KR102051221B1

KR102051221B1 - Cfc 신드롬 환자의 발달 저해를 완화 할 수 있는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102051221B1
Application number: KR1020180085775A
Authority: KR
Inventors: 김미영; 한용만; 홍범진; 최정윤
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2019-12-03

Abstract

본 발명은 본 발명은 CFC 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬)의 치료 및 증상 완화 효과를 가지는 신규 물질의 골세포 분화 촉진 및 약제학적 조성물로서의 용도에 대한 것으로서, 본 발명의 HDAC 억제제는, 유도 만능 줄기세포로부터 골세포의 분화 촉진 효과를 가지며, 결과적으로는 세포 성장 및 분화에 대한 촉진을 통하여 CFC 증후군에 대한 치료 또는 증상을 완화시키는 효과를 가진다.

Description

CFC 신드롬 환자의 발달 저해를 완화 할 수 있는 치료용 조성물 {Therapeutic composition capable of alleviating the inhibition of development of CFC syndrome patients}

본 발명은 CFC 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬)의 발달 저해를 완화할 수 있는 치료용 조성물로서, 특히 골세포 분화 촉진 및 약제학적 조성물로서의 용도에 대한 것이다.

CFC 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome, CFC 신드롬)은 심장기형, 특징적 얼굴형태 피부이상 및 발달지연이 동반되는 유전 질환으로, 심장기형으로는 폐동맥 판막 협착증, 심방 또는 심실 중격 결손, 비후성 심근병증 부정맥이 있을 수 있으며, 얼굴형태는 상대적 대두증, 전두부 돌출, 옅은 눈썹, 안구 돌출의 특징을 보이고, 피부의 이상으로 건조증, 과각화증, 어린선, 습진 및 성긴 두피의 증상을 나타낸다( Roberts A et al. J Med Genet (2006) 43:833-42; Armour CM and Allanson JE. J Med Genet (2008) 45:249-54).. CFC증후군은 누난(Noonan) 증후군과 임상 양상이 유사하며, 코스텔로(Costello) 증후군 및 레오파드(LEOPARD) 증후군과 함께 누난-관련 질환으로 분류된다.

CFC증후군은 BRAF, MEK1, MEK2라고 이름 지어진 세 개의 유전자 중에 하나의 유전자에 돌발적으로 일어나는 이상에 의하여 생기는 상염색체 우성의 유전 질환이다. 이 유전자들은 Ras/MAPK(mitogen-activated protein kinase)라고 불리는 세포성장과 세포분할에서 중요한 경로(RASopathy)의 일부분이며, 상기 유전자들의 변이로 인해 성장인자의 자극을 통한 세포의 성장 및 분화에 관련된 증상이 나타나는 것이 보고되어 있다. 상기 유전자의 변이를 통한 누난 증후군 및 누난-관련 증후군의 감별 및 진단에 대한 연구가 보고되었으나 (Jorge AA et al. Horm Res (2009) 71:185-93), CFC 신드롬이 상기 유전자의 변이와 관련된 구체적인 원인 또는 치료 방법에 대하여는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 CFC 증후군 환자의 체세포로부터 역분화된 줄기세포를 이용한 CFC 증후군 환자의 골세포 분화 회복 치료 약물을 스크리닝 하여 CFC 환자 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화를 회복시칼 수 있는 화합물을 발굴하기 위하여 고효율 스크린 플랫폼(high-throughput screening, HTS) 방식을 활용한 연구를 진행하였다. 이러한 방법으로 RASopathy 관련 질환 치료제 개발에 대한 연구를 진행하던 중, CFC 증후군에 치료 또는 증상 완화 효과를 가지는 물질로서, 히스톤 디아세틸라아제(Histone deacetylase, HDAC) 억제제가 CFC 환자의 섬유아세포로부터 역분화된 유도 만능 줄기세포로부터 골세포로 분화를 촉진시키는 효과를 가지며, 상기 CFC 증후군에 대한 치료 효과가 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상기 HDAC 억제제를 포함하는 CFC 환자의 골세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 CFC 증후군의 치료 효과를 가지는 물질로서, 히스톤 디아세틸라아제 억제제(HDAC 억제제)를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, HDAC 억제제를 포함하는, CFC 환자의 골세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 HDAC 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 산 또는 염 또는 이의 혼합물을 포함하는 CFC 증후군의 치료 및 증상 완화용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 HDAC 억제제는 보리노스탯(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 발프로산(valproic acid), 아스파노비노스탯(aspanobinostat), 파노비노스탯(panobinostat), 벨리노스탯(belinostat), 엔티노스탯(entinostat) 및 레스미노스탯(resminostat)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1이상을 포함하는 것이며, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 엔티노스탯(MS 275)이다.

