KR102050248B1 - Method for analysis of tissue clarity measurement - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고, 투명화된 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 조직을 절단하고, 광학 리더기를 이용하여 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 측정 방법이 제공된다.In the present specification, a process for clarifying a tissue by a transparent technique is performed, the tissue is cut to obtain a target tissue having a predetermined size, including a portion of the transparent tissue, and a target tissue obtained by using an optical reader. A method for measuring the transparency of a tissue is provided, which is configured to measure absorbance or transparency to a tissue.
Description
본 발명은 조직의 투명도 분석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 다양한 투명화 기법에 따라 투명화된 목적 조직에 대하여 표준화된 분석 결과를 제공할 수 있는, 투명도 분석 방법에 관한 것이다The present invention relates to a method for analyzing transparency of tissues, and more particularly, to a method for analyzing transparency, which can provide standardized analysis results for target tissues that have been transparent according to various transparent techniques.
CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel) 와 같은 조직 투명화 기술은 생체 조직 내 특정 물질을 외부물질 (exogenous element) 인 하이드로겔 (hydrogel) 로 대체하여 조직의 내부를 광학적으로 관찰할 수 있도록 투명하게 하는 기술이다. Tissue clearing techniques, such as CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), replace certain substances in living tissue with hydrogels, which are exogenous elements, to optically view the inside of the tissue. It is a technology that makes it transparent.
예를 들어, 뇌 조직에 CLARITY 기법을 적용할 경우, 화학처리 과정을 거쳐 뇌의 지질 성분이 제거되고 최종적으로 투명한 뇌 조직이 획득된다. 이렇게 획득된 투명한 뇌 조직은, 뇌 조직의 구조가 보존됨에 따라 3 차원 이미지 분석, 신경돌기 추적, 추적된 뉴런의 위상 재건 등, 다양한 연구에 이용될 수 있다. For example, when the CLARITY technique is applied to brain tissues, chemical processes remove brain lipids and finally transparent brain tissues are obtained. The transparent brain tissue thus obtained can be used for various studies such as three-dimensional image analysis, neurite tracking, and phase reconstruction of tracked neurons as the structure of the brain tissue is preserved.
나아가, PARS (perfusion-assisted agent release in situ) 는 뇌를 포함한 다른 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장 및 소장을 포함하는 몸 전체를 고분자 투과성 및 광학적 투명성을 제공할 수 있는 투명화 기술이다. Furthermore, perfusion-assisted agent release in situ (PARS) is a transparent technology that can provide polymer permeability and optical transparency throughout the body, including the brain, other spinal cord, heart, muscle, liver, lung, kidney, colon and small intestine. to be.
이러한, 투명화 기법들은 다양한 기관의 조직을 손상시키지 않고도 깊은 영역까지 기관을 관찰할 수 있도록 하여, 기관 구조의 분석 연구에 기여할 수 있고, 손상되지 않은 기관계로부터 통합적인 구조 분석과 분자적 정보의 획득을 가능하게 할 수 있다. These invisibility techniques make it possible to observe organs to deep areas without damaging the tissues of various organs, contributing to the analytical study of organ structures, and integrating structural analysis and acquisition of molecular information from an intact organ system. You can do that.
한편, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직은, R.I (Reflex index) 측정 현미경을 이용하여 굴절도를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 그러나, R.I 측정 기반의 투명도 분석 방법은 분석의 정확도가 떨어질 수 있어, 분석 결과의 신뢰도 또한 낮을 수 있다. 이를 해결하고자 하는 방안으로 포토샵과 같은 프로그램을 통한 투명도 분석 방법이 제안되었으나, 적용한 투명화 기법의 종류에 따라 투명도 분석 결과가 상이할 수 있다. 이에 조직의 투명도 분석에 있어서 포토샵 기반의 투명도 분석 방법은, 실질적으로 이용하기 어려울 수 있다. On the other hand, tissues transparent by various transparent techniques, its transparency can be analyzed by measuring the refractive index using a Reflex index (R.I) measuring microscope. However, the transparency analysis method based on the R.I measurement may reduce the accuracy of the analysis, and thus the reliability of the analysis result may be low. As a way to solve this problem, a transparency analysis method has been proposed through a program such as Photoshop, but the results of the transparency analysis may be different depending on the type of transparency technique applied. Accordingly, in the transparency analysis of a tissue, a photoshop-based transparency analysis method may be practically difficult to use.
이에 따라, 이상의 한계를 극복하고 효과적으로 투명화된 조직을 분석하고 다양한 방식에 대해 공통적으로 실시할 수 있는 투명도 측정 방법에 대한 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다. 즉, 다양한 투명화 기법에 따라 획득한 투명화된 조직에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 새로운 분석 시스템의 개발이 요구되고 있다. Accordingly, there is a continuing need for the development of a transparency measurement method that can overcome the above limitations, analyze the transparent organization effectively, and perform common methods for various methods. In other words, the development of a new analysis system that can perform a standardized analysis for the transparent organization obtained by various transparent techniques.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.The background art of the invention has been created to facilitate understanding of the present invention. It should not be understood that the matters described in the background of the invention exist as prior art.
투명화 기법은, 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 (soluble detergents) 기반의 투명화 기법, 유기 용매 기반의 투명화 기법이 있을 수 있다. The clearing technique may include a hydrogel-based clarification technique, a soluble detergents-based clarification technique, and an organic solvent-based clarification technique.
본 발명의 발명자들은 이러한 투명화 기법의 종류에 따라, 투명화된 조직의 크기가 원래의 조직과 상이한 크기로 변하는 것을 발견하였다. The inventors of the present invention have found that, depending on the kind of this clearing technique, the size of the cleared tissue changes to a different size from the original tissue.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 (soluble detergents) 기반의 투명화 기법을 이용했을 때, 투명화된 조직이 원래의 조직과 유사하거나 미세하게 커지는 것을 발견할 수 있었다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용했을 때, 투명화된 조직이 원래의 조직보다 작아지는 것을 발견할 수 있었다. More specifically, the inventors of the present invention have found that when the hydrogel-based clearing technique and the soluble detergents-based clearing technique are used, the cleared tissue is similar to or slightly larger than the original tissue. Furthermore, the inventors of the present invention have found that when the organic solvent-based clearing technique is used, the cleared tissue becomes smaller than the original tissue.
본 발명의 발명자들은 이상의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화가 조직의 투명도에 대한 불명확한 분석의 요인이 될 수 있음을 인지할 수 있었다. The inventors of the present invention can recognize that the change in the size of the cleared tissue according to the above-described clearing technique may be a factor of an unclear analysis of the transparency of the tissue.
특히, 본 발명의 발명자들은 투명화된 기법에 따른 조직 크기의 변화에 따라, 동일한 샘플에 대하여 반복 실험을 진행 할 경우, 일정하지 않은 부위에 대한 투명도 분석이 수행될 수 있고, 그 결과 낮은 신뢰도를 갖는 분석 결과가 제공될 수 있다는 것에 주목하였다. In particular, the inventors of the present invention, when repeated experiments on the same sample according to the change in the tissue size according to the clearing technique, the transparency analysis can be performed on non-uniform sites, and as a result has a low reliability It is noted that the results of the analysis can be provided.
이에, 본 발명의 발명자들은 분석의 높은 신뢰도를 위해 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화에 따른 새로운 투명도 분석 방법에 대하여 연구하였다. 연구를 통해, 본 발명의 발명자들은 투명화 기법에 의해 겔화 (gelation) 된 조직에 대하여 흡광도, 투명도 또는 투과되는 야광 빛의 세기 등을 측정함으로써 조직의 투명도를 효과적으로 분석할 수 있음을 발견하였다. Therefore, the inventors of the present invention have studied a new method for analyzing the transparency according to the change in the size of the tissue according to the transparency technique for high reliability of the analysis. Through research, the inventors of the present invention have found that the transparency of tissues can be effectively analyzed by measuring absorbance, transparency, or intensity of transmitted luminous light with respect to the gelled tissue.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화에 따른, 다양한 투명화 기법에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 새로운 조직의 투명도 분석 방법을 개발하기에 이르렀다. As a result, the inventors of the present invention have developed a method for analyzing the transparency of a new tissue capable of performing standardized analysis on various transparent techniques according to the change in the size of the tissue according to the transparent technique.
또한, 본 발명의 발명자들은 투명화된 조직의 투명도를 다양하게 설정된 조건에서 분석할 수 있고, 연구실 수준에서도 조직의 투명도를 효과적으로 측정할 수 있는 조직의 투명도 분석 방법을 개발할 수 있었다. In addition, the inventors of the present invention were able to analyze the transparency of the transparent tissue under various set conditions, and were able to develop a method for analyzing the transparency of the tissue that can effectively measure the transparency of the tissue even at the laboratory level.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 절단하여 표적 조직을 획득하고, 광학 리더기를 이용하여 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다. Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to analyze the transparency of the tissue, configured to cut the transparent tissue by the clearing technique to obtain a target tissue, and to measure the absorbance or transparency of the target tissue obtained by using an optical reader To provide a way.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 투명화된 조직을 절단하여 표적 조직 및 표적 조직과 동일한 야광 디스크를 획득하고, 빛을 투과시킨 야광 디스크에 표적 조직을 배치하여, 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다. Another problem to be solved by the present invention is to cut the transparent tissue to obtain the same luminous disk as the target tissue and the target tissue, by placing the target tissue on the luminous disk through the light transmission, through the target tissue from the luminous disk It is to provide a method for analyzing the transparency of tissue, which is configured to measure the intensity of the luminous light emitted.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to analyze the transparency of the tissue, configured to minimize the change in the size of the tissue, according to the hydrogel-based transparent technique, water-soluble formulation-based transparent technique, or organic solvent-based transparent technique To provide a way.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to the above-mentioned objects, and other objects that are not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계, 투명화된 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하는 단계, 및 광학 리더기를 이용하여, 획득된 상기 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법이 제공된다. According to one embodiment of the invention, performing a process for clarifying tissue with a clarification technique, cutting the tissue to obtain a target tissue having a predetermined size, comprising a portion of the clarified tissue, and Using an optical reader, a method for measuring transparency of a tissue is provided, comprising measuring absorbance or transparency for the target tissue obtained.
본 명세서에서 이용되는 용어 “투명화 기법”은 관찰하고자 하는 기관 또는 이의 조직에 대하여 절개 또는 구조적 손상을 최소화하여 광학적으로 조직의 내부를 관찰할 수 있도록 투명하게 하는 기술을 의미할 수 있다. As used herein, the term “transparency technique” may refer to a technique for optically observing the inside of tissue by minimizing incision or structural damage to the organ or tissue thereof to be observed.
이때, 조직은 화학적 처리를 통해 세포막 지질층을 하이드로겔과 같은 외부 물질로 대체되거나 Azobis 계열의 물질에 의해 하이드로겔화됨으로써 투명화될 수 있다. 이와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법은, 예를 들어, CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), PACT (passive clarity technique), ACT (active clarity technique) 또는, SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 하이드로겔 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다. In this case, the tissue may be transparent by replacing the membrane lipid layer with an external material such as a hydrogel or by hydrogelling with an Azobis-based material through chemical treatment. Such hydrogel-based clarification techniques include, for example, clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel (CLARITY), passive clarity technique (PACT), active clarity technique (ACT), or SWITCH (system- wide control of interaction time and kinetics of chemicals). However, the present invention is not limited thereto, and a variety of hydrogel-based clearing techniques may be used to clear the tissue.
나아가, 본 발명의 투명화 기법은, 수용성 제제를 이용하여 조직을 투명화할 수 있는, 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수용성 제제 기반의 투명화 기법은 seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 수용성 제제 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다. Furthermore, the clearing technique of the present invention may include a water-soluble formulation-based clearing technique capable of clearing tissue using a water-soluble formulation. For example, the water soluble formulation based clearing technique may be seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2, or ScaleS. However, the present invention is not limited thereto, and a variety of water-soluble agent-based clearing techniques may be used to make the tissue transparent.
