KR102048137B1 - 알츠하이머 질환 치료시 PI4KIIIα 단백질 및 관련 막 단백질 컴플렉스의 적용 - Google Patents

알츠하이머 질환 치료시 PI4KIIIα 단백질 및 관련 막 단백질 컴플렉스의 적용 Download PDF

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RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 TTC7 단백질과 상호작용하는 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 또는 PI4KIIIα 효소 단백질을 하향 조절하는 유전학적 방법의 사용, 또는 PI4KIIIα 단백질 키나제 활성을 억제하기 위한 약물의 사용은 과실 파리 AD 모델에서 뉴런 내 Aβ42의 축적 및 연령-의존적 연령 의존적 시냅스 전달 실패 및 다른 장애를 감소시키며, AD 모델 마우스의 학습 및 기억 능력을 개선시키는 효과를 나타낸다. 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제, TTC7 억제제 및 PI4KIIIα 억제제를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 신경 세포에 의한 Aβ 분비가 촉진되는지 여부에 따라 알츠하이머 질환을 치료하는 약물을 스크리닝하는 방법이 제공된다.

Description

알츠하이머 질환 치료시 PI4KIIIα 단백질 및 관련 막 단백질 컴플렉스의 적용
투자 지원 연구에 대한 진술
본 발명은 지금까지 중국의 과학기술부의 973개 프로그램 (승인 번호 2013CB530900 및 2011CBA00408), 국가 자연과학 재단 (승인 번호 81371400, 81071026 및 81571101), 및 상하이 기초 주요 프로그램 (승인 번호 06dj14010)에 의해 지원되었다.
기술 분야
본 발명은 의약 분야에 속하고, 구체적으로 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 관련 억제제를 사용한, PI4KIIIα 키나제, 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 TTC7 단백질과 함께 형성된 이의 막 단백질 복합체의 하향조절을 위한 방법에 관한 것이다. 또 다른 양상에서，본 발명은 세포로부터의 Aβ 분비가 촉진되는지 촉진되지 않는지의 여부에 따라 알츠하이머 질환의 치료를 위한 의약 및 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(AD)은 노인들에서 가장 통상적인 신경퇴행성 질환이고, 학습 및 기억 능력의 진행성 상실을 특징으로 한다. 시냅스 기능부전 및 상실은 AD의 조기 단계에서 일어나고 이는 Aβ (특히 Aβ42)의 축적이 중요한 역할을 하는 AD에서 학습 및 기억 기능부전의 주요 세포 기작으로서 광범위하게 인지된다. Aβ 생산을 억제하고 Aβ 제거를 증진시키도록 의도된 화합물 또는 분자에 대한 다양한 임상적 시험이 수행되었지만, 아직까지 학습 및 기억을 개선시킬 수 있거나 학습 및 기억의 기능부전의 추가의 악화를 예방할 수 있는 화합물 또는 분자는 밝혀지지 않았다. 한가지 가능한 설명은 이들의 의약 또는 치료 방법이 AD의 학습 및 기억 기능부전을 유발하는 주요 병리학을 변화시키는데 실패했다는 것이다. AD에서 Aβ 축적의 모든 양상에서 보다 깊은 이해가 요구된다.
Aβ는 세포외 공간에 축적될 뿐만 아니라 뉴런에 축적한다. 증가하는 증거는 Aβ가 뉴런에서 다양한 세포내 기관 내에서 축적되고 시냅스 결핍, 아밀로이드 플라크 형성, 뉴런 사멸 등과 같은 AD 병리학 변화에 관여함을 시사한다. 추가로, 시냅스 및 인지 기능에 대해 가장 해로운 효과인 것으로 사료되는 올리고머성 Aβ는 세포내 형성되고 AD 환자 및 APP 유전자전이 마우스의 뇌 뉴런 또는 세포막에 축적된다. 상기 막-연합된 Aβ는 뉴런의 세포막 또는 세포내 기관의 막에 거주할 수 있다. 뉴런성 Aβ 축적, 예를 들어, 세포외 Aβ의 내포작용, 세포내 생성된 Aβ의 감소된 분비에 의해 유발된 보유, 자가소화포에서 Aβ 생성 및 축적, 및 세포내 Aβ 분해의 감소를 유도할 수 있는 특정 가능성이 있다.
Aβ가 세포내 및 세포외 둘다에서 축적하지만, AD 환자 또는 조기 단계의 AD 환자의 뇌척수액(CSF)에서 Aβ42 농도는 대조군 집단의 약 절반으로 감소한다. AD 모델 마우스에서, 뇌척수액 및 뇌 간질액(ISF) 중 Aβ42 농도는 연령-의존적 감소를 보여주고, Aβ 이량체는 ISF에서 검출가능하지 않다. CSF에서 Aβ42 농도의 감소는 세포외 아밀로이드 플라크의 격리 효과, Aβ42 분비의 감소, 및 뉴런 또는 뇌 세포 막에서 Aβ42 축적에 의해 능히 유발되는 것으로 추정된다.
연구는 인지질 및 이의 대사 효소가 Aβ와의 상호작용을 통해 또는 다음을 포함하는 다양한 세포 및 분자 공정을 거치는 AD-관련 변화에서의 참여를 통해 AD 병리학에 기여할 수 있음을 입증하였다: 1) Aβ42는 지질막으로 삽입되고 산성 인지질에 결합하고 이는 이어서 Aβ42에서 무작위 코일의 β-구조물로의 전환을 유도하여 막에서 또는 막상에 Aβ42 응집을 유발하고; 2) 외형질막(plasmalemma)의 포스파티딜이노시톨-4,5-포스페이트 (PIP2) 수준은 배양된 세포로부터 Aβ42 분비와 역으로 서로 관련되고; 3) Aβ42-발현은 파리에서 뉴런 기능부전 및 학습 및 기억 기능부전을 유도하고 이는 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)의 억제에 의해 구제될 수 있고; 4) 포스파티딜이노시톨 4-키나제 (PI4KIIIα)의 생성물인 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 (PI4P)가 AD 환자의 대뇌 피질에서 상당히 증가하고 상기 증가된 수준이 AD 환자에서 인지 장애의 정도와 밀접하게 관련되어 있다는 최근 발견 (문헌참조: Zhu, L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2015).
드로소필라 (Drosophila)에서, 롤링 블랙아웃 (rbo) 유전자는 디아실글리세롤 리아제와 특정 상동성을 갖는 세포질 막 단백질 RBO를 암호화한다. RBO 단백질은 드로소필라에서 인지질 대사, 광변조, 시냅스 전달 및 벌크 내포작용 기능을 한다. RBO 단백질은 효소에서 인간에 이르기까지 보존적이다. 효모 (EFR3) 및 마우스 (EFR3A 및 EFR3B)에서 RBO의 상동성은 세포막 상에서 포스파티딜이노시톨 4-키나제 IIIα (PI4KIIIα) 및 스캐폴드 단백질 (테트라트리코펩타이드 반복 도메인 7, TTC7로 언급됨, 문헌참조: Baird D, Stefan C, et al., 2008, J Cell Biol; Nakatsu F, Baskin JF, et al., 2012, J Cell Biol)과 복합체를 형성하여 세포막 상에 PI4KIIIα를 부착시키고 추가로 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트 (PI4P) 및 PIP2의 외형질막 수준을 조절한다.
드로소필라에서, 분비 시그날 펩타이드에 융합된 범-뉴런 발현된 Aβ42는 뉴런내 Aβ 축적 및 신경 결손을 유도한다. 본원 발명자는 이전에 단순한 신경 경로, 드로소필라 자이언트 섬유 (GF) 경로에서 분비 시그날 펩타이드를 함유하는 Aβ42의 발현이 뉴런내 Aβ 축적 및 연령-의존적 시냅스 부전증 및 운동 능력 결손을 유발함을 보여주었다. Aβ42를 발현하는 상기 드로소필라는 뉴런내 Aβ42 축적 및 연합된 시냅스 결손에서 후보 유전자의 역할을 시험하기 위해 간편한 플랫폼을 제공한다. 이를 숙지한 본원 발명자는 상기 모델에서 신경퇴행성 질환에 대한 통상의 PI4KIIIα 단백질 억제제 뿐만 아니라 유전자 rbo, PI4KIIIα, 및 ttc7의 돌연변이 또는 과발현의 효과를 시험하였다. 본원 발명자는 추가로 APP/PS1 유전자전이 마우스에서 해마 뉴런의 위축증에 대한 Efr3a (rbo 유전자의 마우스 동족체) 녹다운의 효과, 및 학습 및 기억에 대한 PI4KIIIα의 흔히 사용되는 억제제인 소분자 억제제 페닐아르신 옥사이드 (PAO)의 효과, CSF 및 뇌 실질 막에서 Aβ42의 수준, 및 학습 및 기억에 대한 PI4KA 유전자 (PI4KIIIα 단백질을 암호화하는) 하향조절의 효과, 및 리포좀에서 Aβ42의 올리고성 형성에 대한 PI4KIIIα 생성물 PI4P의 효과를 조사하였다.
본 발명은 PI4KIIIα 단백질, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 및 이의 막 단백질 복합체의 양 또는 유전학적 수단 또는 관련 억제제를 사용한 관련 효소의 활성의 하향조절은 뉴런 세포의 Aβ (특히 Aβ42) 분비를 촉진시킬 수 있고 상응하게는 뉴런내 Aβ 축적을 감소시켜 드로소필라 및 마우스 AD 모델에서 신경 결손을 완화시키는 것(ameliorate)을 기재한다. 따라서, 본 발명은 AD 치료에서 뉴런 Aβ42 분비의 필수 역할을 밝히고, AD를 치료하기 위한 신규 전략을 제공하는 한편; 본 발명은 AD를 치료하기 위한 신규 의약을 제공하고 추가로 AD를 치료하기 위한 의약 및 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 새로운 방향을 추가로 지적한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 AD를 치료하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구현예에 따라, 본 발명은 항-PI4KIIIα 항체, PI4KIIIα에 특이적인 억제 뉴클레오타이드 또는 PI4KIIIα에 특이적인 소분자 화합물 억제제일 수 있는 PI4KIIIα 억제제를 사용함에 의해 AD를 치료하기 위한 방법을 기재하고 있다. 바람직하게, PI4KIIIα에 대한 특이적 억제 뉴클레오타이드는 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열일 수 있고; 상기 PI4KIIIα 억제제는 하기의 소분자 화합물 억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다: PAO, PAO의 유도체, G1, A1의 유사체, G1 또는 A1.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 본 발명은 또한 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제를 사용함에 의해 AD를 치료하기 위한 방법을 기재하고 있다. RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제는 항-RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 항체일 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 본 발명은 또한 PI4P 억제제를 사용함에 의해 AD를 치료하기 위한 방법을 기재하고 있다. PI4P 억제제는 항-PI4P 항체, OSH2-PH2X 융합 단백질 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 PI4KIIIα 억제제, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제, 및 PI4P 억제제 중 하나 이상, 및 임의로 약제학적 담체를 포함하는 AD를 치료하기 위해 사용될 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 추가로 하나 이상의 항-Aβ 항체 및/또는 세포외 Aβ 플라크 또는 해양 올리고사카라이드 탄수화물 HSH971 및 이의 유사체, 아캄프로세이트(acamprosate) 및 이의 유사체 및 에다라본(edaravone) 및 이의 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 침착물(deposit)을 스캐빈징하거나 제거할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명은 또한 AD를 치료하기 위해 약물을 어떻게 스크리닝할지에 대한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구현예에 따라, 본 발명은 PI4KIIIα 단백질의 키나제 활성을 표적화하는 AD 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고 있고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: PI4KIIIα의 포스포키나제 활성에 대한 후보 약물의 효과를 관찰하여, 상기 후보 약물이 PI4KIIIα의 포스포키나제 활성을 억제할 수 있는 경우, 상기 후보 약물이 AD의 질환에 대한 잠재적 약물임을 지적하는 것인 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 본 발명은 또한 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 및 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용을 표적화함에 의해 AD-표적화된 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 상호작용에 대한 후보 약물의 효과를 관찰하여 상기 후보 약물이 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 상호작용을 억제하여, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B-TTC7-PI4KIIIα 단백질 복합체의 형성을 감소시킬 수 있는 경우, 상기 후보 약물이 AD의 치료를 위한 잠재적 약물임을 지적하는 것인 단계.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에 따라, 본 발명은 또한 세포막 상의 PI4P의 수준을 표적화하는 AD 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 세포막 상의 PI4P의 수준에 대해 효과를 갖는지의 여부에 대해 후보 약물을 관찰하여, 상기 후보 약물이 세포막 상의 PI4P 수준을 감소시킬 수 있는 경우, 이것은 상기 후보 약물이 AD를 치료하기 위한 잠재적 약물임을 지적하는 것인 단계.