본 발명에 따른 HDAC 억제제는, 유도 만능 줄기세포로부터 골세포의 분화 촉진 효과를 가지며, 결과적으로는 세포 성장 및 분화에 대한 촉진을 통하여 CFC 증후군에 대한 치료 또는 증상을 완화시키는 효과를 가진다.

도 1은 CFC 환자의 체세포로부터 유도만능 줄기세포를 역분화하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 미분화된 중간엽 줄기세포(MSC)를 이용하여 골세포 분화 과정을 확인하는 실험 과정을 타나낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 MS275를 포함한 임상 화합물 라이브러리로부터 골세포 분화 촉진 효과를 가지는 물질을 스크리닝하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 ALP 활성 증가 효과를 확인하기 위한 PNPP 에세이 결과, WT 대비 상대적인 ALP 활성화 정도를 표시한 결과이다.
도 5는 HDAC 억제제인 MS275의 ALP 활성을 405nm에서의 OD값을 측정하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 HDAC 억제제를 포함하는, CFC 환자의 골세포 분화 촉진용 조성물에 대한 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 일 실시예에서 HDAC 억제제가 정상인에 비하여 현저히 감소되어 있는 CFC 환자의 ALP(염기성인산분해효소(alkaline phosphatase)) 활성을 향상시키는 효과를 가짐을 확인하였으며, ALP 활성 촉진을 통하여 골세포의 성장 및 분화를 촉진시킬 수 있다는 사실로부터 알 수 있었다.

본원 발명의 일 실시예에서, 상기 ALP 활성 촉진 효과를 일반인과 CFC 환자의 체세포(섬유아세포)로부터 역분화된 유도만능줄기세포를 통해 분화 프로토콜을 수행하였으며, 그 결과를 PNPP 에세이를 통하여 확인하였다. CFC 환자의 경우, ALP 활성이 일반인에 비하여 현저히 감소되어 있으나, HDAC 억제제를 처리한 경우, ALP 활성이 높은 수준으로 개선된 것을 확인하였다.

ALP는 골세포로의 분화 시 그 발현이 증가하는 효소이다. CFC환자의 증상중 하나는 short stature인데 이는 골세포로의 분화가 잘 일어나지 않기 때문에 나타나는 현상으로, CFC 세포에 특정 약물 처리 시 ALP활성이 증가된다면 골세포로의 분화가 촉진되는 사실을 증명하는 것이며, 이는 CFC 증상인 환자 발육 저하를 치료할 수 있는 가능성을 가짐을 의미한다.

따라서, 본원 발명의 HDAC 억제제는 골세포 분화 촉진 효과를 가지며, 골세포의 분화가 촉진되는 경우, CFC 증후군 환자의 표현형을 개선하여, 증상을 완화시킬 수 있는 효과를 가질 수 있다.

상기와 같은 효과로서 확인한 바, 본 발명은, 상기 HDAC 억제제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 산 또는 염 또는 이의 혼합물을 포함하는 CFC 증후군의 치료 및 증상 완화용 약제학적 조성물에 대한 것이다.

상기 본원 발명의 HDAC 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 보리노스탯(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 발프로산(valproic acid), 아스파노비노스탯(aspanobinostat), 파노비노스탯(panobinostat), 벨리노스탯(belinostat), 엔티노스탯(entinostat) 및 레스미노스탯(resminostat)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1이상을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 엔티노스탯(MS 275)를 통하여 효과를 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 MS 275는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 첨가제, 희석제, 완충제, 담체, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 첨가제, 희석제, 완충제, 담체, 또는 부형제는 본 분야에 널리 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed, Pharmaceutical Press (2000) 참조).