본 발명의 투명화 기법은, 유기 용매를 이용하여 조직을 투명화할 수 있는, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 기반의 투명화 기법은 3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs), iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs), 또는 BABB (benzyl alcohol-benzyl benzoate) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 유기 용매 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다. The clearing technique of the present invention may include an organic solvent-based clearing technique that can make the tissue transparent using an organic solvent. For example, the organic solvent-based clearing technique may be 3D imaging of solvent-cleared organs (3DISCO), immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs (iDISCO), or benzyl alcohol-benzyl benzoate (BABB). However, without limitation, more organic solvent-based clearing techniques can be used to clear the tissue.
한편, 이상의 투명화 기법의 종류에 따라, 투명화된 조직의 크기가 원래의 조직과 상이한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직은 하이드로겔화되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 조직보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직은 원래의 조직보다 작아질 수 있다. On the other hand, according to the kind of the above-described transparent technique, the size of the transparent tissue may have a different size from the original tissue. For example, when using hydrogel-based and water-soluble preparations-based clearing techniques, the cleared tissue may be slightly larger than the original tissue as hydrogelized or absorb the water-soluble preparations. In addition, with organic solvent based clearing techniques, the cleared tissue may be smaller than the original tissue.
이러한, 이상의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화가 조직의 투명도에 대한 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다. Such a change in the size of the transparent tissue by the above-described transparency technique may be a factor in an unclear analysis of the transparency of the organization.
한편, 본 명세서에서 이용되는 용어 “조직”은 뇌, 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장, 또는 소장일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 투명화 기법이 적용될 수 있는 한, 다양한 조직이 본 발명의 투명화 분석 대상 조직이 될 수 있다. Meanwhile, the term "tissue" as used herein may be a brain, spinal cord, heart, muscle, liver, lung, kidney, large intestine, or small intestine. However, the present invention is not limited thereto, and various organizations may be organizations to be analyzed for transparency according to the present invention, as long as the technique can be applied.
본 명세서에서 이용되는 용어 “표적 조직”은 다양한 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여, 표적이 되는 부위를 포함하는 일정한 크기를 갖도록 절단된 조직을 의미할 수 있다. 예를 들어, 투명화된 조직이 뇌일 경우, 표적 조직은 전뇌, 중뇌 또는, 후뇌를 포함하도록 펀칭된 조직을 의미할 수 있다. As used herein, the term “target tissue” may refer to tissue that has been cut to have a constant size, including a targeted site, for tissue that has been cleared by various techniques. For example, when the cleared tissue is the brain, the target tissue may refer to tissue punched to include the forebrain, the middle brain, or the back brain.
본 명세서에서 이용되는 용어 “광학 리더기”는 표적 조직에 대하여 특정한 파장에서의 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된 광학 분석 장치일 수 있다. 예를 들어, 광학 리더기는 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 마이크로플레이트 리더 (Microplate Reader) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 조직에 대하여 빛을 투과하고 이에 대하여 발생되는 변화를 측정할 수 있는 한, 다양한 장비가 광학 리더기로 이용될 수 있다. As used herein, the term “optical reader” may be an optical analysis device configured to measure absorbance or transparency at a particular wavelength with respect to a target tissue. For example, the optical reader may be an Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Microplate Reader. However, various apparatuses can be used as the optical reader as long as it is not limited thereto and can transmit light to and measure changes caused to the tissue.
본 명세서에서 이용되는 용어 “흡광도”는 특정 파장에 따른 빛의 투과율을 의미할 수 있다. 이때, 흡광도는, 대상 물질에 대하여 측정된 OD (optical density) 값으로 정의될 수 있다. 한편, 흡광도는 조직의 투명한 정도와 연관될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 “투명도”는 투명한 정도를 의미하며, 흡광도에 대한 백분율 값, 즉 OD 값의 백분율로 산출될 수 있다. 이때, 흡광도는 조직의 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 다른 조직에 비하여 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 다른 조직보다 투명도가 낮을 수 있다. As used herein, the term "absorbance" may refer to the transmittance of light according to a specific wavelength. In this case, the absorbance may be defined as an optical density (OD) value measured for the target material. On the other hand, absorbance may be associated with the degree of transparency of the tissue. As used herein, the term “transparency” means the degree of transparency and can be calculated as a percentage of absorbance, ie a percentage of OD value. In this case, the absorbance may be inversely proportional to the transparency of the tissue. For example, tissues with relatively high absorbance compared to other tissues may have lower transparency than other tissues with relatively low absorbance.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 광학 리더기는 웰 플레이트 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성될 수 있다. 이때, 웰 플레이트는 각각의 웰의 직경이 6.0 mm 내지 7.0 mm로 설정된, 96 웰 플레이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to one embodiment of the invention, the optical reader may be configured to irradiate each well in the well plate to measure absorbance or transparency for each well. At this time, the well plate may be a 96 well plate, the diameter of each well is set to 6.0 mm to 7.0 mm, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰 플레이트 내의 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는 표적 조직은, 웰 플레이트 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안의 투명화에 따른 조직의 크기 변화, 예를 들어 표적 조직의 확대는 최소화될 수 있다. 나아가, 표적 부위를 포함하며 웰 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 웰 내에 배치하고, 각각의 웰에 대하여 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동이 적어 그 결과가 정확할 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다. According to one embodiment of the invention, the tissue cleared by a hydrogel-based or water-soluble formulation-based clearing technique can be punched to obtain target tissue having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well in the well plate. have. Target tissue having a diameter of 0.8 to 1 times relative to the wells can be disposed inside the well plate and effectively fixed. Accordingly, the change in the size of the tissue due to the transparency during the analysis of transparency, for example, the enlargement of the target tissue can be minimized. Furthermore, the measurement of absorbance and clarity for target tissues that include the target site and punched to fit the well size is, rather than performing analysis by selecting the tissue corresponding to the target site for the entire tissue that has not been cut. Can be correct. For example, for brain tissues that have been cleared by a hydrogel-based or water-soluble agent-based clearing technique, a target tissue punched to include the forebrain, midbrain, and posterior brain, respectively, is placed in the wells and transparency analysis is performed for each well. In this case, the size of the entire brain tissue is smaller than the analysis of each of the front brain, middle brain, and rear brain regions, and thus the result may be accurate. Furthermore, accurate transparency analysis of target tissues such as midbrain and backbrain regions may be possible.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 및 고정부의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러 (pillar) 를 포함하는 펀치를 이용하여, 펀칭될 수 있다. According to one embodiment of the invention, the tissue transparent by the organic solvent-based clearing technique, the fixing portion and the fixing portion configured to be fixed to the well having a first diameter having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well Punching may be performed using a punch having a hole of a second diameter located inside of and having a hole having a second diameter and configured to obtain a target tissue having the second diameter.
본 명세서에서 이용되는 용어 “펀치”는 조직에 대하여 일정한 크기를 갖도록 구멍을 뚫는 기구를 의미할 수 있다. 예를 들어, 펀치는, 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직을 일정한 모양으로 펀칭할 수 있도록 날카롭고 얇은 날을 갖고, 직경의 선택이 용이한 아일렛 (eyelet) 심일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않고, 펀치는 조직에 대하여 일정한 크기, 예를 들어 웰 플레이트와 유사한 직경을 갖고, 일정한 모양을 유지하도록 절단할 수 있는 한, 다양한 기구일 수 있다. As used herein, the term “punch” may refer to a device that drills holes to have a predetermined size with respect to tissue. For example, the punch may be an eyelet shim with a sharp, thin blade that allows for punching the target tissue into a uniform shape without disruption of surrounding tissue and an easy selection of diameters. However, the present invention is not limited thereto, and the punch may be various instruments as long as the punches have a constant size, for example, a diameter similar to that of a well plate, and can be cut to maintain a constant shape.
한편, 펀치는 웰 내부에 배치되어 조직을 안정적으로 고정할 수 있도록 구성된 고정부와, 전체 조직의 일부를 포함하는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러로 구성될 수 있다. On the other hand, the punch may be composed of a fixing portion disposed in the well and configured to stably fix the tissue, and a cutting filler configured to acquire a target tissue including a part of the whole tissue.
본 명세서에서 이용되는 용어 “제1 직경“은 고정부의 직경을 의미하며, 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있어 웰에 안정적으로 고정될 수 있다. 예를 들어 웰 플레이트가 96 웰 플레이트일 경우, 제1 직경은 6.0 mm 내지 7.0 mm로 설정될 수 있다. As used herein, the term "first diameter" refers to the diameter of the fixing part, and may have a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well, and thus may be stably fixed to the well. For example, when the well plate is a 96 well plate, the first diameter may be set to 6.0 mm to 7.0 mm.
본 명세서에서 이용되는 용어 “제2 직경“은 절단 필러의 직경을 의미하며, 전술한 제1 직경보다 작을 수 있다. 예를 들어, 제2 직경은 웰의 직경에 대하여 0.3 배 내지 0.6 배의 크기를 가질 수 있다. 그러나, 제2 직경의 범위는 이에 제한되지 않고, 광학 리더기에 의해 웰에 대하여 빛이 조사되는 영역 내에서 보다 다양한 범위로 설정될 수 있다. 예를 들어 웰 플레이트가 96 웰 플레이트일 경우, 빛이 투과되는 영역은 웰을 중심으로 직경 2.0 mm 내지 4.0 mm의 내부 영역일 수 있고, 이에 제2 직경은 2.0 mm 내지 4.0 mm로 설정될 수 있다. 한편, 표적 조직의 직경은, 절단 필러에 의해 펀칭됨에 따라 제2 직경과 유사할 수 있다. As used herein, the term “second diameter” refers to the diameter of the cutting filler and may be smaller than the first diameter described above. For example, the second diameter may have a size of 0.3 to 0.6 times the diameter of the well. However, the range of the second diameter is not limited to this, and may be set to a wider range within the region where light is irradiated to the well by the optical reader. For example, when the well plate is a 96 well plate, a region through which light is transmitted may be an inner region having a diameter of 2.0 mm to 4.0 mm with respect to the well, and thus the second diameter may be set to 2.0 mm to 4.0 mm. . On the other hand, the diameter of the target tissue may be similar to the second diameter as punched by the cutting filler.
펀치를 이용하여 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직으로부터 표적 조직을 획득하고, 절단 필러 내에 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안의 투명화에 따른 조직의 크기 축소는 최소화될 수 있다. 이에, 펀치에 의해 고정된 표적 조직에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰 내에 배치하고, 각각의 웰에 대하여 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동, 보다 구체적으로 크기가 축소되는 변화가 적을 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다. When a target is obtained from a tissue that has been cleared by a solvent-based clearing technique using a punch, and a punch containing the target tissue in the cutting filler is placed in a well to analyze transparency, the tissue may be subjected to the clearing during the analysis. Size reduction can be minimized. Accordingly, the measurement of absorbance and transparency of the target tissue fixed by the punch may be more accurate than performing analysis by selecting the tissue corresponding to the target site with respect to the entire tissue that has not been cut. For example, for brain tissues that have been cleared by an organic solvent-based clearing technique, a punch containing target tissue punched to include the fore, middle and back brains, respectively, is placed in the wells and transparency analysis is performed for each well. In this case, the variation in size, more specifically, the size reduction, may be smaller than that of the entire brain tissue, the analysis of the brain region, the brain region, and the brain region. Furthermore, accurate transparency analysis of target tissues such as midbrain and backbrain regions may be possible.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계, 투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 조직을 절단하는 단계, 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득하는 단계, 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계, 빛이 투과된 상기 야광 디스크에, 획득된 상기 표적 조직을 배치하는 단계, 및 젤 이미징 (gel imaging) 분석 장비를 이용하여, 상기 야광 디스크로부터 상기 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법이 제공된다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of clearing a tissue using a clearing technique, cutting the tissue to obtain a target tissue including a portion of the cleared tissue and having a predetermined size. Obtaining a luminous disk having a size, transmitting light to the luminous disk, placing the obtained target tissue on the luminous disk through which light is transmitted, and using a gel imaging analysis device And measuring the intensity of the luminous light emitted from the luminous disk through the target tissue.
