KR102056172B1 - Composition for treating or preventing arthritis comprising culture solution of stem cell-derived exosome - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액의 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 연골 재생 촉진인자 등 기능성 유효성분을 함유한 엑소좀을 다량 함유하고 있어 종래 관절염 치료를 위한 줄기세포 이식 방법 및 일반적인 줄기세포 배양 조건 하에서 수득한 배양액 처리에 비해 월등히 우수한 관절염 치료 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 효과적인 관절염 치료를 위한 새로운 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating arthritis in a stem cell-derived exosome-containing culture, specifically, the present invention is a stem obtained by treating TNF-α in a stem cell culture and culturing under an oxygen concentration condition of 1 to 8% It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a cell-derived exosome-containing culture medium as an active ingredient. The stem cell-derived exosome-containing culture medium according to the present invention contains a large amount of exosomes containing functional active ingredients such as cartilage regeneration promoters, and thus, a stem cell transplantation method for treating arthritis, and a culture solution obtained under general stem cell culture conditions. It was confirmed that the superior arthritis treatment effect compared to. Therefore, the stem cell-derived exosome-containing culture medium according to the present invention has an effect that can be used as a new therapeutic agent for effective arthritis treatment.

Description

줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for treating or preventing arthritis comprising culture solution of stem cell-derived exosome}Composition for treating or preventing arthritis comprising culture solution of stem cell-derived exosomes

본 발명은 줄기세포로부터 분비된 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the prevention or treatment of arthritis, comprising an exosome-containing culture medium secreted from stem cells as an active ingredient.

관절염은 통증, 강직, 운동기능 부전을 일으키는 가장 흔한 질병 중의 하나이다. 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 콜라겐 II (collagen II)에 대한 자가면역 반응으로 인한 염증성 질환으로 관절의 부종과 통증을 동반한다. 이에 비해 골관절염(osteoarthritis, OA)은 관절의 퇴행성 변성을 특징으로 하며, 연골세포 및 조직의 파괴로 인한 통증과 관절변형을 유발한다. 특히 골관절염에서는 노화 및 세포사멸에 따라 연골세포(chondrocytes)의 수 및 기능저하로 peptidoglycans (PG), collagen II 및 aggrecan과 같은 정상적인 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 성분과 구조(architecture)의 소실이 가속화된다. 한편, 현재까지 류마티스 관절염 치료에는 통증과 염증완화를 위한 진통소염제가 주로 처방되고 있을 뿐 면역반응을 근본적으로 해결할 수 있는 원인치료제가 개발되지 못하고 있다. 또한 골관절염의 진행을 멈추고 회복시켜 줄 수 있는 치료제 역시 제시되어 있지 않으며, 단지 일시적으로 통증을 완화시켜 주거나 수술치료에 의존하고 있다.Arthritis is one of the most common diseases causing pain, stiffness and dysfunction. Rheumatoid arthritis (RA) is an inflammatory disease caused by an autoimmune response to collagen II, accompanied by swelling and pain in the joints. In contrast, osteoarthritis (OA) is characterized by degenerative degeneration of the joint and causes pain and joint deformation due to the destruction of chondrocytes and tissues. In osteoarthritis, in particular, loss of the components and architecture of normal extracellular matrix (ECM) such as peptidoglycans (PG), collagen II, and aggrecan due to aging and apoptosis of chondrocytes. This is accelerated. Meanwhile, until now, rheumatoid arthritis treatment is mainly prescribed painkillers for pain and alleviation of inflammation, but there is no development of a causative agent that can fundamentally solve the immune response. In addition, there are no treatments that can stop and restore the progression of osteoarthritis, and only relieve pain temporarily or rely on surgical treatment.

이러한 관점에서 최근 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)를 활용한 관절의 보호 및 재생을 도모할 수 있는 새로운 치료 전략이 큰 관심을 불러일으키고 있다. 특히 중간엽 줄기세포는 골수, 지방, 제대혈 등 여러 조직으로부터 얻을 수 있고, 자가분열과 증식능이 우수하며 체외 및 체내에서 연골조직으로 분화될 수 있어 손상된 관절을 대체할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 실제로, 최근 제대혈 줄기세포(umbilical cord blood stem cells, UCBSC)와 지방줄기세포(adipose tissue stem cells, ASC)가 골관절염 동물모델과 임상시험에서 큰 부작용 없이 관절의 통증완화 및 연골세포 재생을 통해 관절손상을 개선시켜 줌이 입증된 바 있다. 하지만 자가줄기세포(autologous stem cells)에 비해 동종줄기세포(allogeneic stem cells)나 이종줄기세포(heterogenic stem cells)를 고용량으로 주사할 경우 종종 관절강 내 삼출물이 저류되는 문제점이 발생하고 있고 이를 해결하기 위한 방법으로 줄기세포의 직접 이식방법 보다 배양액(conditioned medium, CM)만의 주입으로 연골손상을 회복시켜 줄 수 있는 기술 연구가 진행 중에 있다. 이는 줄기세포가 다양한 생체기능을 매개 및 조절할 수 있는 사이토카인(cytokines), 케모카인(chemokines), 성장인자(growth factors, GF), 신경영양인자(neurotrophic factors, NF) 등의 많은 분비인자(secretory factors)를 방출함으로써 손상조직의 회복을 촉진시켜 주는 곁분비효과(paracrine effect)를 발휘한다는 장점을 지니고 있으며, 더욱이 제대혈줄기세포, 지방줄기세포, 골수줄기세포(bone marrow stem cells, BMSC)와 같은 중간엽 줄기세포로부터 유리된 트롬보스폰딘2 (thrombospondin 2, TSP2)는 줄기세포를 연골세포로 분화시키고 연골세포 증식을 촉진시킴으로써 골관점염을 회복시켜 주는 것으로 알려져 있다.In this regard, a new therapeutic strategy that can promote the protection and regeneration of joints using mesenchymal stem cells (MSCs) has attracted great interest. In particular, mesenchymal stem cells can be obtained from various tissues such as bone marrow, adipose, umbilical cord blood, have excellent self-dividing and proliferative properties, and can be differentiated into cartilage tissues in vitro and in vivo to replace damaged joints. Indeed, umbilical cord blood stem cells (UCBSC) and adipose tissue stem cells (ASC) have recently been used to treat joint damage through joint pain relief and chondrocyte regeneration without significant side effects in osteoarthritis animal models and clinical trials. Has been proven to improve However, injection of allogeneic stem cells or heterologous stem cells at higher doses compared to autologous stem cells often results in the retention of exudates in the joint cavity. As a method, a technique for recovering cartilage damage by injecting only a conditioned medium (CM) rather than a direct transplantation method of stem cells is underway. This is because many secretory factors such as cytokines, chemokines, growth factors (GF) and neurotrophic factors (NF), which stem cells can mediate and regulate various biological functions. It has the advantage of exerting a paracrine effect that promotes the repair of damaged tissue by releasing it. Furthermore, mesenchymals such as cord blood stem cells, adipose stem cells and bone marrow stem cells (BMSC) Thrombospondin 2 (TSP2) released from stem cells is known to restore osteoarthritis by differentiating stem cells into chondrocytes and promoting chondrocyte proliferation.

