KR102053707B1 - 섬유아세포의 조건배지와 기능성 펩타이드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 동물세포의 조건배지 및 기능성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 개시된다. 본 발명은 배양된 균질한 포피(foreskin)로부터 유래된 섬유아세포의 조건배지와 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

섬유아세포의 조건배지와 기능성 펩타이드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물{Anti-wrinkle composition comprising functional peptides and fibroblast conditioned medium}

본 발명은 기능성 펩타이드와 섬유아세포의 조건배지를 포함하는 항노화 및 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라게나제의 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐의 생성을 촉진하고 피부세포의 증식을 촉진하는 효과를 나타내는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장료의 가장 큰 관심 분야 중 하나는 노화와 관련된 주름, 색소침착, 탄력감소, 피부 건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저, 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber) 및 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부주름 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부주름 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부 주름살이나 피부 처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다. 레티놀은 주름 기능성 고시 원료로 등재될 정도로 효과에 대해 검증이 된 원료이나 특유의 피부자극 문제, 안정성 문제에 대해서는 끊임없이 제기가 되어 오고 있으며 높은 가격으로 고가의 제품군에서 활용이 되며 보편적 소재로 활용하기 어려운 부분이 존재한다.

펩타이드는 아미노산이 아마이드 결합(amide bonds)을 이루면서 생성되는 물질로 기초임상 연구 분야, 의약품분야(진단시약, 호르몬, 항생제), 생활용품(식품첨가물, 항진균제, 화장품)등 광범위한 분야에 사용되는 핵심 기초 소재이다. 특히 간염, AIDS을 비롯한 각종 바이러스에 의한 질환에 대해 펩타이드를 이용한 진단법 및 예방, 치료약의 개발은 종래의 고가의 단백질을 이용한 것보다 비용을 낮출 수가 있으며, 단백질보다 높은 감도, 선택적 특이성 및 효율성을 제공할 수 있는 생물 소재이다. 또한, 펩타이드는 필요에 따라 합성되고 그 역할이 끝나면 자연스럽게 소멸되므로, 펩타이드가 의약품, 화장품으로 사용되었을 때, 부작용이 거의 없고 작용도 탁월한 것으로 알려져 있다.

이러한 펩타이드를 화장품에 적용하기 시작한 것은 2000년대 초반부터 프랑스에서 최초로 시도되어 왔으며 현재는 전 세계적으로 활용되고 있는 소재이며 높은 시장 성장률을 보이고, 대표적인 기업으로는 스페인의 리포텍(Lipotec, Inc.), 프랑스의 세데르마(Sederma, Inc), 스위스의 펜타팜(Pentapharm, Inc) 등이 있다.

펩타이드는 뛰어난 안전성과 피부침투력이 임상검사에 의해 입증되었고 피부 활성 성분들은 피부의 주된 세포인 케라티노사이트와 섬유아세포의 증식을 촉진시키고 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산, 라미닌 및 피브로넥틴 등의 세포간 물질 생산을 촉진함으로써, 피부세포를 전반적으로 활성화하고 노화된 피부의 빠른 재생을 도와주는 것으로 알려져 있다.

화장품용 펩타이드 소재의 장점은 안정성과 안전성에 있는데, 예를 들면 기존의 주름개선 성분인 레티놀이 빛과 열에 약하고 불안정한 반면, 펩타이드 제제인 아지렐린의 경우 이러한 제한이 없어 낮에도 사용할 수 있으며, 생체 유래 물질로 많은 양을 사용해도 부작용이 없어 민감한 눈가에도 안심하고 사용할 수 있다, 기능성 펩타이드는 아미노산서열의 다양성에 따라 세포증식, 세포이동, 염증반응, 혈관신생, 피부착색 등 피부 관리에 필요한 다양한 리간드-수용체 결합을 조정하는 데 있어서 유용하며, 생체 유래 물질이므로 면역관용성이 있고, 작은 크기에 따른 높은 경피 투과성과 체외배출도, 합성과 변형이 용이하다는 장점 있는 주요 화장품소재로 활용되고 있다. 기존의 단백질 소재에 비해 효능은 유사한 반면, 크기가 월등히 작으므로 피부투과율이 뛰어나고, 순도 및 가격 등 경제적 생산 측면에도 강력한 경쟁력을 갖추었으며, 분해와 배출이 잘되므로 부작용을 일으킬 가능성이 낮은 등의 장점을 두루 갖춘 소재이다.

성장인자는 통상적으로 다양한 생물학적 효과를 보이는 폴리펩타이드, 상처 치유 및/또는 표피 재형성에 유용한 것으로 확인된 일부의 성장 인자 패밀리, 예를 들면, 성장인자 β(TGF-β), 표피 성장 인자(EGF)를 변환, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ), 산화철을 포함 유래 성장 인자 (PDGF), 섬유 모세포 성장 인자 (FGFs)등이 있다.