본 명세서에서 이용되는 용어 “야광 디스크”는 일정한 세기의 빛에 노출된 후 암막 상태에서 야광 빛을 발하는 디스크를 의미할 수 있다. As used herein, the term “luminous disk” may refer to a disk that emits luminous light in a dark state after being exposed to light of a constant intensity.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 빛이 투과된 야광 디스크 위에 놓여진 표적 조직에 대하여, 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 표적 조직에 대한 투명도 분석을 위해, 특정한 파장에서 빛을 발하는 형광 디스크가 더 이용될 수 있다. Meanwhile, according to another embodiment of the present invention, transparency of the target tissue placed on the luminous disk through which light is transmitted may be analyzed by measuring the intensity of the luminous light transmitted through the black film. However, the present invention is not limited thereto, and a fluorescent disk that emits light at a specific wavelength may be further used for transparency analysis on the target tissue.
본 명세서에서 이용되는 용어 “젤 이미징 분석 장비”는 표적 조직에 대하여 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정하도록 구성된 광학 분석 장치일 수 있다. 특히, 젤 이미징 분석 장비는 투명화 기법에 의해 겔화된 조직으로부터 투과되는 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정하기에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 젤 이미징 분석 장비는 UV를 조사하여 겔화된 표적 조직과 같은 대상에 대한 빛의 세기를 측정하고, 이에 대한 이미지를 제공할 수 있는 Gel Doc (gel documentation system) 기반의 장비 일수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 투명화된 조직에 대하여 발하는 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정할 수 있는 한, 다양한 장비가 젤 이미징 분석 장비로서 이용될 수 있다. The term “gel imaging analysis equipment” as used herein may be an optical analysis device configured to measure the intensity of luminous or fluorescent light with respect to a target tissue. In particular, gel imaging analysis equipment may be desirable for measuring the intensity of noctilucent or fluorescent light transmitted from gelled tissue by the clearing technique. For example, a gel imaging analysis device may be a gel doc (gel documentation system) based device capable of irradiating UV to measure light intensity for an object, such as gelled target tissue, and provide an image of it. However, the present invention is not limited thereto, and various devices may be used as gel imaging analysis equipment as long as the intensity of the luminous or fluorescent light emitted for the transparent tissue can be measured.
한편, 젤 이미징 분석 장비에 이용되는 웰 플레이트는 암막 조건을 제공할 수 있도록 검정색으로 코팅된 웰 블랙 플레이트 (well black plate) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. Meanwhile, the well plate used in the gel imaging analysis equipment may be a well black plate coated in black so as to provide blackout conditions. However, it is not limited thereto.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰 플레이트 내의 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 나아가, 야광 디스크 또한 플레이트의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있다. 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는 야광 디스크 및 표적 조직은, 웰 플레이트 내부에 순차적으로 배치되어 고정될 수 있다. 이에, 젤 이미징 분석 장비에 의해 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기가 측정되는 동안, 표적 조직의 확대와 같은 투명화에 따른 조직의 크기 변화는 최소화될 수 있다. 나아가, 표적 부위를 포함하며 웰 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직으로 투과되는 야광 빛의 세기를 측정하는 것은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 투과되는 야광 빛의 세기를 표적 부위 선택적으로 측정하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직과 빛이 투과된 야광 디스크를 웰 내에 배치하고, 웰 각각에 대하여 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동이 적어 그 결과가 정확할 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다. According to another embodiment of the present invention, tissue cleared by hydrogel-based or water-soluble formulation-based clearing techniques can be punched to obtain target tissue having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the wells in the well plate. have. Furthermore, the luminous disk can also have a size of 0.8 to 1 times the diameter of the plate. Luminous discs and target tissues having a diameter of 0.8 to 1 times relative to the wells may be sequentially arranged and fixed inside the well plate. Thus, while the intensity of the luminous light emitted from the luminous disk through the target tissue by the gel imaging analysis device is measured, the change in the size of the tissue due to the transparency such as the enlargement of the target tissue can be minimized. In addition, measuring the intensity of the luminous light transmitted to the target tissue punched to fit the well size, including the target site, is more effective than selectively measuring the intensity of the luminous light transmitted to the entire tissue that has not been cut. The result can be accurate. For example, for brain tissues that have been cleared by a hydrogel-based or water-soluble agent-based clearing technique, a target tissue and a light-transmitted luminous disk punched to include the front brain, middle brain, and rear brain, respectively, are placed in the wells, and each well When the analysis is performed, the size of the entire brain tissue is less than the analysis of each of the front brain, middle brain, and rear brain regions, and thus the result may be accurate. Furthermore, accurate transparency analysis of target tissues such as midbrain and backbrain regions may be possible.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 펀치를 이용하여 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직으로부터 표적 조직을 획득하고, 빛이 투과된 야광 디스크와 절단 필러 내에 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰의 내부에 순차적으로 배치할 수 있다. 그 다음, 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 야광 디스크로부터 펀치 내의 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 조직의 투명도 분석이 수행될 수 있다. 이에, 펀치 내에 고정된 표적 조직은 분석이 수행되는 동안, 투명화에 따른 조직의 크기 축소가 최소화될 수 있다. 이에, 펀치에 의해 고정된 표적 조직에 대한 야광 빛의 세기의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직 선택적으로 야광 빛의 세기를 측정하는 것 보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 웰의 직경에 대하여 0.8 내지 1.0 배의 직경을 갖는 야광 디스크와, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 포함하는 펀치를 각각 웰 내부에 순차적으로 배치한다. 그 다음, 각각의 웰에 대하여 야광 빛의 세기를 측정함으로써 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동, 보다 구체적으로 크기가 축소되는 변화가 적을 수 있다. 그 결과, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다. According to another embodiment of the present invention, a punch is used to obtain a target tissue from the cleared tissue by a solvent-based clearing technique, and a punch including the target tissue in the light-transmitted luminous disk and the cutting filler to the inside of the well. Can be placed sequentially. Transparency analysis of the tissue may then be performed by measuring the intensity of the luminous light emitted through the target tissue in the punch from the luminous disk using gel imaging analysis equipment. Thus, the target tissue fixed in the punch can minimize the size reduction of the tissue due to clearing while the analysis is performed. Thus, the measurement of the luminous light intensity for the target tissue fixed by the punch may be more accurate than the measurement of the luminous light intensity selectively for the tissue corresponding to the target site with respect to the whole tissue which is not cut. . For example, it includes a luminous disk having a diameter of 0.8 to 1.0 times the diameter of the well, and a target tissue punched to include the front brain, middle brain, and rear brain, respectively, for brain tissues that have been cleared by an organic solvent-based clearing technique. The punches to be disposed are sequentially arranged in the wells, respectively. Then, when transparency analysis is performed by measuring the luminous intensity of light for each well, the variation in size, more specifically, the size of the whole brain tissue, than the analysis of each of the frontal, midbrain, and posterior brain regions is performed. There may be less change that is reduced. As a result, accurate transparency analysis of target tissues such as midbrain and backbrain regions may be possible.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are only for illustrating the present invention by way of example, and the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.
본 발명은, 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화를 최소화 할 수 있는 조직의 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 다양한 투명화 기법에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다. The present invention, by providing a method for analyzing the transparency of the tissue that can minimize the change in the size of the tissue according to the transparent technique, there is an effect that can perform a standardized analysis for the various transparent techniques.
보다 구체적으로, 본 발명은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된 조직의 투명도 분석 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다. More specifically, the present invention may provide a method for analyzing transparency of tissues configured to minimize changes in tissue size according to a hydrogel-based clearing technique, a water-soluble preparation-based clearing technique, or an organic solvent-based clearing technique. It has an effect.
본 발명은, 투명화된 조직에 대하여 흡광도, 투명도 또는 투과되는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성된 새로운 조직의 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 투명화 기법에 의해 겔화된 조직에 대한 투명도 분석을 효과적으로 수행할 수 있다. The present invention provides a novel method for analyzing transparency of tissues configured to measure absorbance, transparency, or intensity of transmitted luminous light with respect to transparent tissues, thereby effectively performing transparency analysis on tissues gelled by the transparent technique. .
나아가, 본 발명은 투명화된 조직의 투명도를 다양하게 설정된 조건에서 분석할 수 있고, 연구실 수준에서도 최소한의 분석 장비만을 이용하여 조직의 투명도를 효과적으로 측정할 수 있는 효과가 있다. In addition, the present invention can analyze the transparency of the transparent tissue in a variety of conditions set, there is an effect that can effectively measure the transparency of the tissue using only minimal analysis equipment at the laboratory level.
이에, 본 발명은 투명화된 다양한 조직에 대한 해부학적 연구에 기여할 수 있는 효과가 있다. Thus, the present invention has an effect that can contribute to the anatomical study of the various tissues that are transparent.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.The effects according to the present invention are not limited by the contents exemplified above, and more various effects are included in the present specification.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 2c는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 4d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 5d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.1A illustrates a flowchart for a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
1B exemplarily illustrates a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
1C illustratively illustrates target tissue placed on a well plate according to a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to one embodiment of the present invention.
2A illustrates a flowchart for a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
2B exemplarily illustrates a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
2C illustratively illustrates target tissue placed on a well plate according to a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
3A illustrates a tissue clearing procedure according to a hydrogel-based clearing technique, used in various embodiments of the present invention.
3B illustrates a tissue clearing procedure according to an organic solvent-based clearing technique used in various embodiments of the present invention.
4A depicts target tissues of cleared tissue according to hydrogel-based clearing techniques, used in various embodiments of the present invention.
Figure 4b shows the results of absorbance measured for the tissue cleared by hydrogel-based clearing technique, according to the method of analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
Figure 4c shows the results of the measured transparency of the tissue cleared by the hydrogel-based clearing technique, according to the method of analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
Figure 4d shows the result of measuring the intensity of the fluorescent light measured for the tissue cleared by the hydrogel-based clearing technique in accordance with a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
5A illustrates target tissue of cleared tissue according to an organic solvent based clearing technique, used in various embodiments of the present invention.
FIG. 5B illustrates the results of absorbance measured on tissues cleared by an organic solvent-based clearing technique according to a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5C illustrates the results of transparency measured for tissues that have been cleared by an organic solvent-based clearing technique according to a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5D illustrates a result of measuring the intensity of fluorescent light measured on the tissue cleared by the organic solvent-based clearing technique according to the method of analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. Advantages and features of the present invention and methods for achieving them will be apparent with reference to the embodiments described below in detail with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, only the embodiments, the disclosure of the present invention is complete, the common knowledge in the art to which the present invention belongs It is provided to fully inform the person having the scope of the invention, the invention is defined only by the scope of the claims.
이하에서는, 도 1a 내지 1c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법을 구체적으로 설명한다. Hereinafter, a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 1A to 1C.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다. 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다. 1A illustrates a flowchart for a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. 1B exemplarily illustrates a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. 1C illustratively illustrates target tissue placed on a well plate according to a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to one embodiment of the present invention.
도 1a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고 (S110), 투명화된 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하고 (S120), 광학 리더기를 이용하여, 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정 (S130) 이 수행된다. Referring to FIG. 1A, a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention includes performing a process for transparent tissue by a transparent technique (S110), including a portion of the transparent tissue, and having a target having a predetermined size. In order to acquire the tissue, the tissue is cut (S120), and an optical reader is used to measure absorbance or transparency of the obtained target tissue (S130).
