KR102052398B1 - 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전립선암 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명은 정상조직 대비 전립선암에서 이상발현되는 새로운 miRNA를 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 외과적 시술 없이 비침습적인 방법으로 전립선암을 빠르고 신속하게 진단(감별)할 수 있다. 특히, 본 발명의 전립선암 진단용 miRNA는 개체의 소변에서 다른 유전자 대비 상대적으로 발현량이 많아 qRT-PCR을 통해 안정적으로 분석이 가능한 이점을 갖는다.

Description

전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for diagnosis of prostate cancer and uses thereof}
본 발명은 전립선암 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트; 및 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성 생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립 선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다.
전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 미국에서는 2016년에만 약 180,890명이 전립선암으로 새로이 진단되어 미국 내 전체 신규 종양진단의 10.7%를 차지하며, 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 빈번하게 발병이 되는 종양이다. 2009년부터 2013년까지의 통계에 비추어 전세계 100,000명의남성 중 129.4명이 전립선암을 가지고 있으며 전립선암의 사망률은 2016년 통계로 26,120명에 이른다. 또한 전립선암은 50세 이전에는 흔하지 않은 질환이나 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보인다. 최근 평균 수명의 연장으로 국내에서도 노인 남성의 수가 급증하고 전립선암을 조기에 진단하여 전이가 발생하는 등으로 악화되지 않도록 지속적인 관리를 필요로 한다. 특히 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 더욱이, 전립선암 치료를 받은 남성의 약 25%는 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 하는 질병으로서, 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인 중 제2의 원인을 차지하고 있는바, 이에 대한 조기진단 및 치료가 필요한 실정이다.
전립선암 진단을 위한 종래기술로는 PSA(Prostate Specific Antigen) 측정 및 바이옵시가 있다. PSA 측정은 전립선암 진단에서 가장 많이 쓰이는 방법으로, 전립선 세포에서 만들어지는 특이 항원 수치를 측정해 전립선암 위험도를 결정짓는 방법이다. 악성 전립선암일수록 PSA 수치는 높으며, 전립선암이 없는 대부분의 남성들은 4ng/mL 미만의 수치를 가지고 있다. 하지만 측정한 PSA 수치가 전립선암의 부재에도 불구하고 굉장히 높거나 혹은 PSA gray zone(PSA 4ng/mL 이상 10ng/mL 이하)구간에 들어 설 경우 바이옵시를 요하게 된다. 바이옵시는 암이 의심되는 장기 부분의 조직을 바늘로 취해 병리조직학적 검사를 통해 환자의 해당 장기에 암, 육종 등의 악성종양 유무를 진단하는 방법이다. 이러한 바이옵시 검사는 환자들로 하여금 굉장히 고통스러우며, 특히 PSA gray zone에서의 전립선암 진단의 정확률은 채 30% 가 되질 않는다. 즉 다시 말해 약 70%의 환자들이 PSA의 한계로 인해 비용이 들고 고통스러운 리바이옵시를 겪게 된다는 단점이 있다.
따라서, 이 같은 불필요한 리바이옵시와 PSA의 한계를 극복 및 대체하기 위해 보다 높은 정확률을 가진 전립선암 특이적 진단법의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명는 전립선암으로 진단된 환자의 소변 샘플 및 비종양 대조군 소변 샘플을 기초로하여 전립선암 특이적 바이오마커로서 특정 miRNA를 규명하였으며, 이들 miRNA 바이오마커가 진행성 전립선암과 국소전립선암 모두의 진단에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2017-0008729호 미국등록특허 제8,597,892호
따라서 본 발명의 목적은 전립선암을 효과적으로 진단(감별)할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단(감별)용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커를 이용하여 전립선암을 효과적으로 진단(감별)을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 전립선암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 hsa-miR-3679-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 전립선암의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 hsa-miR-3679-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 소변일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명은 정상조직 대비 전립선암에서 이상발현되는 새로운 miRNA를 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 외과적 시술 없이 비침습적인 방법으로 전립선암을 빠르고 신속하게 진단(감별)할 수 있다. 특히, 본 발명의 전립선암 진단용 miRNA는 개체의 소변에서 다른 유전자 대비 상대적으로 발현량이 많아 qRT-PCR을 통해 안정적으로 분석이 가능한 이점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 전체적인 실험 설계 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2a는 전립선비대증 대조군(BPH control) 및 전체 전립선암(Total PCa) 환자의 소변에서 miR-3659의 발현량을 보여주는 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 2b는 전립선비대증 대조군(BPH control) 및 전체 전립선암(Total PCa) 환자의 소변에서 miR-3679-5p의 발현량을 보여주는 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 3a는 전립선비대증 대조군(BPH control), 국소전립선암(Localized PCa) 및 진행성 전립선암(Advanced PCa) 환자의 소변에서 miR-3659의 발현량을 보여주는 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 3b는 전립선비대증 대조군(BPH control), 국소전립선암(Localized PCa) 및 진행성 전립선암(Advanced PCa) 환자의 소변에서 miR-3679-5p의 발현량을 보여주는 박스 플롯을 나타낸 것이다.
