTT) are included in the guidelines provided by the Mouse Metabolic Phenotyping Center at Yale School of Medicine (MMPC; https: //www.mmpc.org/). Followed. GTT, ITT and PTT were performed at 4, 5 and 7 weeks of drug treatment, respectively.

두 번째 실험에서, HFD 마우스를 하기와 같이 세 그룹으로 나누었다: 그룹 1) 120 mg/kg의 metformin을 투여한 마우스 8마리; 그룹 2) 12 mg/kg의 ENOblock을 투여한 마우스 7마리; 그룹 3) 용매(10% DMSO를 포함한 saline)만 처리한 마우스 8마리.In the second experiment, HFD mice were divided into three groups as follows: group 1) 8 mice administered 120 mg / kg of metformin; Group 2) 7 mice administered 12 mg / kg of ENOblock; Group 3) 8 mice treated with solvent only (saline with 10% DMSO).

약물은 10 μL/g의 용액 부피로 8주간 24시간마다 복강 내 주사를 통해 투여하였다. 음식 섭취와 체중은 약물 투여 1주부터 매주 모니터링 하였다. GTT, ITT 및 PTT는 각각 약물 처리 4주, 5주 및 7주에 수행하였다. 동물 실험의 경우, GTT, ITT 및 PTT를 수행 할 때 블라인드 테스트하였다. 약물처리가 끝날 때, 마우스는 diethyl ether 흡입을 통해 해부하였다.The drug was administered via intraperitoneal injection every 24 hours for 8 weeks in a solution volume of 10 μL / g. Food intake and body weight were monitored weekly from 1 week of drug administration. GTT, ITT and PTT were performed at 4, 5 and 7 weeks of drug treatment, respectively. For animal experiments, blind tests were performed when performing GTT, ITT and PTT. At the end of drug treatment, mice were dissected through inhalation of diethyl ether.

혈액은 심장에서 수득하였고, 신장, 간, 뇌, 비장, 췌장, 골격근, 성선 지방 조직, 갈색 지방 조직을 적출하였다. 혈액은 microfuge tube에 넣고 15분간 실온에서 두어 응고시켰다. 응고된 부분은 원심분리(1500 g의 속도로 4℃에서 10분간)하여 제거하였다. 상층액은 50 μL로 나누고 -80℃에서 동결시켰다. 해부된 장기와 조직은 PBS로 2회 세척하고 -80℃에서 보관하였다.Blood was obtained from the heart and kidney, liver, brain, spleen, pancreas, skeletal muscle, gonad fat tissue and brown adipose tissue were extracted. Blood was coagulated by placing it in a microfuge tube at room temperature for 15 minutes. The coagulated portion was removed by centrifugation (10 minutes at 4 ° C. at a rate of 1500 g). The supernatant was divided into 50 μL and frozen at -80 ° C. The dissected organs and tissues were washed twice with PBS and stored at -80 ° C.

실시예Example 10. 10. 혈청 serum 트리글리세리드Triglycerides (( triglyceridetriglyceride ) 측정) Measure

혈액 샘플을 마우스로부터 수득하고 혈청 분리 튜브(BD Microtainer® SSTTM, NJ, USA)를 사용하여 원심 분리하였다. 혈청 샘플을 테스트하기 전에 -80℃에서 보관하였다. 제조사의 지침에 따라 비색 트리글리세리드 정량 키트(K622-100; BioVision, CA, USA)를 사용하여 트리글리세리드의 부피를 측정하였다. 트리글리 세리드 농도를 계산하여 mM로 표시하였다. 처리군 당 5 내지 6 마리의 동물에서 혈액 혈청 샘플을 두 번 사용하였다.Blood samples were obtained from mice and centrifuged using serum separation tubes (BD Microtainer® SSTTM, NJ, USA). Serum samples were stored at -80 ° C before testing. The volume of triglycerides was measured using a colorimetric triglyceride quantification kit (K622-100; BioVision, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Triglyceride concentrations were calculated and expressed in mM. Blood serum samples were used twice in 5 to 6 animals per treatment group.

실시예Example 11. 11. 혈청 HDL 및 LDL 콜레스테롤 측정Serum HDL and LDL Cholesterol Measurement

비색 분석법을 사용하여 고밀도 지질단백질(HDL)과 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤을 HDL 및 LDL/VLDL 정량 비색/형광 측정 키트(카탈로그 # K613, BioVision, Inc., USA)로 측정하였다. 처리군 당 5마리의 동물에서 혈액 혈청 샘플을 두 번 사용하였다.Colorimetric analysis was used to measure high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) cholesterol with HDL and LDL / VLDL quantitative colorimetric / fluorescence measurement kit (Catalog # K613, BioVision, Inc., USA). Blood serum samples were used twice in 5 animals per treatment group.

실시예Example 12. 12. 혈청 인슐린 정량Serum Insulin Quantitation

혈청 내의 인슐린 수준은 마우스 ELISA 키트(Abnova, Taiwan)를 사용하여 측정하였다. ELISA를 위해 혈청을 10배 희석시켰다. 처리군 당 6마리의 동물에서 혈청 샘플을 사용하였다.Insulin levels in serum were measured using a mouse ELISA kit (Abnova, Taiwan). Serum was diluted 10-fold for ELISA. Serum samples were used in 6 animals per treatment group.

실시예Example 13. 13. 혈청 알라닌 Serum alanine 아미노전이효소Aminotransferase (ALT) 활성의 측정Measurement of (ALT) Activity

ALT 활성은 nmol/mon/mL(= mU/mL)로 표시하였고, 키트(카탈로그 # K752, BioVision, Inc., USA)가 제공하는 방법에 따라 분석을 수행하였다. 처리군 당 6마리의 동물에서 혈액 혈청 샘플을 세 번씩 사용하였다.ALT activity was expressed in nmol / mon / mL (= mU / mL) and the assay was performed according to the method provided by the kit (Catalog # K752, BioVision, Inc., USA). Blood serum samples were used three times in 6 animals per treatment group.

실시예Example 14. 14. 조직의 Organization 포매Embedding (embedding) 및 절편(embedding) and intercept

해부된 마우스의 조직을 PBS로 2회 세척하고 건조시킨 후, 저온 성형기에 넣고 OCT(Leica, Germany)로 덮어 포매시켰다. 그 후, 포매된 조직을 액체 질소를 사용하여 급속 냉동시키고 이소프로판올 슬러리로 옮겼다. CM 1850 저온 유지 장치(Leica, Germany)를 사용하여 절단할 때까지 냉동 조직을 -80℃에서 보관하였다. 파라핀 절편은 흰색과 갈색의 지방 조직을 10% 포름알데히드 용액으로 5시간 동안 포르말린 고정시킨 후 탈수 및 자일렌 세척 과정을 거쳐 파라핀 포매(paraffin embedment)를 수행하였다. 파라핀 포매된 블록을 3 μm만큼 절단하였다. 섹션은 H&E 또는 Masson Trichrome 염색 전에 탈파라핀화하였다. 염색 키트(Merck, Germany)를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하였다.Tissues of dissected mice were washed twice with PBS and dried, then placed in a low temperature molder and covered with OCT (Leica, Germany). The embedded tissue was then flash frozen with liquid nitrogen and transferred to an isopropanol slurry. Frozen tissue was stored at −80 ° C. until cleavage using a CM 1850 cryostat (Leica, Germany). Paraffin sections were subjected to paraffin embedding after white and brown adipose tissue was fixed in formalin for 5 hours with 10% formaldehyde solution, followed by dehydration and xylene washing. Paraffin embedded blocks were cut by 3 μm. Sections were deparaffinized before H & E or Masson Trichrome staining. Hematoxylin and eosin staining was performed using a staining kit (Merck, Germany).

처리군 당 5마리의 마우스를 사용하여 간 섬유화, 지질 축적, 지방증 및 간장 위성 수를 분석 하였다. 현미경 이미지는 x200 배율로 촬영하였다.Five mice per treatment group were used to analyze liver fibrosis, lipid accumulation, liposemia and hepatic satellite counts. Microscopic images were taken at x200 magnification.

실시예Example 15. 15. 간 조직의 지질 축적 측정Measurement of lipid accumulation in liver tissue

간 지질 축적은 oil red O 염색을 사용하여 시각화하였고 ImageJ 1.45s 소프트웨어(NIH, USA)로 측정하였다. 간 조직을 8 μm 두께로 절단하고, 10분 동안 공기 건조시킨 후 10% 포르말린 용액으로 고정시켰다. 슬라이드를 수돗물로 헹구고, 60% 이소프로판올로 세척하였다.Liver lipid accumulation was visualized using oil red O staining and measured by ImageJ 1.45s software (NIH, USA). Liver tissue was cut to 8 μm thickness, air dried for 10 minutes and then fixed with 10% formalin solution. The slides were rinsed with tap water and washed with 60% isopropanol.

이후, 상기 슬라이드를 새로 준비된 oil red O 염색 용액(3 g/L)(Sigma-Aldrich, USA)으로 15분 동안 염색하고, 60% 이소프로판올로 헹군 후 aqueous mountant(Sigma-Aldrich, USA)로 mount하였다. 5마리의 마우스 간/처리군으로부터 무작위로 캡처된 5개의 현미경 이미지에서 무작위로 선택된 30개의 지질 드로플릿(droplet)을 정량화(배율: 200 배)를 위해 사용하였다.The slides were then stained with freshly prepared oil red O staining solution (3 g / L) (Sigma-Aldrich, USA) for 15 minutes, rinsed with 60% isopropanol and mounted with aqueous mountant (Sigma-Aldrich, USA). . Thirty randomly selected lipid droplets were used for quantification (magnification: 200-fold) in five microscopic images captured randomly from five mouse livers / treatment groups.

실시예Example 16. 16. 간 지방증의 측정Measurement of hepatic steatosis

H&E 염색법을 사용하여 지방증을 시각화하였다. 간 지방증을 정량화하기 위해 Image J 소프트웨어 1.48v 소프트웨어(NIH, USA)와 함께 각 마우스 간의 10개의 다른 영역(배율 200x)을 사용하였다.H & E staining was used to visualize steatosis. Ten different regions (magnification 200x) between each mouse were used with Image J software 1.48v software (NIH, USA) to quantify hepatic steatosis.

실시예Example 17. 17. 조직 섬유화의 결정Determination of Tissue Fibrosis

조직 절편을 Masson Trichrome Staining Kit(Sigma-Aldrich, USA)로 염색 하였다. 섬유증 영역은 Image J 소프트웨어(NIH, USA)로 청색 염색 부위를 검출함으로써 정량화하였다. 처리군 당 5개의 마우스 간(cryo-sectioned) 또는 BAT(paraffin-sectioned)로 준비된 섹션에서 무작위로 8 ~ 10 개의 캡처된 현미경 이미지를 정량(배율: 200x)에 사용하였다.Tissue sections were stained with Masson Trichrome Staining Kit (Sigma-Aldrich, USA). Fibrosis areas were quantified by detecting blue staining sites with Image J software (NIH, USA). Randomly 8-10 captured microscope images were used for quantification (magnification: 200 ×) in sections prepared with 5 mouse livers (cryo-sectioned) or paraffin-sectioned (BAT) per treatment group.

실시예Example 18. 18. 간 성상 세포의 검출Detection of hepatic stellate cells

간 성상 세포는 α-SMA 염색으로 검출하였다. 성상 세포는 α-SMA 및 DAPI 이중 표지된 세포를 계수하여 정량화하였다. 각각의 처리군에서 5마리의 마우스 간으로부터 무작위로 캡처된 10개의 cryo-section 현미경 이미지를 정량화(배율: 200x)에 사용하였다.Hepatic stellate cells were detected by α-SMA staining. Astrocytes were quantified by counting α-SMA and DAPI double labeled cells. Ten cryo-section microscopic images randomly captured from five mouse livers in each treatment group were used for quantification (magnification: 200 ×).

실시예Example 19. 19. 해마의 미토콘드리아 DNA 정량Determination of Mitochondrial DNA in the Hippocampus

해마에 있는 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 함량을 정량하였다. 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올을 사용하여 DNA를 정제하고, 18S 핵(Mm03928990_g1) 또는 16S 미토콘드리아(Mm04260181_s1) DNA(Applied Biosystems, USA)를 위한 TaqMan 프라이머를 갖는 384-웰 플레이트의 각 웰에 2 ng을 로딩 하였다. 각 처리군의 6 마리의 마우스로부터 해마 mtDNA를 정량하였다.Mitochondrial DNA (mtDNA) content in the hippocampus was quantified. Purify DNA using phenol-chloroform-isoamyl alcohol and have 2 ng in each well of a 384-well plate with TaqMan primers for 18S nuclei (Mm03928990_g1) or 16S mitochondria (Mm04260181_s1) DNA (Applied Biosystems, USA). Loaded. Hippocampal mtDNA was quantified from 6 mice of each treatment group.