보다 구체적으로, 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화 처리가 수행될 수 있다. 이때, 투명화 대상 조직 (112) 은 마우스의 뇌 등의 특정 기관에 대하여 4 %의 PFA (paraformaldehyde) 로 고정시키고, 사상 단면을 갖도록 일정한 두께로 절단된 조직일 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는 이러한 투명화 대상 조직 (112) 에 대하여 다양한 방법으로 투명화가 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CLARITY, PACT, ACT, 또는 SWITCH와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS와 같은 수용성 제제 기반의 투명화 기법, 나아가 3DISCO, iDISCO, 또는 BABB와 같은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용해 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화를 수행할 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 의 결과로, 투명화된 조직 (114) 를 획득할 수 있다. More specifically, in the step (S110) of performing the process for the transparent, it is possible to obtain the tissue transparent by a variety of transparent techniques. For example, referring to FIG. 1B, a transparency process may be performed on the tissue to be transparent 112. In this case, the tissue to be transparent 112 may be tissue that is fixed to 4% PFA (paraformaldehyde) with respect to a specific organ such as the brain of a mouse and cut to a constant thickness to have a filamentary cross section. In the step (S110) of performing the process for transparency, the transparency may be performed on the object to be transparent 112 in various ways. More specifically, hydrogel-based clarification techniques such as CLARITY, PACT, ACT, or SWITCH, water soluble formulation-based clarification techniques such as seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, or ScaleS, and even organic such as 3DISCO, iDISCO, or BABB. The solvent-based clearing technique may be used to perform clearing on the
투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는 복수의 투명화 기법으로, 투명도를 분석하고자 하는 복수개의 조직 각각에 대한 투명화가 수행될 수 있다. In the step S110 of performing a process for transparency, transparency may be performed for each of a plurality of tissues to be analyzed for transparency using a plurality of transparency techniques.
한편, 획득된 투명화된 조직 (114) 은 적용된 투명화 기법의 종류에 따라, 크기의 변화가 나타날 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (a)) 은 하이드로겔화 되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (b)) 은 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 작아질 수 있다. On the other hand, the obtained
이에, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 투명화 기법의 종류에 따라 다양한 방법으로 조직을 절단할 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 하이드로겔 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (a)) 이, 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭은 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직 (126 (a)) 을 일정한 모양, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖도록 펀칭할 수 있는, 펀치 (128) 를 이용하여 수행할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (128) 는 내부 직경이 6mm 내지 7mm를 갖는 아일렛 심일 수 있다. Thus, in the step of cutting the tissue (S120) it can be cut tissue in a variety of ways depending on the type of invisibility technique. For example, referring to FIG. 1B, in the step of cutting the tissue (S120), the tissue 114 (a), which has been cleared by a hydrogel or a water-soluble agent-based clearing technique, is formed in each well of the
도 1b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (b)) 이, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 (129 (a)) 및 고정부 (129 (a)) 의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직 (126 (b)) 을 획득하도록 구성된 절단 필러 (129 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 를 이용하여 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭된 표적 조직 (126 (b)) 은 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정될 수 있고, 표적 조직 (126 (b)) 의 직경은 제2 직경과 유사할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 대한 제1 직경이 6mm 내지 7mm이고, 절단 필러 (129 (b)) 제2 직경이 3mm 내지 4mm인 아일렛 심일 수 있다. Referring to FIG. 1B, in the step of cutting the tissue (S120), the tissue 114 (b), which has been cleared by an organic solvent-based clearing technique, has a size of 0.8 to 1 times the diameter of the
본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법은, 조직을 절단하는 단계 (S120) 하는 단계 이후에 표적 조직을 웰 플레이트 내부에 배치하는 단계가 더 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 배치하는 단계에서는, 펀치 (128) 에 의해 획득된, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 각각의 웰 (124) 내부에 배치할 수 있다. 이에 따라, 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 은, 웰 플레이트 (122) 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화에 따른 표적 조직 (126 (a)) 의 확대와 같은 크기의 변화가 최소화될 수 있다. Transparency analysis method of the tissue according to an embodiment of the present invention, after the step of cutting the tissue (S120) may be further performed to place the target tissue inside the well plate. For example, referring to FIG. 1B, in the placing step, the target tissue 126 (a) having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well 124 obtained by the
나아가, 도 1b를 참조하면, 배치하는 단계에서는 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정된, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치할 수 있다. 이때, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 의해 웰 (124) 내에 효과적으로 고정될 수 있다. 이에, 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안 유기 용매의 이용에 따른 표적 조직 (126 (b)) 의 크기 축소는 최소화될 수 있다. Further, referring to FIG. 1B, in the placing step, the
도 1c를 참조하면, 배치되는 단계에 따라 웰 (124) 내부에 배치된 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 표적 조직 (114 (a) 또는 114 (b)) 이 배치되지 않은 웰 (124) (도 1c의 (a) 참조), 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 이 배치된 웰 (124) (도 1c의 (b) 참조), 그리고 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 가 배치된 웰 (124) (도 1c의 (c) 참조) 이 예시적으로 도시된다. Referring to FIG. 1C, a target tissue 126 (a) or 126 (b) is shown disposed within the well 124 according to the stage of placement. More specifically, the target tissue clarified by the well 124 (see (a) of FIG. 1C), the hydrogel-based or water-soluble agent-based clearing technique in which the target tissue 114 (a) or 114 (b) is not disposed A
마지막으로, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 웰 (124) 내에 배치된 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 에 대하여 특정한 파장의 광을 조사하고 OD값을 측정함으로써 이에 대한 투명도 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 광학 리더기를 이용하여 표적 조직 (126 (a)) 을 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 빛을 투과하고 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 흡광도가 측정된다. 나아가, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 측정된 흡광도에 대한 백분율을 취해 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 투명도가 산출될 수 있다. 그 결과, 표적 부위를 포함하며 웰 (124) 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (a)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. Finally, in the step (S130) of measuring the absorbance or the transparency of the target tissue, the target tissue 126 (a) or 126 (b) disposed in the well 124 is irradiated with light of a specific wavelength and the OD value is measured. By measuring this transparency analysis can be performed. For example, referring to FIG. 1B, in the step (S130) of measuring the absorbance or the transparency of the target tissue, light is applied to the
도 1b를 참조하면, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 웰 (124) 내에 배치된 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도 또는 투명도 분석이 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 광학 리더기를 이용하여 표적 조직 (126 (b)) 과 펀치 (129) 를 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 빛을 투과하고 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도가 측정된다. 나아가, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 측정된 흡광도에 대한 백분율을 취해 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 투명도가 산출될 수 있다. 이때, 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 은 광학 리더기에 의해 광이 효과적으로 조사될 수 있다. 그 결과, 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (b)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. Referring to FIG. 1B, the absorbance or transparency of the target tissue 126 (b) in the cutting filler 129 (b) disposed in the well 124 may be measured at step S130. Analysis can be performed. More specifically, in the step (S130) of measuring the absorbance or transparency of the target tissue, light is transmitted to the
이하에서는, 도 2a 및 2c를 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법을 구체적으로 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해 도 1a 내지 도 1c에서 사용된 도면 부호를 함께 이용한다. Hereinafter, a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 2A and 2C. In this case, for convenience of description, reference numerals used in FIGS. 1A to 1C are used together.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다. 도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 도 2c는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다. 2A illustrates a flowchart for a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention. 2B exemplarily illustrates a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention. 2C illustratively illustrates target tissue placed on a well plate according to a procedure of a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
도 2a를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고 (S210), 투명화된 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하고 (S220), 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득 (S230) 하도록 구성된다. 그 다음, 야광 디스크에 빛을 투과하고 (S240), 빛이 투과된 야광 디스크에 표적 조직을 배치하며 (S250), 마지막으로 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정 (S260) 이 수행된다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에서 이용되는 웰 플레이트 (122) 는 야광 빛의 세기를 측정하기 위한 암막 조건을 형성하기 위해 검은색 코팅된 플레이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Referring to FIG. 2A, a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention includes performing a process for transparentizing tissue by a transparent technique (S210), including a portion of the transparent tissue, and having a target having a predetermined size. In order to acquire the tissue, the tissue is cut (S220), and acquire a luminous disk having a predetermined size (S230). Then, light is transmitted through the luminous disk (S240), the target tissue is placed on the luminous disk through which the light is transmitted (S250), and finally, the luminous light is transmitted through the target tissue from the luminous disk by using gel imaging analysis equipment. Measuring the intensity of (S260) is performed. The
보다 구체적으로, 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화 처리가 수행될 수 있다. 이때, 투명화 대상 조직 (112) 은 마우스의 뇌 등의 특정 기관에 대하여 4 %의 PFA (paraformaldehyde) 로 고정시키고, 사상 단면을 갖도록 일정한 두께로 절단된 조직일 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는 이러한 투명화 대상 조직 (112) 에 대하여 다양한 방법으로 투명화가 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CLARITY, PACT, ACT, 또는 SWITCH와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS와 같은 수용성 제제 기반의 투명화 기법, 나아가 3DISCO, iDISCO, 또는 BABB와 같은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용해 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화를 수행할 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 의 결과로, 투명화된 조직 (114) 를 획득할 수 있다. More specifically, in the step (S210) of performing a process for transparentization, it is possible to obtain a transparent tissue by a variety of transparent techniques. For example, referring to FIG. 2B, a transparency process may be performed on the tissue to be transparent 112. In this case, the tissue to be transparent 112 may be tissue that is fixed to 4% PFA (paraformaldehyde) with respect to a specific organ such as the brain of a mouse and cut to a constant thickness to have a filamentary cross section. In the step S210 of performing the process for transparency, transparency may be performed on the object to be transparent 112 in various ways. More specifically, hydrogel-based clarification techniques such as CLARITY, PACT, ACT, or SWITCH, water soluble formulation-based clarification techniques such as seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, or ScaleS, and even organic such as 3DISCO, iDISCO, or BABB. The solvent-based clearing technique may be used to perform clearing on the
투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는 복수의 투명화 기법으로, 투명도를 분석하고자 하는 복수개의 조직 각각에 대한 투명화가 수행될 수 있다. In the step of performing the process for transparency (S210), the plurality of transparency techniques may be performed for each of a plurality of tissues to be analyzed for transparency.