다양한 성장인자 중 가장 대표적이며 많이 활용되고 있는 원료는 EGF(Epidermal Growth Factor, 상피세포 성장인자)이며 유전자 재조합 기술이라는 바이오 기술을 활용한 원료이며, 미국의 생물학자 스탠리 코헨(Stanley Cohen) 박사가 최초 발견하였고, 1986년 노벨 생리의학상을 수상하며 세계의 이목을 끌기 시작한 생리 활성 단백질이다. 침과 땀, 혈액 등 우리 인체 내에 존재하는 천연 피부 재생 물질로 우리 피부 세포를 성장 및 재생뿐 아니라 잔주름 제거, 피부탄력 유지, 피부 재생 작용에 뛰어난 역할을 하는 성분으로 알려져 있다.

최근 남성형 탈모에 대한 메커니즘이 국내 연구팀에 의해 규명되었는데 남성호르몬에 의해 유도되는 'Wnt' 억제 단백질인 'Dickkopf-1(DKK-1)'이 남성형 탈모를 야기하며 모발의 발생과 성장에 신호전달 단백질인 Wnt가 중요한 역할을 한다는 사실은 잘 알려져 있으나, 수염의 경우에는 남성호르몬이 DKK-1이 아니라 세포 성장에 관련된 '인슐린양 성장인자(IGF-1)'의 발현을 증가 시는 반면, 탈모가 진행 중인 머리카락에서는 남성호르몬이 DKK-1의 생성을 유도해 모발세포의 사멸(死滅)을 일으키는 것으로 파악되어 탈모에 대한 새로운 대안으로 IGF-1의 연구가 활발히 이루어지고 있다.

위와 같이 EGF, IGF-1외에 다양한 성장인자들이 메디컬 화장품의 핵심원료로 연구, 사용되고 있으며 시장파급력과 성장성이 크다고 예상되고 있다. 아울러 이들 성장인자들의 약점이라 할 수 있는 가격과 안정성 개선에 대한 연구도 활발히 이루어지고 있으며 연구가 확대될 것이라 전망하고 있다.

줄기세포 배양액의 경우, 메디컬 화장품에서 조직을 재생하는 형태가 아닌 줄기세포 배양 시 분비되는 펩타이드·효소와 같이 배양액이나 추출물을 함유한 화장품을 생산하는데 쓰이고 있으며 피부 노화 예방·주름 개선·미백 등에 효과가 있는 성분들이 줄기세포 배양 과정에서 나오는 것이며 화장품에 함유될 수 있는 정확한 성분의 명칭은 '인체 제대혈 유래 줄기세포 배양액'이고 이는 식약처가 인정한 합법적 화장품 원료로 국제화장품 원료집 INCI에도 등재된 안전한 성분이다. 줄기세포 배양액은 피부에 유효한 성장인자들이 많이 함유돼 있어 화장품에 적용되면 피부 탄력, 투명도 개선 등에 도움을 주는 것으로 사용되고 있다.

살아있는 세포는 인공 배양 중 영양 배지에 성장 인자를 포함하여 세포 외로 단백질 및 펩타이드를 분비한다. 배양 세포의 인공 배양을 통해 성장인자 등이 분비된어 있는 배지를 ‘조건배지(conditioned medium)’(미국특허 제6,372,494호 참조)라 하며 성장 인자가 풍부한 조건배지는 삼차원 기질 및 조직 특이적 세포(즉, 삼차원 배양 시스템)의 다수의 층을 포함하는 세포 배양물을 배양하기 적합하며 기능성 화장품 조성물을 제조하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 미국특허 제6,372,494호 등을 확인하면 복잡한 삼차원 배양 시스템은 예를 들어 간단한 2차원 배양 시스템에 더 큰 표면적을 가지고 있는 등의 많은 장점을 가지고 있어 다양한 실험을 위해 활용되며, 이때 조건배지는 삼차원 배양 시스템을 구축하는 데 적합하다는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 성장인자의 사용은 피부 케어 전문가들 사이에서 많은 호응을 얻으며 피부 외상의 치료, 피부 손상 치료, 주름 및 기타 결함의 방지에 보다 효과적으로 활용되고 있다.

결론적으로 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해 다양한 화장품용 소재들이 개발, 활용되고 있으며 효능이 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 주름 개선 조성물 개발이 필요하며 효능의 검증은 분자생물학적 메카니즘으로 규명되고 인체 대상 임상시험으로 검증하는 것이 중요하다.