도 1. rbo 유전자 돌연변이는 Aβarc-발현 파리에서 신경 결손을 완화시키고, PI4KIIIα 단백질 발현 수준을 감소시키거나 PI4KIIIα 단백질과 RBO 단백질의 상호작용을 약화시킨다.
도 2. PI4KIIIα 단백질 발현 수준의 하향조절 또는 약제학적 억제는 Aβarc-발현 파리에서 신경 결손을 완화시킨다.
도 3. RBO/PI4KIIIα 단백질 발현 수준 또는 기능의 하향조절은 뉴런내 Aβ 축적을 감소시킨다.
도 4. RBO/PI4KIIIα 단백질 발현 수준 또는 기능의 하향조절은 Aβ42 분비를 촉진시킨다.
도 5. APP/PS1 마우스 및 대조군 마우스에서 해마 CA3 및 DG 단편에서 뉴런의 수지상 직경 및 척추 밀도에 대한 Efr3a 유전자 녹다운의 효과.
도 6. APP/PS1 마우스 및 대조군 마우스에서 학습 및 기억, CSF- 및 뇌막-관련 Aβ42 수준에 대한 PA0 치료 효과.
도 7. rbo 유전자 돌연변이는 Aβ42-발현 파리에서 신경 결손을 완화시킨다.
도 8. 각각 Aβarc 또는 드로소필라 타우 (Tau)를 과발현하는 파리의 운동 능력 및 수명에 대한 rbo 및 shibire 유전자 돌연변이의 효과.
도 9. Aβarc-발현 파리에서 rbo S358A 및 itpr SV35 유전자 돌연변이의 효과.
도 10. N2a 세포의 세포외 Aβ의 내포작용에 대한 Efr3a 유전자 녹다운의 효과, 및 Aβarc-발현 파리에서 Aβarc 전사에 대한 rbo 및 PI4KA 유전자 돌연변이의 효과.
도 11. 마우스의 HEK293 세포 또는 1차 해마 뉴런에서 Efr3a 또는 PI4KA 유전자 녹다운의 효율.
도 12. APP/PS1 마우스의 PI4KA 유전자의 하나의 카피로의 트랜스포존 삽입은 학습 및 기억 결함을 상당히 완화시킨다.
도 13. PI4P는 리포좀에서 Aβ42의 올리고머화를 촉진시킨다.
도 14. APP 발현 수준 및 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성에 대한 PAO의 효과.
도 15. Aβarc-발현 파리에서 신경 결손에 대한 ttc7 유전자 돌연변이 및 과발현의 효과.
도 16. APP로 안정하게 형질감염된 HEK293T로부터의 Aβ42 분비에 대한 PAO의 촉진 효과의 농도 의존성.
도 17. PAO와 인간 PI4KIIIα의 효소 활성 센터의 결합에 대한 구조적 시뮬레이션.
도 18. 보다 많은 월령 (month-age)에서 APP/PS1 마우스에서 인지 결함에 대한 PAO의 치료 효과.
도 19. PI4KIIIα 발현 수준의 하향조절 및 PAO에 의한 PI4KIIIα 효소 활성의 억제 둘다는 마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 손상을 상당히 완화시킨다.
달리 특정되지 않는 경우 상세한 설명 및 청구항을 포함하는 본 발명에서, 하기의 용어는 하기의 의미와 함께 사용된다:
본원에 사용된 용어 "rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자"는 드로소필라로부터 기원하는 rbo 유전자, 효모로부터 기원하는 Efr3 유전자, 또는 포유동물로부터 기원하는 Efr3a 유전자 및 Efr3b 유전자를 언급하고; 본원에 사용된 용어 "RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질"은 드로소필라로부터 기원하는 rbo 유전자, 효모로부터 기원하는 Efr3 유전자, 또는 포유동물로부터 기원하는 Efr3a/Efr3b 유전자에 의해 암호화된 단백질을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "PI4KIIIα/PI4KA 유전자"는 드로소필라 또는 포유동물로부터 기원하는 PI4KIIIα 유전자 또는 PI4KA 유전자를 언급하고; 본원에 사용된 바와 같은 용어 "PI4KIIIα 단백질"은 드로소필라 또는 포유동물에서 PI4KIIIα/PI4KA 유전자에 의해 암호화된 단백질을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "ttc7 유전자"는 드로소필라 및 포유동물로부터 기원하는 ttc7 유전자를 언급하고; 본원에 사용된 용어 "TTC7 단백질"은 상기 언급된 드로소필라 및 포유동물에서 ttc7에 의해 암호화된 단백질을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "억제제"는 표적 물체의 양, 특정 기능 및 특정 성질을 저하시키거나, 감소시키거나, 제거할 수 있는 물질을 언급한다. 상기 표적 물체는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산 등 일수 있고, 상기 억제제는 직간접적으로 표적 물체의 양, 특정 기능 및 특정 성질에 영향을 미쳐 표적 물체의 양, 특정 기능 및 특정 성질의 상응하는 저하, 감소 또는 제거를 유도한다. 상기 억제제는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 소분자 화합물 등일 수 있다.
예를 들어, 본원에 사용된 용어 "PI4KIIIα 억제제"는 PI4KIIIα/PI4KA 유전자의 발현, 전사, 해독 및/또는 이로부터 생산된 PI4KIIIα 단백질의 안정성, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 TTC7 단백질로의 결합 능력 및 이의 포스포키나제 활성 등을 저하시키거나, 감소시키거나, 제거할 수 있는 물질을 언급하고, 이는 PI4KIIIα/PI4KA에 특이적인 억제 뉴클레오타이드, PI4KIIIα 단백질에 대한 항체, PI4KIIIα 키나제 활성을 억제할 수 있는 소분자 화합물 억제제, 및/또는 PI4KIIIα 단백질과 다른 막 단백질과의 상호작용 등을 억제할 수 있는 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 본원에 사용된 용어 "RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제"는 rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자의 발현, 전사, 해독 및/또는 이로부터 생성된 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질의 안정성, 및 PI4KIIIα 단백질의 결합 능력 등을 억제하거나, 저하시키거나 제거할 수 있는 물질을 언급하고, 이것은 rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b에 특이적인 억제 뉴클레오타이드, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질에 대한 항체, 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 복합체의 형성을 억제할 수 있는 물질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "TTC7 억제제"는 ttc7 유전자의 발현, 전사, 해독, 및/또는 이로부터 생성된 TTC7 단백질의 안정성 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질로의 결합 능력 등을 저하시키거나, 감소시키거나, 제거할 수 있는 물질을 언급하고, 이는 ttc7에 특이적인 억제 뉴클레오타이드, TTC7 단백질에 대한 항체 및/또는 TTC7 단백질과 막 단백질 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 간의 상호작용을 억제할 수 있는 물질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기와 동일하게, 본원에 사용된 용어 "PI4P 억제제"는 세포막 상의 PI4P의 정량 수준을 억제하거나, 저하시키거나 제거할 수 있는 물질을 언급하고, 이는 PI4P에 대한 항체, 및 PI4P에 특이적으로 결합할 수 있는 OSH2-PH2X 융합 단백질 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 특이적 에피토프에 결합하는 임의의 면역글로불린 또는 완전한 분자 및 이의 단편을 언급한다. 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일쇄 항체, 및 단편 또는 일부가 모 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 한 온전한 항체의 단편 및/또는 일부를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 예를 들어, "PI4KIIIα에 대한 항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체 및 PI4KIIIα 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 기능성 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 이의 면역학적 활성 단편 또는 일부를 언급한다. 본 발명에서, "PI4KIIIα 항체", "PI4KIIIα에 대한 항체", 및 "항-PI4KIIIα 항체"와 같은 용어는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서, "기능성 변이체"는 이의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드를 언급한다. 상기 변형은 "보존적" 변형 (여기서, 상기 치환된 아미노산은 유사한 구조 또는 화학적 성질을 갖는다) 또는 "비-보존적" 변형일 수 있고; 유사한 변형은 또한 아미노산의 첨가 또는 결실, 또는 둘다를 포함한다. 그러나, 아미노산 잔기의 변형 또는 아미노산의 첨가 또는 결실은 실질적으로 본래의 아미노산 서열의 생물학적 또는 면역학적 활성 및 기능을 변화시키거나 손상시키지 않는다. 본 발명에서, 유사하게, "기능성 단편"은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 일부를 언급하고, 이는 이의 일부 (모 단백질 또는 폴리펩타이드)인 단백질 또는 폴리펩타이드의 실질적으로 유사하거나 동일한 생물학적 또는 면역학적 활성 및 기능을 보유한다.
본원에 사용된 용어 "억제 뉴클레오타이드"는 특이적 유전자에 결합할 수 있고 이의 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오타이드 화합물을 언급한다. 전형적 억제 뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 3중 나선 DNA, RNA 압타머, 리보자임, 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 마이크로RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 뉴클레오타이드 화합물은 다른 뉴클레오타이드 서열 보다 높은 친화성으로 상기 특이적 유전자에 결합하여 상기 특이적 유전자의 발현을 억제한다.
본원에 사용된 용어 "소분자 화합물"은 천연적일 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있는 3k 돌턴 미만의 분자량을 갖는 유기 화합물을 언급한다. 본원에 사용된 용어 "유도체"는 하나 이상의 화학적 반응을 통해 모 유기 화합물을 변형시킴에 의해 생성된 화합물을 언급하고, 이는 모 유기 화합물과 유사한 구조 및 이들의 기능에서 유사한 효과를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "유사체"는 모 유기 화합물을 화학적으로 변형시킴에 의해 생성되지 않지만 구조에서 모 유기 화합물과 유사하고 이들의 기능에서 유사한 효과를 갖는 화합물을 언급한다.