한편, 획득된 투명화된 조직 (114) 은 적용된 투명화 기법의 종류에 따라, 크기의 변화가 나타날 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (a)) 은 하이드로겔화 되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (b)) 은 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 작아질 수 있다. On the other hand, the obtained
이에, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 투명화 기법의 종류에 따라 다양한 방법으로 조직을 전단할 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 하이드로겔 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (a)) 이, 젤 이미징 분석에 적합한 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭은 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직 (126 (a)) 을 일정한 모양, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖도록 펀칭할 수 있는, 펀치 (128) 를 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (128) 는 내부 직경이 6mm 내지 7mm를 갖는 아일렛 심일 수 있다. Thus, in the step of cutting the tissue (S220) it can shear the tissue in a variety of ways depending on the type of invisibility technique. For example, referring to FIG. 2B, in the step of cutting the tissue (S220), the tissue clarified by the hydrogel or a water-soluble preparation based clarification technique 114 (a) is a
도 2b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (b)) 이, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 (129 (a)) 및 고정부 (129 (a)) 의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직 (126 (b)) 을 획득하도록 구성된 절단 필러 (129 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 를 이용하여 펀칭될 수 있다. 이때, 표적 조직 (126 (b)) 은 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정될 수 있고, 표적 조직 (126 (b)) 의 직경은 제2 직경과 유사할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 대한 제1 직경이 6mm 내지 7mm이고, 절단 필러 (129 (b)) 제2 직경이 3mm 내지 4mm인 아일렛 심일 수 있다. Referring to FIG. 2B, in the step of cutting the tissue (S220), the tissue 114 (b), which is transparent by the organic solvent-based transparent technique, has a size of 0.8 to 1 times the diameter of the
그 다음, 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230) 에서는 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크가 획득될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230) 에서는 일정 시간 동안 빛이 투과되어 야광을 발할 수 있는 야광 디스크 (232) 가 획득될 수 있다. 이때, 야광 디스크 (232) 의 직경은 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있다. 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 야광 디스크 (232) 는 직경이 6mm 내지 7mm를 가질 수 있다. Next, in step S230 of obtaining the luminous disk, a luminous disk having a predetermined size may be obtained. For example, referring to FIG. 2B, in the step of obtaining a luminous disk (S230), a
한편, 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계 (S240) 에서는, 야광 빛을 발광할 수 없는 상태의 야광 디스크 (232) 에 대하여 빛이 투과될 수 있다. On the other hand, in the step of transmitting light to the luminous disk (S240), the light can be transmitted to the
다음으로, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에서는 야광 디스크 (232) 및 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 웰 (124) 내부에 순차적으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 배치하는 단계 (S250) 에서는, 야광 디스크 (232) 및 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 웰 (124) 내부에 순차적으로 배치할 수 있다. 이에 따라, 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는, 야광 디스크 (232) 및 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 은, 웰 플레이트 (122) 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안, 야광 디스크로부터 표적 조직 (126 (a)) 을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기가 측정되는 동안, 표적 조직의 확대와 같은 투명화에 따른 조직의 크기 변화는 최소화될 수 있다. Next, in the step (S250) of placing the obtained target tissue on the light transmitting luminous disk, the
도 2b를 참조하면, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에서는, 야광 디스크 (232) 및 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정된 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 가 웰 (124) 내에 순차적으로 배치할 수 있다. 이때, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 야광 디스크 (232) 및 펀치 (129) 의 고정부 (129 (a)) 는 웰 (124) 내에 효과적으로 고정될 수 있다. 이에, 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안 유기 용매의 이용에 따른 표적 조직 (126 (b)) 의 크기 축소는 최소화될 수 있다. Referring to FIG. 2B, in the step (S250) of placing the obtained target tissue on the light transmitting luminous disk, the organic solvent-based transparent technique fixed in the
도 2c를 참조하면, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에 따라 웰 (124) 내부에 배치된 야광 디스크 (232) 와 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 야광 디스크 (232) 만 배치된 웰 (124) (도 2c의 (a) 참조), 야광 디스크 (232) 및 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 이 배치된 웰 (124) (도 2c의 (b) 참조), 그리고 야광 디스크 (232) 및 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 가 배치된 웰 (124) (도 2c의 (c) 참조) 이 예시적으로 도시된다. Referring to FIG. 2C, the
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법에서, 조직을 절단하는 단계 (S220), 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230), 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계 (S240) 및 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 는 순차적으로 수행되는 것은 아니다. 나아가, 이상의 단계 (S220, S230, S240 및 S250) 각각은 다른 단계가 수행되는 동안 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 야광 디스크 (232) 는 조직을 절단하는 단계 (S220) 전에 획득될 수 있다. 나아가, 야광 디스크 (232) 는 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 에 미리 배치될 수 있고, 배치된 야광 디스크 (232) 에 일정한 시간 동안 빛을 조사한 후 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 가 그 위에 배치될 수 있다. On the other hand, in the transparency analysis method of the tissue according to another embodiment of the present invention, cutting the tissue (S220), obtaining a luminous disk (S230), the step of transmitting light to the luminous disk (S240) and the light is In the transmitted luminous disk, the step S250 of placing the obtained target tissue is not performed sequentially. Furthermore, each of the above steps S220, S230, S240, and S250 may be simultaneously performed while other steps are performed. For example, the
마지막으로, 마지막으로 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는 웰 (124) 내의 야광 디스크 (232) 에 놓여진 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 에 대하여 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는, 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 표적 조직 (126 (a)) 을 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 야광 디스크 (232) 로부터 표적 조직 (126 (a)) 을 통해 투과되는 야광 빛의 세기를 측정한다. 그 결과, 표적 부위를 포함하며 웰 (124) 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 야광 빛의 세기의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (a)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. Finally, in step S260 of measuring the intensity of the luminous light, the target tissue 126 (a) or 126 (b) that is placed on the
도 2b를 참조하면, 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는 웰 (124) 내의 야광 디스크 (232) 에 놓여진 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 에 대하여 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 이에, 야광 디스크 (232) 로부터 투과된 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 야광 빛의 세기를 측정하는 것은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (b)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 야광 빛의 세기를 측정하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. Referring to FIG. 2B, in step S260 of measuring the intensity of the luminous light, the black film against the target tissue 126 (b) in the cutting filler 129 (b) placed on the
이하에서는, 도 3a 및 도 3b를 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는 투명화 기법에 대하여 구체적으로 설명한다. 이때, 하이드로겔 기반의 투명화 기법으로 mPACT 기법을, 유기용매 기반의 1P BABB를 예로 들어 설명하나 본 발명의 다양한 실시예에서 이용될 수 있는 투명화 기법은 이에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, with reference to FIGS. 3A and 3B, the transparency technique used in various embodiments of the present invention will be described in detail. In this case, mPACT technique is described as a hydrogel-based transparent technique using 1P BABB based on an organic solvent, but the transparent technique that can be used in various embodiments of the present invention is not limited thereto.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다. 3A illustrates a tissue clearing procedure according to a hydrogel-based clearing technique, used in various embodiments of the present invention.
도 3a의 (a)를 참조하면, mPACT 기법에 따른 투명화 대상 기관으로 설정된 마우스의 뇌가 도시된다. 이때, 투명화를 위해 마우스의 뇌는 4 %의 PFA로 고정되고, 사상 단면을 갖도록 4mm의 일정한 두께로 절단될 수 있다. Referring to (a) of FIG. 3A, a brain of a mouse set as a target of invisibility according to the mPACT technique is shown. At this time, the brain of the mouse is fixed with 4% PFA for transparency, it can be cut to a constant thickness of 4mm to have a filamentary cross section.
도 3a의 (b)를 참조하면, 사상 단면을 갖는 마우스의 뇌조직에 대하여 mPACT 기법에 의한 투명화 과정이 된다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따르면 PFA로 고정된 투명화 대상 조직은, 혼합된 A.A (acrylamide) 및 Azobis 계열의 VA-044가 처리된다. 그 다음, 8 %의 SDS (sodium dodecylsulfate) 의 세척 용액 및 0.5 % T.G (1-Thioglycerol) 의 비-갈색화 제제가 처리된다. 그 결과 불투명했던 대상 조직은 투명화 8일 후 하이드로겔화 되어, 투명한 상태가 된다. Referring to Figure 3a (b), the brain tissue of the mouse having a filamentous cross-section is masticated by the mPACT technique. More specifically, according to the mPACT technique, the tissue to be cleared with PFA is treated with mixed A.A (acrylamide) and Azobis-based VA-044. Next, a washing solution of 8% sodium dodecylsulfate (SDS) and a non-browning agent of 0.5% T.G (1-Thioglycerol) are treated. As a result, the target tissue, which was opaque, is hydrogelized after 8 days of clearing, and becomes transparent.
도 3a의 (c)를 참조하면, 투명화가 수행되기 전의 조직 및 mPACT 기법에 따라 투명화된 조직이 함께 도시된다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따라 투명화된 조직은 투명화 전의 조직의 크기보다 커진 것을 알 수 있다. 이러한 현상은, 대상 조직이 하이드로겔화를 위해 처리된 제제를 흡수함에 따라 나타날 수 있다. 이러한, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화는, 조직의 투명도에 대하여 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다. Referring to Figure 3a (c), the tissue before the transparent and the mPACT technique is shown along with the transparent tissue. More specifically, it can be seen that the tissue cleared according to the mPACT technique is larger than the size of the tissue before the clearing. This phenomenon can manifest as the tissue of interest absorbs the agent treated for hydrogelation. The change in the size of the cleared tissue according to the hydrogel-based clearing technique may be a factor in an unclear analysis of the transparency of the tissue.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다. 3B illustrates a tissue clearing procedure according to an organic solvent-based clearing technique used in various embodiments of the present invention.
도 3b의 (a)를 참조하면, 1P-BABB 기법에 따른 투명화 대상 기관으로 설정된 마우스의 뇌가 도시된다. 이때, 투명화를 위해 마우스의 뇌는 4 %의 PFA로 고정되고, 사상 단면을 갖도록 4mm의 일정한 두께로 절단될 수 있다. Referring to (a) of FIG. 3B, the brain of a mouse set as a target of invisibility according to the 1P-BABB technique is shown. At this time, the brain of the mouse is fixed with 4% PFA for transparency, it can be cut to a constant thickness of 4mm to have a filamentary cross section.
도 3b의 (b)를 참조하면, 사상 단면을 갖는 마우스의 뇌조직에 대하여 1P-BABB 기법에 의한 투명화 과정이 된다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따르면 PFA로 고정된 투명화 대상 조직은, 25 %, 50 %, 70 % 및 100 %의 1-P (1-propanol) 에 점진적으로 담겨 배양된다. 그 결과 1-P에 의해 대상 조직은 고정화되고, 약간의 pH조절제와, 1-P (1-propanol) 를 이용하여 다시 한번 대상 조직이 고정되고, BA (benzyl alcohol) 와 BB (benzyl benzoate) 의 혼합액 (BABB) 에 담겨 배양되며 시간이 경과된 후 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 한편, 투명화가 진행될수록, 조직의 크기는 투명화 전의 크기보다 작아지는 것으로 나타난다. Referring to (b) of Figure 3b, the brain tissue of the mouse having a filamentous cross-section is a transparent process by the 1P-BABB technique. More specifically, according to the 1P-BABB technique, the tissue to be cleared with PFA is gradually cultured in 25%, 50%, 70% and 100% of 1-P (1-propanol). As a result, the target tissue is immobilized by 1-P, and the target tissue is immobilized once again using a little pH adjuster and 1-P (1-propanol), and BA (benzyl alcohol) and BB (benzyl benzoate) Clarified tissue can be obtained after culturing in a mixed solution (BABB) and over time. On the other hand, as the clearing progresses, the size of the tissue appears to be smaller than the size before the clearing.
도 3b의 (c)를 참조하면, 투명화가 수행되기 전의 조직 및 1P-BABB 기법 에 따라 투명화된 조직이 함께 도시된다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 조직은 투명화 전의 조직의 크기보다 작아진 것을 알 수 있다. 이러한 현상은, 대상 조직이 휘발성 알코올에 의해 고정화 됨에 따라 나타날 수 있다. 이러한, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화는, 조직의 투명도에 대하여 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다. Referring to FIG. 3B (c), the tissues before the transparentization is performed and the tissues transparent according to the 1P-BABB technique are shown together. More specifically, it can be seen that the tissue cleared according to the 1P-BABB technique is smaller than the size of the tissue before the clearing. This phenomenon may occur as the target tissue is immobilized by volatile alcohol. The change in the size of the cleared tissue according to the organic solvent-based clearing technique may be a factor in an unclear analysis of the transparency of the tissue.
실시예 1: 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법을 이용한, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석Example 1 Transparency Analysis of Tissues Transparent by Hydrogel-Based Transparency Technique Using Tissue Transparency Analysis Method According to Various Embodiments of the Present Invention
이하의 실시예 1에서는 도 4a 내지 4d를 참조하여 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석결과에 대하여 설명한다. 이때 투명도 분석을 위해, mPACT 기법에 따라 투명화된 쥐의 뇌 조직을 예로 들어 설명하나, 투명도 분석 대상 조직 및 투명화 기법은 이에 제한되는 것이 아니다. In the following Example 1 with reference to Figures 4a to 4d will be described for the results of the transparency analysis of the transparent tissue by the hydrogel-based transparent technique. In this case, for the transparency analysis, the brain tissue of the mouse cleared according to the mPACT technique will be described as an example, but the transparency analysis target tissue and the transparent technique is not limited thereto.