하지만 줄기세포 배양액 내에는 연골재생 촉진인자 등 기능성 성분의 농도가 너무 낮아 줄기세포 배양액만의 투여로는 실제적으로 관절염 치료 효능이 줄기세포를 직접 이식하는 것에 비해 저조하다는 문제점이 있다. 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 유효 기능성분이 분비될 때 지질층 내 엑소좀(exosomes) 형태로 분비된다는 사실에 착안하여, 정상적인(일반적인) 줄기세포의 배양방법으로는 엑소좀 분비량이 매우 적기 때문에 엑소좀 분비량을 높일 수 있는 새로운 배양 조건을 확립하였고, 이를 위해 본 발명에서는 양수줄기세포(amniotic fluid stem cells, AFSC), 양막줄기세포(amniotic membrane stem cells, AMSC), 태반줄기세포(placental stem cells, PSC), 제대혈줄기세포(umbilical cord blood stem cells, UCBSC), 신경줄기세포(neural stem cells, NSC), 희소돌기교전구세포(oligodendrocyte progenitor cells, OPC), 지방줄기세포(adipose tissue stem cells, ASC) 및 골수줄기세포(bone marrow stem cells, BMSC)를 tumor-necrosis factor-α (TNF-α) 처리와 저산소 배양 조건 하에서 배양하여 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)을 수득하였으며, 상기 배양액의 우수한 관절염 치료효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.However, the concentration of functional components such as cartilage regeneration promoters in the stem cell culture medium is too low, the administration of stem cell culture solution alone has a problem that the efficacy of treating arthritis is lower than the direct transplantation of stem cells. Therefore, the inventors pay attention to the fact that when the active ingredient is secreted from the stem cells are secreted in the form of exosomes (exosomes) in the lipid layer, exosome secretion because the exosome secretion is very small in the normal (general) stem cell culture method To establish a new culture condition to increase the to this end, in the present invention, amniotic fluid stem cells (AFSC), amniotic membrane stem cells (AMSC), placental stem cells (PSC) , Umbilical cord blood stem cells (UCBSC), neural stem cells (NSC), oligodendrocyte progenitor cells (OCC), adipose tissue stem cells (ASC) and bone marrow Stem cells (BMSC) were cultured under tumor-necrosis factor-α (TNF-α) treatment and hypoxic conditions to produce exosome-rich conditioned medium (ERCM). Was beneficial, the present invention has been completed by confirming the excellent arthritis treatment effects of the culture medium.

대한민국 등록특허 제10-0871984호Republic of Korea Patent No. 10-0871984

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a stem cell-derived exosome-containing culture medium as an active ingredient.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of arthritis, including a stem cell-derived exosome-containing culture medium as an active ingredient.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하여 수득한 것일 수 있다. In addition, in one embodiment of the present invention, the stem cell-derived exo-containing culture solution may be obtained by treating TNF-α in the stem cell culture medium and cultured under oxygen concentration conditions of 1 to 8%.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, TNF-α는 5~500 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 배양은 12~72시간 배양하는 것일 수 있다.In addition, in one embodiment of the present invention, TNF-α is treated at a concentration of 5 ~ 500 ng / ml, the culture may be to incubate for 12 to 72 hours.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 골수 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In addition, in one embodiment of the present invention, the stem cells are in the group consisting of neural stem cells, oligodendrocyte precursor cells, adipose stem cells, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, umbilical cord blood stem cells and bone marrow stem cells It may be selected.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)이고, 상기 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)이고, 상기 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)일 수 있다.In addition, in one embodiment of the present invention, the neural stem cell is an immortal neural stem cell CBNU-NSC cell line (Accession Number: KCTC12635BP), the amniotic stem cells are immortalized amniotic stem cells CBNU-AFSC cell line (Accession Number: KCTC12634BP) The oligodendrocyte progenitor cells may be CBNU-NSC.olig2 cell lines (Accession Number: KCTC12636BP) which are immortalized oligodendrocyte progenitor cells.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 1x104~1x106 세포수일 수 있다.In addition, in one embodiment of the present invention, the stem cells may be 1x10 4 ~ 1x10 6 cells.

또한 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관절염은 골관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 섬유 근육통(Fibromyalgia), 통풍(gout) 및 루퍼스(lupus)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In addition, in one embodiment of the present invention, the arthritis may be selected from the group consisting of Osteoarthritis, Osteoarthritis (Rheumatoid Arthritis), Fibromyalgia, Gout and lupus (lupus).

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액의 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 연골 재생 촉진인자 등 기능성 유효성분을 함유한 엑소좀을 다량 함유하고 있어 종래 관절염 치료를 위한 줄기세포 이식 방법 및 일반적인 줄기세포 배양 조건 하에서 수득한 배양액 처리에 비해 월등히 우수한 관절염 치료 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 효과적인 관절염 치료를 위한 새로운 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating arthritis of a stem cell-derived exosome-containing culture medium, comprising stem cell-derived exosomes obtained by treating TNF-α in a stem cell culture medium and culturing under an oxygen concentration condition of 1 to 8%. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, including a culture solution as an active ingredient. The stem cell-derived exosome-containing culture medium according to the present invention contains a large amount of exosomes containing functional active ingredients such as cartilage regeneration promoters, and thus, a stem cell transplantation method for treating arthritis and a culture solution obtained under general stem cell culture conditions. It was confirmed that the superior arthritis treatment effect compared to. Therefore, the stem cell-derived exosome-containing culture medium according to the present invention has an effect that can be used as a new therapeutic agent for effective arthritis treatment.

도 1은 골관절염을 유발시킨 군, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군 및 대조군 줄기세포 배양액을 처리한 군에 대한 X-ray 분석 사진을 나타낸 것으로, 흰색 화살표는 대퇴골두 골증식체를 나타낸 것이고, 흰색 화살표머리는 대퇴골 또는 경골 변형을 나타낸 것이며, 흰색 화살표는 경골추(골극) 날카로워짐을 나타낸 것이다.
도 2는 골관절염을 유발시킨 군, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군 및 대조군 줄기세포 배양액을 처리한 군에 대한 골관절염 증상 정도를 육안으로 확인한 것을 나타낸 사진이다. 도 3에서 검정색 화살표머리는 미란 및 궤양을 나타낸 것이고, 흰색 화살표머리는 반월판 유착을 나타낸 것이다.
도 3은 정상군, 골관절염을 유발시킨 군, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군 및 대조군 줄기세포 배양액을 처리한 군에 대한 현미경 관찰 결과를 나타낸 것으로, 흰색 화살표 머리는 hematoxylin에 보라색으로 염색된 연골세포층을 나타낸 것이고, 검정색 화살표 머리는 safranin O에 붉게 염색된 peptidoglycans (PG) 층을 나타낸 것이다.Figure 1 shows an X-ray analysis of the osteoarthritis-induced group, the group treated with the stem cell-derived exosome rich culture of the present invention and the group treated with the control stem cell culture, the white arrow indicates the femoral head bone growth Sieves, white arrowheads indicate femur or tibia deformation, and white arrows indicate tibial (sharp) sharpening.
Figure 2 is a photograph showing that the osteoarthritis induced group, the group treated with the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention and the osteoarthritis symptoms for the group treated with the control stem cell culture solution with naked eyes. In FIG. 3, the black arrowheads show erosion and ulceration, and the white arrowheads show meniscus adhesions.
Figure 3 shows the results of microscopic observations for the normal group, osteoarthritis-inducing group, the group treated with the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention and the group treated with the control stem cell culture medium, the white arrow head to hematoxylin The chondrocyte layer stained in purple is shown, and the black arrowhead shows the peptidoglycans (PG) layer stained red in safranin O.

본 발명은 줄기세포를 관절염 치료제의 소재로 보다 효과적으로 사용하기 위한 연구를 진행하던 중, 줄기세포 유래 유효성분의 수득과 효능 증진을 위한 방법으로써, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시켜 수득한 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액이 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.The present invention is a method for obtaining and increasing the efficacy of stem cell-derived active ingredients during the research to use stem cells as a material for treating arthritis more effectively, stems obtained by increasing the secretion of exosomes from stem cells It was confirmed that the cell-derived exosome-containing culture medium can effectively prevent or treat arthritis.

따라서 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다. Therefore, the present invention is characterized by providing a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a stem cell-derived exosome-containing culture medium as an active ingredient.

본 발명에 따른 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있는 방법은, 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 저산소 농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는 줄기세포 배양액에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 처리하고 5%의 산소농도 조건 하에서 24시간 배양하는 단계를 포함할 수 있다.Method for increasing the secretion of exosomes from the stem cells according to the present invention, comprising the step of treating TNF-α in the stem cell culture medium and cultured under low oxygen concentration conditions, preferably TNF-α 5 ~ 500 Treatment at a concentration of ng / mL and incubating for 12-72 hours under oxygen conditions of 1-8%. More preferably, the stem cell culture may include a step of treating TNF-α at a concentration of 50 ng / mL and incubating for 24 hours under an oxygen concentration condition of 5%.