약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 혼합하여 이용할 수 있으며, 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 제제화 방법, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 결정될 수 있다. 약학적 조성물들은 약학적으로 유효한 투여량으로 환자에게 투여될 것이다.

"약학적으로 유효한 투여량"은 투여되는 조건에 관련하여 요구되는 효과들을 생성하기에 충분한 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 투여 방식, 질병의 성질 및 중증도에 따라 달라진다. 환자의 일반적인 건강 상태, 성별, 연령 및 체중에 따라 다른 투여량 들이 요구될 수 있다. 투여량의 투여는 개별 투여 유닛의 형태 또는 그외에 여러 개의 더 작은 투여 유닛들의 형태로 단일 투여 및 또한 특정 간격들로 세분된 투여량들을 다중 투여하여 실시될 수 있다. 유효 화합물들 또는 물질들은 또한 투여 형태에 따라 분리해서 투여되거나 또는 함께 투여될 수 있다.

적합한 제형 형태들은, 예를 들어, 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (마이크로) 캡슐, 마이크로과립, 발포성 분말 또는 과립, 좌약, 앰플 형태의 주사액 및 또한 유효 화합물들의 연장된 방출을 갖는 제형들이며, 이 제형들에서 부형제, 희석제 또는 담체는 상기 기술된 바와 같이 관례적으로 사용된다. 다른 제형들은 본 분야의 당업자에게 널리 공지된 유효 성분들의 다른 방출 프로필들을 나타내는 것들일 수 있다. 예를 들어, 서방성, 지속성(sustainedaction), 지연 방출성(extended-release), 시한 방출성(time-release 또는 timed-release), 조절 방출성(controlled-release), 변이 방출성(modified release) 또는 연속 방출성(continuous-release)을 포함한다. 이들 모두는 본 분야의 당업자에게 널리 공지된 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

CFC 환자 유래 체세포를 이용한 유도만능 줄기세포(iPSC) 제작

CFC 환자의 피부 섬유아세포를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 DMEM(Welgene) 배지에서 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양한 후, 상기 섬유아세포를 trypsin-EDTA(Invitrogen)을 2분간 처리하여 수득한 후, 1×10⁵ cells/well (35mm dish 기준)에 분주하여 하루동안 배양하였다.

상기 배양된 세포를 다시 8㎍/ml polybrene을 포함한 DMEM에 OCT4, SOX2, C-MYC, KLF4 바이러스를 첨가한 배지에서 1일간 배양하고 이를 다시 10% FBS, 1% PS를포함한 DMEM 배지로 교환하여 3일간 배양하였고, 상기 섬유아세포를 trypsin-EDTA를 2분간 처리하여 10% FBS 포함한 DMEM으로 수득 한 후 Mouse embryonic fibroblast(MEF) 위에1 x 10⁴cells/well (35mm dish 기준) 로 분주하였다.

배양 1일 후부터 20% 혈청 대체제, 10 ng/ml bFGF(R&D systems), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비 필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM β-메르캅토에탄올(Sigma)을 포함한 DMEM/F-12(Invitrogen)로 배지를 매일 갈아주며 2-3주간 배양하였다.

iPSC 콜로니가 생성되면, 이를 새 MEF에 분주하여 유지하였다. 상기 실험 과정을 도 1에 도식화하였다.

<실시예 2>

HTS 플랫폼에서 사용 가능한 유도만능 줄기세포의 분화 방법 확립

iPSC 콜로니를 chopper를 이용하여 4~9개의 클럼프로 기계적 분리를 하고(대략0.5 mm x 0.5 mm 크기) 10 mg/ml 디스파제(Invitrogen)를 4분간 처리하여 분리된 클럼프를 코팅되지 않은 petri-dish에 옮기고 10% 혈청 대체제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비-필수 아미노산을 포함한 DMEM/F-12 배양체(embryoid body, EB) 배지에서 1일간 배양하여 EB를 만들었다. 10 μM SB-431542(Abcam)을 포함한 EB 배지에 EB를 8일간 부유 배양하였다.