도 4a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다. 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다. 도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다. 도 4d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다. 4A depicts target tissues of cleared tissue according to hydrogel-based clearing techniques, used in various embodiments of the present invention. Figure 4b shows the results of absorbance measured for the tissue cleared by hydrogel-based clearing technique, according to the method of analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. Figure 4c shows the results of the measured transparency of the tissue cleared by the hydrogel-based clearing technique, according to the method of analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. Figure 4d shows the result of measuring the intensity of the fluorescent light measured for the tissue cleared by the hydrogel-based clearing technique in accordance with a method for analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
도 4a를 참조하면, 전술한 mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터, 대뇌 피질을 포함하는 전뇌 부위, 중뇌 부위 및 소뇌를 포함하는 후뇌 부위를 포함하는 표적 조직을 획득한다. 보다 구체적으로, 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위를 펀칭하고, 펀칭된 세 개의 표적 조직에 대하여 다양한 투명도 분석이 수행된다. Referring to Figure 4a, according to the mPACT technique described above, from the cleared brain tissue, the target tissue including the forebrain region, including the cerebral cortex, the midbrain region and the cerebellum, including the cerebellum. More specifically, 6 mm diameter eyelets are punched to punch the frontal, midbrain, and posterior brain regions, and various transparency analyzes are performed on the punched three target tissues.
도 4b의 및 4c를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌 및 후뇌에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 흡광도 및 투명도가 도시된다. Referring to FIGS. 4B and 4C, absorbance and transparency according to the irradiated wavelength, as measured for punched fore, middle and hind brain, are shown.
보다 구체적으로, 본 분석은 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 투명화 되기 전의 사상단면을 갖는 쥐의 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌, 후뇌 부위를 펀칭하여 획득하고, mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직에 대하여 전술한 부위와 동일한 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위를 펀칭하여 획득한다. More specifically, the analysis was obtained by punching the frontal, midbrain, and posterior brain regions of the brain tissues of rats with a filamentous cross-section before eye clearing using eyelets with a diameter of 6 mm, and using the mPACT technique to clarify the brain tissues. Acquired by punching the same front, middle and back brain areas.
이상의 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 는 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 부위 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 및, 조직이 들어가있지 않은 빈 웰, nRIMS 고정액 및 1 % 아가 (agar) 는 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 대조군으로 설정되었다. The above punched forebrain (after transparency), midbrain (after transparency) and posterior brain (after transparency) were set as experimental groups in absorbance and transparency analysis. Furthermore, the site whole brain (before clearing), mid brain (before clearing), back brain (before clearing) and empty wells without tissue, nRIMS fixative and 1% agar were set as controls in absorbance and transparency analysis. .
흡광도 분석은 각각의 실험군 및 대조군에 해당하는 표적 조직 또는 대조 물질을 96 웰 플레이트의 웰에 넣고, ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 각각의 웰에 다양한 영역의 파장을 조사한 후 OD값을 측정함으로써 수행되었다. Absorbance analysis was performed by placing target tissue or control material corresponding to each experimental group and control group into a well of a 96 well plate, and measuring the OD value after irradiating wavelengths of various regions to each well using an ELISA microplate reader. .
도 4b를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군에 대한 흡광도는 빈 웰, nRIMS 및 1 % 아가의 대조군과 비슷한 수준으로 나타난다. 이와 대조적으로 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 의 대조군은 상대적으로 높은 흡광도를 나타낸다. 한편, 전뇌, 중뇌 및 후뇌의 각각의 표적 조직에 대한 유의한 흡광도 차이는 없는 것으로 나타난다. Referring to FIG. 4B, the absorbances for the experimental group of the front brain (after clearing), mid brain (after clearing) and back brain (after clearing) are shown at similar levels as the control group of empty wells, nRIMS and 1% agar. In contrast, the controls of the forebrain (before clearing), midbrain (before clearing), and posterior brain (before clearing) show relatively high absorbance. On the other hand, there is no significant difference in absorbance for each target tissue of the forebrain, midbrain and posterior brain.
도 4c를 참조하면, 측정된 OD값에 대하여 백분율을 취하여 산출된 투명도가 도시된다. 보다 구체적으로, 빈 웰, nRIMS의 대조군에 대한 투명도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이때, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군에 대한 투명도는 1 % 아가의 대조군과 비슷한 수준으로 나타난다. 한편 이상의 결과와 대조적으로, 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 의 대조군의 투명도는 0에 가까운 수준으로 나타난다. Referring to FIG. 4C, the transparency calculated by taking a percentage of the measured OD values is shown. More specifically, the transparency of empty wells and nRIMS was found to be the highest. At this time, the transparency of the experimental group of the whole brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing), and the rear brain (after the clearing) is displayed at a level similar to that of the control group of 1% agar. On the other hand, in contrast to the above results, the transparency of the control group of the whole brain (before the clearing), the middle brain (before the clearing), and the rear brain (before the clearing) appears to be near zero.
이때, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 각각의 실험군에 대한 투명도는 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 투명도가 높은 것으로 나타난다. At this time, the transparency of each experimental group of the front brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing), and the rear brain (after the clearing) is high transparency in the order of the front brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing), and the rear brain (after the clearing). appear.
한편, 표적 조직에 대하여 측정된 흡광도는 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 조직보다 투명도가 낮을 수 있다. Meanwhile, the absorbance measured for the target tissue may be inversely proportional to the transparency. For example, tissues with relatively high absorbance may have lower transparency than tissues with relatively low absorbance.
이와 같이, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 일 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 표적 조직 각각에 대한 흡광도 및 이에 따른 투명도를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다. As such, the plurality of target tissues that are transparent by the hydrogel-based clearing technique may be measured by measuring absorbance and corresponding transparency of each target tissue according to the transparency analysis method according to an embodiment of the present invention. Differences in degree of clarity and clarity for tissues can be analyzed.
도 4d의 (a) 및 (b)를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌 및 후뇌에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 야광 빛의 세기를 측정한 값이 도시된다. Referring to (a) and (b) of FIG. 4D, measured values of the luminous light according to the irradiated wavelength are measured for punched front brain, middle brain and rear brain.
보다 구체적으로, 본 분석은 도 4b 및 4c에서 전술한 방법과 동일한, mPACT 기법에 따라 투명화된 실험군, 및 대조군이 준비되었다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직은 야광 빛의 세기 측정에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 야광 디스크 및 표적 조직이 들어가 있지 않은 웰, 야광 디스크만 들어가 있는 웰은, 야광 빛의 세기 측정에 있어서 대조군으로 설정되었다. More specifically, the assay was prepared with a clearing experimental group, and a control group according to the mPACT technique, the same as the method described above in Figures 4b and 4c. More specifically, the target tissues of the forebrain (after clearing), midbrain (after clearing) and back brain (after clearing) punched out of the cleared brain tissues according to the mPACT technique were set as experimental groups in the measurement of luminous light intensity. Furthermore, wells containing no luminous disks and target tissues and wells containing only luminous disks were set as controls in the measurement of luminous light intensity.
야광 빛의 세기 측정은 96 웰 블랙 플레이트에서 수행되었으며, 실험군의 표적 조직이 들어갈 각각의 웰과 대조군의 야광 디스크만 들어갈 웰에는, 웰 사이즈에 알맞게 컷팅된 직경 6mm의 야광 디스크를 먼저 배치하였다. 그 다음, 일정한 시간 동안 웰 플레이트를 태양광 또는 형광등의 빛에 노출하였다. 다음으로, 야광 디스크가 배치된 웰 각각에 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 후, Gel Doc+를 이용하여 30초 동안 암 조건에서 표적 조직을 투과하여 나타나는 야광 빛의 세기를 측정하였다. The luminous light intensity measurement was performed in 96 well black plates, and each well into which only the target tissue of the experimental group was to be put in and the well into which only the luminous disk of the control group was placed, was first placed with a luminous disk having a diameter of 6 mm cut to fit the well size. The well plates were then exposed to sunlight or fluorescent light for a period of time. Next, the target tissues of the punched (after clearing), midbrain (after clearing), and rear brain (after clearing) punched are placed in each of the wells in which the luminous disks are placed, and then target in cancer conditions for 30 seconds using Gel Doc +. The intensity of luminous light appearing through the tissue was measured.
도 4d의 (a)를 참조하면, 야광 디스크 및 표적 조직이 배치되어 있지 않은 웰 (표적 조직 (-), 야광 디스크 (-)) 과 대조적으로, 야광 디스크와 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는 암조건에서 야광 빛이 각각의 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 한편, 야광 디스크와 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는, 야광 디스크만 배치된 웰 (표적 조직 (-), 야광 디스크 (+)) 과는 유사한 수준으로 야광 빛이 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 실험군 각각을 살펴보면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 야광 빛의 세기가 큰 것으로 나타난다. Referring to (a) of FIG. 4D, in contrast to wells in which no luminous disk and target tissue are disposed (target tissue (-), luminous disk (-)), the whole brain punched with the luminous disk (after clearing), the midbrain In the wells of the experimental group in which the target tissues (after clearing) and rear brain (after clearing) were placed, luminous light appeared to emit through each target tissue in dark conditions. On the other hand, in the wells of the experimental group in which the target tissues of the luminous disks and punched whole brain (after clearing), midbrain (after clearing), and rear brain (after clearing) were arranged, wells in which only luminous disks were placed (target tissue (-), luminous disk) Similar to (+)), luminous light appears to be emitted through target tissue. Looking at each of the experimental groups, the intensity of the luminous light is shown to be large in the order of the front brain (after clearing), the middle brain (after clearing), and the rear brain (after clearing).
도 4d의 (b)를 참조하면, Gel Doc+의 소프트웨어에 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군 각각의 웰에서 투과되는 빛의 세기와 동일한 측정 범위를 설정하고, 야광 빛의 세기를 비교하여 그래프화한 결과가 도시된다. 도 4d의 (a)의 결과와 동일하게, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 야광 빛의 세기가 큰 것으로 나타난다. 이때, 측정된 야광 빛의 세기가 큰 표적 조직은, 투명도가 높은 표적 조직이라는 것을 의미할 수 있다. Referring to (b) of FIG. 4D, in the software of Gel Doc +, a measurement range equal to the intensity of light transmitted through each well of the experimental group of the front brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing), and the rear brain (after the clearing) is set. The graph shows the result of comparing the intensity of the luminous light. As in the result of (a) of FIG. 4D, the intensity of the luminous light is shown to be large in the order of the front brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing) and the rear brain (after the clearing). In this case, the measured target luminous light intensity may mean that the target tissue has high transparency.
이와 같이, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 다른 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 야광 디스크로부터 표적 조직 각각에 대하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다. As described above, the plurality of target tissues that are transparent by the hydrogel-based transparent technique may be measured by measuring the intensity of luminous light emitted from each of the luminous disks to the target tissues according to the transparency analysis method according to another embodiment of the present invention. The difference in degree of clarity and clarity for each target tissue can be analyzed.
이상의 실시예 1의 결과로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 하이드로겔 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직에 대하여 크기의 변화를 최소화 하여 투명도를 분석할 수 있는 다양한 방법을 제공할 수 있다. As a result of the above Example 1, the tissue transparency analysis method according to various embodiments of the present invention, by providing a variety of methods that can analyze the transparency by minimizing the change in size of the transparent tissue by the hydrogel-based transparency technique can do.
실시예 2: 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법을 이용한, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석Example 2 Transparency Analysis of Tissues Cleared by Organic Solvent-Based Clearing Techniques Using Tissue Transparency Analysis Methods According to Various Embodiments of the Present Invention
이하의 실시예 2에서는 도 5a 내지 5d를 참조하여 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석결과에 대하여 설명한다. 이때 투명도 분석을 위해, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 쥐의 뇌 조직을 예로 들어 설명하나, 투명도 분석 대상 조직 및 투명화 기법은 이에 제한되는 것이 아니다. In the following Example 2, the results of the transparency analysis of the cleared tissue by the organic solvent-based clearing technique will be described with reference to FIGS. 5A to 5D. At this time, for the analysis of transparency, the brain tissue of rats invisible according to the 1P-BABB technique will be described as an example, but the tissue and the technique of transparency analysis is not limited thereto.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다. 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다. 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다. 도 5d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다. 5A illustrates target tissue of cleared tissue according to an organic solvent based clearing technique, used in various embodiments of the present invention. FIG. 5B illustrates the results of absorbance measured on tissues cleared by an organic solvent-based clearing technique according to a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. FIG. 5C illustrates the results of transparency measured for tissues that have been cleared by an organic solvent-based clearing technique according to a method for analyzing tissue transparency according to an embodiment of the present invention. FIG. 5D illustrates a result of measuring the intensity of fluorescent light measured on the tissue cleared by the organic solvent-based clearing technique according to the method of analyzing tissue transparency according to another embodiment of the present invention.