본 발명에서 상기 ‘줄기세포’는 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 세포로서 필요한 경우, 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다.In the present invention, the "stem cells" refers to cells that have the ability to differentiate into all kinds of cells constituting the body, such as nerves, blood, cartilage, etc., if necessary as cells that have not advanced to specific cells.

본 발명에서 엑소좀이 분비될 수 있는 줄기세포의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 골수 줄기세포일 수 있다.Exemplary types of stem cells capable of secreting exosomes in the present invention include, but are not limited to, neural stem cells, rare spinal progenitor cells, adipose stem cells, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells Or bone marrow stem cells.

본 발명의 일실시예에서, 상기 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)를 사용하였고, 상기 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)를 사용하였으며, 상기 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)를 사용하였다.In one embodiment of the present invention, the neural stem cells used an immortal neural stem cell CBNU-NSC cell line (Accession Number: KCTC12635BP), the amniotic stem cells are immortalized amniotic stem cells CBNU-AFSC cell line (Accession Number: KCTC12634BP) The oligodendrocyte progenitor cells were CBNU-NSC.olig2 cell line (Accession Number: KCTC12636BP), which is an immortalized oligodendrocyte progenitor cell.

이는 초대 배양 양수줄기세포와 신경계 줄기세포(신경줄기세포, 희소돌기교전구세포)는 저산소 환경에 취약하여 쉽게 사멸하는 문제점이 있고, 줄기세포로부터 기능성 성분을 포집하고 있는 엑소좀을 다량 분비하기 위해서는 줄기세포를 저산소 하에서 배양해야 하기에, 이를 해결하기 위한 방법으로 본 발명자들은 저산소 환경 하에서 쉽게 사멸하는 양수줄기세포와 신경계 줄기세포를 불멸화 줄기세포로 재조합하여 불멸화 특성을 갖는 줄기세포주를 각각 제조하였으며, 따라서 줄기세포의 생존성을 높일 수 있게 하였고 충분한 엑소좀 풍부 배양액을 얻을 수 있도록 하였다. This is because the primary cultured amniotic stem cells and neural stem cells (nerve stem cells, oligodendrocyte progenitor cells) are susceptible to hypoxic environment and are easily killed. In order to secrete a large amount of exosomes that collect functional components from stem cells, Since the cells have to be cultured under hypoxia, the present inventors have prepared stem cell lines having immortalization characteristics by recombining amniotic stem cells and neural stem cells which are easily killed under hypoxic environment into immortalized stem cells. Stem cell viability was increased and sufficient exosome rich culture was obtained.

상기 기재된 불멸화 줄기세포인 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)를 사용하였고, 상기 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)를 사용하였으며, 상기 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)는 본 발명자가 본 특허 출원일 이전에 기탁기관으로부터 기탁번호를 부여받았고, 이들 불멸화 세포주들에 대해서는 이미 본 발명자가 특허 출원을 진행하여 특허 등록을 받은 상태로서, 각 불멸화 세포주의 제조에 대한 내용은 하기 실시예에 기재된 등록특허 문헌을 참조할 수 있다.CBNU-NSC cell line (Accession No .: KCTC12635BP), which is an immortal neural stem cell, which is the immortal stem cell described above, was used, and the amniotic stem cells used the CBNU-AFSC cell line (Accession No .: KCTC12634BP), which is an immortal amniotic stem cell. The proliferative progenitor cells are immortalized oligodendrocyte progenitor cells CBNU-NSC.olig2 cell line (Accession No .: KCTC12636BP) have been assigned the accession number by the present inventors prior to the date of the present patent application, and for these immortalized cell lines As the inventor has applied for a patent and has registered a patent, the contents of the production of each immortalized cell line can be referred to the registered patent document described in the following Examples.

한편, ‘엑소좀(exosome)’은 정교한 RNA 및 단백질 운반물질이 들어있는 작은크기(30~150 nm)의 소포로서, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체이다. 엑소좀의 분비, 흡수, 조성에 대한 정확한 분자기전과 기능은 아직까지 연구가 미비한 실정이며 다만, 다른 세포 및 조직에 결합하는 막 구성요소, 단백질 및 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.On the other hand, 'exosome' is a small size (30-150 nm) vesicles containing sophisticated RNA and protein carriers, membrane-like vesicles secreted from a variety of cells. Exact molecular mechanisms and functions of exosomes secretion, uptake, and composition have yet to be studied, but they are known to play a role in delivering membrane components, proteins and RNA that bind to other cells and tissues.

이에 본 발명자들은 줄기세포 또는 줄기세포 배양액에 함유된 유효성분의 체내 흡수율을 높이기 위해 지질로 구성된 리포좀을 유효성분과 접목시키는 종래 기술에 비해 더욱 효과적인 방법으로서 줄기세포로부터 엑소좀이 다량 분비될 수 있는 조건을 규명하였는데 즉, 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하는 조건으로서, 이러한 배양 조건은 리포좀 접목 방법에 따른 별도의 처리과정, 외부 물질의 오염 및 리포좀 포접 시 배양액 성분의 변질과 같은 문제점을 해결할 수 있음을 알 수 있었다.In this regard, the inventors of the present invention provide a more effective method of grafting liposomes composed of lipids with active ingredients in order to increase the body uptake rate of the active ingredients contained in stem cells or stem cell cultures. In other words, the stem cell culture treated with TNF-α and cultured under oxygen concentration conditions of 1 to 8%, these culture conditions are separate treatment according to liposome grafting method, contamination of foreign substances and inclusion of liposomes It can be seen that problems such as deterioration of the culture medium components can be solved.

따라서 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 줄기세포를 배양할 경우, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있어 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액을 생산할 수 있고, 동시에 줄기세포로부터 엑소좀을 대량생산할 수 있다.Therefore, when TNF-α is treated in stem cell culture and cultured stem cells under oxygen concentration conditions of 1 to 8%, it is possible to increase the secretion of exosomes from stem cells, which is rich in exosomes from stem cells. Can be produced and at the same time mass production of exosomes from stem cells.

특히 본 발명자들은 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 촉진할 수 있는 촉진제를 연구하던 중, 많은 물질들 중에서 TNF-α가 효과적으로 엑소좀 분비를 촉진하는 것을 알 수 있었고, 최대 엑소좀 분비를 위한 TNF-α의 적정 처리량은 5~500 ng/mL의 농도로 처리하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.In particular, the inventors of the present invention, while studying a promoter capable of promoting the secretion of exosomes from stem cells, it was found that TNF-α effectively promotes exosome secretion among many substances, TNF- for maximum exosome secretion It was found that the proper throughput of α is preferably treated at a concentration of 5 to 500 ng / mL.

상기 범위를 초과하여 처리할 경우, 줄기세포에 손상을 주어 세포가 정상적인 기능을 발휘하지 못하는 문제점이 생길 수 있고, 반면 상기 범위에 미치지 못하는 양으로 처리할 경우 엑소좀의 분비량이 충분치 못하는 문제점이 생긴다.If the treatment exceeds the above range, the stem cells may be damaged and the cells may not function properly. On the other hand, if the treatment is performed in an amount not exceeding the above range, the amount of secretion of exo is insufficient. .

줄기세포는 대식세포(macrophages)와 마찬가지로 TNF-α에 의해 이동하고 활성화된다. 활성화된 대식세포는 활성산소 라디칼(active oxygen radicals)을 분비하여 체내에 유입된 미생물과 종양을 공격하는 데 비해, 활성화된 줄기세포는 성장인자(growth factors, GF)와 신경성장인자(neurotrophic factors, NF)를 분비하여 조직을 보호하고 재생한다. 이러한 GF/NF 단백질은 엑소좀에 싸여 분비되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 줄기세포 배양과정에서 TNF-α를 처리할 경우, 다량의 GF/NF 함유 엑소좀의 분비를 촉진시킬 수 있으며, 다량의 GF/NF 함유 엑소좀을 수득할 수 있다.Stem cells, like macrophages, are migrated and activated by TNF-α. Activated macrophages secrete active oxygen radicals to attack microorganisms and tumors that enter the body, whereas activated stem cells produce growth factors (GF) and neurotrophic factors, Secrete NF) to protect and regenerate tissue. These GF / NF proteins were found to be secreted in exosomes. Therefore, in the present invention, when treated with TNF-α in the stem cell culture process, it is possible to promote the secretion of a large amount of GF / NF-containing exosomes, it is possible to obtain a large amount of GF / NF-containing exosomes.