실시예Example 20. 20. 해마 뉴런의 Hippocampal neuron NisslNissl 염색 dyeing

해마의 뉴런은 NovaUltra Nissl 염색 키트(IHC World, USA)를 사용하여 시각화하였다. 6마리의 SFD, 5마리의 HFD, 6마리의 rosiglitazone 처리된 HFD 및 5마리의 ENOblock 처리된 HFD 마우스에서 얻은 4개의 해마 섹션을 염색에 사용하였다.Neurons in the hippocampus were visualized using the NovaUltra Nissl staining kit (IHC World, USA). Four hippocampal sections obtained from 6 SFD, 5 HFD, 6 rosiglitazone treated HFD and 5 ENOblock treated HFD mice were used for staining.

실시예Example 21. 21. 지방 세포 크기의 측정Measurement of fat cell size

지방 조직 절편을 H&E로 염색하고 지방 세포의 크기 분포를 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 처리군당 5마리의 마우스로부터 생식선 지방 조직을 염색하고 무작위로 선택된 100개의 지방 세포를 각 마우스로부터 측정하였다.Adipose tissue sections were stained with H & E and the size distribution of adipose cells was measured using Image J software. Germline adipose tissue was stained from 5 mice per treatment group and 100 randomly selected fat cells were measured from each mouse.

실시예Example 22. 22. 유동세포분석을 위한 지방 조직 면역 세포의 분리Isolation of Adipose Tissue Immune Cells for Flow Cytometry

생식선 지방 조직을 희생시킨 마우스로부터 해부하였다. 무게를 측정하고 사진을 찍은 후, 지방 조직을 콜라게나제로 소화시켰다. 처리군 당 6마리의 생식선 조직을 면역 세포 분석에 사용하였다. 면역 세포를 함유하는 기질 혈관 분획 펠렛을 FACS 완충액(칼슘 및 마그네슘 불포함 1X DPBS, 2 mM EDTA 및 1% FCS)에 현탁시키고 CD68(매크로시알린) 및 CD206(만노즈 수용체)에 대한 항체로 염색 하였다. 염색된 세포의 집단을 FACS CantoII(BD Biosciences, USA) 및 Flowlogic 소프트웨어(Miltenyi Biotech, 대한민국)로 분석하였다.Dissected from mice sacrificed with gonad adipose tissue. After weighing and taking pictures, adipose tissue was digested with collagenase. Six gonad tissues per treatment group were used for immune cell analysis. Stromal vascular fraction pellets containing immune cells were suspended in FACS buffer (1 × DPBS without calcium and magnesium, 2 mM EDTA and 1% FCS) and stained with antibodies to CD68 (macrosialin) and CD206 (mannose receptor). . Populations of stained cells were analyzed with FACS CantoII (BD Biosciences, USA) and Flowlogic software (Miltenyi Biotech, South Korea).

실험예Experimental Example 1.  One. ENOblock의Of ENOblock 비만증 치료 효과 Obesity treatment effect

비만증 치료제로서 ENOblock의 잠재성을 평가하기 위하여, 지방 세포에서 지질생성 관련 유전자 발현을 분화의 여러 단계로 측정하였다. 본 실험에서는 하기 유전자를 평가하였다: 지질생성 조절 유전자, 아디포넥틴(Adipoq), 지방 세포 단백질 2(Ap2), 퍼옥시좀 증식 활성 수용체 감마(Ppar -γ), 레시스틴(Retn), 앤지오텐신(Agt), CCAAT/증폭체 결합 단백질-α(Cebpa) 및 CCAAT/증폭체 결합 단백질-β(Cebpb).To assess the potential of ENOblock as a therapeutic agent for obesity, lipid production-related gene expression in adipocytes was measured at various stages of differentiation. The following genes were evaluated in the following genes: lipid production regulatory genes, adiponectin ( Adipoq ), adipocyte protein 2 ( Ap2 ), peroxysome proliferation active receptor gamma ( Ppar -γ ), lecithin ( Retn ), angiotensin ( Agt ), CCAAT / amplifier binding protein-α ( Cebpa ) and CCAAT / amplifier binding protein-β ( Cebpb ).

β-3 아드레날린 작용제 길항근과 같은 비만증 치료 화합물의 수는 백색 지방 세포에서 산화적 인산화 또는 열발생을 조절하는 유전자의 발현을 향상시키는 기능을 나타내었다. 따라서, 산화적 인산화 마커(핵 호흡 인자 1(Nrf1), 시토크롬 c 산화 효소 서브유닛 VIIIb(Cox8b) 및 카르니틴 팔미토일트란스퍼레이스 I(Cpt1b)) 또는 열발생(비결합 단백질 1-3 (Ucp -1, Ucp -2, Ucp -3), 퍼옥시좀 증식 활성 수용체 감마 보조 활성제 1-알파(Pgc - 1α) 및 PR domain containing 16(Prdm16))에서 ENOblock의 효과를 평가하였다.The number of therapeutic compounds for obesity, such as β-3 adrenergic agonist antagonists, has been shown to function to enhance the expression of genes that regulate oxidative phosphorylation or thermogeneration in white fat cells. Thus, oxidative phosphorylation markers (nuclear respiratory factor 1 ( Nrf1 ), cytochrome c oxidase subunit VIIIb ( Cox8b ) and carnitine palmitoyltransferase I ( Cpt1b )) or pyrogenic (unbound protein 1-3 ( Ucp −) 1 , Ucp- 2 , Ucp- 3 ), peroxysome proliferation active receptor gamma co-activator 1-alpha ( Pgc - 1α ) and PR domain containing 16 ( Prdm16 ) were evaluated for the effect of ENOblock.

첫 번째 테스트로서, 쥐의 지방전구세포의 일차 배양물을 72시간 동안 10 μM의 ENOblock으로 처리하였다. 유전자 발현 패턴의 효과를 10 μM의 포스콜린(forskolin)(열발생(1 μM 이상의 농도에서)을 유도하는 adenylyl cyclase의 활성제) 또는 1 μM의 라파마이신(rapamycin)(지방생성을 억제하는 mTOR 억제제)으로 처리된 지방전구세포와 비교하였다.As a first test, primary cultures of rat progenitor cells were treated with 10 μM of ENOblock for 72 hours. Effects of gene expression patterns can be influenced by 10 μM of forskolin (an activator of adenylyl cyclase that induces heat generation (at concentrations above 1 μM)) or 1 μM of rapamycin (mTOR inhibitors that inhibit adipogenesis). Compared with adipocytes treated with.

이를 도 102 내지 도 105에 나타내었다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 '대조군' 또는 '치료되지 않은 사람'과 크게 다름; ## 또는 ###: 상응하는 'ENOblock' 처리군과 크게 다름; ж, жж 또는 жжж: 해당 'Forskolin' 처리군과 크게 다름).102 to 105 (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, significantly corresponding to the corresponding 'control' or 'untreated person') Different from ## or ###: significantly different from the corresponding 'ENOblock' treatment group; ж, жж or жжж: significantly different from the corresponding 'Forskolin' treatment group).

도 102 내지 도 105에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리 72시간 후, ENOblock 처리된 지방전구세포는 지방생성 조절 유전자, Adipoq, Ppar -γ, Cebpa 및 Cebpb의 발현에서 유의한 변화를 보이지 않았고, Ap2 및 Agt의 발현을 하향 조절함을 보였고, Retn의 발현을 상향 조절함을 보였다(도 102 및 도 103).102 to 105, after 72 hours of ENOblock treatment, the ENOblock treated adipocytes did not show significant changes in the expression of adipogenic regulatory genes, Adipoq , Ppar- γ , Cebpa and Cebpb , and Ap2 And downregulate the expression of Agt and upregulate the expression of Retn (FIGS. 102 and 103).

ENOblock 처리는 산화적 인산화 조절 유전자, Cox8b 및 Cpt1b의 발현을 상향 조절하였고, Nrf1 마커의 발현을 하향 조절하였다(도 104). 또한, ENOblock 처리는 열발생 마커인 Ucp -1의 발현을 상향 조절한 반면, Prdm16의 발현을 하향 조절하였고, Ucp-3 및 Pgc-1α는 발현에는 유의한 변화를 나타내지 않았다(도 105).ENOblock treatment upregulated the expression of oxidative phosphorylation regulatory genes, Cox8b and Cpt1b , and Nrf1 Expression of the markers was down regulated (FIG. 104). In addition, ENOblock treatment upregulated the expression of the heat generating marker Ucp- 1 , while downregulated the expression of Prdm16 , and Ucp-3 and Pgc-1α did not show significant changes in expression (FIG. 105).

실험예Experimental Example 2.  2. ENOblock의Of ENOblock 지방생성 유도 효과 Induction of Adipogenesis

ENOblock의 지방생성 유도 효과를 확인하기 위하여, 지방전구세포를 10 μM의 forskolin, 1 μM의 rapamycin 또는 10 μM의 ENOblock으로 72시간 동안 처리하였다. 이후, 지방세포화 인자를 5일 동안 관찰하였다. 이를 도 106 내지 도 109에 나타내었다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 '대조군' 또는 '치료되지 않은 사람'과 크게 다름; ## 또는 ###: 상응하는 'ENOblock' 처리군과 크게 다름; ж, жж 또는 жжж: 해당 'Forskolin' 처리군과 크게 다름.).In order to confirm the adipogenic induction effect of ENOblock, adipose progenitor cells were treated with 10 μM forskolin, 1 μM rapamycin or 10 μM ENOblock for 72 hours. Thereafter, adipocyte localization factor was observed for 5 days. 106-109 (ns: not significantly different; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, significantly corresponding to the corresponding 'control' or 'untreated person') Different; ## or ###: significantly different from the corresponding 'ENOblock' treatment group; ж, жж or жжж: significantly different from the corresponding 'Forskolin' treatment group.).

도 106 내지 도 109에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리된 세포는 지방생성 유전자인 Adipoq, Ap2, Ppar -γ, Retn, Agt, Cebpa 및 Cebpb의 하향 조절을 나타내었다. rapamycin 처리는 Adipoq, Ap2, Ppar -γ 및 Retn의 하향 조절을 유도한 반면, Agt, Cebpa 및 Cebpb의 하향 조절을 유도하지 않았다(도 107). ENOblock은 산화적 인산화 마커 유전자인 Nrf1 및 Cox8b를 상향 조절하였고, Cpt1b을 하향 조절하였다(도 108).106 to 109, ENOblock treated cells showed down regulation of adipogenic genes Adipoq , Ap2 , Ppar -γ , Retn , Agt , Cebpa and Cebpb . Rapamycin treatment induced downregulation of Adipoq , Ap2 , Ppar- γ and Retn , while not inducing downregulation of Agt , Cebpa and Cebpb (FIG. 107). ENOblock upregulated oxidative phosphorylation marker genes Nrf1 and Cox8b and downregulated Cpt1b (FIG. 108).

또한, ENOblock 처리는 열발생 마커인 Ucp -3의 발현을 증가시킨 반면, Ucp -1, Prdm16 또는 Pgc - 1α의 발현을 증가시키지 않았다. forskolin 처리는 Ucp -3 및 Prdm16 마커의 발현을 증가시켰다(도 109). 한편, qPCR을 사용을 통해 관찰한 지방세포의 분화과정에서 Ucp-2 발현을 관찰할 수 없었다.Also, ENOblock treatment while increased expression of the marker Ucp -3 heat, Ucp -1, Prdm16 or Pgc - did not increase the expression of 1α. forskolin treatment increased the expression of Ucp- 3 and Prdm16 markers (FIG. 109). On the other hand, Ucp-2 expression could not be observed during adipocyte differentiation observed through qPCR.