따라서, 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 섬유아세포의 조건배지 및 기능성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 문제를 해결하기 위하여 본 발명은, 배양된 균질한 포피(foreskin)로부터 유래된 섬유아세포의 조건배지와 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 섬유아세포는 ATCC 수탁번호 PTA-11680으로 지정된 세포주 또는 PTA-11681으로 지정된 세포주로부터 나온것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 전체 조성물에 대하여 상기 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1은 각각 0.005 내지 0.1%(w/v)으로 포함이 되며, 상기 조건배지는 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 피부 섬유아세포의 생장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 MMP-1의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 세포 내 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 섬유아세포의 배지 및 기능성 펩타이드를 이용하여 피부 세포 내 콜라겐을 분해하여 주름생성에 영향을 주는 콜라게나제의 활성을 억제하고 세포 내 콜라겐의 생성을 촉진하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 20, 비교예 1 및 2에서 제조된 화장료 조성물에 따른 콜라게나제 저해능을 비교한 그래프,
도 2는 본 발명의 실시예 11, 13, 18 및 20에서 제조된 화장료 조성물과 비교예 2 내지 6에서 제조된 화장료 조성물에 따른 MMP-1 저해능을 비교한 그래프,
도 3은 본 발명의 실시예 11, 13, 18 및 20에서 제조된 화장료 조성물과 비교예 2 내지 6에서 제조된 화장료 조성물에 따른 콜라겐 생성능을 비교한 그래프,
도 4는 본 발명의 실시예 11 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물의 각질세포의 재생능을 위상차 현미경(LABOMED, Eyecam)으로 촬영한 사진,
도 5은 본 발명의 실시예 11 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물의 시간경과에 따른 색 및 향의 변화를 관찰하여 디지털 카메라(NIKON D3200, 18-55mm)로 촬영한 사진,
도 6은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 열 안정성을 측정한 그래프,
도 7은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 광 안정성을 측정한 그래프,
도 8은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 세포독성을 NIH3T3 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프,
도 9는 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 세포독성을 HACAT 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이다.

이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2, 아세틸 테트라펩타이드-1 및 섬유아세포(fibroblast)의 조건배지 성분을 유효성분으로 포함하는 조성물이 피부세포의 재생과 콜라게나제의 활성을 저해하고 세포 내 콜라겐의 생성을 촉진하는 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 본 발명자들은 우수한 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효능을 가지는 조건배지에 대한 특허를 참고하였다(미국 특허 등록번호 US제8,518,879호). 본 발명에서는 상기 선행 특허를 통해 그 효과를 확인한 조건배지와 전통적으로 피부 주름 개선에 효과가 알려져있어 많이 활용되어 온 5종의 펩타이드를 포함한 조성물을 개발하여 그 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 상기 미국 특허출원(미국 특허 등록번호 US제8,518,879호)에 개시된 내용은 모두 본 발명을 위한 참고자료가 될 수 있다.

본 발명의 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 구성하는 기능성 원료들은 모두 다른 메카니즘을 통해 피부에 작용하여, 피부 주름 개선에 도움을 주는 원료이며, 따라서 이들을 조합하여 사용할 경우 각각의 원료들은 단독으로 사용하는 것과 비교하여 그 효과가 더욱 증강될 수 있다.

따라서 본 발명은 배양된 균질한 포피(foreskin)로부터 유래된 섬유아세포의 조건배지와 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 개시한다.

살아있는 세포는 인공 배양 중 영양 배지에 성장 인자를 포함하여 세포 외로 단백질 및 펩타이드를 분비하는데, 본 발명에서‘조건배지(conditioned medium)’란 배양 세포의 인공 배양을 통해 성장인자 등이 분비되어 있는 배지를 의미한다(미국특허 제6,372,494호 참조).

상기 섬유아세포는, ATCC 수탁번호 PTA-11680으로 지정된 세포주 또는 PTA-11681으로 지정된 세포주일 수 있다.

상기 섬유아세포는 다음과 같은 방법으로 분리될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 새로운 조직 샘플(예, 사람 포피)을 철저하게 세정하고, 행크(Hank‘s) 평형 염 용액(HBSS)하에서 잘게 절단하여 혈청을 제거한다. 잘게 절단한 조직을 트립신과 같은 용액하에서 1 내지 12시간 동안 배양한다. 그러한 배양 후, 해리된 세포를 현탁시키고, 원심분리기를 통해 분리할 수 있다.

본 발명에서 상기 조건배지는 상기 섬유아세포를 성장 배지에 접종하여 배양한 배지일 수 있다.

상기 성장 배지는 배양되는 세포의 영양 요구를 적절하게 설명하는 임의의 세포 배양 배지일 수 있다.

또한, 상기 성장 배지는 소정의 세포 또는 조직 배양물을 지지하는데 필요한 임의의 성분을 사용하여 보충될 수 있다. 추가로, 성장 억제제, 성장 촉진제, 글로불린 및 알부민의 복합액인 소 혈청과 같은 혈청을 필요할 경우 첨가할 수 있고, 혈청은 병원체가 없어야 한다.

상기 성장 배지의 성분은 아미노산(D 및/또는 L-아미노산 모두), 예컨대 글루타민, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스틴, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 및 그의 유도체; 산 가용성 하부기, 예컨대 티아민, 아스코르브산, 제2철화합물, 제1철 화합물, 퓨린, 글루타티온 및 1 염기성 인산나트륨을 포함할 수 있다.

또한, 추가 성분으로 당, 데옥시리보스, 리보스, 뉴클레오시드, 수용성 비타민, 리보플라빈, 염, 미량의 금속, 지질아세테이트 염, 포스페이트 염, HEPES, 페놀 레드, 피루베이트 염 및 완충제가 있을 수 있다.