또한, 줄기세포로부터 관절염 치료 효능을 갖는 엑소좀의 다량 분비 유도를 위한 요건으로 정상농도(약 21% 산소)보다 현저히 낮은 산소농도 하에서의 배양이 필요함을 확인하였는데, TNF-α 처리 후 1~8%의 저산소 조건 하에서 12~72시간 배양하는 것이 바람직함을 알 수 있었다. 산소농도 조건이 1% 미만일 경우 세포의 정상적인 증식 및 성장에 문제를 발생시킬 수 있으며, 8%를 초과할 경우 엑소좀 분비가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 1~8%의 저산소 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 5%의 산소 농도로 배양하는 것이 좋다.In addition, as a requirement for inducing large secretion of exosomes having the efficacy of treating arthritis from stem cells, it was confirmed that culture at an oxygen concentration significantly lower than the normal concentration (about 21% oxygen) was required, and 1 to 8% after TNF-α treatment. It was found that it is preferable to incubate for 12 to 72 hours under low oxygen conditions. If the oxygen concentration is less than 1% may cause problems in the normal proliferation and growth of the cells, if exceeding 8% may not be enough exosome secretion. Therefore, it is preferable to perform under low oxygen conditions of 1 to 8%, and more preferably, culture at an oxygen concentration of 5%.

또한, 본 발명에 따른 방법에서 상기 줄기세포 배양액은 줄기세포를 배양하는 배지라면 모두 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 사용하였다. In addition, the stem cell culture in the method according to the present invention can be used as long as the medium for culturing stem cells, in one embodiment of the present invention was used DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium) medium.

상기 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리되어지는 줄기세포는 바람직하게 1x104~1x106 세포수의 줄기세포일 수 있다.Stem cells treated with the TNF-α at a concentration of 5 to 500 ng / mL may be preferably stem cells having a number of 1 × 10 4 to 1 × 10 6 cells.

이와 같이 본 발명의 조건으로 줄기세포를 배양할 경우, 줄기세포가 증식하는 과정에서 분비되는 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생관련 유전자, 단백질, 성장인자 등 생리활성 물질들을 함유하고 있는 엑소좀의 분비를 촉진 및 증진시킬 수 있으며, 일반 줄기세포 배양액 수득 방법(즉 TNF-α 및 저산소 조건 하에서의 배양을 수행하지 않은 방법)에 비해 엑소좀의 분비 및 생산량을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.As described above, when culturing stem cells under the conditions of the present invention, exosomes containing bioactive substances such as stem cell proliferation, differentiation, regeneration-related genes, proteins, growth factors, etc. It was found that the secretion can be promoted and enhanced, and the secretion and production of exosomes can be significantly increased compared to the method of obtaining normal stem cell culture (that is, a method in which cultivation under TNF-α and hypoxic conditions is not performed).

또한, 본 발명에서는 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀이 관절염을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면 전방십자인대 절제술로 골관절염을 유발시킨 토끼 동물모델을 대상으로 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 21% 산조 조건 하에서 배양하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액(정상배양액)을 각각 관절강 내로 투여한 후, 관절염의 증상 개선 정도를 분석하였다.In addition, the present invention was confirmed that the stem cell-derived exosomes obtained by the method of the present invention has the effect of preventing or treating arthritis, according to an embodiment of the present invention rabbit animals causing osteoarthritis by anterior cruciate ligament resection Stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention and stem cell-derived exosome-containing culture solution (normal culture solution) obtained by culturing under 21% acidic conditions, respectively, were administered to the joint cavity, and then the degree of symptom improvement of arthritis was analyzed. It was.

그 결과, 대조군으로 사용한 정상배양액 처리 군에 비해 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군이 줄기세포 종류별 모두 월등히 우수한 관절염 개선 및 치료 효과가 있는 것으로 나타났는데, 관절표면의 손상 및 연골세포의 소실을 억제할 수 있고, 반월판 유착, 대퇴골과 경골 변형 및 골증식체 형성과 같은 관절 변형을 방지할 수 있으며, 손상된 연골을 재생시킬 수 있는 효과가 있음을 확인하였다(표 1 내지 표 4 참조).As a result, the group treated with the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention showed significantly superior arthritis improvement and treatment effect for each stem cell type, compared to the normal culture solution group used as a control group. It was confirmed that there is an effect that can suppress the loss of cells, to prevent joint deformation such as meniscus adhesion, femur and tibia deformation and osteoprogenitor formation, and to regenerate damaged cartilage (Tables 1 to 4). Reference).

뿐만 아니라 관절염의 유발 및 증상 악화에 원인을 주는 염증성 사이토카인의 억제도 대조군으로 사용한 정상배양액 처리 군에 비해 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군이 월등하게 우수한 것으로 나타났다(표 5 참조).In addition, the group treated with the stem cell-derived exosome-rich culture solution of the present invention was significantly superior to the normal culture solution treatment group used as a control group as well as the inhibition of inflammatory cytokines causing arthritis and symptoms worsening (Table 5). Reference).

따라서 본 발명자들은 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액이 종래 줄기세포 자체 또는 일반적인 줄기세포 배양조건(21% 산소 조건에서 배양)에서 수득한 엑소좀 함유 배양액에 비해 더 우수한 효과로 관절염을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다. Therefore, the present inventors have prevented arthritis from the stem cell-derived exosome-containing culture medium according to the present invention with a superior effect compared to the exosome-containing culture medium obtained in the conventional stem cell itself or general stem cell culture conditions (cultured at 21% oxygen condition). Or it can be treated.

그러므로 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 관절염으로는 이에 제한되지는 않으나 골관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 섬유 근육통(Fibromyalgia), 통풍(gout) 또는 루퍼스(lupus)일 수 있다. Therefore, the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, including a stem cell-derived exosome-containing culture medium as an active ingredient, but not limited to the arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis ( Rheumatoid Arthritis, Fibromyalgia, gout or lupus.

또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In addition, in the present invention, the pharmaceutical composition may further include a suitable carrier, excipient or diluent according to a conventional method. Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, may be used, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하며, 상기 주사용 앰플은 사용직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.The pharmaceutical compositions according to the invention can be used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., respectively, according to conventional methods. Can be. Specifically, when formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, It can be prepared by mixing sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used. Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used. In addition, as a parenteral administration preparation, an injection such as an ampoule for injection, an injection such as an infusion bag, and a spray agent such as an aerosol preparation are preferable, and the injection ampoule may be mixed with an injection solution immediately before use. Physiological saline, glucose, Ringer's solution and the like can be used. Also, the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 관절 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 병변 부위에 직접 투여할 수 있다. The compositions of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intraarticular injection, preferably directly to the lesion site of the subject in need of treatment. May be administered.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is dependent on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific active ingredient used. The dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, extent of disease, drug form, route of administration and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art and may be 0.0001 to 50 mg / day. It may be administered at kg or 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect. The pharmaceutical compositions according to the invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are intended to illustrate the present invention more specifically, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