본 발명은 전립선암 진단을 위한 바이오커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "전립선암 (prostate cancer)"이란, 전립선에서 발생하는 악성 종양으로서 ‘국소전립선암(localized prostate cancer)’ 및 ‘진행성 전립선암(Advanced prostate cancer)’을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 전립선암의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p의 전립선암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 전립선암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 hsa-miR-3679-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열은 전립선암의 진행 또는 발병 여부를 진단할 수 있는 진단 마커로 활용될 수 있으며, 상기 서열은 전립선암의 진행 또는 발명 여부를 진단하는데 있어서 일정정도 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 전립선암 진단 마커로서 정상 개체와 전립선암 질환을 가진 개체 간에 발현량 차이를 유의있게 비교 가능하는 한, 본 발명의 상기 염기서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 전립선암을 가진 개체를 정상 세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 전립선암이 진행 또는 발병된 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 전립선암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 전립선암 세포에서 특이적으로 발현 수준의 차이를 보이는 miRNA 또는 해당 miRNA의 단편이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA 또는 이의 단편의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 해당 miRNA 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 전립선암 진단 마커로서 활용될 수 있는 miRNA를 도출하였다. 상기 miRNA는, 조직학적으로 전립선암으로 진단된 14명의 환자 및 비종양 대조군 5명의 소변 샘플을 마이크로 어레이 기술을 사용하여 분석하였으며, 총 60개의 유전자를 선별하였다. 이후, 종양과 비종양 대조군 소변 샘플 모두에서 다른 유전자들에 비해 상대적으로 발현량이 많아 qRT-PCR을 통해 안정적으로 분석이 가능한 유전자 후보군을 선별하였으며, 이들 중 비종양 대조군에 비해 종양군에서 하향 발현되는 2개의 miRNA (hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p)를 최종 선별하였다.
최종적으로 도출된 본 발명의 2개의 miRNA (hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p)는 이후 전립선암(95명) 및 전립선비대증(52명) 환자로부터 수득한 총 147개의 소변 샘플에서 검출마커로의 유용성을 평가하였다. 그 결과, 국소전립선암 및 전이성 전립성암을 포함하는 전체 전립선암 환자의 소변 샘플에서 hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p 발현 수준이 전립선비대증 대조군에 비해 두드러지게 하향 발현되는 것을 보여주었다. 특히, hsa-miR-3659의 경우 국소전립선암 및 진행성 전립선암 환자의 소변 샘플에서 전립선비대증 대조군에 비해 하향 발현되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통하여, 상기 hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p는 전립선암이 있는 경우 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 본 발명의 2개의 새로운 miRNA(hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p)의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하면 전립선암을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암의 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 전립선암 진단 마커인, 상기 2개의 miRNA(hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p) 중 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정(확인)함으로써 피험체를 대상으로 하여 전립선암을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 전립선암 진단용 키트에는 상기 총 2개의 miRNA(hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p) 중 하나 이상의 miRNA를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 2개의 miRNA(hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p) 중 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 2개의 새로운 miRNA 이외에 종래 알려진 전립선암 진단 바이오마커 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수도 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.
마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데, 구체적으로 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 1종 이상의 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
자세하게는, 상기 (a) 단계에서 miRNA 또는 이의 단편의 발현수준을 측정한 후, 상기 (b) 단계에서 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하여, hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p의 발현수준이 유의하게 감소하는 경우 전립선암이 진행 또는 발병된 것으로 판정할 수 있다.