도 5a를 참조하면, 전술한 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터, 대뇌 피질을 포함하는 전뇌 부위, 중뇌 부위 및 소뇌를 포함하는 후뇌, 시상하부 및 뇌교 부위를 포함하는 표적 조직을 획득한다. 보다 구체적으로, 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교 부위를 펀칭하고, 펀칭된 다섯 개의 표적 조직에 대하여 다양한 투명도 분석이 수행된다. Referring to Figure 5a, according to the 1P-BABB technique described above, from the cleared brain tissue, the target tissue including the forebrain region, the midbrain region and the cerebellum, including the cerebral cortex, and the hypothalamus, and the pontoon region including the cerebral cortex . More specifically, a 6 mm diameter eyelet is used to punch the frontal brain, midbrain, posterior brain, hypothalamus, and pontoon sites, and various transparency analyzes are performed on the punched five target tissues.
도 5b 및 5c를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교의 표적 조직에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 흡광도 및 투명도가 도시된다. With reference to FIGS. 5B and 5C, absorbance and transparency according to the irradiated wavelength, as measured for the target tissues of the punched forebrain, midbrain, posterior brain, hypothalamus and pons, are shown.
보다 구체적으로, 본 분석은 외부 직경이 6mm, 내부 직경이 3.5mm인 아일렛을 이용하여, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교의 부위를 펀칭하여 획득한다. 이때, 펀칭된 각각의 표적 조직의 직경은 아일렛의 내부직경인 3.5mm와 유사할 수 있다. 나아가, 아일렛의 외부 직경은 본 분석에서 이용되는 96 웰 플레이트의 웰의 직경의 범위에 있어, 표적 조직을 포함하는 아일렛은 웰 내에서 안정적으로 고정될 수 있다. More specifically, this analysis uses an eyelet having an outer diameter of 6 mm and an inner diameter of 3.5 mm, punching the frontal, midbrain, posterior, hypothalamus, and pons regions of the brain tissues that are transparent according to the 1P-BABB technique. Acquire. At this time, the diameter of each punched target tissue may be similar to 3.5mm, the inner diameter of the eyelet. Furthermore, the outer diameter of the eyelets is in the range of the diameters of the wells of the 96 well plates used in this assay, so that the eyelets containing the target tissues can be stably fixed in the wells.
아일렛에 고정된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직은 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 조직이 들어가있지 않은 빈 웰 및 표적 조직을 포함하지 않은 아일렛은 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 대조군으로 설정되었다. The target tissues of the forebrain (after clearing), midbrain (after clearing), posterior brain (after clearing), hypothalamus (after clearing) and pontoon (after clearing) fixed to the eyelets were set as experimental groups in the absorbance and transparency analysis. Furthermore, empty wells without tissues and eyelets without target tissues were set as controls for absorbance and transparency analysis.
흡광도 분석은 각각의 실험군에 대하여 해당하는 표적 조직이 고정된 아일렛을 96 웰 플레이트의 웰 내에 배치하고, ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 각각의 웰에 다양한 영역의 파장을 조사한 후 OD값을 측정함으로써 수행되었다. Absorbance analysis is performed by placing the eyelets immobilized with the corresponding target tissue in the wells of a 96 well plate for each experimental group, and measuring the OD value after irradiating the wavelengths of various regions to each well using an ELISA microplate reader. It became.
도 5b를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 실험군에 대한 흡광도는, 350 nm 내지 450 nm에서 0에 가까운 수준을 나타내는 빈 웰 및 아일렛의 대조군과 상이하게, 0.5 내지 3.5의 높은 수준으로 나타난다. 한편, 각각의 실험군에 대한 흡광도는 뇌교 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후), 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 낮은 순서로 높은 것으로 나타난다. 특히, 동일한 파장에서의 뇌교 (투명화 후) 와 후뇌 (투명화 후) 의 흡광도는 약 1.5배의 차이를 보인다. Referring to FIG. 5B, the absorbances for the experimental group of the whole brain (after clearing), middle brain (after clearing), posterior brain (after clearing), hypothalamus (after clearing) and glial (after clearing) are 0 at 350 nm to 450 nm. Different from controls in empty wells and eyelets showing levels close to, high levels appear between 0.5 and 3.5. On the other hand, the absorbance for each experimental group appears to be high in the order of glial (after clearing), hypothalamus (after clearing), anterior brain (after clearing), midbrain (after clearing) and rear brain (after clearing). In particular, the absorbances of the pons (after clarification) and posterior brain (after clarification) at the same wavelength show a difference of about 1.5 times.
도 5c를 참조하면, 측정된 OD값에 대하여 백분율을 취하여 산출된 투명도가 도시된다. 보다 구체적으로, 빈 웰, 아일렛의 대조군에 대한 투명도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이때, 도 5b의 결과와 유사하게, 각각의 실험군에 대한 투명도는 뇌교 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후), 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 높은 것으로 나타난다. Referring to FIG. 5C, the transparency calculated by taking a percentage of the measured OD values is shown. More specifically, the transparency of empty wells and eyelets was found to be the highest. At this time, similar to the results of Figure 5b, the transparency for each experimental group was higher in the order of pons (post-transparence), hypothalamus (post-transparence), front brain (post-transparence), mid brain (post-transparence) and rear brain (post-transparence) Appears to be.
한편, 표적 조직에 대하여 측정된 흡광도는 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 조직보다 투명도가 낮을 수 있다. On the other hand, the absorbance measured for the target tissue may be inversely proportional to the transparency. For example, tissues with relatively high absorbance may have lower transparency than tissues with relatively low absorbance.
이와 같이, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 일 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 표적 조직 각각에 대한 흡광도 및 이에 따른 투명도를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다. As such, the plurality of target tissues that have been cleared by the organic solvent-based clearing technique, by measuring the absorbance and thus the transparency of each target tissue, according to the transparency analysis method according to an embodiment of the present invention, each target Differences in degree of clarity and clarity for tissues can be analyzed.
도 5d의 (a) 및 (b)를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시항하부 및 뇌교에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 야광 빛의 세기를 측정한 값이 도시된다. Referring to (a) and (b) of FIG. 5D, the measured values of the luminous light intensity according to the irradiated wavelength, which are measured for the punched front brain, middle brain, rear brain, lower section and pons, are shown.
보다 구체적으로, 본 분석은 도 5b 및 5c에서 전술한 방법과 동일한, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 실험군, 및 대조군이 준비되었다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직은 야광 빛의 세기 측정에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 야광 디스크만 들어가 있는 웰은, 야광 빛의 세기 측정에 있어서 대조군으로 설정되었다. More specifically, this assay prepared the experimental group and control group cleared according to the 1P-BABB technique, the same as the method described above in Figures 5b and 5c. More specifically, target tissues of the forebrain (after clearing), midbrain (after clearing), posterior brain (after clearing), hypothalamus (after clearing) and glial (after clearing) punched from cleared brain tissue according to the 1P-BABB technique. Was set as the experimental group in the measurement of the intensity of the luminous light. Furthermore, the well containing only a luminous disk was set as a control in measuring the intensity of luminous light.
야광 빛의 세기 측정은 96 웰 블랙 플레이트에서 수행되었으며, 실험군의 아일렛에 고정된 표적 조직이 들어갈 각각의 웰과 대조군의 야광 디스크만 들어갈 웰에는, 웰 사이즈에 알맞게 컷팅된 직경 6mm의 야광 디스크를 먼저 배치하였다. 그 다음, 일정한 시간 동안 웰 플레이트를 태양광 또는 형광등의 빛에 노출하였다. 다음으로, 야광 디스크가 배치된 웰 각각에 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직을 포함하는 아일렛을 배치한 후, Gel Doc+를 이용하여 30초 동안 암 조건에서 표적 조직을 투과하여 나타나는 야광 빛의 세기를 측정하였다. Luminous intensity measurements were performed on 96-well black plates, with each well containing only the target tissue immobilized in the eyelets of the experimental group and the well containing only the luminous disks of the control group. Placed. The well plates were then exposed to sunlight or fluorescent light for a period of time. Next, eyelets containing target tissues of the forebrain (after clearing), midbrain (after clearing), posterior brain (after clearing), hypothalamus (after clearing), and pontoon (after clearing) punched into each well in which the luminous disks are placed After placement, the gel Doc + was used to measure the luminous intensity of the light transmitted through the target tissue in the dark condition for 30 seconds.
도 5d의 (a)를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는 암조건에서 야광 빛이 각각의 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 이때, 실험군의 웰은 조직이 들어있지 않은 야광 디스크만 배치한 대조군 (표적 조직 (-)) 에 비하여 발하는 야광 빛의 세기는 약한 것으로 나타난다. Referring to (a) of FIG. 5D, cancer in the wells of the experimental group in which the target tissues of the entire brain (after the clearing), the middle brain (after the clearing), the rear brain (after the clearing), the hypothalamus (after the clearing), and the pons (after the clearing) are placed In the conditions luminous light appears to emanate through each target tissue. In this case, the intensity of the luminous light emitted from the wells of the experimental group was lower than that of the control group (target tissue (-)) in which only the luminous disk containing no tissues was placed.
한편, 각각의 실험군에서 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 시상하부 (투명화 후) 의 야광 빛은 후뇌 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 야광 빛보다 강하게 나타난다. On the other hand, the luminous light of the forebrain (after clearing), midbrain (after clearing) and hypothalamus (after clearing) in each experimental group is stronger than the luminous light of the back brain (after clearing) and pons (after clearing).
도 5d의 (b)를 참조하면, Gel Doc+의 소프트웨어에 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 실험군 각각의 웰에서 투과되는 빛의 세기와 동일한 측정 범위를 설정하고, 야광 빛의 세기를 비교하여 그래프화한 결과가 도시된다. 보다 구체적으로, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 의 야광 빛의 세기는 유사한 것으로 나타난다. 이와 대조적으로, 뇌교 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후) 는 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 보다 야광 빛의 세가 낮은 것으로 나타난다. 이때, 측정된 야광 빛의 세기가 큰 표적 조직은, 투명도가 높은 표적 조직이라는 것을 의미할 수 있다. Referring to (b) of FIG. 5D, the gel Doc + software was used in each well of the experimental group of the whole brain (after clearing), the middle brain (after clearing), the back brain (after clearing), the hypothalamus (after clearing), and the pontoon (after clearing). The result of graphing by setting the same measurement range as the intensity of the transmitted light and comparing the intensity of the luminous light is shown. More specifically, the luminous light intensity of the whole brain (after clearing), midbrain (after clearing) and hypothalamus (after clearing) appears to be similar. In contrast, the pons (after clearing), rear brain (after clearing) appear to have lower luminous light than the front brain (after clearing), midbrain (after clearing), and hypothalamus (after clearing). In this case, the measured target luminous light intensity may mean that the target tissue has high transparency.
이와 같이, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 다른 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 야광 디스크로부터 표적 조직을 포함하는 아일렛 각각에 대하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다. As such, the plurality of target tissues that are transparent by the organic solvent-based clearing technique, the intensity of the luminous light emitted from each of the eyelets containing the target tissue from the luminous disk, according to the transparency analysis method according to another embodiment of the present invention By measuring the difference in degree of clarity and clarity for each target tissue can be analyzed.
이상의 실시예 2의 결과로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직에 대하여 크기의 축소를 최소화 하여 투명도를 분석할 수 있는 다양한 방법을 제공할 수 있다. As a result of the above Example 2, the tissue transparency analysis method according to various embodiments of the present invention, provides a variety of methods for analyzing the transparency by minimizing the reduction of the size of the transparent tissue by the organic solvent-based transparency technique can do.