<준비예> <Preparation Example>

줄기세포Stem Cells

하기 실시예에서 관절염 치료 효과 여부를 확인하기 위한 유효성분인 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 수득하기 위한 줄기세포는 다음과 같은 세포들을 사용하였다. 먼저, 불멸화 양수줄기세포(AFSC), 불멸화 신경줄기세포(NSC) 및 불멸화 희소돌기교전구세포(OPC)는 본 발명자가 이미 불멸화 세포주로 제조하여 확립한 세포주이며, 각 세포주들은 미생물 기탁기관으로부터 기탁번호를 부여받은 줄기세포주로서, 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (KCTC12634BP; 대한민국 등록특허 제10-1719274호), 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (KCTC12635BP; 대한민국 등록특허 제10-1719274호) 및 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주를 (KCTC12636BP; 대한민국 등록특허 제10-1740357호 참조) 각각 사용하였다. 상기 불멸화 세포주들의 제조방법은 각 세포주에 대한 등록특허의 내용을 참고할 수 있다. 또한 하기 본 발명의 실시예 및 실험예에서 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주를 사용한 것이고, 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주를 사용한 것이며, 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주를 사용하여 분석하였다.In the following examples, stem cells for obtaining exosome-rich stem cell culture, which is an active ingredient for confirming the effect of arthritis treatment, were used as the following cells. First, immortalized amniotic stem cells (AFSC), immortalized neural stem cells (NSC) and immortalized oligodendrocyte progenitor cells (OPC) are cell lines already established and established by the present inventors as immortalized cell lines, and each cell line is a deposit number from a microorganism depositing institution. As a stem cell line that has been given, CBNU-AFSC cell line (KCTC12634BP; Korean Patent No. 10-1719274), which is an immortal amniotic stem cell, CBNU-NSC cell line (KCTC12635BP; Korean Patent No. 10-1719274), which is an immortal neural stem cell, and CBNU-NSC.olig2 cell lines, immortalized oligodendrocyte precursor cells (KCTC12636BP; see Korean Patent No. 10-1740357), respectively. The method of producing the immortalized cell lines may refer to the contents of the registered patent for each cell line. In addition, the amniotic stem cells in the Examples and Experimental Examples of the present invention are those using CBNU-AFSC cell lines, which are immortal amniotic stem cells, and the neural stem cells are CBNU-NSC cell lines, which are immortalized neural stem cells, and oligodendrocyte progenitor cells are immortalized. The oligodendrocyte precursor CBNU-NSC.olig2 cell line was analyzed.

또한, 양막줄기세포(AMSC), 태반줄기세포(PSC) 및 제대혈줄기세포(UCBSC)는 정상적인 출산 과정에서 산모의 동의하여 채취한 줄기세포들을 각각 수집하여 사용하였고, 지방줄기세포(ASC)와 골수줄기세포(BMSC)는 각각 53세와 50세의 정상인 여성으로부터 복부 지방흡입술과 골수천자를 통해 각각의 기관윤리위원회(Institutional Review Board, IRB) 심의를 거쳐 본인의 동의서를 받아 채취한 줄기세포를 사용하였다. Amniotic stem cells (AMSC), placental stem cells (PSC) and umbilical cord blood stem cells (UCBSC) were collected and used to collect stem cells obtained from the mother's consent during normal birth, and were derived from adipose stem cells (ASC) and bone marrow. Stem cells (BMSCs) are obtained from normal women aged 53 and 50 years, using stem cells obtained through their own institutional review by the Institutional Review Board (IRB) through abdominal liposuction and bone marrow puncture. It was.

<실시예 1> <Example 1>

<1-1> 줄기세포의 배양 및 <1-1> Stem Cell Culture and 엑소좀Exosomes 풍부 배양액의 채취 Collection of abundant culture

상기 준비한 각각의 줄기세포(1 x 106 세포/mL)를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 접종하고 5% 이산화탄소(CO2) 공급 배양기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액(ERCM)을 수득하기 위해, 상기 배양 배지에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 첨가하고 산소 농도를 5%로 낮춘 후, 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하여 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 수득하였다.Each of the prepared stem cells (1 × 10 6 cells / mL) was inoculated in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) medium and incubated for 24 hours at a temperature of 37 ° C. in a 5% carbon dioxide (CO 2 ) feed incubator. Then, in order to obtain an exosome-rich culture (ERCM) from the stem cells, TNF-α was added to the culture medium at a concentration of 50 ng / mL and the oxygen concentration was lowered to 5%, followed by incubation for 24 hours. Then, the culture solution was collected, filtered with a filter, and concentrated 10 times at low temperature to obtain a stem cell-derived exosome-rich culture medium according to the present invention.

비교예로서, 각각의 줄기세포로부터 엑소좀이 함유된 배양액을 수득하는 과정에서, 상기 실시예 1의 과정 중, TNF-α (50 ng/mL) 처리와 산소(O2) 농도를 21%로 유지한 상태로 수행한 것으로 제외하고는 동일한 방법으로 수행하여, 비교예(대조군)로 사용할 일반적인 방법(정상적인 방법)의 줄기세포 정상배양액(CM)을 수득하였다.As a comparative example, in the process of obtaining a culture solution containing exosomes from each stem cell, TNF-α (50 ng / mL) and oxygen (O 2 ) concentration of 21% during the process of Example 1 The same procedure was followed except that the stem cell normal culture solution (CM) of the general method (normal method) to be used as a comparative example (control) was obtained.

<1-2> 배양액 내 유효 <1-2> Effective in culture 분비인자Secretion factor 함량 분석 Content analysis

줄기세포 배양액을 채취하여 5분간 초음파로 엑소좀을 파쇄한 다음, Sephacryl gel filtration column을 장착한 protein liquid chromatograph를 사용하여 주요 기능성 분비인자[brain-derived neurotrophic factor (BDNF), hepatocyte growth factor (HGF), nerve grown factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-β (TGF-β), vascular endothelial growth factor (VEGF)]의 함량을 분석하였다.Stem cell cultures were harvested and exosomes were disrupted by ultrasound for 5 minutes, followed by the use of protein-liquid chromatographs equipped with Sephacryl gel filtration columns for major functional secretion factors (BDNF) and hepatocyte growth factor (HGF). , nerve grown factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-β (TGF-β), and vascular endothelial growth factor (VEGF)].

분석 결과, 양수줄기세포 배양액에는 HGF가 다량 함유되어 있고, BDNF, TGF 및 VEGF 역시 상당량 함유되어 있는 것을 확인하였다. 양막줄기세포 역시 다량의 HGF와 상당량의 VEGF를 분비하고 있었으며, 태반줄기세포는 HGF 외에는 상대적으로 적은 량의 단백질 성분을 분비한 데 비해, 제대혈줄기세포는 다량의 HGF와 VEGF를 분비하였다. 흥미롭게도 신경계세포인 신경줄기세포와 희돌기교전구세포는 다량의 BDNF, NGF, PDGF는 물론, 어느 정도의 TGF도 분비하였는데, 희돌기교전구세포는 HGF도 상당량 배출하였다. 이에 비해 골수줄기세포는 중등도의 HGF와 PDGF를 분비하는 것으로 확인되었다.As a result, it was confirmed that the amniotic fluid of the amniotic stem cells contained a large amount of HGF and a considerable amount of BDNF, TGF and VEGF. Amniotic stem cells also secreted a large amount of HGF and a significant amount of VEGF, whereas placental stem cells secreted a relatively small amount of protein other than HGF, whereas cord blood stem cells secreted a large amount of HGF and VEGF. Interestingly, neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells secreted a large amount of BDNF, NGF and PDGF, as well as a certain amount of TGF. The oligodendrocyte progenitor cells also released a considerable amount of HGF. In contrast, bone marrow stem cells secrete moderate levels of HGF and PDGF.

한편, 줄기세포를 TNF-α와 저산소 처리하여 얻어진 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액 내에는 모든 줄기세포에서 정상적인 배양액(대조군) 내 농도에 비해 2.5~3.5배 높은 함량으로 유효인자가 함유되어 있는 것으로 확인되어 각종 질환의 치료에 더 우수한 효능을 보일 수 있음을 알 수 있었다(하기 표 1 참조).On the other hand, in the exosome-rich culture solution of the present invention obtained by treating the stem cells with TNF-α and hypoxic, it was confirmed that all stem cells contained an effective factor at a content of 2.5 to 3.5 times higher than the concentration in the normal culture (control). It can be seen that it can show a better efficacy in the treatment of various diseases (see Table 1 below).