본원에 사용된 용어 "알츠하이머 질환" (AD)은 점진적 학습 및 기억 기능부전을 특징으로 하는 연령-관련 신경퇴행성 질환을 언급한다. 중간 및 진보된 단계에서 대부분의 AD 환자들은 뉴런 세포외 베타 아밀로이드 플라크, 타우 단백질로 형성된 세포내 신경섬유매듭 또는 시냅스 및 신경 세포의 상실을 갖는다. 상기 질환은 인간 또는 개와 같은 동물에서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Aβ"는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 세크레타제 절단에 의해 생성된 38 내지 48개 아미노산의 길이를 갖는 일련의 폴리펩타이드를 언급하고, 이는 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ44, Aβ45 등을 포함한다. 본 발명에서, Aβ는 또한 유전자전이 방법, 또는 특정 발현 시스템을 통해 세포를 바이러스 벡터로 감염시킴에 의해 발현된 Aβ 융합 단백질의 다른 단백질 절단 효소의 절단에 의해 생성될 수 있고, 예를 들어, 이의 N-말단을 통한 Aβ는 드로소필라 괴사 유전자에 의해 암호화된 단백질로부터 기원하는 분비 시그날 펩타이드 (아미노산 서열: MASKVSILLLLTVHLLAAQTFAQDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) (서열번호 1) 또는 래트 프레-프로엔케팔린으로부터 기원하는 분비 시그날 펩타이드 (아미노산 서열: MAQFLRLCIWLLALGSCLLATVQA) (서열번호 2) 등과의 융합 단백질을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Aβ 분비"는 세포내 또는 세포막을 통한 세포막 상에 생성된 Aβ의 방출 과정을 언급하고 이는 세포내 Aβ 축적을 감소시킬 수 있다. 여기서, "Aβ42 분비"는 구체적으로 세포내 또는 세포막을 통한 세포막 상에 생성된 Aβ42의 방출 과정을 언급하고, 이것은 세포내 Aβ42 축적을 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 표적"은 동물 또는 인간 신체에서 특정 질환 및 물질의 표적을 치료하기 위해 사용될 수 있는 다양한 물질을 언급한다. 상기 질환에 대한 치료 효과는 상기 물질이 상기 표적에 작용하는 경우 수득될 수 있다. 상기 물질은 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 소분자 화합물과 같은 다양한 물질일 수 있고, 상기 표적은, 물질이 유전자, 단백질, 단백질 복합체 또는 특징, 기능, 질환을 치료하기 위한 이의 상호작용 관계에 영향을 미칠 수 있는 한, 특정 유전자 (유전자의 특이적 서열을 포함하는), 특정 단백질 (단백질의 특정 부위를 포함하는), 특정 단백질 복합체 (이의 특이적 결합 부위를 포함하는)와 같은 물질, 또는 특정 특징, 특정 기능, 상기한 유전자 및/또는 단백질의 주변 물질 및 환경과의 특정 상호작용 관계 등일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 상기 용어가 적용되는 질환 또는 상기 질환의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 억제함을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, 환자의 병태에 의존하여 상기 용어는 또한 질환의 예방을 포함하고 이는 질환의 예방 또는 이와 관련된 임의의 증상의 개시를 예방하고 증상을 완화시키거나 이의 개시 전 임의의 병태의 중증도를 감소시킴을 포함한다.
용어 "억제하다", "약화시키다", "하향조절하다", "제거하다" 등 모두는 양 또는 정도의 축소 또는 감소를 언급한다. 상기 축소 또는 감소는 이것이 상기 경향을 나타내는 한 임의의 정도로 제한되지 않는다. 예를 들어, 축소 또는 감소는 본래의 양 또는 정도와 비교하여 100 %일 수 있거나 50 % 또는 심지어 1 % 이하일 수 있다.
본 발명은 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 또는 PI4KIIIα 단백질의 발현을 하향조절하고, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 및 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용을 약화시키고, PI4KIIIα의 효소 활성을 억제하는 것과 같은 다양한 작용이 시냅스 결손 및 Aβ42를 발현하는 신경 세포의 손실과 같은 연령-관련 기능부전을 개선시킬 수 있음을 밝히고 이들 효과는 뉴런 세포의 Aβ (특히 Aβ42) 분비를 촉진시키고 뉴런 세포막 상에 또는 세포에서 Aβ (특히 Aβ42) 축적을 감소시킴에 의해 성취됨을 기재한다.
본 발명에서, 예를 들어, 본 발명자는 Efr3a 유전자 녹다운이 APP/PS1 유전자전이 마우스에서 해마 뉴런의 수지상 세포 및 척추의 위축증을 감소시킬 수 있고 PI4KIIIα 단백질의 통상의 억제제인 페닐아르신 옥사이드 (PAO)를 사용한 위관영양법은 APP/PS1 마우스의 학습 및 기억을 상당히 완화시킬 수 있고, 뇌 조직에서 외형질막 결합된 Aβ42 (특히, Aβ42 응집물/올리고머에서 Aβ42)의 내용물을 감소시킬 수 있음을 발견하였지만 상기 과정은 뇌척수액에서 Aβ42 내용물의 증가를 수반할 수 있다. 이들 결과는 APP/PS1 마우스의 치매 증상이 Aβ42의 뉴런 분비를 촉진시키고 뉴런내 또는 뉴런 막 상에 Aβ42 (특히 응집된 Aβ42)의 축적을 감소시킴에 의해 완화될 수 있음을 입증하였다.
본원 발명자는 세포 또는 뉴런에서 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 또는 PI4KIIIα 단백질의 발현을 하향조절하거나, 막 상에 PI4KIIIα 단백질의 국소화를 감소시키기 위해 단백질 복합체의 형성을 예방하거나, PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 억제하는 것이 세포 및 뉴런의 Aβ42 분비를 촉진시켜, 뉴런에서 Aβ42 축적을 감소시키고, AD-관련 신경퇴행 및 이의 기능부전을 완화시키고; 한편 Aβ42 또는 APP의 발현 수준, APP를 절단하는 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성이 상당히 영향받지 않음을 발견하였다. 추가로, 본원 발명자는 또한 PI4KIIIα 단백질의 생성물인 PI4P가 리포좀에서 Aβ42 단량체의 응집을 촉진시키고 상기 촉진이 PI4P (PI)의 전구체 및 이의 유도체 PI4,5P의 것 보다 강함을 발견하였다.
본원 발명자는 Aβ (Aβ42를 포함하는)가 외형질막 또는 세포내 기관으로부터 생성되고; 따라서 생성된 Aβ가 수동 방출, 외포작용, 리소좀-매개된 방출 또는 다른 발견되지 않는 경로를 통해 세포로부터 분비될 수 있음을 믿는다. Aβ 기원 또는 이것이 어떻게 분비되는지에도 불구하고 외형질막은 이를 통해 Aβ가 세포를 이탈하는 마지막 경로이다. 외형질막 상에 Aβ의 소수성으로 인해, Aβ는 한편 소수성 지방산 쇄 영역으로 삽입되고 다른 한편 포스파?리이노시톨 (특히 인산화된 포스파티딜이노시톨 PI4P) 및 다른 산 인지질과 상호작용하고, 상기 상호작용은 무작위 코일로부터 β-구조로의 형태적 변화를 촉진시키고, Aβ 응집물을 추가로 막 상에 침적되거나 내포작용에 의해 세포에 축적되도록 응집시킨다. 추가로, 연구는 가용성 Aβ (Aβ42를 포함하는) 응집물/올리고머의 세포 또는 리포좀 막으로의 친화성이 Aβ 단량체의 것 보다 매우 높음을 임증하였다. 따라서, 응집된 Aβ는 세포막 상에 축적하기가 보다 용이하다.
PI4P는 외형질막 인산화된 포스파티딜이노시톨의 주요 성분이고 이는 PI 및 PIP2 보다 Aβ 응집물/올리고머의 형성에 대해 보다 강한 촉진을 나타낸다. 본 발명에서, 본원 발명자는 리포좀에서 Aβ42 응집물/올리고머 형성에 대한 PI4P의 촉진 효과가 명백하게 용량 의존적임을 발견하였다. RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 또는 PI4KIIIα 단백질의 발현을 하향조절하거나, 단백질 복합체의 이들의 형성을 예방하거나, PI4KIIIα 단백질의 키나제 활성을 억제하는 것이 세포막 상에 PI4P 생성을 감소시킬 수 있다. 따라서, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 또는 PI4KIIIα 단백질의 발현을 하향조절하거나 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 및 PI4KIIIα 단백질의 막 부착된 단백질 복합체의 형성을 예방하거나 PI4KIIIα 단백질의 상응하는 포스포키나제 활성을 억제하는 것이 실질적으로 외형질막 인산화된 포스파티딜이노시톨 (특히 PI4P)의 양을 감소시켜 외형질막 Aβ (Aβ42를 포함하는)와 인산화된 포스파티딜이노시톨간의 상호작용을 약화시키고 Aβ 단량체의 무작위 형태로 존재하는 외형질막 Aβ를 유도한다. 상기된 바와 같이 Aβ 단량체의 상기 무작위 형태는 막으로의 낮은 친화성을 가졌고 따라서 막으로부터 상대적으로 용이하게 방출되고 세포외로 분비된다. 따라서, 상기 조절 거동은 APP의 발현 수준 또는 α, β, 및 γ 세크레라제의 활성에 영향을 주는 것 없이 Aβ의 세포내 축적을 효과적으로 감소시켜 세포외 Aβ 수준의 명백한 증가를 유발할 수 있다.
이전의 연구는 드로소필라에서 PI3K 및 관련 PI3K/Akt 시스날전달 경로를 활성화시킴에 따라서 AD-관련 시냅스 결손 및 장기 기억 상실을 유도함을 보고하였고; 상응하게, 관련된 연구는 PI3K 활성을 억제하는 것이 AD를 치료하는 방법일 수 있음을 보여주었다. 그러나, 본 발명에서, 본원 발명자는 세포내 Aβ42 축적이 포스파티딜이노시톨 키나제 (PI3K를 포함하는)의 PI3K/Akt 시그날전달 경로 활성화에 의해 유발되지 않지만 세포막뒷받침막 포스파티딜이노시톨 키나제가 활성화된 후 인산화된 막 상에 포스파티딜이노시톨에 의해 보다 직접적으로 유발되고, 더욱이 본 발명에 포함된 포스파티딜이노시톨 키나제는 PI3KAkt 시그날전달 경로에서 PI3K 보다는 차라리 주로 PK4KIIIα임을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자는 PAO와 같이 PI4KIIIα에 고도로 특이적이지만 PI3K에 민감하지 않은 포스파티딜이노시톨 키나제 억제제를 사용함에 의해 세포로부터 Aβ42 분비가 낮은 농도와 함께 효과적으로 촉진될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본원 발명자들은 AD 치료를 성취하기 위해, Aβ 분비, 특히 Aβ42 분비를 촉진시켜 신경 세포내에서 또는 세포 막 상에 Aβ (Aβ42를 포함하는) 축적을 감소시키는 방법을 채택할 수 있음을 밝힌다. 그러나, Aβ의 증가된 분비는 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성에서의 변화에 의해 유발되는 APP의 상향조절 또는 Aβ의 증가된 생성에 기여할 수 없다.
Aβ 및 외형질막 사카라이드, 지질 및 단백질과의 결합 또는 상호작용을 약화시킴을 포함하는, 신경 세포의 Aβ 분비를 촉진시키는 다양한 경로가 있음을 당업자가 이해할 수 있다. 본 발명에서, 상기된 바와 같이 세포막 상의 Aβ (특히 Aβ42) 응집을 감소시킴에 의해 세포의 Aβ 분비를 촉진시키는 것이 바람직하다.
추가로, 본 발명은 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 및 PI4KIIIα 단백질의 양 및 복합체를 형성하는 이들의 능력을 조절함에 의해 그리고 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 조절함에 의해, 세포막 상에 형성된 Aβ 응집물/올리고머는 감소되어 세포의 Aβ (특히 Aβ42) 분비를 촉진시킴에 따라서 이들 단백질 및 이들의 관계는 AD를 치료하기 위한 잠재적 치료학적 표적에 기여할 수 있음을 밝힌다.