또한, 배지 제제에 종종 사용되는 기타의 성분은 지용성 비타민(A, D, E 및 K 포함) 스테로이드 및 그의 유도체, 콜레스테롤, 지방산 및 지질트윈(Tween) 80, 2-머캅토에탄올 피라미딘 뿐만 아니라, 혈청(태아, 말, 송아지 등), 단백질(인슐린, 트랜스페린, 성장 인자, 호르몬 등), 항생제(겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신B 등) 전란 한외 여과액 및 부착 인자(피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 테나스신 등)을 비롯한 각종 보충물을 포함할 수 있다.

또한, 다수의 세포 작제물 자체가 배지에 상기 성장 및 유착 인자 및 기타의 생성물을 생성하므로, 배지는 성장인자, 펩티드 및 기타 단백질, 예컨대 부착 인자가 보충될 수 있다.

상기 성장 배지를 위한 기타 성분, 예컨대 비타민, 성장 및 유착 인자, 펩티드, 단백질 등은 특정한 필요에 따라 당업자에 의하여 선택될 수 있다.

본 발명의 배양된 균질한 포피(foreskin)로부터 유래된 섬유아세포의 조건배지는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 ATCC 수탁번호 PTA-11680으로 지정된 세포주 또는 ATCC 수탁번호 PTA-11681으로 지정된 세포주로부터 나온 섬유아세포가 10⁵ 내지 10¹⁰cfu/㎖으로 포함된 배지를 0.5 내지 5중량부 접종시켜 35 내지 39℃에서 1 내지 5일간 배양하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁹cfu/㎖의 배양액으로 0.5 내지 2중량부 접종시켜 36 내지 38℃에서 2 내지 4일간 배양하여 수행될 수 있다. 이때 배양에 사용되는 배지는 펩톤, 아세트산 나트륨 수화물, 황산 마그네슘 수화물, 황산 망간 수화물, 트윈 80, 시트르산 아암모늄, 인산이칼륨 및 증류수를 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명에서 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1은 전체 조성물에 대하여 각각 0.005 내지 0.1%(w/v)으로 포함이 될 수 있고, 상기 조건배지는 1 내지 10%(v/v)로 포함 될 수 있고, 바람직하게는 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1은 각각 0.005 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)로 포함이 될 수 있다. 또한, 상기 조건배지는 바람직하게 5 내지 10%(v/v)로 포함이 될 수 있다.

상기 트리펩타이드-29는 분자량의 크기가 300 이하인 크기가 작은 펩타이드로서 Hyp-Pro-Gly의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 경피흡수가 가능하여 효율적으로 각질층, 표피층, 모낭 등으로 고농도로 흡수가 가능함으로써 피부에 흡수되어 콜라겐을 생성하여 피부탄력 증가 및 주름개선 등에 효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있다.

상기 아세틸테트라펩타이드-7은 4개의 아미노산 (Gly-Glnp-Pro-Arg)으로 으로 이루어진 펩타이드에 팔미토일 (Palmitoyl)기 도입(Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH 분자량 694.91)하여 만들어진 펩타이드로 Palmitoyl기를 도입하여 기존 tetrapeptide의 피부 흡수도를 증대시켜 피부의 콜라겐 합성 증대로 피부탄력 증가,피부재생 및 콜라겐의 증가로 피부탄력 증가에 효과가 있는 화장품용 펩타이드이다.

상기 아세틸펩타펩타이드-1 및 아세틸테트라펩타이드-2는 Thymopoietin (Lamina-associated polypeptide 2 ; LAP2)에서 유래한 2종의 펩타이드로 Thymopoietin은 youth hormone이라는 별칭이 존재할 정로로 사람의 몸안에서 피부의 재생과 안티에이징에 중요한 호르몬으로 작용하는 물질로 아세틸펩타펩타이드-1 및 아세틸테트라펩타이드-2는 Thymopoietin의 핵심적인 서열만을 재구성하여 만든 펩타이드로 피부의 표피세포의 분화와 생장에 관여하여 피부 재생과 주름 예방에 효과가 있는 화장품 조성물로 활용되고 있다.

또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 2 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성되어 매우 분자량이 작고, 상기 조건배지도 미생물에 의한 발효로 인해 저분자화되어 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서, 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 높은 피부 침투율로 인해 우수한 피부 주름 개선 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 피부 섬유아세포의 생장을 촉진할 수 있고, MMP-1의 활성을 저해할 수 있고, 세포 내 콜라겐 생성을 촉진시킬 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 콜라게나제, MMP-1과 같은 콜라겐 분해 효소의 활성을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인이 되었으며, 또한 세포 내 섬유아세포의 생장을 촉진하고 콜라겐 생성을 촉진하는 효과도 매우 우수한 것으로 확인이 되었다.

또한, 상기 화장료 조성물은 사람 유래의 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였고, 100ng/ml-1000μg/ml의 농도로 HaCat 세포 및 NIH3T3 세포에 해당 조성물을 처리한 결과, 세포 독성은 측정되지 않았으며 육안으로 세포의 형태를 확인하였을 때도 큰 변화는 관찰되지 않았다.

또한, 상기 화장료 조성물은 40~60℃ 온도에서도 우수한 열 안정성을 나타내며, 일광 조건에서도 안정함을 확인하였다. 즉, 상기 화장료 조성물은 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있음을 의미한다.