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<< 실험예Experimental Example 1> 1>

본 발명의 줄기세포 유래 Stem Cell Derivation of the Invention 엑소좀Exosomes 풍부 배양액의 관절염 치료 효과 분석 Analysis of Arthritis Treatment Effect of Abundant Culture Solution

<1-1> 실험동물용 토끼의 사육 <1-1> Breeding of Experimental Rabbits

생후 8개월령(3.5 kg)의 수컷 New Zealand white (NZW) 토끼를 약 2주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 토끼용 케이지에 1마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기 횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00 - 19:00), 조도 150-300 lux로 조절하여 사육하였다. 사료는 실험동물용으로 공급되는 펠렛형 고형사료인 Purina Rabbit Chow®와 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행하였다.Male New Zealand white (NZW) rabbits, 8 months of age (3.5 kg), were used after about two weeks of laboratory acclimatization. One animal is placed in a cage for rabbits, and the environment of the animal laboratory is 23 ± 2 ℃, relative humidity 55 ± 10%, ventilation times 12 times / hour, lighting cycle 12 hours (07:00-19:00), The breeding was adjusted to roughness 150-300 lux. The feed was freely ingested with Purina Rabbit Chow ® , which is a pellet-type solid feed for experimental animals, and sterile purified water.This experiment was conducted by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Chungbuk National University. In accordance with the Agency's Standard Operation Procedures (SOP).

<1-2> 전방십자인대절제술(anterior cruciate ligament transection , ACLT )을 통한 골관절염 유발 및 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 투여 <1-2> Osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection ( ACLT ) and administration of exosome- rich culture medium derived from stem cells of the present invention

상기 <1-1>에서 사육한 토끼를 대상으로 ketamine (50 mg/kg)과 xylazine (5 mg/kg)을 근육 내로 주사하여 전신 마취시키고, 우측 무릎 주변의 털을 제거한 다음 베타딘(Betadine)과 70% 에탄올로 피부를 소독한 후, 무균상태에서 수술을 개시하였다. 피부를 절개하고 근막과 관절낭을 절개(내측 관절 도달법)한 후, 무릎골(슬개골)을 젖혀 하기 도면과 같이 전방십자인대를 노출시켰다. 외과용 수술칼로 전방십자인대의 중간 실질부위와 내측반월판경골인대(medial meniscotibial ligament, MMTL) 및 외측반월판경골인대(lateral meniscotibial ligament, LMTL)를 절단한 후 봉합하였다. 수술 후 3일간 항생제인 Foxolin (삼진제약, 10 mg/kg)과 진통제 Maritrol (제일제약, 3 mg/kg)을 매일 2회 근육 내로 주사하였고, 이후 3일간 Foxolin을 매일 1회 추가로 처치하였다. 관절염 유발수술 8주 후에 상기 실시예 1에서 수득한 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)과 대조군인 정상배양액(CM)을 0.1 mL/토끼의 양으로 매주 2일 간격으로 8주간 관절강 내로 투여하였다.In general, anesthesia was injected by intramuscularly injection of ketamine (50 mg / kg) and xylazine (5 mg / kg) in rabbits bred in the above <1-1>, and the hair around the right knee was removed, followed by betadine. After disinfecting the skin with 70% ethanol, the operation was started under aseptic condition. After the incision of the skin and the incision of the fascia and articular capsule (medial arthrosis approach), the knee (patella) was bent over to expose the anterior cruciate ligament as shown below. Surgical knife was used to cut the medial parenchyma, medial meniscotibial ligament (MMTL) and lateral meniscotibial ligament (LMTL). Three days after surgery, antibiotics Foxolin (Samjin Pharmaceuticals, 10 mg / kg) and analgesic Maritrol (Cheil Pharmaceuticals, 3 mg / kg) were injected intramuscularly twice daily, followed by an additional dose of Foxolin once daily for three days. 8 weeks after arthritis-induced surgery, the stem cell-derived exosome-rich culture medium obtained in Example 1 (ERCM) and the control medium culture medium (CM) in an amount of 0.1 mL / rabbit at an interval of 2 days every week for 8 weeks. It was administered intraarticularly.

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<토끼 무릎관절 모식도>                <Schematic diagram of the rabbit knee joint>

상기 그림에서, F: femur (대퇴골), T: tibia (경골), MM: medial meniscus (내측반월판), ACL: anterior (cranial) cruciate ligament (전방십자인대), MMTL: medial meniscotibial ligament (내측반월판경골인대), LMTL: lateral meniscotibial ligament (외측반월판경골인대)를 나타낸다. In the figure above, F: femur (femur), T: tibia (tibia), MM: medial meniscus (medial meniscus), ACL: anterior (cranial) cruciate ligament (medial cruciate ligament), MMTL: medial meniscotibial ligament (medial meniscus tibia) Ligament), LMTL: Lateral meniscotibial ligament.

<1-3> 방사선학적 치료효능 평가 <1-3> Evaluation of Radiation Therapy

8주간의 골관절염 유발기간 및 8주간의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 및 대조군 배양액(CM)을 투여한 후, X-ray 촬영을 통해 골관절염지수(osteoarthritis scores)를 Modified Kellgren-Lawrence 등급(KL score)으로 분석하였다. 분석지표인 KL score는 대퇴골두 골증식체(osteophytes in medial femoral condyle, score 0~5), 대퇴골 또는 경골 변형(deformity of femur or tibia, score 0~5), 경골추(골극) 날카로워짐(sharpening of tibial spine, score 0~5)의 3가지 지표의 합(score 0~15)으로 치료 효능을 평가하였다.After 8 weeks of osteoarthritis-induced period and 8 weeks of stem cell-derived exosome-rich culture (ERCM) and control culture (CM), the osteoarthritis scores were evaluated by X-ray imaging (Modified Kellgren-Lawrence grade). KL score). The KL score, an analytical index, was defined as osteophytes in medial femoral condyle (score 0-5), deformity of femur or tibia (score 0-5), and sharpening of the tibia (skeletal). The efficacy of treatment was assessed by the sum of three indicators (score 0-15): sharpening of tibial spine (score 0-5).

분석 결과, 토끼 동물모델을 대상으로 전방십자인대와 내외측 반월판경골인대 절제를 통한 골관절염 유발 8주 후 방사선 검사 결과, 대퇴골두 골증식체, 내측경골 변형 및 경골추 날카로워짐의 이상소견(병변)이 총점 15점 중 평균 10.1점으로 심한 관절염이 유발된 것을 확인할 수 있었다(도 1 및 하기 표 2 참조).The results of the radiographic examination, femoral head osteoprogenitor, medial tibial deformity, and tibial vertebral sharpening after 8 weeks of osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament and medial meniscus ), It was confirmed that severe arthritis was induced with an average of 10.1 points out of 15 points (see FIG. 1 and Table 2 below).

이러한 골관절염이 유발된 토끼의 관절강 내로 줄기세포를 21% 산소농도 하에서 배양하여 수득한 대조군의 정상배양액(CM, 0.1 mL/토끼)을 2일 간격으로 8주간 투여했을 때, 신경줄기세포(병변 평균 6.0점) ≥ 희소돌기교전구세포(6.1점) > 지방줄기세포(6.4점) > 양수줄기세포(6.8점) > 양막줄기세포(7.1점) ≥ 제대혈줄기세포(7.3점) > 태반줄기세포(8.5점) = 골수줄기세포(8.5점)의 순으로 방사선 소견에 대해 우수한 치료효능을 보이는 것으로 나타났다.When stem cells were cultured under 21% oxygen concentration in the osteoarthritis-induced rabbit joints, normal stem solution (CM, 0.1 mL / rabbit) of the control group was administered for 8 weeks at two-day intervals. Point) ≥ Rare dendritic cells (6.1 points)> Adipose stem cells (6.4 points)> Amniotic stem cells (6.8 points)> Amniotic stem cells (7.1 points) ≥ Cord blood stem cells (7.3 points)> Placental stem cells (8.5 points) Point) = bone marrow stem cells (8.5 points) in order to show an excellent therapeutic effect on radiation findings.