따라서, 당업자는 rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자의 발현, 전사 또는 해독을 억제하거나, 저하시키거나, 감소시키거나, 제거할 수 있고 이로부터 암호화된 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질의 안정성을 감소시킬 수 있는 억제제 또는 방법, 및 포스파티딜이노시톨 키나제 PI4KIIIα 단백질 및 TTC7 단백질과의 단백질 복합체의 이의 형성을 억제할 수 있는 억제제 또는 방법을 사용하여 AD를 치료할 수 있음을 이해할 수 있다. 상기 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제는 rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자의 억제 뉴클레오타이드 (안티센스 RNA, siRNA, miRNA 등을 포함하는), RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질에 대한 항체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자는 rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자의 억제 뉴클레오타이드가 당업계에 널리 공지되어 있음을 이해한다 (예를 들어, 참조: www.genecards.org, 및 시판품: ORIGENE, Cat. # SR308056 및 Cat. # TR303768). 유사하게, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질에 대한 항체는 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 참조: www.genecards.org, 및 시판품: Novus, Cat. # NBP1-81539; Thermo Fisher Scientific, Cat. # PA5-24904).
더욱이, 상기된 바와 같이, PI4KIIIα/PI4KA 유전자의 세포 발현, 전사 또는 해독을 조절하고, PI4KIIIα/PI4KA 유전자로부터 암호화된 PI4KIIIα 단백질의 안정성을 조절하고, 막 단백질 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 및 TTC7 단백질과의 복합체를 형성하는 PI4KIIIα 단백질의 능력을 조절하고, PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 조절하는 것이 AD를 치료하는 방법으로서 간주될 수 있다. 따라서, 당업자는 PI4KIIIα/PI4KA 유전자의 발현, 전사 또는 해독을 억제하거나, 저하시키거나 감소시키거나, 제거할 수 있거나, 이로부터 암호화된 PI4KIIIα 단백질의 안정성을 감소시킬 수 있는 억제제 또는 방법, 억제 뉴클레오타이드가 PI4KIIIα/PI4KA 유전자에 특이적인 것, PI4KIIIα 단백질에 대한 항체, 및 막 단백질과 함께 PI4KIIIα 단백질의 단백질 복합체 형성을 억제할 수 있고 이들 키나제 활성을 억제할 수 있는 소분자 화합물 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않고 AD를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 상기 억제제는 소분자 화합물, 예를 들어, PAO (페닐아르신 옥사이드), PAO 유도체, A1, G1, 또는 A1 및 G1의 유사체이다. 보다 바람직하게, 상기 억제제는 PAO 또는 PAO 유도체이다.
당업자는 PAO가 옥소아르신 그룹 및 페닐 그룹을 포함하는 기본 구조를 갖고 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성에 대한 강한 억제 효과를 나타내는 소분자 화합물임을 이해한다. PAO의 화학적 구조는 다음과 같다:
Figure 112017130717360-pct00001
페닐아르신 옥사이드 (옥소(페닐)아르산)
PAO의 합성 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따라, AD의 치료에 사용될 수 있는 화합물은 상기 화합물이 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성에 대한 억제 효과를 나타내는 한 PAO의 유도체를 추가로 포함한다. 당업자는 상기 유도체의 합성 방법이 당업계에 널리 공지되어 있음을 이해한다.
유사하게, 당업자는 A1 및 G1 둘다가 PI4KIIIα 단백질의 소분자 화합물 억제제이고 유사한 구조를 가짐을 이해한다. 여기서, A1의 화학적 구조는 다음과 같다:
Figure 112017130717360-pct00002
.
5-(2-아미노-1-(4-(4-모르폴리닐)페닐)-1H-벤즈이미다졸-6-일)-N-(2-플루오로페닐)-2-메톡시-3-피리딘설폰아미드
G1의 화학적 구조는 다음과 같다:
Figure 112017130717360-pct00003
.
(aS)-5-(2-아미노-4-옥소-3-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-3,4-디하이드로퀴나졸린-6-일)-N-(2,4-디플루오로페닐)-2-메톡시피리딘-3-설폰아미드
A1 및 G1의 합성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 참조: Bojjireddy, N., et al. (2014), JBC 289:6120-6132; Leivers, A.L., et al. (2014), JMC 57:2091-2106). 본 발명에 따라, A1 및 G1의 구조적 유사체를 사용하여 이들이 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성에 대한 억제 효과를 나타내는 한 AD를 치료할 수 있다. 당업자는 상기 구조적 유사체의 합성 방법이 당업계에 널리 공지되어 있음을 이해한다.
추가로, PI4KIIIα 단백질 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질의 막 복합체의 형성은 스캐폴드 단백질 TTC7의 보조를 요구한다. 따라서, 본 발명에 따라, ttc7 유전자의 발현, 전사 또는 해독을 억제하거나, 저하시키거나, 감소시키거나, 제거할 수 있고 이로부터 암호화된 TTC7 단백질의 안정성을 감소시킬 수 있는 억제제 또는 방법, 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 PI4KIIIα 단백질과의 단백질 복합체의 형성을 억제할 수 있는 억제제 및 방법을 사용하여 AD를 치료할 수 있음을 이해할 수 있다. 상기 TTC7 억제제는 ttc7 유전자의 억제 뉴클레오타이드 (안티센스 RNA, siRNA, miRNA 등을 포함하는), TTC7 단백질에 대한 항체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
더욱이, 본 발명에 따라, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 발현을 하향조절하거나 막 상에 PI4KIIIα 단백질의 분포를 감소시키기 위해 단백질 복합체의 이들의 형성을 예방하거나 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 억제하는 것은 필수적으로 외형질막 PI4P의 감소를 유도하고 추가로 세포의 Aβ 분비를 촉진시킨다. 따라서, 당업자는 외형질막 PI4P의 양 또는 수준을 감소시킬 수 있고 세포막 상의 Aβ 응집물/올리고머의 형성을 추가로 감소시킬 수 있는 임의의 억제제 또는 방법이 상기된 바와 같이 AD를 치료하는 효과를 성취할 수 있음을 이해할 수 있다.
당업자는 상기 언급된 PI4P 억제제가 PI4P에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 분자일 수 있음을 이해할 수 있다. 현재, PI4P에 대한 항체의 합성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌참조: Brown BK and Karasavass N, et al., 2007, J virol; Wassef NM and Roerdink F, et al. 1984, Mol Immuol). 예를 들어, 인간-유래된 광범위-중화 항체 4E10, 및 PI4P에 대한 다른 항체일 수 있다. 현재, PI4P에 특이적으로 결합하는 분자의 합성 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌참조: Balla A and Kim YJ, et al., 2008, Mol Biol Cell; Zubenko GS and Stiffler et al., 1999, Biol Psychiary). 예를 들어, OSH2-PH2X 융합 단백질 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질일 수 있다.
AD를 치료하기 위해 사용될 수 있는 본 발명에 의해 제공되거나 AD에 대한 치료 잠재력을 갖는 상기 언급된 물질 (이후부터 총체적으로 "본 발명의 물질"로서 언급됨)은 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B에 대한 항체, PI4KIIIα에 대한 항체, TTC7에 대한 항체, PI4P에 대한 항체, rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b 유전자에 특이적인 억제성 폴리펩타이드, PI4KIIIα/PI4KA 유전자에 특이적인 억제성 폴리펩타이드 및 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 억제하는 소분자 화합물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않고 단리되고, 정제되고, 합성되고/되거나 재조합될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 물질은 또한 약제학적 조성물과 같은 조성물로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 임의의 상기 언급된 항체, 억제성 폴리펩타이드 및/또는 소분자 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 임의의 물질을 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 물질, 예를 들어, 항체 및 소분자 화합물, 억제성 폴리펩타이드 및 항체, 또는 2개의 이상의 항체 또는 소분자 화합물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 약제학적 조성물은 또한 또 다른 약제학적 활성제 또는 약물과 배합하여 본 발명의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 Aβ에 대한 항체 약물, 예를 들어, 바피네우주맙 또는 Aβ 응집을 차단시키거나 Aβ 응집물의 해리를 촉진시키기 위해 뇌에서 신경 세포외 Aβ 또는 β 아밀로이드 플라크에 결합하는 화합물, 예를 들어, 해양-유래된 황산화된 올리고사카라이드 HSH971 및 이의 유사체, 아캄프로세이트 (트라미프로세이트) 및 이의 유사체, 및 에다라본 및 이의 유사체를 포함한다. 이와 같은 방식으로, 상기 약제학적 조성물은 한편 뉴런으로부터 Aβ 분비를 촉진시키고 또 다른 한편 뉴런 외부의 Aβ의 제거를 촉진시킴으로써 AD의 치료에 대한 보다 우수한 치료학적 효과를 성취한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 AD의 치료를 위해 새로운 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 상기 언급된 발견을 토대로 구성되고, 즉, 세포내 Aβ42 축적은 Aβ42 분비를 촉진시켜 AD-관련 신경퇴행 및 기능부전을 완화시키고 예방함에 의해 감소될 수 있다. 따라서, 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 기준은 치료학적 표적의 의약의 투여 또는 조절 후 Aβ 분비 (특히 Aβ42 분비)에 대한 촉진 효과이고 증가된 Aβ 분비는 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성에서 변화에 의해 유발되는 APP의 상향조절 또는 Aβ의 증가된 생성으로 인한 것일 수 없다.
본 발명에 따라, 치료학적 표적의 조절은 치료학적 표적의 말초 환경과의 기능, 성질 또는 관계를 변화시키기 위해 직간접적으로 치료학적 표적상에 작용하도록 관련 물질을 사용하여 따라서 세포의 Aβ 분비 (특히 Aβ42 분비)의 촉진을 유발하거나 유도할 수 있음을 언급한다.
당업자는 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 효과적인 약물을 선택하기 위해, 스크리닝 시험을 위한 세포주가 포유동물, 곤충 등으로부터의 진핵 세포주, 예를 들어, HEK293, COS7, N2a, SH-SY5Y, S2, sf9 등일 수 있음을 이해한다. 상기 방법은 후보 약물이 알츠하이머 질환을 치료하기 위해 효과적인 약물을 선택하기 위해 세포막 상에 또는 세포 내에서 Aβ 축적, 특히 Aβ42 축적을 감소시킬 수 있는지의 여부를 시험함을 포함한다. 바람직하게, Aβ 분비가 증가되는지의 시험은 APP를 과발현하는 세포주 (예를 들어, 인간-유래된 APP로 안정적으로 형질감염된 HEK293, COS7, N2a, SH-SY5Y 세포주)에서 또는 드로소필라 모델을 사용하여, 바람직하게 드로소필라 제3령 유충의 조직에서 수행될 수 있다. Aβ 분비가 증가되는지의 여부는 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 전기-화학발광 검정 (ECLIA)을 포함하는 면역검정 방법으로 검출될 수 있다.