이때, 상기 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서,상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 hsa-miR-3679-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료는 피험자로부터 획득한 소변(뇨)이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 전립선암의 진행 또는 발병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하고, hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 전립선암의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은 (ⅰ) 대조군인 전립선암이 발병된 실험동물의 시료로부터 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; (ⅱ) 상기 실험동물에 전립선암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및, (d) 대조군에서 측정된 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것보다도 실험군에서 측정된 것이 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 전립선암의 진행 또는 발병을 방지하는 예방하거나 치료하는 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
전립선암을 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 miRNA 또는 이의 단편의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 증대시키는 물질을 전립선암의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 hsa-miR-3659, hsa-miR-3679-5p 또는 이의 단편을 표적으로 한 증진제를 유효성분으로 포함하는 전립선암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
소변 및 혈청 샘플 준비
본 실험에서는 충북대 병원에서 제공된 전립선비대증 환자 52개의 소변 샘플과, 전립선암 환자 95개의 소변 샘플(국소전립선암: 32개, 진행성 전립선암: 63개)을 이용하였다. 전립선암 및 전립선비대증 환자에서 수술 전 아침에 첫 소변을 채취하였다. 소변 샘플을 2,500 rpm에서 15 분간 원심 분리하고 상등액을 -80℃에 보관하였다. 혈청 샘플은 수술날 아침에 채취하여 -80℃에 보관하였다.
마이크로어레이
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 소변 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. RNA의 양(quantity) 및 무결성(integrity)은 RNA 6000 Pico Chip Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)와 Agilent 2100 Bioanalyzer로 검사하였다. 1,205개의 인간 miRNA 및 144 개의 바이러스 miRNA를 검사하는 Agilent Human miRNA Microarray Release 16.0 플랫폼을 사용하여 miRNA 프로파일링을 수행하였다.
소변 샘플로부터 miRNA 추출
소변 샘플로부터 miRNA를 추출하기 위하여 Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)을 이용하였다. Genolution proprietary miRNA 분리 용액이 들어있는 튜브에 각 소변 샘플의 상등액 500μL를 첨가하고, 20초간 볼텍싱했다. 이후, 200μL의 클로로포름을 첨가하고 10초간 복텍싱한 다음, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리를 진행하였다. 하얀색의 침전물 없이 상층의 수용액상을 600μL 수득하여 1.5ml 새로운 튜브에 옮기고, 800μL의 이소프로판올을 첨가한 다음 4℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리를 진행하였다. 원심분리가 완료된 용액은 예상되는 RNA 펠렛 반대 반향으로 가만히 부었주었다. 그리고 70% 에탄올을 1ml 첨가하고 4℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리를 진행하였다. 남은 에탄올을 제거한 후, 40 μL의 RNase-free water에 펠렛을 녹여 실험에 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
소변 샘플로부터 추출된 miRNA의 cDNA 합성
소변 샘플로부터 추출된 miRNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 The Mir-XTM miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit (Clontech, TAKARA, Otsu, Japan)를 이용하였다. 각 RNase-free 0.2ml 튜브에 mRQ Buffer (2x) 5 μL, mRQ 효소 1.25 μL 및 miRNA 샘플 3.75 μL를 첨가하고 시약을 thermocycler에 잘 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 효소 불활성화를 위해 85℃에서 5분 동안 반응을 종료시키고, 얼음에 놓아두었다. 90μl ddH2O를 첨가하여 총 부피를 100μl로 만들었다.
Real-time PCR
소변 샘플로부터 추출한 miRNA를 증폭시키기 위하여 Rotor Gene 6000 장비 (Corbett Research, Mortlake, Australia)를 사용하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 수행하였다. RT-PCR를 위해 SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 포함하는 미세 반응 튜브 (Corbett Research)를 사용하였다. miRNA 증폭을 위하여 다음과 같이 디자인된 포워드 프라이머를 사용하였다. MiR-3659 : 5'- UGA GUG UUG UCU ACG AGG GCA -3'(21 염기쌍). MiR-3679-5p : 5'- UGA GGA UAU GGC AGG GAA GGG GA -3'(23 염기쌍). 시약과 주형 cDNA를 해동한 후 5μL 2X QuantiTect SYBR Green PCR master mix, 0.2 μL 10X miScript universal primer, 0.2 μL 10 pmol forward primer, 2 μL template cDNA 및 2.6μL RNase-free water를 포함하는 10 μL의 최종 부피로 PCR 반응을 수행하였다. RT-PCR 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5초 및 60℃에서 20초간 45사이클 후 95℃에서 60초, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초 1회 사이클을 진행하였다. 멜팅 프로그램(melting program)은 70℃에서 99℃까지 5초 당 1℃의 가열속도로 수행되었다. 스펙트럼 데이터는 Rotor-Gene Q 소프트웨어 2.3.1.49를 사용하여 캡처하고 분석하였다. 모든 샘플은 3 반복 실험하였다.