실험예Experimental Example 3. 지방 세포에 대한  3. for fat cells ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

실험예 3.1. 백색 지방 세포Experimental Example 3.1. White fat cell

지방 생성을 일으키는 지방 세포에 대한 ENOblock의 효과를 조사하기 위해, 마우스에서 직접 분리한 분화 중인 백색 지방 세포를 10μM의 forskolin, 1 μM의 rapamycin, 10 μM의 ENOblock 또는 1 mM의 NaF를 72시간 동안 처리하였다. 이후, 지방 생성 인자를 5일 동안 관찰하였다. ENOblock 처리에 따른 효과는 ENOblock과 달리 에놀라제 핵 전위를 유발하지 않는 또 다른 에놀라제 효소 억제제인 NaF와 비교하였다. 그 결과를 도 110 내지 113에 나타내었다.To investigate the effects of ENOblock on adipocytes causing adipogenesis, differentiated white adipocytes isolated directly from mice were treated with 10 μM forskolin, 1 μM rapamycin, 10 μM ENOblock or 1 mM NaF for 72 hours. It was. The fat producing factor was then observed for 5 days. The effects of ENOblock treatment were compared to NaF, another enolase enzyme inhibitor that, unlike ENOblock, does not induce enolase nuclear translocation. The results are shown in FIGS. 110 to 113.

도 110 내지 도 113에 나타난 바와 같이, 지방 세포 전구체를 이용하여 분화하는 과정에서, ENOblock 처리는 지방 생성 유전자인 Adipoq, Ap2, Ppar -γ, Retn, Agt, Cebpa 및 Cebpb의 발현을 억제했다. NaF 처리는 Adipoq, Ap2, Retn 및 Cebpa를 하향 조절하였지만, Ppar -γ 및 Cebpb는 하향 조절하지 않았다.110 to 113, in the process of differentiation using adipocyte precursors, ENOblock treatment inhibited the expression of adipogenic genes Adipoq , Ap2 , Ppar -γ , Retn , Agt , Cebpa and Cebpb . NaF treatment downregulated Adipoq , Ap2 , Retn and Cebpa , but did not downregulate Ppar- γ and Cebpb .

ENOblock과 마찬가지로, rapamycin의 처리는 지방 생성 관련 유전자 7종 모두의 발현을 낮추었다(도 111). ENOblock 처리는 산화적 인산화 마커인 Nrf1, Cox8b 및 Cpt1b의 발현을 억제하고 열 생성관련 마커인 Ucp -1의 발현을 증가 시켰으나 Ucp -2, Ucp -3 및 Pgc -1a은 발현을 증가하지 않았다. 또한, Forskolin의 처리는 UCP -1의 발현을 상향 조절하고 Nrf1, Cox8b 및 Cpt1b의 발현을 하향 조절 하였다. NaF의 처리는 Cox8b의 발현을 하향 조절하였으며, Nrf1, Cpt1b 또는 Ucp -1의 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 112 및 도 113).Like ENOblock, treatment with rapamycin lowered the expression of all seven fat-related genes (FIG. 111). ENOblock treatment inhibited the expression of oxidative phosphorylation markers Nrf1 , Cox8b and Cpt1b and increased the expression of heat generating markers Ucp -1 , but did not increase the expression of Ucp -2 , Ucp -3 and Pgc -1a . In addition, the treatment of Forskolin upregulated the expression of UCP- 1 and downregulated the expression of Nrf1, Cox8b and Cpt1b . Treatment of NaF downregulated the expression of Cox8b and did not significantly affect the expression of Nrf1 , Cpt1b or Ucp- 1 (FIGS. 112 and 113).

실험예Experimental Example 3.2. 갈색 지방 세포 3.2. Brown fat cell

지방 생성, 산화적 인산화 및 열 생성에 대한 ENOblock 처리의 효과를 갈색 지방 조직(BAT)에서 분리된 갈색 지방전구세포를 이용한 초기 배양 및 분화 실험을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 114 내지 117에 나타내었다.The effect of ENOblock treatment on fat production, oxidative phosphorylation and heat production was confirmed by initial culture and differentiation experiments using brown adipose precursor cells isolated from brown adipose tissue (BAT). The results are shown in FIGS. 114 to 117.

도 114 내지 117에 나타난 바와 같이, 지방 생성 유전자 Adipoq, Ap2, Ppar -γ, Retn, Agt 및 Cebpa는 ENOblock 처리에 의해 유의한 영향을 받지 않았다(도 114 및 도 115). 산화적 인산화 마커인 Nrf1과 Cpt1b는 ENOblock에 의해 하향 조절되었고(도 116), 열 생성 마커인 Ucp -1, Ucp -2 및 Ucp -3의 발현은 유의성 있는 결과를 얻지 못하였다(도 117).As shown in FIGS. 114 to 117, the fat-producing genes Adipoq , Ap2 , Ppar- γ , Retn , Agt and Cebpa were not significantly affected by ENOblock treatment (FIGS. 114 and 115). The oxidative phosphorylation markers Nrf1 and Cpt1b were down regulated by ENOblock (FIG. 116) and the expression of the heat generating markers Ucp -1 , Ucp -2 and Ucp -3 did not yield significant results (FIG. 117).

실험예Experimental Example 4.  4. ENOblock의Of ENOblock 지방 조직 열 생성 유도 Induce Adipose Tissue Heat Generation

실험예 4.1. ENOblock의 지방전구세포의 미토콘드리아 막 전위 조절Experimental Example 4.1. Regulation of Mitochondrial Membrane Potential of Adipose Progenitor Cells by ENOblock

항 비만제는 갈색 지방 조직(BAT)과 백색 지방 조직(WAT)의 열 생성을 유도 할 수 있으며, 이는 내부 미토콘드리아 막에서 양성자 누출로 검출될 수 있다. 3T3-L1 백색 지방전구세포와 갈색 지방전구세포에 10 μM의 ENOblock, 1 mM의 NaF, 1 μM의 rapamycin, 또는 10 μM의 forskolin을 처리하였다. 미토콘드리아 막 전위는 tetramethylrhodamine, ethyl ester(TMRE, mitochondrial membrane potential의 지시자)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 118 및 도 119, 및 도 122에 나타내었다.Anti-obesity agents can induce the heat production of brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT), which can be detected as proton leakage in the inner mitochondrial membrane. 3T3-L1 white and progenitor cells were treated with 10 μM ENOblock, 1 mM NaF, 1 μM rapamycin, or 10 μM forskolin. Mitochondrial membrane potential was measured using tetramethylrhodamine and ethyl ester (TMRE, indicator of mitochondrial membrane potential). The results are shown in FIGS. 118 and 119 and 122.

도 118 및 도 119, 및 도 122에 나타난 바와 같이, ENOblock, rapamycin 및 forskolin 처리된 3T3-L1과 갈색 지방전구세포는 감소된 막 전위 효과를 보였다.As shown in FIGS. 118, 119 and 122, ENOblock, rapamycin and forskolin treated 3T3-L1 and brown adipocytes showed reduced membrane translocation effect.

또한, 막 전위에 대한 ENOblock의 억제 효과를 자동 현미경 검사(LionheratFX)를 사용하여 백색 지방 조직에서 분리된 백색 지방전구세포에서 확인하였다. 그 결과를 도 120 내지 도 121에 나타내었다.In addition, the inhibitory effect of ENOblock on membrane translocation was confirmed in white adipose progenitor cells isolated from white adipose tissue using automated microscopy (LionheratFX). The results are shown in FIGS. 120 to 121.

도 120 내지 도 121에 나타난 바와 같이, rapamycin 처리된 백색 지방전구세포에서 막 전위가 감소하였다. NaF 처리는 막 전위를 감소시키지 않았다.As shown in Figure 120 to 121, the membrane potential was reduced in rapamycin-treated white adipose precursor cells. NaF treatment did not reduce the membrane potential.

실험예Experimental Example 4.2. 지질 축적에 대한  4.2. For lipid accumulation ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

ENOblock이 지방 생성을 억제하는지 확인하기 위해, 분화 배양 중인 3T3-L1 백색 지방전구세포를 10 μM의 ENOblock, 10 μM의 forskolin 또는 1 μM의 rapamycin으로 72시간 동안 처리하고 Oil Red O로 염색하여 지질 축적을 시각화하였다.To determine whether ENOblock inhibits fat production, 3T3-L1 white progenitor cells in differentiation cultures were treated with 10 μM ENOblock, 10 μM forskolin or 1 μM rapamycin for 72 hours and stained with Oil Red O to accumulate lipids. Was visualized.

그 결과를 도 123 및 도 124에 나타내었다(ns: 유의미한 차이를 보이지 않음; *, ** 또는 ***: 해당하는 '대조군' 또는 'untreated' 그룹에 각각 p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임; ## 또는 ###: NaF 샘플과 각각 p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임; ж, жж, жжж: ENOblock 샘플과 각각 p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임.).The results are shown in FIGS. 123 and 124 (ns: no significant difference; *, ** or ***: p <0.05, p <0.01 or p, respectively, to the corresponding 'control' or 'untreated' groups). Significant differences of <0.001; ## or ###: Significant differences between NaF samples and p <0.01 or p <0.001, respectively; ж, жж, жжж: Signs of ENOblock samples and p <0.05, p <0.01 or significant difference of p <0.001).

도 123 및 도 124에 나타난 바와 같이, ENOblock 처리 시 분화하는 지방 세포에서 지질 축적의 감소가 확인되었다.As shown in Figures 123 and 124, a decrease in lipid accumulation in adipocytes that differentiate upon ENOblock treatment was identified.

실험예Experimental Example 5. 비만에 대한  5. About Obesity ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

ENOblock의 화학 구조는 도 125에 나타내었다. 고지방식(HFD)으로 유도된 비만 마우스 모델에서 ENOblock의 영향을 조사하기 위한 처리 프로토콜을 도 126에 나타내었다. ENOblock 또는 로지글리타존을 8주간 HFD 마우스 모델에 처리하였다.The chemical structure of the ENOblock is shown in FIG. 125. A treatment protocol for investigating the effects of ENOblock in a high fat diet (HFD) induced obese mouse model is shown in FIG. 126. ENOblock or rosiglitazone were treated in the HFD mouse model for 8 weeks.

그 결과를 도 127 및 도 132에 나타내었다(SFD= 표준 사료를 먹인 쥐; HFD= 고지방사료를 먹인 쥐; HFD-ENO= ENOblock을 처리한 HFD 쥐; HFD-Rosi= 로지글리타존을 처리한 HFD 쥐; *, ** 또는 ***: 해당하는 'SFD-Normal' 또는 'SFD-Control'(SFD-약물을 처리하지 않은 건강한 쥐 그룹)에 각각 p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임; ## 또는 ###: 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD-약물을 처리하지 않은 대조군 쥐 그룹)에 각각 p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임; ж, жж, жжж: 'HFD-Rosi'샘플에 각각 p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001의 유의미한 차이를 보임.).The results are shown in Figures 127 and 132 (SFD = rats fed standard feed; HFD = rats fed high fat diet; HFD rats treated with HFD-ENO = ENOblock; HFD-Rosi = HFD rats treated with rosiglitazone; *, **, or ***: significant differences of p <0.05, p <0.01 or p <0.001 for the corresponding 'SFD-Normal' or 'SFD-Control' (a group of healthy rats not treated with SFD-drugs), respectively ## or ###: Significant differences of p <0.01 or p <0.001 for 'HFD-none' or 'HFD-Control' (HFD-drug-treated control rat group), respectively; ж, жж, жжж: Significant differences of p <0.05, p <0.01 or p <0.001 for 'HFD-Rosi' samples, respectively).

도 127 내지 도 132에 나타난 바와 같이, ENOblock을 처리한 마우스는 로지글리타존으로 처리한 마우스과 비교하였을 때 현저히 감소된 비만 유도 양상을 보였다. 또한, 약물 투여를 받지 않거나 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스는 기름진 체모가 발견되었는데, 이것은 ENOblock을 처리한 HFD 마우스에서 발견되지 않았다(도 127 및 도 128).As shown in Figures 127 to 132, mice treated with ENOblock showed significantly reduced obesity induction compared to mice treated with rosiglitazone. In addition, HFD mice not treated with drug or treated with rosiglitazone were found to have oily hair, which was not found in HFD mice treated with ENOblock (FIGS. 127 and 128).

ENOblock 또는 로지글리타존 처리 8주 동안, ENOblock이 처리된 HFD 마우스의 체중 증가는 약물을 처리하지 않은 HFD 마우스 및 로시글리타존이 처리된 HFD 마우스에 비해 감소되었다. ENOblock이 처리된 HFD 마우스 및 처리되지 않은 HFD 마우스 사이의 체중 감소는 3주 후에 통계적으로 그 유의성을 나타내었다.During 8 weeks of ENOblock or rosiglitazone treatment, weight gain in ENOblock-treated HFD mice was reduced compared to non-drug treated HFD mice and rosiglitazone-treated HFD mice. Weight loss between ENOblock-treated HFD mice and untreated HFD mice was statistically significant after three weeks.