또한, 상기 화장료 조성물의 임상 효능을 확인하기 위해 공인 임상기관에 의뢰하여 본 특허의 조성물이 포함된 크림과 포함되지 않은 크림의 주름 개선효과를 비교한 결과, 본 발명에 따른 조성물이 포함된 크림에서 눈가 주름 개선 효능이 현저히 더 우수한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 콜라게나제 저해, 콜라겐 생성 촉진, 피부탄력 개선 및 보습 효과가 매우 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등의 화장료 조성물에 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 주름개선 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 피부 주름개선 성분으로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.

제조예 : 섬유아세포의 조건배지의 제조

I. 배양

조건배지 제조를 위해 필요한 섬유아세포(ATCC 수탁번호 PTA-11680 및 PTA-11681)를 확보하는 방법은 선행특허(미국 특허 등록번호 US제8,518,879호)를 참조하였고, 이후 상기 확보된 섬유아세포를 배양하여 세포 현탁액을 만들었다. 구체적으로 눈크 마이크로헥스 마이크로캐리어(덴마크에 소재하는 날쥐 눈크 인터내셔날(Nalge Nunc International))를 갖는 파동형 생물반응기를 사용하여 진행하였다. 눈크 마이크로헥스는 측면 길이가 125 미크론인 2D, 평편 육방정계 형상의 폴리스티렌 담체이다.

II. 접종

셀백(Cellbag)(웨이브 바이오테크(Wave Biotech))이 단단해질 때까지 공기 및 10% CO₂로 부풀렸다. 배지를 첨가하고, 필터의 투입구 및 배출구를 클램프로 고정시켰다. 그 후, 셀백을 1 분당 약 15회로 약 7°의 각도로 흔들고, 온도 및 pH가 평형을 이루도록 하였다. 초기 부피는 최종 배양물 부피의 약 50%이었다. 그 후, 마이크로캐리어 및 상기 세포 현탁액을 첨가하였다. 일반적으로, 1 ㎖당 약 0.1 내지 0.5×10⁶개의 세포의 초기 세포 밀도를 첨가하였다.

필터의 투입구 및 배출구를 클램프로 고정시킨 상태를 유지하고, 약 20 rpm의 속도 및 약 7°의 각도로 계속 흔들었다. 부착 과정을 수시간에 걸쳐 또는 밤새 지속하였다.

III. 작동

일단 세포가 부착되면, 나머지 양의 세포현탁액을 첨가하여 배양물이 최종 부피가 되도록 하였다. 세포 밀도, 생육성 및 대사는 세포가 성장하는 동안 모니터하였다. 산소 레벨을 모니터하고, 반응에서 배양물의 산소 요구량으로 rpm 및 각도를 조절하였다. 충분한 산소를 유지하고 그리고 마이크로캐리어 및 세포의 현탁된 상태를 유지하면서 낮은 rpm 및 각도를 유지하는 것이 바람직하다. 흔드는 것을 중단하고 배지 교환을 실시한다. 플랫폼을 앞으로 기울여서 마이크로캐리어 및 세포 복합체가 셀백의 바닥 모서리에 수분 이내에 가라앉게 하였다. 그 후, 임의의 마이크로캐리어를 제거하지 않으면서 배지를 펌핑 처리하였고, 배양물 부피의 90% 이하를 이러한 방식으로 제거하였다. 새로운 예비-가온시킨 배지를 첨가하고, 셀백을 흔드는 것을 이전의 설정에서 재개하였다.

IV. 흔들기 속도(rocking speed)

흔들기 속도는 배양물 부피, 세포 밀도 및 셀백 크기 세포 또는 배양물 플라스크 또는 페트리 접시에 의존하였다. 셀백 2 ℓ 및 10 ℓ의 경우, 속도는 초기에 약 15 내지 20 rpm으로 설정하였다. 세포 밀도가 증가됨에 따라 속도를 약 20 내지 25 rpm로 증가시켰다.

V. 흔들기 각도

셀백 2 ℓ 및 10 ℓ의 경우, 6 °의 초기 각도로 설정하였다. 최대 세포 밀도가 달성되면, 약 7 내지 8°의 각도로 설정하였다.

VI.환기 속도(aeration rate)

셀백을 단단하게 부풀려서 유지하였다. 셀백이 부풀어 있는 동안 1분당(1 pm) 약 0.5ℓ 이하의 유속을 사용하였다. 세포의 성장이 관찰되면, 유속을 2 ℓ 백의 경우 약 0.11pm 그리고 10ℓ 셀백의 경우 약 0.21pm으로 설정하였다.

VII. 작동 온도

포유동물 세포에 대한 통상의 작동 온도는 36 내지 37℃이다.