통계분석
Mann-Whitney U 검사를 전립선암에서 샘플 소변 miRNA 발현에 이용하였다. 통계분석은 IBM SPSS Statistics ver. 20.0 (IBM Co., Armonk, NY)를 사용하여 수행되었다. P <0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결과
연구설계 개요
흐름도 및 전체적인 실험 설계는 도 1에서 나타내었다. 전립선암에 특이적인 후보 소변 miRNA를 동정하기 위하여, 전립선암 환자로부터 14개의 소변 샘플 및 5개의 전립선비대증 대조군 소변 샘플로 이루어진 디스커버리 코호트를 miRNA 마이크로어레이 분석을 위해 사용하였다. 먼저 마이크로어레이를 통해 유전자를 총 60개 선별하였다(하기 표 1 참조). 초반 Pilot test cohort (전립선암 36개[국소전립선암 18개, 진행성 전립선암 18개], 전립선비대증 대조군 18개)을 통해 최종 후보 유전자 선별을 진행하였다. 최종 후보 유전자 선별을 위해 ① 종양과 비종양 대조군 소변 샘플 모두에서 다른 유전자들에 비해 상대적으로 발현량이 많아 qRT-PCR을 통해 안정적으로 분석이 가능한 유전자를 선별하였으며, ② 상기 조건을 만족하는 후보군을 대상으로 하여 비종양 대조군에 비해 종양군에서 하향 발현되는 유전자를 선별하였다.
마이크로어레이 분석을 통해 도출된 최종적인 2개의 miRNA (hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679-5p)는 이후 전립선암(95명) 및 전립선비대증(52명) 환자로부터 수득한 총 147개의 소변 샘플에서 검출마커로의 유용성을 평가하였다.
마이크로어레이를 통해 선별된 60개의 유전자
순번 유전자 순번 유전자
1 bkv-mir-B1-5p 31 hsa-mir-3115
2 hsa-mir-3162-3p 32 hsa-let-7d-5p
3 hsa-mir-4299 33 hsa-let-7d-3p
4 hsa-mir-1268a 34 hsa-mir-885-3p
5 hsa-mir-320a 35 hsa-mir-99a-5p
6 hsa-mir-671-5p 36 hsa-mir-99a-3p
7 hsa-mir-1268b 37 hsa-mir-767-5p
8 hsa-mir-3605-5p 38 hsa-mir-26a-5p
9 hsa-mir-549a 39 hsa-mir-26a-2-3p
10 hsa-mir-3162-5p 40 hsa-mir-1264
11 hsa-mir-4257 41 hsa-mir-3924
12 hsa-mir-1237d 42 hsa-let-7i-5p
13 hsa-mir-4270 43 hsa-let-7i-3p
14 hsa-mir-3194-3p 44 hsa-mir-3919
15 hsa-mir-3194-5p 45 hsa-mir-1277-5p
16 hsa-mir-3659 46 hsa-mir-1277-3p
17 hsa-mir-638 47 hsa-mir-32-5p
18 hsa-mir-601 48 hsa-mir-32-3p
19 hsa-mir-3679-5p 49 hsa-mir-4320
20 hbv-mir-B2RC 50 hsa-mir-519b-3p
21 hsa-mir-4271 51 hsa-mir-624-5p
22 hsa-mir-3161 52 hsa-let-7a-5p
23 hsa-mir-3195 53 hsa-mir-519c-3p
24 hsa-mir-517c-3p 54 hsa-mir-517c-5p
25 hsa-mir-762 55 hsa-let-7a-3p
26 hsa-mir-769-3p 56 hsa-mir-325
27 hsa-mir-3115 57 hsa-mir-105-5p
28 hsa-mir-612 58 hsa-let-7a-2-3p
29 hsa-mir-3920 59 hsa-mir-624-3p
30 hsa-mir-760 60 hsa-mir-105-3p
연구 대상의 기본 특성
환자 및 대조군의 기본적인 특성은 하기 표 2에서 나타내었다. 총 147개의 소변 샘플(전립선암-95, 전립선비대증-52)을 본 실험에서 이용하였다. 한편, 전립선암 샘플은 32개의 국소전립선암 및 63개의 진행성 전립성으로 분류된다. 전립선암 환자의 평균 연령은 66.86 ± 5.50 세; 전립선비대증 대조군의 평균 연령은 69.13 ± 8.95이었다. 전립선암 환자에서 평균 PSA(serum prostate-specific antigen; 전립선 특이항원) 수치는 86.23 ± 465.33 ng / ml; 전립선비대증 대조군의 평균 PSA 수치는 43.85 ± 276.73 ng / ml이었다.