한편, 줄기세포 배양배지에 TNF-α (50 ng/mL)를 첨가하고 5%의 저산소농도 하에서 배양하어 수득한 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)을 투여했을 때는 모든 줄기세포에서 대조군 정상배양액 투여 보다 더 우수한 치료 효능을 보였는데, 신경줄기세포(병변 평균 4.8점) ≥ 희소돌기교전구세포(5.0점) ≥ 지방줄기세포(5.2점) ≥ 양수줄기세포(5.4점) > 양막줄기세포(5.7점) > 제대혈줄기세포(6.2점) > 태반줄기세포(6.8점) ≥ 골수줄기세포(6.9점)의 순으로 치료효능을 나타내었다.Meanwhile, when the exosome-rich culture solution (ERCM) of the present invention obtained by adding TNF-α (50 ng / mL) to the stem cell culture medium and incubated at a low oxygen concentration of 5%, the control normal culture solution in all stem cells Treatment was more effective than administration, with neural stem cells (mean 4.8 points on lesions) ≥ rare spinal progenitor cells (5.0 points) ≥ adipocytes (5.2 points) ≥ amniotic stem cells (5.4 points)> amniotic stem cells (5.7) Dot)> Umbilical cord blood stem cells (6.2 points)> Placental stem cells (6.8 points) ≥ Bone marrow stem cells (6.9 points).

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*골관절염(ACLT) 유발군에 비해 유의함(P<0.05). #정상배양액에 비해 유의함(P<0.05).* Significant compared to osteoarthritis (ACLT) -induced group ( P <0.05). # Significant compared to normal culture ( P <0.05).

<1-4> 육안적 치료효능 평가 <1-4> Evaluation of Visual Treatment Efficacy

8주간의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 및 대조군 배양액(CM)의 투여기간 종료 후, 동물을 희생시키고 내측관절 도달법을 통해 무릎관절 실험부위를 노출시킨 다음 연골손상에 주의하면서 무릎관절 주위의 연부조직을 제거하고 실험부위를 포함한 대퇴골의 과상부를 채취하였다. 무릎관절의 부종, 열상, 골극 형성, 활액막 비후를 육안적으로 관찰하여 O'Driscoll scoring 분석을 수행하였는데, 즉, 연골결손 부위의 변화, 연골결손 부위 표면상태, 결손 경계부위와 새롭게 생긴 조직과의 경계부의 연속성을 관찰하고 사진 촬영하여 표면 거침(roughness of surface, score 0~5), 반월판 유착(adhesion with meniscus, score 0~5), 관절 비대(hypertrophy of joint, score 0~5), 골증식체(osteophyte, score 0~5)에 대한 4가지 지표의 합(score 0~20)으로 치료 효능을 평가하였다.After the administration of the stem cell-derived exosome-rich culture medium (ERCM) and the control culture medium (CM) for 8 weeks, the animals were sacrificed and the knee joint exposed through the medial joint approach. Peripheral soft tissue was removed and the upper part of the femur, including the experimental site, was collected. O'Driscoll scoring analysis was performed by visually monitoring the swelling of the knee joint, laceration, skeletal formation, and synovial thickening, ie, changes in cartilage defects, surface condition of cartilage defects, defect boundary and newly formed tissue. Observation of the continuity of the boundary and photographing to determine the roughness of surface (score 0-5), meniscus with meniscus (score 0-5), hypertrophy of joint (score 0-5), bone growth Treatment efficacy was assessed by the sum of four indicators (score 0-20) for the sieve (osteophyte, score 0-5).

상기 방법에 의해 골관절염 유발 8주 후 토끼를 부검하여 관절염 유발부위에 대한 육안적 검사를 수행한 결과, 하기 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이 표면 거침, 반월판 유착, 관절 비대 및 골증식체 형성의 이상소견(병변)이 총점 20점 중 평균 18.1점으로 심한 손상이 확인되었다. 이러한 골관절염 유발 토끼의 관절강 내로 대조군으로 사용한 정상배양액을 투여했을 때 신경줄기세포(병변 평균 13.4점) > 희소돌기교전구세포(13.8점) > 양수줄기세포(14.3점) > 지방줄기세포(14.7점) > 양막줄기세포(15.4점) > 제대혈줄기세포(15.8점) > 태반줄기세포(16.3점) = 골수줄기세포(16.3점)의 순으로 육안적 소견에 대해 치료 효능이 있는 것으로 나타났다.Eight weeks after osteoarthritis-induced osteoarthritis by the above method, the rabbits were examined by gross examination for arthritis-induced sites. As shown in Table 3 and FIG. 2, surface roughness, meniscus adhesion, joint hypertrophy, and osteoprogenitor formation were observed. Abnormal findings (lesions) were 18.1 points out of 20 points. Neural stem cells (mean lesion average 13.4 points)> oligodendrocyte progenitor cells (13.8 points)> Amniotic stem cells (14.3 points)> Adipose stem cells (14.7 points) Amniotic stem cells (15.4 points)> Umbilical cord blood stem cells (15.8 points)> Placental stem cells (16.3 points) = Bone marrow stem cells (16.3 points).

한편, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 투여했을 때는 모든 줄기세포에서 대조군으로 사용한 정상배양액 투여군 보다 더 우수한 치료 효능이 있음을 확인하였는데, 신경줄기세포(병변 평균 9.9점) ≥ 희소돌기교전구세포(10.0점) > 지방줄기세포(10.7점) > 양수줄기세포(11.2점) > 양막줄기세포(12.6점) > 제대혈줄기세포(13.1점) > 태반줄기세포(13.4점) ≥ 골수줄기세포(13.5점)의 순으로 나타나, 병변증상 정도가 월등히 개선됨을 알 수 있었다.Meanwhile, when the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention was administered, it was confirmed that all stem cells had better therapeutic efficacy than the normal culture group used as a control group, and neural stem cells (lesion mean 9.9 points) ≥ oligodendrocyte precursors Cells (10.0 points)> Adipose stem cells (10.7 points)> Amniotic stem cells (11.2 points)> Amniotic stem cells (12.6 points)> Umbilical cord blood stem cells (13.1 points)> Placental stem cells (13.4 points) ≥ Bone marrow stem cells (1 point) 13.5 points), indicating that the degree of lesion symptoms was significantly improved.

Figure 112017121693015-pat00004
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*골관절염(ACLT) 유발군에 비해 유의함(P<0.05). #정상배양액에 비해 유의함(P<0.05).* Significant compared to osteoarthritis (ACLT) -induced group ( P <0.05). # Significant compared to normal culture ( P <0.05).

<1-5> 현미경적 치료효능 평가 <1-5> Evaluation of Microscopic Treatment Efficacy

상기 실험예에서 수득한 토끼 유래의 관절조직을 3일간 10% 중성 포르말린에 고정하고 EDTA로 60일간 탈석회화 과정을 거친 후 파라핀 절편을 제작하였다. 이후 Hematoxylin & eosin (H&E)으로 염색하여 사진을 촬영하고 연골생성 면적을 현미경 영상분석 프로그램인 ImageJ 5.1을 이용해 연골재생부위/절단면 넓이의 비율로 정량 분석하였다. 또한 연골 내 peptidoglycals (PG)에 대한 safranin O/fast green 염색을 통해 초자연골(hyaline cartilage)의 온전성을 분석하였다. 즉, 상기 염색결과로부터 연골의 손상 정도를 구조(structure, score 0~11), 연골 세포수(cellularity, score 0~4), 클러스터 형성(cluster, score 0~5), 연골세포 성분(PG, score 0~6)에 대한 4가지 지표의 합(score 0~24)으로 치료효능을 평가하였다(하기 표 4 참조).The rabbit-derived joint tissue obtained in the above experimental example was fixed in 10% neutral formalin for 3 days and subjected to a 60-day demineralization process with EDTA to prepare paraffin sections. Afterwards, hematoxylin & eosin (H & E) staining was used to take pictures. The area of cartilage was quantitatively analyzed by the ratio of cartilage regeneration site / cutting area using ImageJ 5.1. In addition, the integrity of hyaline cartilage was analyzed by safranin O / fast green staining for peptidoglycals (PG) in cartilage. In other words, the degree of damage to cartilage from the staining results (structure, score 0-11), cartilage cell number (cellularity, score 0-4), cluster formation (cluster, score 0-5), chondrocyte components (PG, Treatment efficacy was evaluated by the sum of four indicators (score 0-24) for scores 0-6) (see Table 4 below).