7주간의 투여 후, ENOblock을 처리한 HFD 마우스의 체중은 표준 식이가 도입된(SFD 그룹) 마우스와 유의한 차이가 없었다(도 129). 음식 섭취량을 측정한 결과, 처리군 간에 유의한 차이는 보이지 않았다(도 130). ENOblock 처리한 마우스 그룹은 처리하지 않거나 로지글리타존을 처리한 마우스 그룹에 비해 체온이 유의하게 상승되는 효과가 약물을 처리한 6주차에 나타났다.After 7 weeks of administration, the weight of HFD mice treated with ENOblock did not differ significantly from mice fed the standard diet (SFD group) (FIG. 129). As a result of measuring the food intake, there was no significant difference between the treatment groups (FIG. 130). The ENOblock-treated group of mice showed a significant increase in body temperature compared to the untreated or rosiglitazone-treated group at 6 weeks of drug treatment.

약물 처리 6주차에 ENOblock으로 처리한 마우스의 체온은 SFD 마우스에 비해 유의하지 않았지만, 로시글리타존을 처리한 마우스의 체온은 SFD 마우스보다 유의성 있게 감소하였다(도 131). 약물 처리 3, 5 및 7주차에는 ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 마우스 그룹이 고지방식(HFD)으로 유도된 마우스에 비해 공복 혈당치가 유의하게 감소하였다(도 132).The body temperature of mice treated with ENOblock at 6 weeks of drug treatment was not significant compared to SFD mice, but the body temperature of mice treated with rosiglitazone was significantly reduced than that of SFD mice (FIG. 131). At weeks 3, 5, and 7 of the drug treatment, the fasting blood glucose levels of the ENOblock or rosiglitazone treated mice group were significantly reduced compared to the mice fed with the high fat diet (HFD) (FIG. 132).

실험예Experimental Example 6. 포도당, 인슐린 및 피루브산 내성에 대한  6. Against glucose, insulin and pyruvate resistance ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

ENOblock 처리 4주차에 마우스에게 포도당 내성 검사(GTT)를 수행하였다. 그 결과를 도 133 및 도 134에 나타내었다. 또한, ENOblock 처리 5주차에 마우스에게 인슐린 내성 검사(ITT)를 수행하였다. 그 결과를 도 135 및 도 136에 나타내었다. 또한, ENOblock 처리된 마우스에서 과인슐린혈증(hyperinsulinemia) 및 인슐린 저항성을 평가하였다. 이를 도 137 및 도 138에 나타내었다.Mice were subjected to glucose tolerance test (GTT) at week 4 of ENOblock treatment. The results are shown in FIGS. 133 and 134. In addition, mice were tested for insulin resistance (ITT) at week 5 of the ENOblock treatment. The results are shown in FIGS. 135 and 136. In addition, hyperinsulinemia and insulin resistance were evaluated in ENOblock treated mice. This is illustrated in FIGS. 137 and 138.

또한, ENOblock 처리 7주차에 마우스에게 피루브산 내성 테스트(PTT)를 수행하였다. 그 결과를 도 139 및 도 140에 나타내었다(SFD= 표준 쥐를 먹인 마우스; HFD= 고지방 사료 급여 마우스; HFD-ENO= ENO 차단된 HFD 마우스; HFD-Rosi= 로지글리타존 처리된 HFD 마우스; ns: 유의미한 차이를 보이지 않음; *, ** 또는 ***: 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.05 인 경우 해당 SFD- 정상 또는 SFD- 대조군(표준 지방식이 - 처리되지 않은 정상 건강 마우스 그룹) 0.001; ## 또는 ###: p <0.01 또는 p <0.001 인 해당 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD- 비 처리 대조군 마우스 그룹) 샘플과는 유의미한 차이가 없음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 'HFD-Rosi' 표본과 크게 다름.).In addition, mice undergoing pyruvate resistance test (PTT) at week 7 of ENOblock treatment. The results are shown in FIGS. 139 and 140 (SFD = mouse fed mice; HFD = high fat feed fed mice; HFD-ENO = ENO blocked HFD mice; HFD-Rosi = logiglitazone treated HFD mice; ns: significant) No difference; *, **, or ***: respectively, corresponding to the SFD-normal or SFD-control (standard fatty diet-untreated normal healthy mouse group) for p <0.05, p <0.01 or p <0.05, respectively 0.001 ; ## or ###: No significant difference from the corresponding 'HFD-none' or 'HFD-Control' (HFD-non-treated control mouse group) samples with p <0.01 or p <0.001; ж, жж or жжж : p <0.05, p <0.01 or p <0.001, significantly different from the corresponding 'HFD-Rosi' sample.).

도 133 내지 도 140에 나타난 바와 같이, ENOblock 및 로지글리타존 처리된 마우스는 처리되지 않은 HFD 마우스보다 포도당 내성이 향상됨을 나타내었다(도 133 및 도 134). ENOblock 및 로지글리타존 처리된 마우스는 처리되지 않은 HFD 마우스와 비교했을 때 향상된 인슐린 내성을 나타낸 반면, SFD 마우스의 인슐린 내성과는 크게 다르지 않았다(도 135 및 도 136).As shown in Figures 133-140, ENOblock and rosiglitazone treated mice showed improved glucose tolerance than untreated HFD mice (Figures 133 and 134). ENOblock and rosiglitazone treated mice showed improved insulin resistance compared to untreated HFD mice, while not significantly different from insulin resistance of SFD mice (FIGS. 135 and 136).

ENOblock 및 로지글리타존 처리된 마우스는 처리되지 않은 HFD 마우스와 비교했을 때 과인슐린혈증이 감소하였고, 생체 항상성 모델 평가에서 인슐린 저항성이(HOMA-IR) 감소하였다(도 137 및 도 138). 또한, ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 HFD 마우스는 처리되지 않은 HFD 마우스보다 피루브산 챌린지 이후 향상된 혈당 반응을 나타내었다. PTT 후 혈당 수치는 SFD 마우스와 ENOblock 또는 로지글리타존 처리된 HFD 마우스 사이에 통계적인 유의성을 보이지 않았다(도 139 및 도 140).ENOblock and rosiglitazone treated mice had reduced hyperinsulinemia compared with untreated HFD mice and reduced insulin resistance (HOMA-IR) in the bio homeostasis model assessment (FIGS. 137 and 138). In addition, HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone showed improved glycemic responses after pyruvate challenge than untreated HFD mice. Blood glucose levels after PTT showed no statistical significance between SFD mice and ENOblock or rosiglitazone treated HFD mice (FIGS. 139 and 140).

실험예Experimental Example 7. 간의 지방증 및 섬유증에 대한  7. For liver fatosis and fibrosis ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

실험예 7.1. ENOblock 처리에 따른 간 중량 평가Experimental Example 7.1. Liver weight evaluation according to ENOblock treatment

HFD 마우스의 대표적인 해부-간 조직 사진을 도 141에 나타내었다. HFD 또는 로지글리타존을 처리한 마우스 그룹을 SFD 또는 ENOblock을 처리한 HFD 마우스와 비교하였다. 그 결과를 도 141 및 도 142에 나타내었다.Representative anatomical-liver tissue photographs of HFD mice are shown in FIG. 141. Groups of mice treated with HFD or rosiglitazone were compared to HFD mice treated with SFD or ENOblock. The results are shown in FIGS. 141 and 142.

도 141 및 도 142에 나타난 바와 같이, HFD 또는 로지글리타존을 처리한 마우스 그룹의 간 조직에서 눈에 띄게 옅은 패치를 발견할 수 있었다. ENOblock을 처리한 HFD 마우스는 HFD 및 SFD 마우스와 비교하여 유의하게 더 작은 간 중량을 나타냈다.As shown in Figures 141 and 142, a noticeably pale patch could be found in the liver tissues of a group of mice treated with HFD or rosiglitazone. HFD mice treated with ENOblock showed significantly less liver weight compared to HFD and SFD mice.

실험예Experimental Example 7.2.  7.2. ENOblockENOblock 처리에 따른 간 독성 평가 Liver Toxicity Evaluation by Treatment

ENOblock 처리에 따른 잠재적인 간 독성을 평가하기 위해, ALT(serum alanine aminotransferase) 분석을 시행하였다. 그 결과를 도 143에 나타내었다.To assess potential liver toxicity following ENOblock treatment, serum alanine aminotransferase (ALT) analysis was performed. The results are shown in FIG.

도 143에 나타난 바와 같이, 어떤 약물도 투여 받지 않은 HFD와 로지글리타존으로 처리한 HFD 마우스는 SFD 마우스에 비해 유의하게 높은 혈청 ALT를 보였다. 또한, ENOblock을 처리한 마우스의 ALT 수준은 SFD 마우스와 비교하여 유의하게 상승하지 않았다.As shown in FIG. 143, HFD mice treated with HFD and rosiglitazone without any drug showed significantly higher serum ALT compared to SFD mice. In addition, ALT levels of mice treated with ENOblock were not significantly elevated compared to SFD mice.

실험예Experimental Example 7.3.  7.3. ENOblockENOblock 처리에 따른 간 지질 축적 평가 Assessment of Liver Lipid Accumulation by Treatment

간장 지질 축적을 평가하기 위해, Oil red O 염색, H&E 염색, Masson의 Trichrome 염색 및 알파-평활근 액틴(α-SMA)에 대한 면역 염색을 시행하였다. 그 결과를 도 144 내지 도 153에 나타내었다(스케일 바= 100 μm; ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: SFD-정상 또는 SFD-대조군(Standard Fat Diet을 처리하지 않은 정상 마우스 그룹)에 대해서 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.05; ## or ###: p <0.01 또는 p <0.001값으로 'HFD-free' 또는 'HFD-컨트롤'(HFD-처리하지 않은 대조군 마우스 그룹) 샘플들과 유의한 차이가 없음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001값으로 'HFD-Rosi'표본과 유의하게 다름.)To assess hepatic lipid accumulation, Oil red O staining, H & E staining, Machrome Trichrome staining and immunostaining for alpha-smooth muscle actin (α-SMA) were performed. The results are shown in FIGS. 144-153 (scale bar = 100 μm; ns: not very different; *, ** or ***: SFD-normal or SFD-control (normal mice not treated with Standard Fat Diet) P <0.05, p <0.01 or p <0.05; ## or ###: 'HFD-free' or 'HFD-control' (HFD-untreated) with p <0.01 or p <0.001, respectively. No significant differences from the samples; ж, жж or жжж: significantly different from the 'HFD-Rosi' sample with p <0.05, p <0.01 or p <0.001.

도 144 내지 도 153에 나타난 바와 같이, HFD 마우스는 SFD 마우스와 비교하여 유의한 지질 축적을 나타내었으며, 이는 ENOblock 처리에 의해 억제되었다. 로지글리타존 처리는 지질 축적을 감소시키지 못했다(도 144 및 도 145). H&E 염색은 HFD 마우스가 간 미세 지방증을 소견을 보여주었다. ENOblock 처리는 미세 지방증을 감소시키는 반면, 로시글리타존 처리에 의한 유의한 효과가 없었다(도 146 및 도 147).As shown in Figures 144-153, HFD mice showed significant lipid accumulation compared to SFD mice, which were inhibited by ENOblock treatment. Rosiglitazone treatment did not reduce lipid accumulation (FIGS. 144 and 145). H & E staining showed that HFD mice showed hepatic steatosis. ENOblock treatment reduced microlipidism, while there was no significant effect by rosiglitazone treatment (FIGS. 146 and 147).

Masson-Trichrome 염색은 HFD 마우스에서 간 섬유화의 유의한 발달을 보였다. 로지글리타존이 아닌 ENOblock 처리는 SFD 마우스에서 관찰된 수준으로 섬유화를 감소시켰다(도 148 및 도 149). 식이로 인해 유발된 비만유래의 간 섬유화의 발달은 알파-평활근 액틴(α-SMA)에 대한 면역 염색으로 검출할 수 있는 간 성상 세포의 활성화와 관련이 있다.Masson-Trichrome staining showed significant development of liver fibrosis in HFD mice. ENOblock treatment, but not rosiglitazone, reduced fibrosis to the levels observed in SFD mice (FIGS. 148 and 149). The development of obese-derived liver fibrosis caused by diet is associated with the activation of hepatic stellate cells that can be detected by immunostaining against alpha-smooth muscle actin (α-SMA).