바람직하게, AD의 치료를 위한 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법은 다음을 포함할 수 있다: PI4KIIIα의 효소 활성에 대한 후보 의약 또는 표적 조절의 발명의 효과를 관찰하는 단계, 후보 의약 또는 표적 조절의 발명이 검출 시스템에서 PI4KIIIα 키나제의 기능에 부정적으로 영향을 주는, 즉 PI4KIIIα 키나제 활성 또는 외형질막 PI4P 수준의 감소를 특징으로 하는 경우, 이것은 후보 의약, 제제 또는 표적이 AD를 치료하기 위한 잠재적 의약 또는 치료학적 표적임을 지적한다. 상기 스크리닝 후, 세포내 Aβ (특히 Aβ42) 축적이 감소되는지 및 세포외 Aβ 분비가 촉진되는지의 여부가 추가로 검출된다. 이들 방법을 사용하여 후보물의 스크리닝 효율은 크게 개선될 수 있다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 따라, AD의 치료를 위한 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법은 다음을 포함할 수 있다: 치료학적 표적의 후보 의약 또는 조절의 발명이 막 상에 PI4KIIIα 단백질의 양을 감소시키기 위해 엔도킬레마로 외형질막 PI4KIIIα 단백질을 재분포시키고 세포외 분비를 증가시키는 것 뿐만 아니라 외형질막 Aβ 단량체의 응집/올리고머화의 감소를 유도하는지를 직접적으로 분석함을 기준으로 결정하는 단계. 바람직하게, 형광 표지된 PI4KIIIα는 관찰을 위해 선택될 수 있고, 예를 들어, 형광성 단백질 (GFP-PI4KIIIα)로 표지된 PI4KIIIα이고, 형광적으로 표지된 PI4KIIIα가 외형질막로부터 엔도킬레마로 이전하는지의 여부를 관찰한다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 따라, AD의 치료를 위한 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법은 또한 단백질들 간의 상호작용이 분석되는 동시-면역침전 검정과 같은 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 후보 의약 또는 치료학적 표적의 조절 발명이 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질, 및 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용을 감소시키는 경우, 이것은 의약 또는 치료학적 표적이 세포외 분비를 증가시키는 것 뿐만 아니라 외형질막 Aβ 단량체의 응집을 감소시키기 위해 막 단백질 복합체를 형성하는 PI4KIIIα 단백질의 능력을 약화시킬 수 있음을 지적한다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에 따라, AD의 치료를 위한 의약 또는 치료학적 표적을 스크리닝하기 위한 방법은 또한 후보 의약 또는 치료학적 표적의 조절 의 발명이 외형질막 PI4P 수준을 감소시키는지의 여부를 직접적으로 분석함에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 형광 현미경, 공초점 현미경, 또는 2개-광자 현미경을 사용하여 PI4P에 특이적으로 결합하는 형광적으로 표지된 분자, 예를 들어, 형광성 단백질로 표지된 OSH2-PH2X 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질이 외형질막 양에서 감소되는지 또는 외형질막로부터 엔도킬레마로 이전되는지를 관찰할 수 있다.
본 발명은 하기 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명을 수행하기 위한 방법은 하기의 실시예로 제한되지 않는다.
이후, 데이터는 주로 동물 및 세포 배양 실험을 통해 수득되고 SPSS 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 달리 특정되지 않는 경우, 데이터는 평균 ± sem으로 나타낸다. P < 0.05는 상기 차이가 통계학적으로 유의적임을 지적한다. 여기서 나타낸 모든 데이터는 평균 ± sem으로 나타낸다. "*", "**", 및 "***" 각각은 p < 0.05, 0.01, 및 0.001임을 나타낸다.
실시예 1: 드로소필라 종 및 유전학적 방법
표준 배양 배지, 12시간 광 및 12시간 암의 교차 사이클, 25 ℃의 일정 온도하에 배양.
하기의 유전자전이 드로소필라 종은 본 발명에 사용되었다: rbo S358A , [UAS]Aβ arc , [UAS]Aβ 42 , [UAS]dtau, [UAS]mCD8-gfp (Dr. Z. Wang에 의해 제공됨), [UAS]shibire ts1 (Dr. A Guo에 의해 제공됨), [Gal4]A307 (Dr. O'Kane에 의해 제공됨). 여기서, rbo S358A 유전자는 부위-지시된 돌연변이를 통해 rbo 유전자를 포함하는 야생형 게놈 DNA로부터 작제된 전이유전자이고, 상기 돌연변이의 발현은 rbo 유전자 자체의 프리-드라이버에 의해 구동된다. [Gal4]A307은 자이언트 섬유 경로의 뉴런에서 및 소량의 다른 뉴런에서 Aβarc, Aβ42, dTau, mCD8-GFP, 또는 온도 민감성 돌연변이 다이나민을 발현하도록 [UAS]Aβ arc , [UAS]Aβ 42 , [UAS]dtau, [UAS]mCD8-gfp, [UAS]shibire ts1 전이유전자를 구동하는 전사 인자 Gal4를 발현한다. 본 발명에 사용된 드로소필라 돌연변이는 다음을 포함한다: rbo ts1 (온도 민감성 미스센스 돌연변이), rbo 2 (녹다운 돌연변이), itpr sv35 (난센스 돌연변이, Bloomington Stock # 30740), PI4KIIIα def (PI4KIIIα 유전자 및 말초 DNA의 결실을 갖는 돌연변이, Bloomington Stock # 9518), PI4KIIIα GS27 , 및 PI4KIIIα GJ86 (둘다는 난센스 돌연변이이다). P{lacW}l(2)k14710k15603 트랜스포존은 l(2) k14710 (Bloomington Stock # 11134); P{EPgy2}bin3EY09582 (Bloomington Stock # 20043)의 전사를 예방하기 위해 l(2) k14710 유전자의 제1 엑손으로 삽입된다. 유전학적 배경을 정제하기 위해, 모든 전이유전자 및 돌연변이 파리는 사용 전에 5회 초과의 세대 동안 야생형 동종동계 종과 역교배하였다 (동종동계성 w 1118, Bloomington stock #5905).
본원 발명자의 사전 연구는 GF 경로의 뉴런에서 야생형 또는 아크틱 돌연변이 Aβ42를 발현하는 파리 (Aβ42 또는 Aβarc 파리 또는 드로소필라)가 뉴런내 Aβ42 축적, 연령 의존적 시냅스 전달 실패 및 미성숙 사망을 나타냄을 발견하였다. 상기 파리는 또한 크라이밍 능력의 연령-의존적 감소를 나타낸다. 뉴런내 Aβ42 축적에 의해 유발된 신경 결손에서 rbo 유전자의 역할을 연구하기 위해, rbo 유전자의 2개의 돌연변이, 미스센스 돌연변이 (rbo ts1 ) 및 녹다운 돌연변이 (rbo 2 )는 Aβarc 파리에 도입하였고, 시냅스 전달, 크라이밍 능력 및 연령에 대한 효과를 각각 시험하였다. 4개 그룹의 파리를 작제하였다: 대조군 파리 (대조군, ctrl), rbo ts1/+ 또는 rbo 2/+ 이형접합체 (rbo), Aβarc 파리 (Aβarc), 및 rbo ts1/+ 또는 rbo 2/+ 이형접합성 돌연변이 (Aβarc-rbo)를 갖는 Aβarc 파리. 각각의 그룹은 1 또는 2개의 종을 함유하고, 여기서, "ctrl"은 [Gal4]A307 전이유전자를 갖는 야생형 대조군 파리를 지칭하고; "rbo ts1/+ "및"rbo 2/+ "은 [Gal4]A307 전이유전자의 하나의 카피를 갖는 rbo ts1/+ 및 rbo 2/+ 의 이형접합성 파리를 지칭하고; "Aβarc"는 [Gal4]A307/[UAS]Aβ arc 이중 유전자전이 파리를 지칭하고; "Aβarc-rbo ts1/+ " 및 "Aβarc-rbo 2/+ "은 각각 [Gal4]A307-rbo ts1 /[UAS]Aβ arc 및 [Gal4]A307-rbo 2 /[UAS]Aβ arc 를 지칭한다. 제1의 2개 그룹의 파리는 Aβarc를 발현하지 않았고 "비-Aβ 파리"로서 분류된 반면, 후자 2개 그룹의 파리는 Aβarc를 발현하고 "Aβ 파리"로서 분류되었다.
실시예 2: rbo 유전자 돌연변이는 시냅스 전달 조사에 의해 시험된, Aβ42-발현하는 드로소필라에서 신경 결손을 특이적으로 억제한다.
시냅스 전달의 조사 방법:
세포내 자이언트 섬유 (GF) 시스템에서 흥분 접합 전위 (EJP)의 기록. 특정 일령의 성숙한 암컷 파리는 해부 현미경하에 저융점 왁스 택키왁스 (Boekel Scientific)를 사용하여 유리 슬라이드 상에 배쪽 측면 아래로 탑재하였다. 기록 시스템은 복부에 하나의 표준 전극, 2개의 눈으로 삽입된 2개의 자극 전극 및 등쪽 종축 근육 세포로 삽입된 하나의 기록 전극을 함유한다. 2개의 눈은 전기 자극 (100 Hz, 50 펄스)에 적용하였다. 자극 강도는 0.2 ms의 지속시간과 함께 5 내지 20 볼트이고 이는 역치 자극 강도의 대략 150 %이다. 전기 시그날을 기록하고 Axonal clamp 900A (Molecular Devices)에 의해 증폭시키고 Digidata 1440A (Molecular Devices)에 의해 10 kHz의 주파수로 디지탈화하였다. 데이터를 기록하고 pClamp 소프트웨어 (버젼 10.0; Molecular Devices)에 의해 분석하였다. 모든 전극은3M KCl 용액이 충전된 유리 전극이다. 환경 온도는 기록 동안에 25 ℃였다.
도 1은 4개 그룹의 파리에서 상이한 일령에서 뇌 자극된 EJP의 대표적 기록 (도 1a) 및 유발된 EJP의 성공율의 정량적 분석 (도 1b)을 보여준다. 특히 rbo 돌연변이가 Aβarc에 의해 유발된 연령 의존적 뉴런 시냅스 전달 실패를 상당히 억제하는 것으로 주지된다. 통계학적 분석은 3-7th, 15-17th, 및 25-27th 일 (n=6~12), 및 31-35th 일 (n=10~23)의 데이터에 대해 원-웨이 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
시냅스 전달의 상기 조사 방법에 따라, 고주파 전기 자극 (100 Hz, 50 펄스) 하에 등쪽 종축 근육 섬유에서 EJP의 세포내 기록은 우화 후 3-7th, 15-17th, 25-27th, 및 31-35th 일에 대해 수행하였다. 제1 그룹에서 고주파 전기 자극에 의해 유발된 EJP의 성공율은 3-7th 및 15-17th 일에 대해 다른 3개의 그룹에서의 것과 상당히 상이하지 않았다 (도 1a-1b). 25-27th 및 31-35th 일에 대해, Aβarc-rbo 파리에서 EJP의 성공율은 대조군 파리 및 rbo 파리에서의 것 보다 낮게 되었지만 Aβarc 파리에서 것 보다 상당히 높았다 (도 1a-1b).
이들 결과는 rbo 유전자 돌연변이가 뉴런내 Aβarc 축적에 의해 유발된 연령-의존적 시냅스 전달 실패를 완화시킴을 설명한다. 유전학적 배경에서 차이는 상기 완화에 기여할 가능성이 없는데 그 이유는 4개 그룹의 파리를 제조하기 위해 사용되는 유전자전이 파리 및 rbo 돌연변이의 유전학적 배경이 사용 전에 5회 초과 세대 동안 야생 동종동계 종 (동종동계성 w 1118)과 역교배하였고 따라서 유전학적 배경은 필수적으로 정제되기 때문이다. rbo 유전자의 총 녹다운은 배아 치사를 유발하기 때문에, Aβarc 유도된 시냅스 전달 실패에 대한 이의 효과는 조사될 수 없다.