한편, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 투명도 분석 방법은, 투명화 기법에 따라 조직의 크기의 변화를 최소화 할 수 있는 새로운 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 다양한 투명화 기법에 따라 투명화된 조직에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다. On the other hand, the transparency analysis method according to various embodiments of the present invention, by providing a new transparency analysis method that can minimize the change in the size of the tissue according to the transparent technique, the standardized analysis of the transparent tissue according to the various transparent techniques There is an effect that can be performed.
특히, 본 발명은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된 조직의 투명도 분석 방법을 제공하여, 동일한 조직에 대하여 상이한 투명화 기법에 적용되더라도, 표준화된 투명도 분석이 가능할 수 있다. In particular, the present invention provides a method for analyzing the transparency of tissues configured to minimize the change in tissue size according to a hydrogel-based clearing technique, a water-soluble agent-based clearing technique, or an organic solvent-based clearing technique, the same tissue Although applied to different transparency techniques, standardized transparency analysis may be possible.
이에, 본 발명은 투명화된 조직에 대한 다양한 투명도 분석 방법 및 이에 대한 해석 방법을 제공함으로써, 해부학적 연구 등 다양한 구조적 연구에 기여할 수 있다. Accordingly, the present invention can contribute to various structural studies, such as anatomical studies, by providing a variety of transparency analysis methods and interpretation methods for the transparent tissue.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다. Each of the features of the various embodiments of the present invention may be combined or combined with each other in part or in whole, various technically interlocking and driving as can be understood by those skilled in the art, each of the embodiments may be implemented independently of each other It may be possible to carry out together in an association.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention. . Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention but to describe the present invention, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive. The protection scope of the present invention should be interpreted by the following claims, and all technical ideas within the equivalent scope should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
S110: 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계
S120: 조직을 절단하는 단계
S130: 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계
112: 투명화 대상 조직
114: 투명화된 조직
114 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
114 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
122: 웰 플레이트
124: 웰
126 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
126 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
128, 129: 펀치
129 (a): 펀치의 고정부
129 (b): 펀치의 절단 필러
S210: 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계
S220: 조직을 절단하는 단계
S230: 야광 디스크를 획득하는 단계
S240: 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계
S250: 획득된 표적 조직을 배치하는 단계
S260: 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계
232: 야광 디스크S110: performing a process for transparency
S120: cutting tissue
S130: measuring absorbance or transparency to the target tissue
112: Organization to be transparent
114: Invisible Organization
114 (a): Tissues cleared by hydrogel-based or water-soluble formulation-based clearing techniques
114 (b): Tissues cleared by organic solvent-based clearing techniques
122: well plate
124: Well
126 (a): Target tissue cleared by hydrogel-based or water-soluble agent-based clearing techniques
126 (b): Target tissue cleared by organic solvent based clearing technique
128, 129: Punch
129 (a): fixing part of the punch
129 (b): Cutting filler for punch
S210: performing a process to be transparent
S220: cutting tissue
S230: obtaining a luminous disk
S240: step of transmitting light to the luminous disk
S250: deploying the obtained target tissue
S260: step to measure the intensity of the luminous light
232: luminous disk
Claims (15)
투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 절단하는 단계, 및
광학 리더기를 이용하여, 획득된 상기 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 투명화 기법은 하이드로겔 (hydrogel) 기반의 투명화 기법 또는 수용성 제제 (souluble detergents) 기반의 투명화 기법이고,
상기 광학 리더기는 웰 플레이트 (well plate) 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 펀칭하는 단계 이후에 수행되는, 상기 웰의 내부에 상기 표적 조직을 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.Performing a process to transparentize the tissue with a transparency technique;
Cutting the tissue to include a portion of the tissue that has become clear and to obtain a target tissue having a predetermined size, and
Using an optical reader, measuring absorbance or transparency for the target tissue obtained,
The transparent technique is a hydrogel-based transparent technique or a water-soluble detergents based transparent technique,
The optical reader is configured to irradiate each well in a well plate to measure absorbance or transparency for each well,
Cutting the tissue,
Punching the tissue to obtain a target tissue having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well,
Placing the target tissue inside the well, which is performed after the punching step.
상기 하이드로겔 기반의 투명화 기법은,
CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), PACT (passive clarity technique), ACT (active clarity technique) 및 SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals) 중 적어도 하나이고,
상기 수용성 제제 기반의 투명화 기법은,
seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2 및 ScaleS 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 2,
The hydrogel-based transparency technique,
At least one of CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), PACT (passive clarity technique), ACT (active clarity technique) and SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals)
The water-soluble formulation-based transparency technique,
A method for measuring tissue transparency, which is at least one of seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2, and ScaleS.
투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 절단하는 단계, 및
광학 리더기를 이용하여, 획득된 상기 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 투명화 기법은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 포함하고,
상기 광학 리더기는 웰 플레이트 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 상기 웰에 고정되도록 구성된 고정부, 및 상기 고정부의 내부에 위치하고 상기 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러 (pillar) 를 포함하는 펀치를 이용하여, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 펀칭하는 단계 이후에 수행되는, 상기 절단 필러 내부에 상기 표적 조직이 고정된 상기 펀치를, 상기 웰의 내부에 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.Performing a process to transparentize the tissue with a transparency technique;
Cutting the tissue to include a portion of the tissue that has become clear and to obtain a target tissue having a predetermined size, and
Using an optical reader, measuring absorbance or transparency for the target tissue obtained,
The clearing technique includes an organic solvent-based clearing technique,
The optical reader is configured to irradiate each well in the well plate to measure absorbance or transparency for each well,
Cutting the tissue,
A fixing part configured to be fixed to the well and having a first diameter having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well, and having a hole of a second diameter located inside the fixing part and smaller than the first diameter; Punching the tissue using a punch comprising a cutting pillar configured to obtain a target tissue having the second diameter,
And disposing the punch in which the target tissue is fixed inside the cutting filler, inside the well, which is performed after the punching step.
상기 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계는,
서로 상이한 복수의 투명화 기법으로 복수개의 조직 각각에 대한 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계를 포함하고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 복수의 투명화 기법에 의해 획득한 투명화된 상기 조직 각각에 대한 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직 각각을 절단하는 단계를 포함하고,
상기 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계는,
상기 복수의 투명화 기법에 따른 표적 조직 각각에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. The method according to claim 2 or 4,
The performing of the process for the transparentization,
Performing a process for transparency of each of the plurality of tissues with a plurality of different transparency techniques,
Cutting the tissue,
Cutting each of the tissues to obtain a target tissue for each of the cleared tissues obtained by the plurality of clearing techniques,
Measuring the absorbance or transparency,
Measuring absorbance or transparency for each of the target tissues according to the plurality of clearing techniques.
상기 유기 용매 기반의 투명화 기법은,
3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs), iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs) 및 BABB (benzyl alcohol-benzyl benzoate) 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 4, wherein
The organic solvent-based clarification technique,
A method for measuring transparency of a tissue, which is at least one of 3DIS imaging of solvent-cleared organs (3DISCO), immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs (iDISCO) and benzyl alcohol-benzyl benzoate (BABB).
상기 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계는,
상기 광학 리더기를 이용하여 550 nm 내지 650 nm의 파장에서 상기 표적 조직에 대하여 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.The method according to claim 2 or 4,
Measuring the absorbance or transparency,
Measuring absorbance or transparency of the target tissue at a wavelength of 550 nm to 650 nm using the optical reader.
상기 표적 조직의 직경은 3.0mm 내지 6.0mm인, 조직의 투명도 측정 방법.The method according to claim 2 or 4,
The diameter of the target tissue is 3.0mm to 6.0mm, how to measure the transparency of the tissue.
상기 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계는,
사상 단면 (sagittal section) 을 갖도록, 상기 조직을 절단하는 단계, 및
사상 단면을 갖는 상기 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.The method according to claim 2 or 4,
The performing of the process for the transparentization,
Cutting the tissue to have a sagittal section, and
A method of measuring transparency of a tissue, comprising performing a process to transparentize the tissue having a filamentary cross section.
투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 절단하는 단계;
미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득하는 단계;
상기 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계;
빛이 투과된 상기 야광 디스크에, 획득된 상기 표적 조직을 배치하는 단계, 및
젤 이미징 (gel imaging) 분석 장비를 이용하여, 상기 야광 디스크로부터 상기 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. Performing a process to transparentize the tissue with a transparency technique;
Cutting the tissue to obtain a target tissue having a predetermined size, wherein the tissue comprises a portion of the tissue that has become cleared;
Obtaining a luminous disk having a predetermined size;
Transmitting light through the luminous disk;
Placing the obtained target tissue on the luminous disk through which light is transmitted, and
And measuring the intensity of the luminous light emitted from the luminous disk through the target tissue using a gel imaging analysis device.
상기 야광 빛의 세기를 측정하는 단계는,
암막 상태에서 발현하는 야광 디스크의 노출 시간에 따른, 상기 표적 조직을 투과하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 10,
Measuring the intensity of the luminous light,
And measuring the intensity of the luminous light passing through the target tissue according to the exposure time of the luminous disk expressing in the blackout state.
상기 투명화 기법은 하이드로겔 기반의 투명화 기법 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법이고,
상기 젤 이미징 분석 장비는 웰 플레이트 내의 각각의 웰로부터 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 펀치하는 단계를 포함하고,
상기 야광 디스크는, 상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖고,
상기 배치하는 단계는,
상기 웰의 내부에 상기 야광 디스크 및 상기 표적 조직을 순차적으로 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 10,
The clearing technique is a hydrogel-based transparent technique or a water-soluble formulation-based transparent technique,
The gel imaging analysis equipment is configured to measure the intensity of the luminous light emitted from each well in the well plate,
Cutting the tissue,
Punching the tissue to obtain a target tissue having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well,
The luminous disk has a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well,
The disposing step,
And sequentially placing the luminous disk and the target tissue in the well.
상기 하이드로겔 기반의 투명화 기법은,
CLARITY, PACT, ACT 및 SWITCH 중 적어도 하나이고,
상기 수용성 제제 기반의 투명화 기법은,
seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2 및 ScaleS 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 12,
The hydrogel-based transparency technique,
At least one of CLARITY, PACT, ACT, and SWITCH,
The water-soluble formulation-based transparency technique,
A method for measuring transparency in an organization, which is at least one of seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, and ScaleS.
상기 투명화 기법은 유기 용매 기반의 투명화 기법이고,
상기 젤 이미징 분석 장비는 웰 플레이트 내의 각각의 웰로부터 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 상기 웰에 고정되도록 구성된 고정부, 및 상기 고정부의 내부에 위치하고 상기 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러를 포함하는 펀치를 이용하여, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 야광 디스크는, 상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖고,
상기 배치하는 단계는,
상기 웰의 내부에 상기 야광 디스크 및, 상기 절단 필러 내부에 상기 표적 조직이 고정된 상기 펀치를 상기 웰의 내부에 순차적으로 배치하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 10,
The clearing technique is an organic solvent-based clearing technique,
The gel imaging analysis equipment is configured to measure the intensity of the luminous light emitted from each well in the well plate,
Cutting the tissue,
A fixing part configured to be fixed to the well and having a first diameter having a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well, and having a hole of a second diameter located inside the fixing part and smaller than the first diameter; Punching said tissue using a punch comprising a cutting filler configured to obtain a target tissue having said second diameter,
The luminous disk has a size of 0.8 to 1 times the diameter of the well,
The disposing step,
And sequentially placing the luminous disk in the well and the punch in which the target tissue is fixed inside the cutting filler in the well.
상기 유기 용매 기반의 투명화 기법은,
3DISCO, iDISCO 및 BABB 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 측정 방법.The method of claim 14,
The organic solvent-based clarification technique,
A method of measuring transparency of a tissue, wherein at least one of 3DISCO, iDISCO, and BABB.
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