HFD 마우스는 SFD 마우스에 비해 간 성상 세포의 증가를 보였다. 로지글리타존은 아니지만 ENOblock을 처리한 마우스는 SFD 마우스에서 관찰된 수준으로 성상 세포 수를 감소시켰다. HFD 마우스의 간에서 섬유화의 발달을 감소시키는 ENOblock의 효과는 qPCR 및 α-SMA 발현의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 150 내지 도 153).HFD mice showed an increase in hepatic stellate cells compared to SFD mice. Mice treated with ENOblock but not rosiglitazone reduced stellate cell numbers to levels observed in SFD mice. The effect of ENOblock on reducing the development of fibrosis in the liver of HFD mice was confirmed by Western blot analysis of qPCR and α-SMA expression (FIGS. 150-153).

실험예Experimental Example 8. 염증에 대한  8. against inflammation ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

HFD 유도된 간 지방증은 만성 염증 및 간경변을 진행시킬 수 있다. 마우스에게 ENOblock을 8주간 처리하여 간 염증 마커의 평가를 진행하였다. 그 결과를 도 154 및 도 155에 나타내었다. S100 칼슘-결합 단백질 A9(S100a9)는 골수세포 기능을 조절하며, 이는 비알콜성 지방간염의 바이오마커이다. ENOblock을 처리한 마우스에서 상기 단백질의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 156에 나타내었다.HFD-induced hepatic steatosis can progress chronic inflammation and cirrhosis. Mice were treated with ENOblock for 8 weeks to assess liver inflammation markers. The results are shown in FIGS. 154 and 155. S100 calcium-binding protein A9 ( S100a9 ) regulates myeloid cell function, which is a biomarker of nonalcoholic steatohepatitis. Expression of the protein was assessed in mice treated with ENOblock. The result is shown in FIG.

도 154 및 도 155에 나타난 바와 같이, HFD가 인터루킨-6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF -α)의 발현을 증가시켰다. 또한, ENOblock 또는 로지글리타존의 처리는 SFD 마우스와 비교했을 때 IL-6 및 TNF -α의 발현을 감소시켰다. 또한, 도 156에 나타난 바와 같이, SFD 마우스보다 HFD 마우스에서 S100a9 발현이 증가하였다. 로지글리타존의 처리는 HFD 마우스에서 S100a9 발현을 증가시킨 반면, ENOblock 처리는 아무런 효과를 보이지 않았다.As shown in FIGS. 154 and 155, HFD increased the expression of interleukin-6 ( IL-6 ) and tumor necrosis factor-alpha ( TNF- α ). In addition, treatment with ENOblock or rosiglitazone reduced the expression of IL-6 and TNF- α as compared to SFD mice. In addition, as shown in Figure 156, S100a9 expression was increased in HFD mice than SFD mice. Treatment with rosiglitazone increased S100a9 expression in HFD mice, whereas treatment with ENOblock showed no effect.

실험예Experimental Example 9.  9. ENOblock의Of ENOblock 간 지질 항상성 및 글루코오스 신생 합성 억제 인자의 유도 Induction of Liver Lipid Homeostasis and Glucose Angiogenesis Inhibitors

스테롤 규정 성분 결합 단백질(Srebp -1a 및 Srebp -1c)은 지질 합성의 중요한 조절 인자이다. 마우스에게 ENOblock을 처리하여 상기 단백질의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 157에 나타내었다. 또한, Insig -1 및 Insig -2 단백질은 골지에서 Srebp-1a 및 Srebp -1c의 성숙을 막고, 자가분비 운동성 인자 수용체, 아이소폼 2(Amfr 또는 Gp-78)에 의해 교대로 조절된다. 마우스에 ENOblock을 처리하여 상기 단백질의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 158에 나타내었다. Sterol regulatory component binding proteins ( Srebp- 1a and Srebp- 1c ) are important regulators of lipid synthesis. Mice were treated with ENOblock to assess expression of these proteins. The result is illustrated in FIG. 157. Also, Insig Insig -1 and -2 proteins blocking the maturation of Srebp-1a -1c and Srebp from cardboard, self is controlled by secretion of motility factor receptor, alternately by the isoform 2 (Amfr or Gp-78). Mice were treated with ENOblock to assess expression of these proteins. The result is shown in FIG.

또한, ENOblock 처리된 마우스에서 간 X 수용체(LXR) 타겟 유전자의 발현을 관찰하였다. 그 결과를 도 159에 나타내었다. 비만에서 당뇨병 전증의 시작은 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제(Pck)에 의해 조절되는 글루코오스 신생 합성의 불규칙과 관련이 있다. ENOblock 처리된 마우스에서 상기 Pck 단백질의 발현을 측정하였다. 그 결과를 도 160에 나타내었다.In addition, expression of liver X receptor (LXR) target genes was observed in ENOblock treated mice. The result is illustrated in FIG. 159. The onset of prediabetes in obesity is associated with irregularities in glucose neosynthesis that are regulated by phosphoenolpyruvic acid carboxykinase ( Pck ). Expression of the Pck protein was measured in ENOblock treated mice. The results are shown in FIG. 160.

또한, 지방 생성의 중요한 조절 인자(Adipoq, Ap2, Ppar -γ, Retn 및 Cebpa)의 발현을 측정함으로써, ENOblock이 HFD 마우스에서 지방증을 억제함을 평가하였다. 그 결과를 도 161에 나타내었다(SFD= 표준 쥐를 먹인 마우스; HFD= 고지방 사료 급여 마우스; HFD-ENO= ENO 차단된 HFD 마우스; HFD-Rosi= 로지글리타존 처리된 HFD 마우스; ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.05 인 경우 해당 SFD- 정상 또는 SFD-대조군(표준 지방식이- 처리되지 않은 정상 건강 마우스 그룹) 0.001; ## 또는 ###: p <0.01 또는 p <0.001인 해당 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD- 비 처리 대조군 마우스 그룹) 샘플과는 유의미한 차이가 없음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001로 해당 'HFD-Rosi' 표본과 크게 다르지 않음.).In addition, by measuring the expression of important regulatory factors of adipogenesis ( Adipoq , Ap2 , Ppar -γ , Retn and Cebpa ), it was evaluated that ENOblock inhibited steatosis in HFD mice. The results are shown in FIG. 161 (SFD = mouse fed mice; HFD = high fat feed fed mice; HFD-ENO = ENO blocked HFD mice; HFD-Rosi = logiglitazone treated HFD mice; ns: not significantly different; *, ** or ***: corresponding SFD-normal or SFD-control (standard fatty diet-untreated normal healthy mouse group), if p <0.05, p <0.01 or p <0.05, respectively 0.001; ## or # ##: No significant difference from the corresponding 'HFD-none' or 'HFD-Control' (HFD-non-treated control mouse group) samples with p <0.01 or p <0.001; ж, жж or жжж: p <0.05, p <0.01 or p <0.001, not significantly different from the corresponding 'HFD-Rosi' sample.).

도 157 내지 도 161에 나타난 바와 같이, Srebp -1a 및 Srebp -1c의 발현은 SFD 마우스보다 HFD 마우스의 간에서 상향 조절되었다. ENOblock 처리는 Srebp -1a 및 Srebp -1c 발현을 억제하였다. 그리고, 로지글리타존 처리는 Srebp -1a 및 Srebp -1c의 발현을 억제하였다(도 157). 또한, ENOblock 처리는 Amfr 및 Insig -1의 발현에 큰 영향을 끼치지 않은 반면, Insig -2의 발현을 억제하였다(도 158). 뿐만 아니라, 간 X 수용체(LXR) 타겟 유전자인 Scap 및 Abcg5는 ENOblock 처리에 의해 각각 영향을 받지 않았거나 억제되었다(도 159).As shown in Figures 157 to 161, expression of Srebp- 1a and Srebp- 1c was upregulated in the liver of HFD mice rather than SFD mice. ENOblock treatment inhibited Srebp- 1a and Srebp- 1c expression. And rosiglitazone treatment inhibited the expression of Srebp- 1a and Srebp- 1c (FIG. 157). In addition, ENOblock treatment did not significantly affect the expression of Amfr and Insig- 1 , while inhibiting the expression of Insig- 2 (FIG. 158). In addition, the liver X receptor (LXR) target genes, Scap and Abcg5, were not affected or inhibited by ENOblock treatment, respectively (FIG. 159).

HFD 마우스는 SFD 마우스보다 증가된 Pck -1 및 Pck -2의 발현을 나타내었다. ENOblock 또는 로지글리타존 처리는 HFD 마우스에서 Pck -1 및 Pck -2의 발현을 감소시켰다(도 160). 또한, HPD 마우스는 SFD 마우스보다 모든 5개의 지방 생성 유전자의 발현이 상향 조절되었다. ENOblock 처리는 SFD 마우스에서 관찰된 수준으로 모든 5개의 지방 생성 유전자의 발현을 감소시켰다. HFD 마우스에서 로지글리타존 처리는 Ppar -γ, Retn 및 Cebpa의 발현을 감소시켰으나, Adipoq 및 Ap2의 발현을 유의하게 감소시키지 않았다(도 161).HFD mice showed increased expression of Pck- 1 and Pck- 2 than SFD mice. ENOblock or rosiglitazone treatment reduced the expression of Pck- 1 and Pck- 2 in HFD mice (FIG. 160). In addition, HPD mice upregulated the expression of all five adipose genes than SFD mice. ENOblock treatment reduced the expression of all five fat producing genes to the levels observed in SFD mice. Rosiglitazone treatment in HFD mice reduced the expression of Ppar- γ , Retn and Cebpa , but did not significantly reduce the expression of Adipoq and Ap2 (FIG. 161).

실험예Experimental Example 10. 해마 염증에 대한  10. Against Hippocampus Inflammation ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

실험예 10.1. ENOblock 처리에 따른 해마 염증 마커의 발현 평가Experimental Example 10.1. Expression Evaluation of Hippocampus Inflammatory Markers Following ENOblock Treatment

비만은 해마의 HFD 유발성 염증 반응으로 인한 것으로 생각되는 해마 기능 장애 및 기억 장애와 관련이 있다고 알려져 있다. HFD 마우스와 SFD 마우스를 비교하여 해마 염증 마커인 톨 유사 수용체(Tlr4), IL-6, TNF-α 및 CD11c의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 162에 나타내었다.Obesity is known to be associated with hippocampal dysfunction and memory impairment, which is thought to be due to HFD-induced inflammatory responses in the hippocampus. Comparison of HFD mice and SFD mice confirmed the expression of toll-like receptors (Tlr4), IL-6, TNF-α and CD11c, which are hippocampal inflammation markers. The result is illustrated in FIG. 162.

도 162에 나타난 바와 같이, HPD 마우스는 SFD 마우스와 비교하여 해마 염증 마커인 톨 유사 수용체(Tlr4), IL-6, TNF -α 및 CD11c의 발현이 증가한 것을 나타내었다. ENOblock 처리는 SFD 마우스(TNF -α 및 Cd11c의 경우) 또는 SFD 마우스(Tlr4 및 IL-6의 경우)에서 관찰된 수준으로 HFD 마우스에서 이들 염증 마커들의 발현을 감소시켰다.As shown in FIG. 162, HPD mice showed increased expression of toll-like receptors ( Tlr4 ), IL-6 , TNF- α, and CD11c , which are hippocampal inflammation markers, compared to SFD mice. ENOblock treatment reduced the expression of these inflammatory markers in HFD mice to the levels observed in SFD mice (for TNF- α and Cd11c ) or SFD mice (for Tlr4 and IL-6 ).

또한, 로지글리타존 처리는 해마의 염증성 마커들의 발현을 감소시켰다. 신경 pentraxin-2(Nptx2)는 시냅스 소성을 조절하고 비 apoptotic 신경 세포 death49의 친염증성 바이오 마커이다. Nptx2 발현은 SFD 마우스에 비해 HFD 마우스에서 상향 조절되었다. ENOblock의 처리는 SFD 마우스에서 관찰된 수준으로 HFD 마우스에서 Nptx2 발현을 감소시켰다. 또한, 로지글리타존도 HFD 마우스에서 Nptx2 발현을 감소시켰다.In addition, rosiglitazone treatment reduced the expression of inflammatory markers in the hippocampus. Neuronal pentraxin-2 ( Nptx2 ) regulates synaptic plasticity and is an proinflammatory biomarker of non-apoptotic neuronal cell death49. Nptx2 expression was upregulated in HFD mice compared to SFD mice. Treatment of ENOblock with Nptx2 in HFD mice to levels observed in SFD mice Expression was reduced. In addition, rosiglitazone is also Nptx2 in HFD mice. Expression was reduced.