VIII. pH 조절

파동형 생물반응기의 높은 기체 수송 용량으로 인하여, pH는 신속하게 이동될 수 있다. 하기 절차에 따라 pH를 조절하였다.

a. 셀백을 초기에 10% CO₂로 부풀렸다. 부풀린 후, 배지 및 마이크로캐리어를 생물반응기에 첨가하고, 공기 필터의 투입구 및 배출구를 닫았다. 완전 평형화시키기 위한 pH 및 온도의 경우, 셀백을 1 내지 2시간 동안 약15rpm에서 흔들도록 하였다. 접종 전, 필요할 경우 샘플을 취하여 pH를 체크하고 조절하였다.

b. 마이크로캐리어를 세포에 접종시키고, 여기서 필터의 투입구 및 배출구를 닫아두었다.

c. pH, 글루코스 농도 및 세포 밀도를 모니터한다. 일단 pH 및 글루코스 레벨이 떨어지기 시작하면 상부 공간을 통한 연속 기류를 5% CO₂로 교체하였다. 급격하게 성장하는 세포를 발견하면, 스위프(sweep) 가스 중의 CO₂ 농도로 pH를 조절한다.

d. 흔들기 속도 및 각도를 증가시켜 산소 농도를 유지시켰다.

e. 사용된 배지의 교체 시 주의하고, 세포가 새로운 배지에 적응됨에 따라 pH를 모니터하고, CO₂ 농도를 조절하였다.

IX. 규모 확대

규모 확대를 하기 절차에 따라 진행한다.

a. 500㎖ 배지를 사용하여 2ℓ셀백을 채웠다. 13g의 마이크로헥스 캐리어를 첨가하고, pH가 평형을 이루도록 하였다. 충분한 세포 접종물을 첨가하여 0.3×10⁶ 세포/㎖ (총 1.5×10⁸ 세포) 이상의 출발 세포 계수를 생성하였다. 흔들기 속도는 약 15rpm으로, 흔들기 각도는 약 6°로 12 내지 24시간 동안 설정하였다. 시스템은 작동 온도를 유지하였다.

b. 그 다음날, 500 ㎖의 배지를 첨가하고, rpm을 약 18로 조절하며, 각도는 약 6로 조절하였다.

c. pH가 떨어지기 시작할 때까지 배양을 지속하였다. 필터의 투입구 및 배출구의 클램프를 풀고, CO₂를 첨가하였다. 배양물내의 산소 레벨을 모니터하였고, rpm을 약 20으로 조절하였다.

d. 글루코스 레벨 및 낮은 pH는 배지가 사용되었다는 것을 나타낼 때까지 배양을 수일간 더 지속시켰다. 배지의 50%를 교환하고, pH를 조심스럽게 모니터하였다. rpm을 약 22로 조절하고, 각도를 약 7°로 조절하였다.

e. 50% 배지 교환은 격일로 지속하였다.

상기와 같은 과정을 거쳐서 조건배지를 제조하였다.

실시예 1

제조예에서 제조된 동물세포의 조건배지, 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1에 물을 첨가하여 각각 조건배지 5v/v%, 헥사펩타이드-9 0.06w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.01w/v%, 트리펩타이드-29 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.01w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.01w/v%을 제조하였다. 이후 물을 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 2

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.05w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 3

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.05w/v%, 및 트리펩타이드-29 0.02w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 4

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.04w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v% 및 트리펩타이드-29 0.02w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 5

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.03w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.03w/v% 및 트리펩타이드-29 0.02w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 6

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.03w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v% 및 트리펩타이드-29 0.02w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 7

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.03w/v% 및 트리펩타이드-29 0.03w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 8

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-7 0.04w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 9

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v% 및 트리펩타이드-29 0.04w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 10

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-7 0.05w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 11

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v%, 트리펩타이드-29 0.05w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 12

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.05w/v%, 트리펩타이드-29 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 13

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.03w/v%, 트리펩타이드-29 0.04w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 14

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.04w/v%, 트리펩타이드-29 0.03w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 15

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.07w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 16

상기 실시예 1에서 트리펩타이드-1 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.06w/v%, 트리펩타이드-29 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 17

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.05w/v%, 트리펩타이드-29 0.03w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 18

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.04w/v%, 트리펩타이드-29 0.04w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 19

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.03w/v%, 트리펩타이드-29 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

실시예 20

상기 실시예 1에서 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v%, 트리펩타이드-29 0.06w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 1

시판중인 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 물에 녹여 0.05w/v%로 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 2

상기 제조예에서 제조된 조건배지에 물을 첨가하여 5v/v%의 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 3

조건배지 없이 물을 첨가하여 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v%, 트리펩타이드-29 0.05w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 4

조건배지 없이 물을 첨가하여 헥사펩타이드-9 0.02w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.03w/v%, 트리펩타이드-29 0.04w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 5

조건배지 없이 물을 첨가하여 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.04w/v%, 트리펩타이드-29 0.04w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

비교예 6

조건배지 없이 물을 첨가하여 헥사펩타이드-9 0.01w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-7 0.02w/v%, 트리펩타이드-29 0.06w/v%, 아세틸 테트라펩타이드-2 0.005w/v% 및 아세틸 테트라펩타이드-1 0.005w/v%를 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

하기 표 1은 실시예 1 내지 20 및 비교예 2 내지 6의 각 조성의 비율을 나타낸 표이다.