그 후, 피브로넥틴 코팅 접시에 EB를 붙이고 1% B27 supplement(Invitrogen), 1% 인슐린-트렌스페린-셀레늄 액상 배지 보충제(Sigma), 1% chemically defined lipid concentrate(Invitrogen), 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM/F-12에서 4일간 배양한 후, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 약2주간 배양하였다.

상기 배양된 EB는 80~90% confluenc에서 tripsin-EDTA를 2분 간 처리 하여 서브 컬쳐 하면서유지 하거나 LN2 탱크에 얼려서 보관할 수 있다.

FACS를 통해 표면 마커 발현이 정상인지 확인하여 MSC의 분화 효율을 검증하고, 젤라틴으로 코팅된 접시에 MSC를 2x10⁴ cells/cm² 로 분주하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 3일간 배양하였다.

상기 배양된 결과물에 대하여, StemProⓡ Osteogenesis Supplement를 포함한 StemProⓡ Osteocyte/Chondrocyte Differentiation Basal Medium에서 배양하면서 분화 진행하였다.

<실시예 3>

ALP 활성도 측정

한국 화합물 은행에서 공급받은 MS275를 이용하여 일반인과(WT) CFC환자 (CFC7) 체세포에서 역분화된 중간엽 줄기세포를 사용하여, MS 275의 골세포 분화 촉진 효과를 확인하였다.

미 분화된 MSC에 trypsin-EDTA(Invitrogen)를 2분간 처리하여 10% FBS를 포함하는 α-MEM으로 수득하고, 골세포 분화 배지(Invitrogen)로 균일하게 resuspention 하여 1.25×105 cell/well로 세포 밀도를 조절한 후, 384 well에 5000개의 MSC를 플레이팅 하고 24시간 동안 배양하였다.

상기 웰에 MS275를 포함하여 한국 화합물 은행에서 공급받은 화합물 라이브러리를 화합물이 1 mM이 되도록 DMSO(sigma)와 약 1:5로 희석한 후, 각 well의 희석된 화합물을 다시 골 세포 분화 배지와 1:20의 비율로 희석하였다.

배양된 MSC에 상기 희석된 화합물을 각각 넣어준 후, 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 6일간 배양하였다. 상기 배양된 배양액을 p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) 에세이 (ThermoFisher Scientific, 37621, 1-Step^TM PNPP)를 이용하여, ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 측정하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하고, DMSO 대조군과 대비하여 상대적인 ALP 활성화 정도를 계산하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 본 발명의 HDAC 억제제인 MS275를 처리한 경우, CFC 환자의 MSC의 ALP 활성화 정도에 비하여, 활성도가 크게 증가하였다는 것을 확인할 수 있었다. 일반인(WT)의 경우와 비교하여 낮은 수준이나, 상기 결과로부터, ALP 활성 증진을 통한 골 세포 분화 촉진 효과로부터 CFC 증상을 완화시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, 도 5에서는 MS275의 처리 농도에 따른 ALP 활성 정도를 측정한 결과를 도시하였다. 405nm의 파장에서의 흡광도 측정을 통해 활성도를 측정하였으며, 약 10μM의 농도 미만으로 처리할 경우에는 농도 의존적으로 활성이 증가하였으나, 그 이상의 농도로 처리하였을 경우에는 오히려 활성이 감소되는 효과를 확인할 수 있었다. 이는 10μM 이상의 높은 농도에서는 MS 275가 오히려 세포 사멸을 유도할 수 있다는 사실을 보여주는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

삭제
엔티노스탯(entinostat, MS275) 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 산 또는 염 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 CFC 증후군 환자의 발육 촉진용 약제학적 조성물.
삭제
삭제
제2항에 있어서,
상기 엔티노스탯(entinostat, MS275)은 조성물 내에 0.01μM 내지 10μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제, 희석제, 담체, 부형제 또는 완충제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, 마이크로캡슐, 마이크로과립 또는 발포성 형태로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.