실험예Experimental Example 10.2.  10.2. ENOblockENOblock 처리에 따른 미토콘드리아 관련 단백질의 발현 평가 Expression Assessment of Mitochondrial Related Proteins Following Treatment

HFD는 다양한 세포 유형에서 미토콘드리아 질량을 감소시켜 뇌의 에너지 및 기반 시설에서 변화를 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 본 실험에서는 ENOblock 처리에 따른 미토콘드리아 관련 단백질의 발현을 확인하였다.HFD is known to reduce mitochondrial mass in various cell types, causing changes in brain energy and infrastructure. In this experiment, we confirmed the expression of mitochondrial related proteins following ENOblock treatment.

그 결과를 도 163 내지 도 165에 나타내었다(스케일 바= 100 μm; SFD= 표준 사료 먹인 마우스; HFD= 고지방 사료먹인 마우스; HFD-ENO= ENOblock 처리한 HFD 마우스; HFD-Rosi= 로지글리타존 처리한 HFD 마우스; ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.01값으로 SFD- 정상 또는 SFD- 대조군(표준 지방식이 처리되지 않은 정상 마우스 그룹)과 유의미한 차이가 있음; ## 또는 ###: p <0.01 또는 p <0.001값으로, 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD- 비 처리 대조군 마우스 그룹) 샘플과는 유의미한 차이가 없음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001값으로 'HFD-Rosi' 샘플과 유의미한 차이가 있음.).The results are shown in Figures 163 to 165 (scale bar = 100 μm; SFD = standard feed fed mouse; HFD = high fat feed fed mouse; HFD-ENO = ENOblock treated HFD mouse; HFD-Rosi = rosiglitazone treated HFD Mice; ns: not significantly different; *, ** or ***: SF <-0.05, p <0.01 or p <0.01, respectively, with SFD-normal or SFD-control (normal mouse group without standard fat diet) Significant difference: ## or ###: p <0.01 or p <0.001, no significant difference from 'HFD-none' or 'HFD-Control' (HFD-non-treated control mouse group) samples; ж, жж or жжж: Significant difference from 'HFD-Rosi' sample with p <0.05, p <0.01 or p <0.001.).

도 163 내지 도 165에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아의 전사 인자 A(Tfam)는 mitochondrial genome copy number의 조절과 양의 상관관계를 가진다. Tfam의 발현은 SFD 마우스에 비해 HFD 마우스의 해마에서 감소되었다. ENOblock의 처리는 SFD 마우스에서 관찰된 수준으로 Tfam 발현을 증가시켰다. 또한 로지글리타존 투여는 HFD 마우스에서 Tfam 발현을 증가시켰다.As shown in Figures 163 to 165, mitochondrial transcription factor A ( Tfam ) has a positive correlation with the regulation of mitochondrial genome copy number. Tfam expression was decreased in the hippocampus of HFD mice compared to SFD mice. Treatment of ENOblock increased Tfam expression to the levels observed in SFD mice. Rosiglitazone administration also increased Tfam expression in HFD mice.

전사 인자 cAMP 반응 요소 결합 단백질(Creb)은 신경 세포의 에너지 상태의 변화에 민감하다. Creb 발현은 SFD 마우스에 비해 HFD 마우스에서 증가했다. 로지글리타존이 아닌 ENOblock은 HFD 마우스에서 Creb 발현을 감소시켰다. Nrf -1 및 Nrf-2는 신경 돌기 성장 및 미토콘드리아 생합성을 조절한다. Nrf -1 발현은 HFD 마우스에서 감소하였고 ENOblock 투여는 Nrf -1 발현을 유의하게 증가시켰다. 대조적으로, Nrf -2 발현은 HFD 마우스에서 증가하고 ENOblock 처리에 의해 감소되었다. 로지글리타존 처리는 Nrf -1 발현에 영향을 미치지 않았으나, ENOblock 투여와 유사하게 Nrf2의 발현을 감소시켰다(도 163).The transcription factor cAMP response element binding protein ( Creb ) is sensitive to changes in the energy state of neurons. Creb expression was increased in HFD mice compared to SFD mice. ENOblock, but not rosiglitazone, reduced Creb expression in HFD mice. Nrf- 1 and Nrf-2 regulate neurite outgrowth and mitochondrial biosynthesis. Nrf- 1 expression was decreased in HFD mice and ENOblock administration significantly increased Nrf- 1 expression. In contrast, Nrf- 2 expression was increased in HFD mice and decreased by ENOblock treatment. Rosiglitazone treatment did not affect Nrf- 1 expression, but decreased expression of Nrf2 similar to ENOblock administration (FIG. 163).

hippocampal bioenergetics에 대한 HFD의 부정적인 효과는 mtDNA 함량의 감소로 나타났다. ENOblock의 처리는 mtDNA 함량의 감소를 막았다. 또한, 로지글리타존 처리는 HFD 마우스에 비해 mtDNA 함량을 향상시켰지만, ENOblock 처리보다 유의성이 적었다(p<0.05, p <0.01)(도 164). 해마 뉴런의 Nissl 염색은 SFD, HFD 또는 ENOblock 처리된 HFD 마우스에서 신경 생존에 조직학적 차이를 나타내지 않았다. 이는 로지글리타존이 해마에서 독성을 일으킬 수 있다고 알려진 최초의 보고이다(도 165). 상기 결과는 ENOblock의 투여가 식이요법으로 인한 비만으로 발생하는 해마 손상의 발병을 해결할 수 있는 가능성을 보여준다.The negative effect of HFD on hippocampal bioenergetics resulted in a decrease in mtDNA content. Treatment of ENOblock prevented a decrease in mtDNA content. In addition, rosiglitazone treatment improved mtDNA content compared to HFD mice, but was less significant than ENOblock treatment ( p <0.05, p <0.01) (FIG. 164). Nissl staining of hippocampal neurons showed no histological difference in neuronal survival in SFD, HFD or ENOblock treated HFD mice. This is the first report that rosiglitazone is known to be toxic in the hippocampus (FIG. 165). The results show the possibility that administration of ENOblock may resolve the development of hippocampal damage caused by dietary obesity.

실험예Experimental Example 11. 혈청 지질에 대한  11. For Serum Lipids ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

HFD 마우스에 ENOblock 또는 로지글리타존을 8주간 처리 후, 트리글리세라이드, HDL 및 LDL 콜레스테롤의 혈청 수치를 측정하여 지질의 혈청 농도를 평가하였다. 그 결과를 도 166 내지 도 168에 나타내었다.After 8 weeks of treatment with ENOblock or rosiglitazone in HFD mice, serum levels of triglycerides, HDL and LDL cholesterol were measured to assess serum concentrations of lipids. The results are shown in FIGS. 166 to 168.

도 166 내지 도 168에 나타난 바와 같이, HFD 마우스는 트리글리세리드, HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 혈청 농도가 증가됨을 보였다. 로지글리타존이 처리된 HFD 마우스에서 혈청 트리글리세리드 수치가 증가하였고, HDL 콜레스테롤 수치가 감소하였으며, LDL 콜레스테롤 수치는 유의한 변화가 없었다. ENOblock 처리된 HFD 마우스는 처리되지 않은 HFD 마우스보다 혈청 트리글리세리드 및 LDL 콜레스테롤 수치가 감소하였다. ENOblock 처리된 HFD 마우스에서 혈청 LDL 콜레스테롤 수치는 SFD 마우스와 동일한 범위에 도달하였다.As shown in Figures 166-168, HFD mice showed increased serum concentrations of triglycerides, HDL cholesterol and LDL cholesterol. In the HFD mice treated with rosiglitazone, serum triglyceride levels were increased, HDL cholesterol levels were decreased, and LDL cholesterol levels were not significantly changed. ENOblock treated HFD mice had lower serum triglyceride and LDL cholesterol levels than untreated HFD mice. Serum LDL cholesterol levels in ENOblock treated HFD mice reached the same range as SFD mice.

실험예Experimental Example 12. 지방 과다증에 대한  12. About fatty hyperplasia ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

실험예 12.1. 생식선의 백색 지방 조직Experimental Example 12.1. White adipose tissue of the gonad

생식선의 백색 지방 조직을 대표하는 사진을 도 169에 나타내었다. ENOblock을 처리한 HFD 마우스에서 생식선의 백색 지방 조직 무게와 조직에서 지방 세포의 크기, 지질생성 유도 및 염증 마커의 발현을 측정하였다. 그 결과를 도 170 내지 도 174에 나타내었다.A photo representing white adipose tissue of the gonad is shown in FIG. 169. In the HFD mice treated with ENOblock, the white adipose tissue weight of the gonad and the size of fat cells, induction of lipid production and expression of inflammatory markers were measured. The results are shown in FIGS. 170-174.

도 170 내지 도 174에 나타난 바와 같이, HFD 마우스에서 ENOblock 처리는 생식선의 조직 무게를 감소시킨 반면, 로지글리타존 처리는 유의한 효과를 나타내지 않았다(도 170). 또한, ENOblock 처리에 의해, HFD 마우스의 생식선의 백색 지방 조직에서 지방 세포 크기의 증가가 억제되었다. 이는 지방 세포 크기를 감소시키는 로지글리타존보다 더 효과적이었다(도 171 및 도 172).As shown in FIGS. 170-174, ENOblock treatment decreased the tissue weight of the gonads in HFD mice, while rosiglitazone treatment did not show a significant effect (FIG. 170). ENOblock treatment also inhibited the increase of adipocyte size in white adipose tissue of the gonads of HFD mice. This was more effective than rosiglitazone, which reduced fat cell size (FIGS. 171 and 172).

갈색 지방 조직에서 열발생 조절인자와 비만은 백색 지방 조직에서 지질생성을 유도하는 것을 보였다. H&E 염색은 ENOblock 처리된 HFD 마우스의 생식선의 백색 지방 조직에서 지방세포의 침투를 나타내었다(도 173). 또한, ENOblock 및 로지글리타존 처리는 생식선의 백색 지방 조직에서 염증 마커인 TNF -α 및 Cd11c의 발현을 하향 조절한 반면, Mcp -1의 발현을 하향 조절하지 않았다. 지질생성의 마스터 중재자인 Ppar -γ의 발현은 생식선의 백색 지방 조직에서 ENOblock 처리에 의해 하향 조절되었다. 로지글리타존 처리는 ENOblock 보다 HFD 생식선의 백색 지방 조직에서 Ppar-γ의 발현을 덜 억제하였다(도 174).Thermogenic regulators and obesity in brown adipose tissue have been shown to induce lipid formation in white adipose tissue. H & E staining showed infiltration of adipocytes in white adipose tissue of the gonad of ENOblock treated HFD mice (FIG. 173). In addition, ENOblock and rosiglitazone treatment down-regulated the expression of inflammatory markers TNF- α and Cd11c in white adipose tissue of the gonad, while not down-regulating the expression of Mcp- 1 . The expression of Ppar- γ , a master mediator of lipogenesis , was down regulated by ENOblock treatment in white adipose tissue of the gonads. Rosiglitazone treatment inhibited the expression of Ppar-γ in white adipose tissue of HFD gonads less than ENOblock (FIG. 174).

실험예Experimental Example 12.2. 견갑골 사이의 12.2. Scapula 갈색 지방 조직Brown adipose tissue

견갑골 사이의 갈색 지방 조직을 대표하는 사진을 도 175에 나타내었다. ENOblock을 처리한 HFD 마우스에서 견갑골 사이 갈색 지방 조직의 무게, 지방 세포의 크기, 염증 마커의 발현 및 섬유증 정도를 측정하였다.A photograph representing the brown adipose tissue between the scapula is shown in FIG. 175. The weight of brown adipose tissue, the size of fat cells, the expression of inflammatory markers and the degree of fibrosis were measured in HFD mice treated with ENOblock.

그 결과를 도 176 내지 도 181에 나타내었다(SFD= 표준 사료를 먹인 마우스; HFD= 고지방 사료 급여 마우스; HFD-ENO= ENOblock 처리한 HFD 마우스; HFD-Rosi= 로지글리타존 처리한 HFD 마우스; 스케일바= 100 μm; ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001의 값으로 SFD- 정상 또는 SFD- 대조군(표준 지방 다이어트- 약물 처리하지 않은 정상 마우스 그룹)과 유의하게 다름; ## 또는 ###: p <0.01 또는 p <0.001 값으로 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD- 비 처리 대조군 마우스 그룹) 샘플과는 유의미한 차이가 없음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001의 값으로 'HFD-Rosi' 표본과 크게 다름.).The results are shown in Figures 176 to 181 (SFD = mice fed standard feed; HFD = high fat feed fed mice; HFD-ENO = HFD mice treated with ENOblock; HFD-Rosi = rosiglitazone treated HFD mice; scale bars = 100 μm; ns: not very different; *, ** or ***: SFD-Normal or SFD-Control (standard fat diet-Non-drug normal) with values of p <0.05, p <0.01 or p <0.001, respectively Significantly different from the 'HFD-none' or 'HFD-Control' samples (p <0.01 or p <0.001). None; ж, жж or жжж: significantly different from the 'HFD-Rosi' sample with p <0.05, p <0.01 or p <0.001.).