실험예 1 : 조성물의 콜라게나제 활성 저해 효과 확인

상기 실시예 1 내지 20, 비교예1 및 2에서 제조한 주름 개선 화장료 조성물의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 생체 외(In vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 저해능에 대한 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

<실험 방법>

1. 실시예 1 내지 20 및 비교예1 내지 6에서 제조한 주름 개선 화장료 조성물을 인산 완충액에 녹여 준비한다(100, 50, 25ppm)

2. 48well에서 용매(DMSO)를 이용하여 적당한 농도 범위로 희석하여 상기 테스트 샘플을 300㎕/48well씩 준비한다.

3. 15㎖ 글래스 튜브를 준비하고, 하기 표 2와 같은 순서로 용액을 분주한다.

4. 25mM 시트르산을 400㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다.

5. 에틸아세테이트를 1.5㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 10분간 방치한다.

6. 상등액을 취하여 황산나트륨 150mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다.

7. 상등액 300㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320nm에서 흡광도를 측정한다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 20, 비교예1 및 2에서 제조된 화장료 조성물에 따른 콜라게나제 저해능을 비교한 그래프이다.

도 1을 참조하면, 생체 외 콜라게나아제 활성 저해 시험을 실시한 결과 조건배지와 펩타이드가 혼합된 화장료 조성물(실시예 1 내지 20)이 조정배지 만으로 제조된 화장료 조성물(비교예 2)에 비해 높은 콜라게나제 저해 활성을 보이는 것으로 확인되었으며 조건배지 자체의 콜라게나아제 저해활성은 없는 것으로 판단된다. 특히 실시예 11, 13, 18 및 20이 콜라게나아제 활성의 저해율이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, EGCG를 이용하여 제조된 화장료 조성물(비교예1)의 콜라게나아제 저해율은 조건배지와 펩타이드가 혼합된 화장료 조성물(실시예 1 내지 20)과 유사한 저해율을 확인하였다.

실험예 2 : MMP -1(Matrix Metalloproteinase - 1)활성 저해 실험

Matrix methaloprotease-1(MMP-1, collagenase) 생성을 저해하는 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 원료에 대한 MMP-1 생성저해 활성을 측정하여 활성을 갖는 원료는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가 할 수가 있다. 실시예(실시예 11, 13, 18 및 20), 비교예 2 내지 6의 화장료 조성물에 대하여 MMP-1 활성 저해능 실험을 하기 방법에 따라 진행 하였고 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로 레티놀을 사용하였다.

<실험방법>

(1) 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(2) 24-웰 플레이트에 2 X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 9종의 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다.

(3) 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 생성 저해능을 측정하였다.

도 2는 본 발명의 실시예 11, 13, 18 및 20에서 제조된 화장료 조성물과 비교예 2 내지 6에서 제조된 화장료 조성물에 따른 MMP-1 저해능을 비교한 그래프이다.

도 2를 참조하면, 세포내에서 생성되는 MMP-1의 발현양이 조건배지 및 펩타이드로 제조된 화장료 조성물(실시예 11, 13, 18 및 20)에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였으며 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 효능에 차이가 있는 것으로 확인되었다. 실시예 11의 효능이 가장 우수하였으며 펩타이드 및 조건배지를 이용하여 제조된 화장료 조성물의 경우 조건 배지만 이용하여 제조된 화장료 조성물(비교에 2) 및 펩타이드만을 이용하여 제조된 화장료 조성물(비교예 3 내지 6) 대비 높은 MMP-1 발현 저해능을 보였다.

이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 MMP-1생성을 저해하여 피부의 주름을 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

실험예 3 :세포 내 콜라겐 생성능 평가

실시예(실시예 11, 13, 18 및 20) 및 비교예 2 내지 6 대해 세포 내 콜라겐 생성능 시험을 하기 방법에 따라 진행하였고, 그에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 대조군으로 TGF-b를 사용하였다.

<실험 방법>

(1) 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(2) 24-웰 플레이트에 1X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 9종의 실험군과 대조군으로 TGF를 10μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다.

(3) 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101) 을 통해 콜라겐 생성량을 측정하였다.

도 3은 본 발명의 실시예 11, 13, 18 및 20에서 제조된 화장료 조성물과 비교예 2 내지 6에서 제조된 화장료 조성물에 따른 콜라겐 생성능을 비교한 그래프이다.

도 3을 참조하면, 조건배지 및 펩타이드를 혼합하여 제조된 화장료 조성물(실시예11, 13, 18 및 20)의 경우 콜라겐의 양이 대조군인 TGF에 비해 콜라겐 생성량이 증가하는 것을 확인하였으며 조성물내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 또한, 조건배지 및 펩타이드를 혼합하여 제조된 화장료 조성물(실시예11, 13, 18 및 20)의 경우 펩타이드만을 혼합하여 제조된 화장료 조성물(비교예 3 내지 6)보다 콜라겐 생성양이 증가한 것을 확인 할 수 있다.