실시예 3: rbo 유전자 돌연변이는 튜브-클라이밍 능력 검정에 의해 시험된, Aβ42-발현 파리에서 신경 결손을 특이적으로 억제한다
튜브-클라이밍 시험:
클라이밍 능력은 수직으로 위치한 시험 튜브의 바닥으로부터 제7 초에서 10개 파리의 평균 클라이밍 높이를 측정함에 의해 조사하였다. 높은 재현성을 갖는 과실 파리 클라이밍 능력 시험 장치가 개발되었다. 장치는 다음을 포함한다: 1) 안에 10개의 투명한 플라스틱 튜브가 수직으로 탑재된 직사각형 금속 프레임 (32 cm 폭, 21 cm 높이); 2) 금속 프레임의 수직 이동을 구동시키기 위한 전기 모터; 3) 1분 간격으로 미리 결정된 높이에 대해 4시간 동안 금속 플레임을 상하로 용이하게 이동시키는 작동 사이클에서 전기 모터를 제어하기 위한 스텝핑 작동기; 4) 클라이밍 공정을 비디오 녹화하기 위한 비디오 카메라; 5) 비디오의 특정 시점에 파리의 클라이밍 위치를 분석하기 위한 분석 소프트웨어. 실험에서, 특정 유전자형의 10개 파리를 각각의 투명한 플라스틱 튜브로 이전시켰다. 상기 튜브는 균등하게 분포시키고 금속 박스에 탑재시켰다. 금속 박스는 기재 (base) 상에 수직으로 탑재된 2개의 금속 막대를 따라 수직으로 슬라이딩할 수 있다. 클라이밍 시험에서, 스테핑 작동기는 전기 모터를 제어하여 5.8 cm로 금속 박스를 올리고 이어서 해제되어 상기 금속 박스는 중력에 의해 본래의 위치로 하강한다. 금속 박스가 이동을 멈추는 즉시 파리는 튜브의 바닥으로 낙하하였다. 금속 박스가 3초 이내 4회 동안 상하로 이동한 후, 모든 파리는 튜브의 바닥에 있다. 이어서 파리는 튜브의 벽을 따라 클라이밍하도록 허용하였다. 전체 공정은 후속적 분석을 위해 비디오 녹화하였다. 본원 발명자들은 튜브 클라이밍이 개시된 후 임의의 소정의 시점에 파리의 높이를 측정하기 위해 컴퓨터 프로그램을 개발하였다.
도 1c에서, rbo 유전자 돌연변이는 Aβarc-발현 파리에서 연령 의존적 클라이밍 능력을 완화시키고, 원-웨이 ANOVA 분석을 수행하였고, n=3이다 (3개 그룹의 파리, 각각의 그룹에서 10마리의 파리).
클라이밍 능력은 우화 후 3rd, 16th, 26th, 및 31st 일째 조사하였다. 3rd 및 16th 일째에, 4개 그룹에서 파리의 클라이밍 능력은 유사하였다 (도 1c). 26th 및 31st 일째에, Aβarc-rbo 파리는 Aβarc 파리 보다 상당히 높게 클라이밍하였지만, 대조군 및 rbo 파리 만큼은 높지 않았다 (도 1c).
실시예 4: rbo 유전자 돌연변이는 장수 검정에 의해 시험된, Aβ42-발현 파리에서 신경 결손을 특이적으로 억제한다
장수 (수명) 검정:
각각의 유전자형의 100 또는 200마리 파리는 균등하게 표준 파리 음식 및 건조 효모를 함유하는 5 또는 10개의 튜브에 분리하여 거주시키고 25 ℃에서 배양하였다. 파리는 3일 마다 새로운 음식 및 건조 효모를 갖는 튜브로 이전시키고 죽은 파리는 각각의 이전 시점에서 계수하였다. 생존율은 SPSS 11 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 1d에서, rbo 유전자 돌연변이는 Aβarc-발현 파리의 수명을 연장시켰다. 각각의 그룹에 대해 n=200 파리이고, p<0.001, 로그 랭크 시험 (Log Rank test)이다.
도 7은 3개 그룹의 파리에서 상이한 일령 (도 7a) 및 유발된 EJP의 성공율의 정량적 분석 (도 7b)에서 뇌 자극된 EJP의 대표적 기록을 보여준다. "ctrl"은 [Gal4]A307 전이유전자를 갖는 야생형 대조군 파리를 지칭하고; "Aβ42"는 [Gal4]A307/[UAS]Aβ 42 이중 유전자전이 파리를 지칭하고; "Aβ42-rbo ts1/+ " 및 "Aβ42-rbo 2/+ " 각각은 [Gal4]A307-rbots1/[UAS]Aβ 42 및 [Gal4]A307-rbo2/[UAS]Aβ 42 를 지칭한다. rbo 돌연변이는 Aβ42에 의해 유발된 연령 의존적 뉴런 시냅스 전달 실패를 상당히 억제하는 것으로 주지된다. 3-5th 일의 데이터에 대해 n=6-12이고 37-39th 일의 데이터에 대해 n=10 -12이고, 원-웨이 ANOVA 분석이다.
도 7c에서, rbo 유전자 돌연변이는 Aβ42-발현 파리에서 연령 의존적 클라이밍 능력을 완화시켰고, 원-웨이 ANOVA 분석을 수행하였고 n=3이다.
도 7d에서, rbo 유전자 돌연변이는 Aβ42-발현 파리의 수명을 연장시켰다. 각각의 그룹에 대해 n=200 파리였고, p<0.001이고, 로그 랭크 시험이다.
장수 검정은 Aβarc-rbo 파리의 수명이 Aβarc 파리의 것 보다 길었음을 보여주었지만, 대조군 및 rbo 파리의 것 보다는 짧았고 (도 1d); 동일한 결론은 4개 그룹에서 평균 수명을 비교함에 의해 수득될 수 있다 (표 1). 이를 결과는 시냅스 전달 검사에서의 것과 일치한다. 야생형 Aβ42를 발현하는 파리의 시냅스 전달, 클라이밍 능력 및 수명에 대한 rbo 유전자 돌연변이의 효과에 대한 추가의 조사를 수행하였고, 심지어 보다 양호한 개선을 나타냈다 (도 7a-d).
Figure 112017130717360-pct00004
도 8a는 드로소필라 자이언트 섬유 경로에서 모터 결함에 대한 rbo 유전자 돌연변이의 효과 (좌측) 및 드로소필라 타우 단백질 과발현에 의해 유도된 미성숙한 사망을 보여준다. 도 8b는 드로소필라 자이언트 섬유 경로에서 모터 결함에 대한 shibire 유전자 돌연변이의 효과 (좌측) 및 Aβarc 과발현에 의해 유도된 미성숙한 사망을 보여준다. 장수 검정에서, 각각의 그룹에 대해 n=100 파리가 있고, 로그 랭크 시험이다.
Aβ42 독성에 대한 rbo 유전자 돌연변이의 효과는 독성 단백질의 뉴런내 축적에 대한 일반 효과에 기인할 수 없는데 이는 rbo 유전자 돌연변이가 타우 단백질을 과발현하는 파리의 수명 단축을 완화시킬 수 없다 (도 8a). Aβ42 독성에 대한 rbo 유전자 돌연변이의 효과는 잠재적으로 시냅스 또는 내포작용 기능을 기준으로 일반 효과에 기인할 수 없는데 그 이유는 shibire 유전자 돌연변이 (shibire ts1 )의 Aβarc 파리로의 도입이 Aβarc 파리의 미성숙한 사망을 약화시킬 수 없기 때문이다 (도 8b). rbo ts1 유전자 돌연변이와 동일하게, shibire ts1 유전자 돌연변이는 또한 온도 의존성 시냅스 전달, 벌크 내포작용 및 모터 능력에 대한 효과를 유도하였다.
실시예 1 내지 4와 함께, 상기 결과는 rbo 유전자 돌연변이 또는 부전증이 야생형 및 돌연변이 Aβ42-발현 파리에서 신경 결손을 특이적으로 억제할 수 있음을 보여주었다.
실시예 5: RBO 단백질과 상호작용하는 PI4KIIIα 효소의 결핍 또는 억제는 면역침전 검정에 의해 시험된, Aβarc 파리에서 신경 결손을 완화시킨다
면역침전 및 면역블롯:
총 300마리의 파리 머리를 수거하고 500 μL의 예비 냉각된 Tris 완충액에서 분쇄함에 의해 균질화시켰다. Tris 완충액의 제형은 다음을 함유한다: 50 mM Tris, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 % 칵테일 프로테아제 억제제 (Calbiochem), 및 7.4로 조정된 pH. 조직 균질물은 10분 동안 10000 g에서 원심분리하였다. 상등액을 수거하고 RBO에 대한 약 1 ㎍의 마우스 모노클로날 항체 또는 드로소필라 PI4KIIIα에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 면역침전 또는 면역블롯 시험에 적용하였다. 2개의 항체는 각각 Abmart (Shanghai) 또는 Abgent (China)와 협력하여 생산하였다. RBO 항체는 드로소필라 서브타입 C RBO 단백질의 251th-500th 아미노산을 사용하여 생성하였고; PI4KIIIα 항체는 펩타이드 NH2-KRSNRSKRLQYQKDSYC-CONH2 (서열번호 3)을 사용하여 생성하였다. 면역블롯 시험에서, 드로소필라 RBO 및 PI4KIIIα에 대한 항체는 1:2000으로 희석시켰다. 야생형 및 상응하는 동종접합성 돌연변이의 머리 조직 균질물을 각각 사용하여 드로소필라 RBO 및 PI4KIIIα에 대한 항체를 검출하였다.
도 9a에서, rbo S358A 유전자 돌연변이는 Aβarc-발현 파리의 수명을 개선시키지 않았다 (P=0.07).
RBO는 추정 디아실글리세롤 (DAG) 리파제일 수 있고 DAG 리파제의 활성이 AD 환자 및 동물 모델의 해마에서 증가될 것으로 보고되었지만, 전이유전자 rbo S358A 의 Aβarc 파리로의 도입이 미성숙한 사망을 변화시킬 수 없기 때문에 (도 9a) RBO 단백질은 DAG 리파제로서 작용함에 의해 Aβarc 독성을 조절할 수 없다. rbo S358A 유전자에 의해 암호화된 RBO 단백질에서, 추정 효소 활성 센터가 돌연변이되었다.
도 1e는 RBO 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 동시면역침전의 대표적인 면역블롯을 보여주고, n=3이다.
도 1f는 야생형 대조군 파리 및 rbo 이형접합체에서 RBO 단백질 및 PI4KIIIα 단백질 수준의 대표적 면역블롯 (좌측) 및 반-정량 분석 (우측)을 보여준다 (n=7, 원=웨이 ANOVA 분석).
도 1g는 야생형 (wtRBO) 및 돌연변이 (mRBO) RBO 단백질로 동시면역침전된 PI4KIIIα의 대표적 면역블롯 (좌측) 및 반-정량 분석(우측)을 보여준다 (n=4, t-시험 분석).
도 1h는 Aβarc, Aβarc-rbo ts1/+ , 및 Aβarc-rbo 2/+ 파리에서 PI4KIIIα mRNA 발현 수준의 RT-PCT 정량 분석을 보여준다 (n=5-6, 원-웨이 ANOVA 분석).
효모 및 마우스에서 RBO 동족체는 PI4KIIIα를 채용하고 세포막 상에서 이와 복합체를 형성한다. 이것과 일치하여, RBO 단백질은 드로소필라 PI4KIIIα와 특이적으로 동시면역침전시켰다 (도 1e). 추가로, Aβarc-rbo 드로소필라에서 rbo 유전자 (rbo 2/+ )의 하나의 카피를 제거하는 것은 RBO 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 발현 수준을 상당히 감소시킬 수 있는 반면 (도 1f), rbo ts1/+ 유전자 돌연변이는 RBO 단백질 및 PI4KIIIα 단백질의 발현 수준을 상당히 감소시키지 않았지만 RBO 단백질과 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용을 상당히 약화시켰다 (도 1g). 주지할만하게, 2개의 rbo 돌연변이 중 어느 하나도 PI4KIIIα 유전자의 전사를 변화시키지 않았다 (도 1h).
PI4KIIIα가 Aβarc 파리의 신경 결손에서 RBO 단백질과 유사한 역할을 수행하는지의 여부를 시험하기 위해, 염색체 결핍 (염색체의 PI4KIIIα-함유 DNA 절편의 결실, pi4k def/+ ) 및 PI4KIIIα의 난센스 돌연변이 (PI4KIIIα GS27/+ )는 별도로 Aβarc-발현 파리에 도입하였다.