도 176 내지 도 181에 나타난 바와 같이, ENOblock 또는 로지글리타존을 처리한 HFD 마우스는 HFD 또는 SFD 마우스와 비교했을 때 견갑골 사이의 갈색 지방 조직 무게를 증가시켰다. 갈색 지방 조직 무게에서 ENOblock의 효과는 로지글리타존 처리된 마우스보다 크다(도 176). 견갑골 사이 갈색 지방 조직의 H&E 염색은 HFD, 로지글리타존 처리된 HFD 및 SFD 마우스와 비교할 때 ENOblock 처리된 HFD 마우스에서 감소된 지방 세포 크기를 보였다(도 177).As shown in Figures 176-181, HFD mice treated with ENOblock or rosiglitazone increased the brown adipose tissue weight between the scapula when compared to HFD or SFD mice. The effect of ENOblock on brown adipose tissue weight was greater than that of rosiglitazone treated mice (FIG. 176). H & E staining of brown adipose tissue between the scapula showed reduced adipocyte size in ENOblock treated HFD mice compared to HFD, rosiglitazone treated HFD and SFD mice (FIG. 177).

염증 마커인 TNF -α, Cd11c 및 Mcp -1, 그리고 지질생성의 마스터 조절 인자인 Ppar -γ는 모두 ENOblock 또는 로지글리타존 처리 이후 HFD 갈색 지방 조직에서 하향 조절되었다(도 178). Masson-Trichrome 염색은 ENOblock 또는 로지글리타존 처리가 HFD 갈색 지방 조직에서 섬유증의 진행을 억제함을 나타내었다(도 180 및 도 181).Inflammatory markers TNF- α , Cd11c and Mcp- 1 , and Ppar- γ , the master regulator of lipogenesis, were all downregulated in HFD brown adipose tissue after ENOblock or rosiglitazone treatment (FIG. 178). Masson-Trichrome staining showed that ENOblock or rosiglitazone treatment inhibited the progression of fibrosis in HFD brown adipose tissue (FIGS. 180 and 181).

실험예Experimental Example 13. 당뇨병  13. Diabetes 전증의Wholehearted 증상에 대한  For symptoms ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

비만은 당뇨병 전증/인슐린 저항의 진행과 연관이 있으며, 이는 식이 유도된 비만 마우스 모델에서 발생한다. 비만에서 당뇨병 전증을 예방하기 위한 ENOblock의 잠재적인 효과를 평가하기 위하여, HFD 마우스를 ENOblock 또는 metformin(Glucophage^TM)으로 처리하였고, 이는 비만 환자의 당뇨병에 대한 가장 중요한 치료법이다.Obesity is associated with progression of prediabetes / insulin resistance, which occurs in a diet-induced obese mouse model. To assess the potential effects of ENOblock to prevent prediabetes in obesity, HFD mice were treated with ENOblock or metformin (Glucophage ^™ ), which is the most important treatment for diabetes in obese patients.

HFD 마우스에서 ENOblock 또는 metformin의 처리 일정은 도 182에 나타내었다. 상기 결과를 도 183 내지 도 191에 나타내었다(SFD= 표준 쥐를 먹인 마우스; HFD= 고지방 사료 급여 마우스; HFD-ENO= ENO 차단된 HFD 마우스; HFD-Metf= metformin 처리된 HFD 마우스; ns: 유의성 있는 차이가 없음; *, ** 또는 ***: 각각 p <0.05, p <0.01 또는 p <0.05인 경우 해당 SFD- 정상 또는 SFD- 대조군(표준 지방식이- 처리되지 않은 정상 건강 마우스 그룹) 0.001; ## 또는 ###: p <0.01 또는 p <0.001인 해당 'HFD-none' 또는 'HFD-Control'(HFD- 처리되지 않은 대조군 마우스 그룹) 샘플과는 유의미한 차이가 없었음; ж, жж 또는 жжж: p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001인 각각의 해당 'HFD-Metf' 표본과 유의미한 차이가 있음.).The schedule of treatment of ENOblock or metformin in HFD mice is shown in FIG. 182. The results are shown in FIGS. 183-191 (SFD = mouse fed mice; HFD = high fat feed fed mice; HFD-ENO = ENO blocked HFD mice; HFD-Metf = metformin treated HFD mice; ns: significant) No difference; *, **, or ***: respectively, with p <0.05, p <0.01 or p <0.05. ; ## or ###: no significant difference from the corresponding 'HFD-none' or 'HFD-Control' (HFD-untreated control mouse group) samples with p <0.01 or p <0.001; ж, жж Or жжж: significant difference from each corresponding 'HFD-Metf' sample with p <0.05, p <0.01 or p <0.001.).

도 183 내지 도 191에 나타난 바와 같이, 8주 뒤, metformin 또는 ENOblock 처리된 HFD 마우스는 감소된 양의 내장 지방을 나타냈다(도 183). 약물 처리 과정 동안, ENOblock 및 metformin은 모두 체중을 감소시켰다. 7주 후, ENOblock 처리된 마우스는 metformin 처리된 마우스보다 상당히 가벼워졌다(도 184). 공복혈당은 metformin 및 ENOblock 처리된 HFD 마우스 모두에서 감소하였다.As shown in FIGS. 183-191, after 8 weeks, metformin or ENOblock treated HFD mice showed reduced amounts of visceral fat (FIG. 183). During the course of drug treatment, both ENOblock and metformin lost weight. After 7 weeks, ENOblock treated mice were significantly lighter than metformin treated mice (FIG. 184). Fasting glucose was decreased in both metformin and ENOblock treated HFD mice.

또한, 약물 처리 6주차에 metformin 처리된 마우스보다 ENOblock 처리된 마우스가 더 낮은 혈당수치를 나타냈다(도 185). 혈당 내성 테스트(약물 처리 4주차), 인슐린 내성 테스트(약물 처리 5주차) 및 피루브산 내성 테스트(약물 처리 7주차)는 ENOblock 및 metformin이 인슐린 저항/감수성 및 글루코오스 신생 합성 수치에서 비슷하게 향상함을 나타내었다. SFD 마우스는 모든 범위 안에 포함되었다(도 186 내지 도 191).In addition, at 6 weeks of drug treatment, ENOblock-treated mice showed lower blood glucose levels than metformin-treated mice (FIG. 185). Blood glucose tolerance test (week 4 drug treatment), insulin resistance test (week 5 drug treatment) and pyruvate resistance test (week 7 drug treatment) showed similar improvements in ENOblock and metformin in insulin resistance / sensitivity and glucose neosynthesis levels. . SFD mice were included in all ranges (FIGS. 186-191).

실험예Experimental Example 14. 고인슐린혈증( 14. Hyperinsulinemia ( hyperinsulinemiahyperinsulinemia )에 대한 For) ENOblock의Of ENOblock 효과 effect

HFD 마우스에게 ENOblock 및 metformin을 8주간 처리하여 고인슐린혈증에 대한 ENOblock의 효과를 확인하였다. 그 결과를 도 192 내지 도 197에 나타내었다(ns: 크게 다르지 않음; *, ** 또는 ***: ‘SFD-Normal’ 또는 ‘SFD-Control’(Standard Fat Diet-none)과 유의한 차이가 없음; p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001; ## 또는 ###: 각각 해당 HFD-none 또는 HFD-Control(HFD-none-treated p <0.01 또는 p <0.001인 대조군 마우스 그룹) 샘플; p <0.05, p <0.01 또는 p <0.001 인 각각의 'HFD-Metf'샘플과 유의성 있는 차이가 있음.).HFD mice were treated with ENOblock and metformin for 8 weeks to confirm the effect of ENOblock on hyperinsulinemia. The results are shown in FIGS. 192-197 (ns: not significantly different; *, ** or ***: significant differences from 'SFD-Normal' or 'SFD-Control' (Standard Fat Diet-none) None; p <0.05, p <0.01 or p <0.001; ## or ###: corresponding HFD-none or HFD-Control (HFD-none-treated p <0.01 or p <0.001, respectively) samples; significant difference with each 'HFD-Metf' sample with p <0.05, p <0.01 or p <0.001).

도 192 내지 도 197에 나타난 바와 같이, HFD 마우스는 고인슐린혈증과 증가된 HOMA-IR을 나타내었고, 이는 ENOblock 또는 metformin 처리에 의해 감소되었다. 약물 처리 8주 후, ENOblock 처리는 metformin 보다 고인슐린혈증 및 HOMA-IR을 상당히 감소시켰다(도 192 및 도 193). 해부된 생식선의 백색 지방 조직 사진을 도 194에 나타내었다. ENOblock 및 metformin 처리는 생식선의 갈색 지방 조직 무게를 감소시켰고, ENOblock이 metformin보다 더 큰 효과를 나타내었다(도 195). 비만은 지방 조직 염증과 관련이 있으며, 이는 항 염증'M2'형 대식세포의 감소된 수에 의해 특징지어진다. 백색 지방 조직으로부터 유래된 염증 세포 내에 판 대식세포 마커 CD68(macrosialin) 및 M2 대식세포 마커 CD206(mannose receptor)의 발현에 대한 유동세포분석은 SFD 마우스보다 HFD 마우스에서 M2 대식세포 수의 감소를 확인하였다. ENOblock 처리는 HFD 마우스의 지방 조직에서 M2 대식세포의 비율을 증가시켰다. metformin 처리는 HFD 마우스에서 가변적인 반응을 일으켰다. 전반적으로, M2 대식세포의 비율은 처리되지 않은 HFD 마우스보다 유의성 있는 변화가 없었다 (도 196 및 도 197).As shown in Figures 192-197, HFD mice showed hyperinsulinemia and increased HOMA-IR, which were reduced by ENOblock or metformin treatment. After 8 weeks of drug treatment, ENOblock treatment significantly reduced hyperinsulinemia and HOMA-IR than metformin (FIGS. 192 and 193). White adipose tissue photographs of the dissected gonads are shown in FIG. 194. ENOblock and metformin treatment reduced the weight of brown adipose tissue of the gonad, and ENOblock showed a greater effect than metformin (FIG. 195). Obesity is associated with adipose tissue inflammation, which is characterized by a reduced number of anti-inflammatory 'M2' type macrophages. Flow cytometry of the expression of plate macrophage marker CD68 (macrosialin) and M2 macrophage marker CD206 (mannose receptor) in inflammatory cells derived from white adipose tissue confirmed a decrease in the number of M2 macrophages in HFD mice than in SFD mice. . ENOblock treatment increased the proportion of M2 macrophages in adipose tissue of HFD mice. Metformin treatment caused a variable response in HFD mice. Overall, the proportion of M2 macrophages was not significantly changed than untreated HFD mice (FIGS. 196 and 197).