이러한 결과로부터 피부에서의 콜라겐 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 콜라겐 생성을 증가시켜 피부의 주름을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

실험예 4 : 각질세포 재생능 평가

다양한 원인으로 손상된 피부세포의 재생에는 다양한 세포 간, 세포 내 Metabolisom이 작용한다. 이러한 metabolism을 활성화 하여 손상된 피부 세포의 성장을 촉진, 세포 회복능을 향상시킬 수 있는 실험인 wound healing assay를 통해 실시예 11 및 비교예 2의 세포 재생 유도 효과를 하기 방법에 따라 확인하였고, 이를 도 4에 나타내었다.

<실험방법>

(1)6 well plate에 100% 차도록 자란 인간 피부 각질 세포주의 중간을 tip을 이용하여 균일하게 상처를 낸 후 PBS를 이용하여 2회 세척한다.

(2) 실시예 11 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물을 전체 세포 배양 배지에 10, 5, 2.5, 1.3% 농도가 되도록 처리하였으며 실험 시간을 총 12, 24시간을 기준으로 하며, 각각의 시간 동안 상처의 회복 정도를 이미지 장비를 통해 확인한였다.

도 4는 본 발명의 실시예 11 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물의 각질세포의 재생능을 위상차 현미경(LABOMED, Eyecam)으로 촬영한 사진이다.

인간 피부 각질세포(HaCaT)에 기능성 펩타이드 N또한 양성 대조군 Vitamin C 와는 동등한 효과를 보였으며, 시중 제품에 비해서는 동등하거나 그 이상의 피부 재생 유도 효과를 나타내었다.(미도시)

도 4를 참조하면, 각질세포 재생능을 확인한 결과 각질세포의 재생능은 처리한 혼합액의 농도에 따라 효능이 다름을 확인하였으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 특히 조건배지 및 펩타이드를 혼합하여 제조한 화장료 조성물(실시예 11)이 조건배지만을 이용하여 제조된 화장료 조성물(비교예 2)보다 세포 재생능이 우수한 것을 알 수 있고, 이러한 결과로 조건배지 및 펩타이드를 혼합하는 경우, 세포 재생에 시너지 효과가 있는 것으로 판단된다. 따라서, 상기 결과로부터 피부 각질 세포에서의 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 다양한 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 상처 난 피부의 재생에 좀 더 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

실험예 5 :피부 주름 개선용 조성물의 안정성 확인 실험

본 발명의 주름 개선 조성물의 열 및 광 안정성을 확인하기 위하여, 실시예 11, 13, 18, 20 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물을 하기 방법에 따라 실험을 수행하였고, 그에 대한 결과를 각각 도 5 내지 7에 나타내었다.

<실험 방법>

주름 개선 조성물이 10mg/mL이 되도록 조성물을 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50℃ 에서 7, 14, 21, 28, 35, 42 및 60일 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드 성분의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다.

도 5은 본 발명의 실시예 11 및 비교예 2에서 제조된 화장료 조성물의 시간경과에 따른 색 및 향의 변화를 관찰하여 디지털 카메라(NIKON D3200, 18-55mm)로 촬영한 사진이고, 도 6은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 열 안정성을 측정한 그래프이고, 도 7은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른 광 안정성을 측정한 그래프이다.

도 5를 참조하면 60일까지 색 및 향에 변화가 없었고, 도 6 내지 7을 참조하면, 60일까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 광 안정성에 있어서 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 6 : 세포독성 실험

본 발명의 조성물이 각질세포에 대해 독성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 11, 13, 18 및 20에서 제조된 화장품 조성물에 대하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그에 대한 결과를 도 8 및 9에 각각 나타내었다.

<실험 방법>

세포 독성 평가는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HACAT세포와 3T3세포를 24 well plate에 각 well당 4 X 10⁴ cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24 h 동안 37℃, 5% CO₂조건으로 항온 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 배양 후 합성 tranexamic acid dipeptide를 농도별(1mg ~ 1ug/mL)로 처리하여 24 h 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT 0.5% in DPBS를 배양배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 570nm에서 측정하였다.

도 8은 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른세포독성을 NIH3T3 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이고, 도 9는 본 발명의 실시예 11,13,18 및 20에서 제조된 화장료 조성물에 따른세포독성을 HACAT 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이다.

도 8 및 9을 참조하면, 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 NIH3T3 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 처리한 조성물에 의한 세포수의 감소는 관찰되지 않았으며, 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 주름 개선 조성물은 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 이로써 본 주름 개선 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims (7)

1. 배양된 균질한 포피(foreskin)로부터 유래된 섬유아세포의 조건배지와 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물로서,
   상기 섬유아세포는 ATCC 수탁번호 PTA-11680으로 지정된 세포주 또는 PTA-11681으로 지정된 세포주인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   전체 조성물에 대하여 헥사펩타이드-9, 아세틸 테트라펩타이드-7, 트리펩타이드-29, 아세틸 테트라펩타이드-2 및 아세틸 테트라펩타이드-1은 각각 0.005 내지 0.1%(w/v)으로 포함이 되며,
   상기 조건배지는 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 섬유아세포의 생장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 MMP-1의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 세포 내 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양에센스, 영양크림, 마사지크림, 바디크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   

Images