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분석 결과, 관절염 유발조직을 H&E와 safranin O로 염색하여 현미경으로 검사해 보니, 연골의 구조, 연골세포수, 클러스터 형성 및 peptidoglycans (PG) 함량 등의 충실도 이상소견이 총점 24점 중 평균 17.2점으로 심각한 수준인 것으로 나타났다. 이러한 골관절염 유발 토끼의 관절강 내로 정상배양액을 투여했을 때 신경줄기세포(병변 평균 13.1점) > 희소돌기교전구세포(13.7점) > 지방줄기세포(14.2점) > 양막줄기세포(14.8점) > 제대혈줄기세포(15.5점) ≥ 양수줄기세포(15.6점) > 태반줄기세포(16.3점) = 골수줄기세포(16.3점)의 순으로 현미경 소견에 대해 치료효과가 있는 것으로 나타났다. As a result, the arthritis-induced tissues were stained with H & E and safranin O and examined microscopically. The results of fidelity such as cartilage structure, chondrocyte count, cluster formation and peptidoglycans (PG) content averaged 17.2 out of 24 points. It appeared to be serious. Neural stem cells (average of 13.1 points)> oligodendrocyte progenitor cells (13.7 points)> Adipose stem cells (14.2 points)> Amniotic stem cells (14.8 points)> Umbilical cord blood stem Cells (15.5 points) ≥ Amniotic stem cells (15.6 points)> Placental stem cells (16.3 points) = Bone marrow stem cells (16.3 points) were found to have a therapeutic effect on microscopic findings.

한편, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 투여했을 때는 모든 줄기세포에서 정상배양액 투여 시보다 병변의 증상이 더 우수하게 개선된 것으로 나타났는데, 특히 신경줄기세포(병변 평균 10.4점) ≥ 지방줄기세포(10.5점) > 희소돌기교전구세포(10.9점) > 양수줄기세포(11.7점) ≥ 양막줄기세포(11.9점) > 제대혈줄기세포(12.8점) > 골수줄기세포(14.0점) > 태반줄기세포(14.3점)의 순으로 나타내어, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액이 관절염 치료에 매우 효과적임을 알 수 있었다(도 3 및 표 5 참조).Meanwhile, when the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention was administered, the symptoms of the lesions were improved in all stem cells more than that in the normal culture solution. In particular, the nerve stem cells (mean lesion average 10.4 points) ≥ fat stem Cells (10.5 points)> Rare progenitor cells (10.9 points)> Amniotic stem cells (11.7 points) ≥ Amniotic stem cells (11.9 points)> Umbilical cord blood stem cells (12.8 points)> Bone marrow stem cells (14.0 points)> Placenta stem In order of cells (14.3 points), it was found that the stem cell-derived exosome-rich culture medium of the present invention was very effective in treating arthritis (see FIG. 3 and Table 5).

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*골관절염(ACLT) 유발군에 비해 유의함(P<0.05). #정상배양액에 비해 유의함(P<0.05).* Significant compared to osteoarthritis (ACLT) -induced group ( P <0.05). # Significant compared to normal culture ( P <0.05).

<1-6> 염증성 사이토카인 분석 <1-6> Inflammatory cytokine assay

염증인자 분석을 위해 관절강 개구 직전 0.1 mL의 생리식염수를 관절강 내로 주입하고 5회 정도의 피스톤 운동 후 0.1-0.2 mL의 희석된 관절강액을 채취하였다. 채취된 관절강액으로부터 염증성 사이토카인인 TNF-α, interleukin-6 (IL-6) 및 IL-8을 ELISA로 분석하여 항염증 효능을 분석하였다.For inflammatory factor analysis, 0.1 mL of normal saline was injected into the joint cavity immediately before the opening of the joint cavity and 0.1-0.2 mL of diluted joint fluid was collected after five piston movements. Inflammatory cytokines TNF-α, interleukin-6 (IL-6) and IL-8 were analyzed by ELISA from the collected joint cavity fluids.

분석 결과, 관절염 유발 관절강액 내 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 함량은 정상연골 내 농도보다 2배 이상 증가한 것으로 나타났고, 골관절염 유발 토끼의 관절강 내로 대조군인 정상배양액을 투여했을 때 염증성 사이토카인의 함량이 감소되는 효과가 있는 것으로 나타났다. 상대적인 효과에 대해, 양수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 지방줄기세포가 희소돌기교전구세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포 및 골수줄기세포보다 우수한 염증성 사이토카인 저감 효능을 보였다. 한편, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 투여했을 때는 모든 줄기세포에서 대조군인 정상배양액 투여군에 비해 염증성 사이토카인 저감 효과가 월등히 더 우수한 것으로 나타났고, 구체적으로 양수줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포가 제대혈줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포 및 골수줄기세포에 비해 우수하게 염증성 사이토카인을 억제하는 것으로 나타났다(하기 표 6 참조).As a result, the contents of the cytokines TNF-α, IL-6 and IL-8 in arthritis-induced joint cavity fluid were more than doubled than those in normal cartilage. It has been shown that the effect of reducing the content of inflammatory cytokines. For the relative effects, amniotic fluid stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells and adipose stem cells showed better inflammatory cytokine reduction effects than oligodendrocyte progenitor cells, amniotic stem cells, placental stem cells and bone marrow stem cells. Meanwhile, when the stem cell-derived exosome-rich culture solution of the present invention was administered, all stem cells showed significantly superior inflammatory cytokine-reducing effects as compared with the control group, which was the control group, and specifically, amniotic stem cells, neural stem cells, and rare cells. Dendritic progenitor cells were found to inhibit inflammatory cytokines better than cord blood stem cells, amnion stem cells, placental stem cells and bone marrow stem cells (see Table 6 below).

Figure 112017121693015-pat00007
Figure 112017121693015-pat00007

*골관절염(ACLT) 유발군에 비해 유의함(P<0.05). #정상배양액에 비해 유의함(P<0.05).* Significant compared to osteoarthritis (ACLT) -induced group ( P <0.05). # Significant compared to normal culture ( P <0.05).

<1-7> 통계학적 분석 <1-7> Statistical Analysis

모든 시험결과는 mean±SEM으로 표시하였고, 집단 간 차이는 oneway analysis of variance (ANOVA) (SPSS 12.0 version)을 이용하여 분석하였으며 P value<0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.All test results were expressed as mean ± SEM. Differences between the groups were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) (SPSS 12.0 version) and statistically significant when P value <0.05.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. Those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential features of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in descriptive sense only and not for purposes of limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope will be construed as being included in the present invention.

한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC12634BPKCTC12634BP 2014072520140725 한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC12635BPKCTC12635BP 2014072520140725 한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC12636BPKCTC12636BP 2014072520140725

Claims (7)

줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액을 유효성분으로 포함하되,
상기 줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP) 또는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)이고,
상기 줄기세포 유래 엑소좀 함유 배양액은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 50 ng/ml의 농도로 처리하고 5%의 산소농도 조건 하에서 24시간 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.Stem cell-derived exo-containing medium containing as an active ingredient,
The stem cells are CBNU-AFSC cell line (Accession No .: KCTC12634BP), which is an immortal amniotic stem cell, or CBNU-NSC.olig2 cell line (Accession No .: KCTC12636BP), which is an immortal oligodendrocyte precursor,
The stem cell-derived exosome-containing culture medium is obtained by treating TNF-α at a concentration of 50 ng / ml in stem cell culture and culturing for 24 hours under an oxygen concentration condition of 5%, for the prevention or treatment of osteoarthritis Pharmaceutical compositions. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 1x104~1x106 세포수인 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The method of claim 1,
The stem cell is characterized in that the number of 1x10 4 ~ 1x10 6 cells, pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis. 삭제delete
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