도 2는 시냅스 전달, 모터 기능 및 미성숙한 사망이 이형접합성 PI4KIIIα 유전자 결실 (PI4KIIIα def/+ ) (도 2a를 참조한다) 또는 난센스 돌연변이(PI4KIIIα GS27/+ ) (도 2b 참조)에 의해 억제되고, PAO (도 2c-e)에 의해 억제됨을 보여준다. "ctrl"은 [Gal4]A307 전이유전자를 갖는 야생형 대조군 파리를 지칭하고; "PI4KIIIα def/+ " 및 "PI4KIIIα GS27/+ "은 [Gal4]A307 전이유전자의 하나의 카피를 갖는 PI4KIIIα def/+ 및 PI4KIIIα GS27/+ 이형접합성 파리를 지칭하고; "Aβarc"는 [Gal4]A307/[UAS]Aβ arc 이중 유전자전이 파리를 지칭하고; "Aβarc-PI4KIIIα def/+ " 및 "Aβarc-PI4KIIIα GS27/+ " 각각은 PI4KIIIα def/+ ;[Gal4]A307/[UAS]Aβ arc 및 PI4KIIIα GS27/+ ;[Gal4]A307/[UAS]Aβ arc 를 지칭한다. 각각의 그룹에서 EJP 데이터 기록에 대해, n=6~10이다. 각각의 클라이밍 검정에 대해 n=3~5이다. 각각의 파리 종의 수명 데이터에 대해 n=100~200이다. P 값은 0.001 미만이다. 통계학적 분석 방법은 상기된 바와 같다.
사실, 실험적 결과는 상기 PI4KIIIα 돌연변이가 시냅스 전달, 모터 기능 및 수명에서 Aβarc 유도된 결함을 억제하였음을 입증하였다 (도 2a-b). 일관되게, Aβarc 파리에게 PI4KIIIα 억제제 PAO의 공급은 또한 용량-의존적 방식으로 이들 결함을 상당히 완화시켰다 (도 2c-e).
도 9b에서, itpr SV35 유전자 돌연변이는 Aβarc-발현 파리의 시냅스 전달 또는 수명을 개선시키지 않았다 (P=0.13). 장수 검정에서, 각각의 그룹에 대해 n=100의 파리이고, 로그 랭크 시험이다. 성공율에서 유발된 EJP의 분석, n=5.
그러나, RBO/PI4KIIIα를 하향조절함에 의해 신경 결손의 억제는 포스포리파제 C, PI4,5P 및 이노시톨 트리포스페이트 (IP3R)의 수용체에 의해 매개된 칼슘 방출의 약화에 의해 유발되는 독성 효과에 기인할 수 없는데 그 이유는 IP3R을 암호화하는 유전자의 난센스 돌연변이의 Aβarc-발현 파리로의 도입이 시냅스 실패 또는 미성숙한 사망을 약화시킬 수 없기 때문이다 (도 9b-c).
실시예 6: RBO/PI4KIIIα의 하향조절은 염색 및 이미지화에 의해 검출된, 세포내 Aβ42 축적을 감소시킨다
염색 및 이미지화:
드로소필라의 중추 신경계는 다음과 같이 염색시켰다. 뇌 및 척수신경절을 포함하는, 파리의 전체 중추신경계 (CNS)는 냉 PBS 중에서 해부하고 약 45분 동안 PBS 중에서 4 % PFA로 고정시켰다. 제조물은 30분 동안 PBS로 세척하고 45분 동안 포름산 (물 중 70 %)으로 처리하여 항원성 결정인자를 재노출시키고 0.25 % Triton이 보충된 PBS 용액 중 5 % BSA로 반복적으로 세척하고 10 내지 12시간 동안 4 ℃에서 1차 항체 (6E10, 1:100 희석)로 항온처리하고, PBS로 다시 세척하고 최종적으로 2시간 동안 실온에서 cy3-접합된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:200 희석)로 항온처리하였다. Nikon A1R-A1 공초점 현미경하에 이미지를 촬영하고; 파리 CNS의 유전자형은 이미지화 요원에게 알리지 않았다.
도 3a는 mCD8-GFP를 발현하는 대조군 파리 (상부 열: top raw) 및 21 내지 25일령의 Aβarc-발현 파리 (중앙 열: middle row)에서 척수 신경절의 전체-탑재 Aβ 염색의 공초점 이미지를 보여주고; mCD8-GFP 및 Aβarc의 발현은 둘다 [Gal4]A307에 의해 구동되었다. 각각의 그룹의 염색은 2회 반복하고; 하부 열은 중앙 열에서 정사각형에 의해 정의되는 영역의 확대된 뷰를 나타낸다. 도 3b는 21-25일령의 Aβarc, Aβarc-rbo ts1/+ , Aβarc-rbo 2/+ , Aβarc-PI4KIIIα def/+ , 및 Aβarc-PI4KIIIα GS27/+ 파리의 척수 신경절의 전체-탑재 Aβ 염색의 대표적 공초점 이미지를 보여주고 각각의 그룹의 염색은 2회 반복하고; 도 3c (상부)은 ELISA 방법에 의해 정량된 머리 Aβ 수준을 보여준다. 도 3c (하부)는 ELISA 방법에 의해 정량된 상이한 농도에서 PAO 치료와 함께 Aβarc-발현 파리에서 머리 Aβ 수준을 보여준다. ELISA 정량 검정, 원-웨이 ANOA 분석에서 데이터의 각각의 그룹에 대해 n=3~5이다. 도 3a-3b에서, 상기 스케일 막대는 50 ㎛를 나타낸다.
이전에, GF 경로에서 Aβarc-발현에 의해 유도된 뉴런 손상은 세포내 축적 Aβ 단백질에 기인하였다. 여기서, 본원 발명자는 추가로 uas-mCD8-gfp 전이유전자를 Aβarc 파리로 도입함에 의해 Aβ의 뉴런내 축적을 확인하였다. uas-mCD8-GFP는 mCD8-GFP 형광성 단백질을 발현하고 이것은 세포질막을 표적화하고 Aβarc의 것과 동일한 드라이버에 의해 구동시켜 Aβarc-발현 뉴런이 GFP로 표지될 수 있도록 한다. 공초점 이미지화는 Aβ 면역염색 시그날이 GFP 시그날과 동시에 위치함을 밝혔고 (도 3a) 이는 상기 파리 모델에서 뉴런내 Aβ 축적 현상을 입증한다.
RBO/PI4KIIIα 부전증이 세포내 Aβ 축적에 영향을 주는지를 분석하기 위해, Aβ 면역염색은 Aβarc, Aβarc-rbo, 및 Aβarc-PI4KIIIα 파리에서 수행하였다. Aβarc-rbo 및 Aβarc-PI4KIIIα 파리의 면역 염색 시그날은 Aβarc 파리의 것과 비교하여 상당히 감소한 것으로 밝혀졌다 (도 3b).
실시예 7: RBO/PI4KIIIα의 하향조절은 ELISA 정량 분석에 의해 검출된 세포내 Aβ42 축적을 감소시킨다
ELISA 방법 분석:
ELISA는 제조업자의 세부항목에 따라 Aβ42 인간 ELISA 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. CNS 중 Aβ42 수준을 분석하기 위해, 종 당 25마리의 파리의 온전한 뇌를 냉 PBS 중에서 해부하고 칵테일 프로테아제 억제제 (Calbiochem)가 보충된 냉 ELISA 샘플 희석 완충액에 즉각적으로 위치시켰다. 뇌는 완전히 균질화시키고 4시간 동안 실온에서 항온처리하고 -20 ℃하에 저장하였다.
실시예 6에서와 유사하게, ELISA 정량 분석은 PAO 처리 후 Aβ42의 양이 Aβarc-rbo 파리, Aβarc-PI4KIIIα 파리, 및 Aβarc 파리에서 상당히 감소됨을 보여준다 (도 3c-3d).
도 10a는 EFR3a 유전자의 녹다운 효율의 대표적 이미지 (좌측) 및 RT-PCR 방법에 의해 N2 세포에서 정상화된 정량 (중앙)을 보여주고, 우측 이미지는 EFR3a 유전자 녹다운이 N2a 세포의 세포외 Aβ의 내포작용에 영향을 주지 않음을 설명한다. Efra 녹다운 RNAi를 작제하기 위해 사용된 서열은 5'-AGGTATCATTCAGGTTCTGTT-3' (서열번호 4)이다. 도 10b는 rbo 및 PI4KIIIa 유전자 돌연변이가 RT-PCR 방법에 의해 Aβarc-발현 파리에서 Aβarc 전사 수준을 감소시키지 않음을 보여준다.
실시예 6 및 7과 함께, RBO/PI4KIIIα 하향조절에 의해 유도된 뉴런내 Aβ 축적의 감소가 세포외 Aβ42의 섭취 감소로 인한 것이 아닐 가능성이 입증된다. 상기 이유는 다음과 같다: 1) rbo 동족체 유전자 녹다운을 갖는 N2a 세포에서 세포외 Aβ42의 섭취는 상당히 감소하지 않고 (도 10a); 2) 상이한 령(age)의 Aβarc-rbo 및 Aβarc-PI4KIIIα 파리에서 Aβarc mRNA 발현 수준은 실험 그룹에서 Aβarc 파리와 비교하여 감소되지 않는다 (도 10b).
실시예 8: PI4KIIIα 억제제 PAO, A1 및 G1의 용액 제조 및 독성 검사
HEK293 세포, 드로소필라 유충 및 성충 파리는 PAO 또는 A1로 처리하고, 10 mM 및 0.9 mM A1의 스톡 용액은 DMSO 중에 PAO 분말 (Sigma-Aldrich, CAS NO. 637-03-6) 및 A1 분말을 용해시킴에 의해 별도로 제조하였다. 이어서 증류수를 사용하여 농도 구배적으로 목적하는 농도로 희석하고; DMSO의 최종 농도는 실험 결과가 DMSO 변동에 의해 영향받지 않음을 확신하기 위해 동일한 수준으로 조정하였다.
생존 파리 상에 PAO의 독성을 시험하기 위해, 본원 발명자는 50, 100, 200, 300, 400, 및 600 μM의 PAO를 함유하는 파리 음식물로 야생형 파리를 배양하고 PAO, 배아 단계로부터 개시하였다. 200 μM 이하에서 PAO 처리가 우화율을 변화시키지 않거나 우화 후 클라이밍 능력을 변형시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서 25, 50, 100, 및 150 μM의 PAO는 Aβarc 및 대조군 파리를 배양하기 위해 선택되었다.
해부된 드로소필라 제3령 유충에 대한 PAO의 독성을 시험하기 위해, 50, 100, 200, 300, 400, 및 500 nM PAO를 함유하는 슈나이더 (Schneider) 배양 배지를 사용하여 25 ℃에서 밤새 해부된 드로소필라 제3령 유충을 배양하였다. 300 nM 이상에서 PAO로 처리된 유충 내 침샘 세포 및 CNS 뉴런을 백색으로 변화시키는 것으로 밝혀졌고 손상을 반영하고, 반면 150 nM 이하에서 PAO를 사용해서는 어떠한 효과도 없었다. 따라서 50, 100, 및 150 nM PAO는 배양을 위해 선택하였다.
HEK293T 세포에 대한 PAO 및 A1의 독성을 시험하기 위해, 50, 100, 200, 300, 400, 및 600 nM의 PAO 또는 A1을 함유하는 DMEM 배양 배지를 사용하여 12시간 동안 HEK239 세포를 배양하였다. MTT 시험에 따라, 250 nM 이상에서 PAO 또는 A1이 세포의 대부분을 사멸시키는 것으로 밝혀진 반면 150 nM 이하에서는 어떠한 효과도 없었다. 따라서 25, 50, 100, 및 150 nM의 PAO 또는 A1은 배양을 위해 선택하였다.