연구 대상의 기본 특성(n=147)
Parameters No. of patients (%)
PCa BPH p-value
No. 95 52
PSA± SD (ng/ml) 86.23 ± 465.33 43.84 ± 276.73 0.000
Mean ± SD age 66.86 ± 5.50 69.13 ± 8.95 0.153
Gleason score (%)
7 (3+4) 30 (31.58) - -
7 (4+3) 31 (32.63) - -
8≥ 34 (35.79) - -
Stage (%)
Localized 32 (33.68) - -
Advanced 63 (66.32) - -
PCa, prostate cancer; BPH, benign prostate hyperplasia; PSA, prostate specific antigen; SD, standard deviation
Mann-Whitney U test was used to compare the expression levels to clinical variables.
2 patients of PCa has only T and N and without clinical information of M (metastasis)
전립선암 및 전립선비대증 대조군 소변에서 hsa - miR -3659 및 hsa - miR -3679-5p의 발현양 측정
본 발명의 전립선암 miRNA 마커의 유용성을 검증하기 위하여, 전립선비대증 대조군 및 전립선암에서 miRNA 발현을 비교하였다. 그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 박스 플롯은 전체 전립선암 소변 샘플(국소전립선암 및 전이성 전립성암을 포함)에서 miR-3659 및 miR-3679-5p 발현 수준이 전립선비대증 대조군에 비해 두드러지게 낮은 것을 보여주었다(each P<0.001, P=0.007). 또한, 도 3에서 나타낸 바와 같이 RT-PCR 결과는 전립선비대증 소변 샘플과 비교하여 국소전립선암 및 진행성 전립선암 모두의 소변 샘플에서 miR-3659 발현이 하향 발현되는 것으로 나타났으며(each P<0.001, P<0.001), miR-3679-5p의 경우 전립선비대증 대비 진행성 전립선암에서 하향 발현되는 것으로 나타났다.
현재까지 전립선암 특이적 바이오 마커에 대한 연구가 많이 진행되어왔지만, 국소전립선암의 경우 체액에서의 바이오 마커 검출의 민감성과 특이성은 매우 낮은 것으로 보고되었다. 또한, PSA(전립선특이항원)는 전립선암을 검출하는데 많이 사용되고 있으나, 암 특이성 마커가 아니므로 종종 잘못 진단경우가 발생하게 되며, 정확한 검진을 위해 전립선 조직 생검을 시행하는 경우 환자의 고통이 심하며 비용도 많이 소요되므로 전립선암 조기 발견을 위한 비침습적 바이오 마커가 필요한 실정이다.
본 실험에서는 소변을 통해 전립선암을 진단할 수 있는 바이오마커로서 hsa-miR-3659와 hsa-miR-3679-5p의 유용성을 입증하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
miRNA: MicroRNA
PCa: prostate cancer
BPH: benign prostate hyperplasia
PSA: prostate-specific antigen
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Biomarkers for diagnosis of prostate cancer and uses thereof <130> NPDC-68276 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3659 <400> 1 ugaguguugu cuacgagggc a 21 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3679-5p <400> 2 ugaggauaug gcagggaagg gga 23

Claims (8)

  1. hsa-miR-3659의 miRNA 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 전립선암의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 전립선암의 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 전립선암의 진단용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 전립선암의 진단용 키트.
  5. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 hsa-miR-3659의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 hsa-miR-3659는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 시료는 소변인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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