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY COMPRISING ENOblock <130> FPD/201704-0044 <150> KR 10-2017-0017032 <151> 2017-02-07 <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abcg5_forward primer <400> 1 cgtggcggac caaatga 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abcg5_reverse primer <400> 2 gctcgccact ggaaattcc 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiotensin_forward primer <400> 3 agtgggagag gttctcaata gca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiotensin_reverse primer <400> 4 gacgtggtcg gctgttcct 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asah2_forward primer <400> 5 gcaaagcgaa ccttctccac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asah2_reverse primer <400> 6 actggtaaca aacaagaggg tga 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-Enolase(eno1)_forward primer <400> 7 gcaccctctt tccttgcttt g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-Enolase(eno1)_reverse primer <400> 8 cctgagaata gacatggcga att 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-MHC_forward primer <400> 9 gggaagactg tgaacacaaa acg 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-MHC_reverse primer <400> 10 cttgctacgg tcccctatgg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax_forward primer <400> 11 ggcctttttg ctacagggtt t 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax_reverse primer <400> 12 gtgtctcccc agccatcct 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B4galnt1_forward primer <400> 13 cagcccagtt ctggataaac tca 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B4galnt1_reverse primer <400> 14 agctccggct gctgtaagtc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd11c_forward primer <400> 15 ctggatagcc tttcttctgc tg 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd11c_reverse primer <400> 16 gcacactgtg tccgaactca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_forward primer <400> 17 cagctgcctg cgtaagttca 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_reverse primer <400> 18 gcagacgttg ttgatgttgc a 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a2_forward primer <400> 19 cccatctgac atcacacttg ttg 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a2_reverse primer <400> 20 tgagattacg ccgggtatcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a3_forward primer <400> 21 ggcagagctc tcgaacccta t 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a3_reverse primer <400> 22 tgaacagcta tggccattgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a3_forward primer <400> 23 catcgatgga tcccgaaatg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a3_reverse primer <400> 24 cgggtggtgt caaagcctat 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox-2_forward primer <400> 25 agaggtgtat ccccccacag t 21 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox-2_reverse primer <400> 26 tgctcccgaa gccagatg 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc_forward primer <400> 27 gtctttccct acccgctcaa c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc_reverse primer <400> 28 gtggaatcgg acgaggtaca g 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbb2_forward primer <400> 29 tggatgattg actccgaatg tc 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbb2_reverse primer <400> 30 tgccatacgg gagaattctg a 21 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata4_forward primer <400> 31 cctcccgcac gatttctg 18 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata4_reverse primer <400> 32 ctcaggaaaa agaaaatccc aaatt 25 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-4_forward primer <400> 33 catggctgtc gctggtttc 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-4_reverse primer <400> 34 aaacccatgc cgacaatga 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-1_forward primer <400> 35 cacctgggag aaccacacaa g 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-1_reverse primer <400> 36 cacggcaata cagcgcataa 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2_forward primer <400> 37 atgtgatcac gagcatcttt tca 23 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2_reverse primer <400> 38 ggctgtgccg cagcat 16 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2a_forward primer <400> 39 tctggtaggt cccacgttca g 21 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2a_reverse primer <400> 40 gaactgtgaa gtgaagcaga ccaa 24 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2b_forward primer <400> 41 tctggtaggt cccacgttca g 21 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2b_reverse primer <400> 42 gaactgtgaa gtgaagcaga ccaa 24 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-6_forward primer <400> 43 tagtccttcc taccccaatt tcc 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-6_reverse primer <400> 44 ttggtcctta gccactcctt c 21 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Irap_forward primer <400> 45 tgccattatt cctctatgct atgaact 27 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Irap_reverse primer <400> 46 cagatcccct gaatgtcatt ga 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kcnk1_forward primer <400> 47 caacggtgta ggaccagaca ac 22 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kcnk1_reverse primer <400> 48 ccagtccaaa tagattcacc ttctc 25 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3_forward primer <400> 49 tcctgatgtt ggtggcttca g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3_reverse primer <400> 50 tgtcttggca aatccggtgt a 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcp-1(=ccl2)_forward primer <400> 51 ctcctgctca tagctaccac cat 23 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcp-1(=ccl2)_reverse primer <400> 52 gggtgctcac cgcatctg 18 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-1_forward primer <400> 53 ctgcataacg gtctggactt c 21 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-1_reverse primer <400> 54 cagcaactgc ccgtactcc 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-2_forward primer <400> 55 ccacaggact ccccatgct 19 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-2_reverse primer <400> 56 atggctgcta tgtacctccc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_forward primer <400> 57 tgcatggacg atctgttgct 20 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_reverse primer <400> 58 ttcacttggg ccttcaaaaa a 21 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar-c_forward primer <400> 59 gcccaccaac ttcggaatc 19 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar-c_reverse primer <400> 60 tgcgagtggt cttccatcac 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1a_forward primer <400> 61 gatgtgcgaa ctggacacag 20 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1a_reverse primer <400> 62 catagggggc gtcaaacag 19 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1c_forward primer <400> 63 ccagagggtg agcctgacaa 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1c_forward primer <400> 64 agcctctgca atttccagat ct 22 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scap_forward primer <400> 65 tctgacttct tcctccagat gct 23 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scap_reverse primer <400> 66 catccggcga atgtcgat 18 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tlr-4_forward primer <400> 67 cctggctggt ttacacgtc 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tlr-4_reverse primer <400> 68 gacattgcag aaacattcgc 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf-a_forward primer <400> 69 aagcctgtag cccacgtcgt a 21 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf-a_reverse primer <400> 70 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24 <110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY          COMPRISING ENOblock <130> FPD / 201704-0044 <150> KR 10-2017-0017032 <151> 2017-02-07 <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abcg5_forward primer <400> 1 cgtggcggac caaatga 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Abcg5_reverse primer <400> 2 gctcgccact ggaaattcc 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiotensin_forward primer <400> 3 agtgggagag gttctcaata gca 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiotensin_reverse primer <400> 4 gacgtggtcg gctgttcct 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asah2_forward primer <400> 5 gcaaagcgaa ccttctccac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asah2_reverse primer <400> 6 actggtaaca aacaagaggg tga 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-Enolase (eno1) _forward primer <400> 7 gcaccctctt tccttgcttt g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-Enolase (eno1) _reverse primer <400> 8 cctgagaata gacatggcga att 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-MHC_forward primer <400> 9 gggaagactg tgaacacaaa acg 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-MHC_reverse primer <400> 10 cttgctacgg tcccctatgg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax_forward primer <400> 11 ggcctttttg ctacagggtt t 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax_reverse primer <400> 12 gtgtctcccc agccatcct 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B4galnt1_forward primer <400> 13 cagcccagtt ctggataaac tca 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B4galnt1_reverse primer <400> 14 agctccggct gctgtaagtc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd11c_forward primer <400> 15 ctggatagcc tttcttctgc tg 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cd11c_reverse primer <400> 16 gcacactgtg tccgaactca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_forward primer <400> 17 cagctgcctg cgtaagttca 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a1_reverse primer <400> 18 gcagacgttg ttgatgttgc a 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a2_forward primer <400> 19 cccatctgac atcacacttg ttg 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a2_reverse primer <400> 20 tgagattacg ccgggtatcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a3_forward primer <400> 21 ggcagagctc tcgaacccta t 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col4a3_reverse primer <400> 22 tgaacagcta tggccattgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a3_forward primer <400> 23 catcgatgga tcccgaaatg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col6a3_reverse primer <400> 24 cgggtggtgt caaagcctat 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox-2_forward primer <400> 25 agaggtgtat ccccccacag t 21 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox-2_reverse primer <400> 26 tgctcccgaa gccagatg 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc_forward primer <400> 27 gtctttccct acccgctcaa c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc_reverse primer <400> 28 gtggaatcgg acgaggtaca g 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbb2_forward primer <400> 29 tggatgattg actccgaatg tc 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erbb2_reverse primer <400> 30 tgccatacgg gagaattctg a 21 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata4_forward primer <400> 31 cctcccgcac gatttctg 18 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata4_reverse primer <400> 32 ctcaggaaaa agaaaatccc aaatt 25 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-4_forward primer <400> 33 catggctgtc gctggtttc 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut-4_reverse primer <400> 34 aaacccatgc cgacaatga 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-1_forward primer <400> 35 cacctgggag aaccacacaa g 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-1_reverse primer <400> 36 cacggcaata cagcgcataa 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2_forward primer <400> 37 atgtgatcac gagcatcttt tca 23 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2_reverse primer <400> 38 ggctgtgccg cagcat 16 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2a_forward primer <400> 39 tctggtaggt cccacgttca g 21 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2a_reverse primer <400> 40 gaactgtgaa gtgaagcaga ccaa 24 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2b_forward primer <400> 41 tctggtaggt cccacgttca g 21 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insig-2b_reverse primer <400> 42 gaactgtgaa gtgaagcaga ccaa 24 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-6_forward primer <400> 43 tagtccttcc taccccaatt tcc 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-6_reverse primer <400> 44 ttggtcctta gccactcctt c 21 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Irap_forward primer <400> 45 tgccattatt cctctatgct atgaact 27 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Irap_reverse primer <400> 46 cagatcccct gaatgtcatt ga 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kcnk1_forward primer <400> 47 caacggtgta ggaccagaca ac 22 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kcnk1_reverse primer <400> 48 ccagtccaaa tagattcacc ttctc 25 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3_forward primer <400> 49 tcctgatgtt ggtggcttca g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mmp3_reverse primer <400> 50 tgtcttggca aatccggtgt a 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcp-1 (= ccl2) _forward primer <400> 51 ctcctgctca tagctaccac cat 23 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcp-1 (= ccl2) _ reverse primer <400> 52 gggtgctcac cgcatctg 18 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-1_forward primer <400> 53 ctgcataacg gtctggactt c 21 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-1_reverse primer <400> 54 cagcaactgc ccgtactcc 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-2_forward primer <400> 55 ccacaggact ccccatgct 19 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pck-2_reverse primer <400> 56 atggctgcta tgtacctccc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_forward primer <400> 57 tgcatggacg atctgttgct 20 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_reverse primer <400> 58 ttcacttggg ccttcaaaaa a 21 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar-c_forward primer <400> 59 gcccaccaac ttcggaatc 19 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar-c_reverse primer <400> 60 tgcgagtggt cttccatcac 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1a_forward primer <400> 61 gatgtgcgaa ctggacacag 20 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1a_reverse primer <400> 62 catagggggc gtcaaacag 19 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1c_forward primer <400> 63 ccagagggtg agcctgacaa 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srebp-1c_forward primer <400> 64 agcctctgca atttccagat ct 22 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scap_forward primer <400> 65 tctgacttct tcctccagat gct 23 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scap_reverse primer <400> 66 catccggcga atgtcgat 18 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tlr-4_forward primer <400> 67 cctggctggt ttacacgtc 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tlr-4_reverse primer <400> 68 gacattgcag aaacattcgc 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf-a_forward primer <400> 69 aagcctgtag cccacgtcgt a 21 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tnf-a_reverse primer <400> 70 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24

Claims (11)

삭제delete 삭제delete 삭제delete ENOblock을 유효성분으로 포함하고,
상기 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 1>

상기 화학식에서, R1은 H이고; R2는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p, q 및 m은 각각 1-5의 정수이다)이다.Including ENOblock as an active ingredient,
The ENOblock is a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis, characterized in that represented by the following formula (1):
<Formula 1>

In the above formula, R 1 is H; R2 is-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p, q and m are each an integer of 1-5). 제4항에 있어서,
상기 섬유증은 간 섬유증, 신장 섬유증, 심근 섬유증 및 심장 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.The method of claim 4, wherein
The fibrosis is characterized in that any one selected from the group consisting of liver fibrosis, kidney fibrosis, myocardial fibrosis and cardiac fibrosis. ENOblock을 유효성분으로 포함하고,
상기 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

상기 화학식에서, R1은 H이고; R2는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p, q 및 m은 각각 1-5의 정수이다)이다.Including ENOblock as an active ingredient,
The ENOblock is a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver, characterized in that represented by the formula (1).
<Formula 1>

In the above formula, R 1 is H; R2 is-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p, q and m are each an integer of 1-5). ENOblock을 유효성분으로 포함하고,
상기 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는,
당뇨성 신장병, 당뇨성 간 장애, 당뇨성 심장질환, 당뇨성 뇌병증, 및 당뇨성 신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 당뇨 합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

상기 화학식에서, R1은 H이고; R2는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p, q 및 m은 각각 1-5의 정수이다)이다.Including ENOblock as an active ingredient,
The ENOblock is characterized in that represented by the following formula (1),
A pharmaceutical composition for preventing or treating at least one diabetic complication selected from the group consisting of diabetic nephropathy, diabetic liver disorder, diabetic heart disease, diabetic encephalopathy, and diabetic neuropathy.
<Formula 1>

In the above formula, R 1 is H; R2 is-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p, q and m are each an integer of 1-5). 삭제delete ENOblock을 유효성분으로 포함하고,
상기 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

상기 화학식에서, R1은 H이고; R2는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p, q 및 m은 각각 1-5의 정수이다)이다.Including ENOblock as an active ingredient,
The ENOblock is a pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia, characterized in that represented by the formula (1).
<Formula 1>

In the above formula, R 1 is H; R2 is-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p, q and m are each an integer of 1-5). ENOblock을 유효성분으로 포함하고,
상기 ENOblock은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
<화학식 1>

상기 화학식에서, R1은 H이고; R2는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 n, p, q 및 m은 각각 1-5의 정수이다)이다.Including ENOblock as an active ingredient,
The ENOblock is a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease, characterized in that represented by the following formula (1).
<Formula 1>

In the above formula, R 1 is H; R2 is-(CH2) q- (CONH)-[(CH2) mO] n- (CH2) p-NH2 (where n, p, q and m are each an integer of 1-5). 삭제delete

Images