마우스 상에 PAO 경구 위관영양법의 독성을 시험하기 위해, PAO 분말은 DMSO 중에 용해시켜 30 mg/mL의 스톡 용액을 제조하였다. 이어서 농도 구배적으로 증류수를 사용하여 목적하는 농도로 희석시키고; DMSO의 최종 농도는 실험 결과가 DMSO 변동에 의해 영향받지 않도록 확신하기 위해 동일한 수준으로 조정하였다. 3개월령의 C57BL/6 마우스는 18, 10 및 6 mg/kg 체중의 용량에서 위관영양법에 적용하였고, 2마리의 마우스는 각각의 용량 수준에 대한 것이다. 모든 마우스는 제2 일에 죽은 것으로 밝혀졌다. 이어서 마우스는 4.5 및 2.0 mg/kg 체중의 용량으로 위관영양법에 적용하였고, 5마리의 마우스는 각각 용량 수준에 대한 것이다. 4.5 mg/kg의 체중 용량과 관련하여, 5일 연속으로 하루 1회 위관영양법에 적용하고 5마리 중 4마리의 마우스가 생존하였다. 2.0 mg/kg의 체중 용량과 관련하여, 월요일부터 금요일까지 마다 하루 1회 위관영양법을 적용하고 주말에는 위관영양법을 적용하지 않았다. 연속 2주 후, 모든 5마리의 마우스는 생존하였다. 따라서, C57/B6 마우스와 관련하여, PAO 위관영양범의 메디안 치사 용량은 2-6 mg/kg 체중이고, 대략적으로 4 mg/kg 체중이다. 따라서 0.1, 0.3 및 1.0 mg/kg 체중 용량은 APP/PS1 마우스 및 대조군 마우스에서 PAO 위관영양법을 위해 선택하였고, 연속 6주 동안 월요일부터 금요일까지 마다 하루 1회 위관영양법을 적용하고 주말에는 위관영양법을 적용하지 않았다.
실시예 9: RBO/PI4KIIIα의 하향조절은 Aβ-발현 유충 조직의 배양에 의해 검출된, Aβ42 분비를 촉진시킨다
Aβ-발현 유충 조직의 배양:
제3령 유충은 물로 세척하고 2분 동안 70 % 알콜로 멸균시키고 슈나이더 (Sigma) 배양 배지에서 등쪽 중앙선을 따라 해부하였다. 유충의 도관, 소화관, 및 지방체 (fat body)는 주의깊게 제거하였다. 상기 해부된 유충은 슈나이더 배양 배지로 세척하고 젠타마이신 (20 mg/mL)이 보충된 150 μL의 슈나이더 배양 배지를 함유하는 2 mL의 원심분리 튜브로 이전시켰다. 각각의 튜브는 5개의 해부된 유충을 함유하였다. 상기 원심분리 튜브는 25 ℃에서 8시간 동안 습한 암실 환경에 위치시켰다. 이어서 100 μL를 각각의 튜브로부터 취하고 Aβ42의 ELISA 정량을 위해 사용하였다. ELISA는 Aβ42 인간 ELISA 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다.
도 4에서, 도 4a-4c는 상이한 농도에서 PAO 처리, rbo 및 PI4KIIIα 유전자 돌연변이로 해부된 Aβarc-발현 제3령 드로소필라 유충을 항온처리하는 배지에서 Aβ42 수준의 표준화된 정량을 보여준다.
PAO 처리 기작 및 뉴런내 Aβ 축적을 감소시키는 RBO/PI4KIIIα 부전증을 조사하기 위해, 슈나이더 배양 배지에서 Aβarc-발현 제3령 유충의 해부된 샘플을 항온처리하면서 Aβ42 분비를 검출하였다. ELISA 검정은 PAO 처리가 Aβ42 분비를 촉진시키고 약물 용량 의존성 경향을 나타냄을 보여주고 (도 4a), 이는 PI4KIIIα 효소 활성의 억제가 Aβ42 분비를 촉진시킴을 입증한다. 일관되게, 해부된 Aβarc 유충을 배양하는 배지와 비교하여, Aβarc-rbo 및 Aβarc-PI4KIIIα 유충을 배양하는 배지에서 Aβ42 농도는 상당히 증가한다 (도 4b-4c).
실시예 10: RBO/PI4KIIIα의 하향조절은 인간-유래된 APP-발현 HEK293T 세포의 배양에 의해 검출된, Aβ42 분비를 촉진시킨다
인간-유래된 APP-발현 HEK293T 세포의 배양:
인간 APP로 안정하게 형질감염된 HEK293T 세포 (여기서 HEK293T-APP 세포로서 호칭됨)는 10 % FBS (Gibco), 페니실린, 스트렙토마이신, 및 G418 (100 ㎍/mL)이 보충된 DMEM (Hyclone) 중에서 배양하였다. 표적 유전자의 재조합 플라스미드 pSUPER.기본-발현 shRNA는 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)을 사용하여 HEK293T에 일시적으로 형질감염시켰다. 세포는 형질감염 후 2일 동안 항온처리하고 이어서 후속 실험하였다. 배양 배지에서 Aβ42 농도의 ELISA 정량을 위해, 새롭게 변화된 배양 배지는 12시간 동안 세포를 배양한 후 조사하였다.
HEK293T-APP 세포에서 APP의 β, 및 γ 세크레타제의 활성 및 APP 발현 수준의 검정:
HEK293T-APP 세포는 12-웰 플레이트에서 항온처리하고, 배양 유체는 0, 25, 50, 100, 또는 150 nM 농도로 PAO를 함유하였다. 6 내지 8시간 항온처리 후, 동일량의 세포를 별도로 수거하였다. 세크레타제 활성을 분석하기 위해, 세포는 500 μL의 TBS 완충액으로 별도로 용해시키고, 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 수거하고 침전물을 500 μL의 TBS 완충액으로 재현탁시켰다. α 및 β 세크레타제의 활성을 분석하기 위해, 100 μL의 상등액을 α 또는 β 세크레타제 (Calbiochem, Cat. No. 565767/565758)의 10 μM의 특이적 형광원 기질을 함유하는 2x 반응 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4 mM EDTA, 0.5 % CHAPSO (w/v))과 혼합하고; γ 세크레타제의 활성을 분석하기 위해, 100 μL의 재현탁된 용액을 γ 세크레타제(Calbiochem, Cat. No. 565764)의 10 μM의 특이적 형광원 기질을 함유하는 2x 반응 용액(50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4 mM EDTA, 0.5 % CHAPSO (w/v))과 혼합하였다. 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 미세플레이트 판독기로 분석한다 (여기/발광: α/β 효소 활성에 대해 365/490 nm, γ 효소 활성에 대해 365/440).
APP의 발현 수준을 분석하는 경우, 웨스턴 블롯팅은 프로테아제 억제제 (1 % 칵테일, invitrogen)를 함유하는 TBS 완충액으로 용해된 후 수거된 세포 상에 항-APP/Aβ 항체(6E10)를 사용하여 수행하였다.
도 14a는 HEK293T-APP 세포의 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성에 대한 PAO의 효과의 표준화된 정량을 보여주고, 각각의 데이터 포인트에 대해 n=5이고, 원-웨이 ANOVA 분석이고; 도 14b는 상이한 농도에서 PAO 처리 후 APP-APP 세포를 보여주는 대표적 면역블롯을 보여주고, 실험은 3회 이상 동안 반복하였다.
상기 촉진이 β 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 절단으로부터 유래된 Aβ42의 분비에 영향을 주는지를 검출하기 위해, HEK293T-APP 세포의 Aβ42 분비를 시험하였다. 도 4d-4g는 상이한 농도에서 PAO 및 A1 처리, EFR3a 및 PI4KA 녹다운과 함께 HEK293T-APP 세포를 항온처리하는 배지에서 Aβ42 수준의 정상화된 정량을 보여준다. 사실, 배양 배지에서의 PAO 처리는 배양 배지에서 Aβ42 농도를 증가시키는데 있어 유사한 효과를 갖고 (도 4d), PAO는 심지어 γ 세크레타제 억제제인 DAPT (1 μM)의 존재하에 배양 배지에서 Aβ42 농도를 증가시킨다 (도 4e). 주지할만하게, PAO는 여전히 PAO 농도가 매우 낮은 (1.0 nM 정도로 낮은) 경우에도 안정한 효과를 갖는다 (도 16). 추가로, EFR3a 또는 PI4KA 유전자의 녹다운 또는 HEK293T-APP 세포에서 A1 처리의 적용은 배양 배지에서 Aβ42 농도를 상당히 증가시킬 수 있다 (도 4f-4g). 데이터의 각각의 그룹에 대해 n=4~15, 원-웨이 ANOVA 분석.
PAO 및 PAO 유도체는 HEK293T-APP 세포에서 검출된 Aβ42 분비에 따라 분석하고, 하기의 결과를 표 2에 기재된 바와 같이 수득하였다:
Figure 112017130717360-pct00005
Figure 112017130717360-pct00006
Figure 112017130717360-pct00007
Figure 112017130717360-pct00008
Figure 112017130717360-pct00009
Figure 112017130717360-pct00010
Figure 112017130717360-pct00011
Figure 112017130717360-pct00012
Figure 112017130717360-pct00013
추가로, PAO는 APP를 절단하는 α, β, 및 γ 세크레타제의 활성에 영향을 주거나 (도 14a) APP 수준의 증가를 유발하는 (도 4b) 것 없이 인간-유래된 APP로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포에서 Aβ42 분비를 촉진시킨다.
PI4KIIIα와 함께 PAO 및 이의 유도체의 결합 시뮬레이션
현재, PI4KIIIα의 구조는 여전히 측정되고 보고되어야만 한다. 본원 발명자는 2개의 통상적으로 사용되는 소프트웨어, SWISS-MODEL 및 MODELLER를 채택하였고, PI4KIIIα의 6개 구조적 모델을 작제하기 위한 주형으로서 PI4KIIIβ의 보고된 4D0L 구조, PI3Kα의 4YKN 구조 및 PI3Kγ의 1e8x 구조를 참조하였다. 6개 모델의 구조는 서로 매우 일치하는 것으로 밝혀졌고; 구조 간의 평균 제곱근 편차는 3 Å 미만이다. PAO와 PI4KIIIα 간의 상호작용 파라미터는 본 모델과 함께 시뮬레이션되고 계산된다. PAO는 인간 및 다른 포유동물로부터의 PI4KIIIα의 효소 활성 센터에 결합할 수 있고, 문헌에서 추정된 바와 같이 탈수 후 인접한 시스테인과 함께 공유 결합을 형성하기 보다는 PI4KIIIα의 효소 활성 센터의 특징적인 1840번째 또는 1844번째와 함께 2개의 강한 수소 결합 (결합 길이 ~2.03 Å)을 형성한다(도 17, 좌측). 추가로, 야생형 PI4KIIIα, 또는 1844번째 시스테인에서 돌연변이를 갖는 PI4KIIIα와 함께 PAO의 결합의 동력학적 시뮬레이션이 또한 수행된다. PAO와 야생형 PI4KIIIα의 결합은 80나노초 후 안정화하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 17, 우측).
PAO가 골격 N원자 및 CYS1844의 측쇄 S 원자와 2개의 수소 결합을 형성한다는 것이 시뮬레이션으로부터 자명해졌고, 여기서, 상기 N으로의 수소 결합은 또한 2.03 Å의 O--H 거리로 강하다. 야생형 PI4KIIIα (검정) 및 1844번째 시스테인에서 돌연변이를 갖는 PI4KIIIα (적색)로의 PAO 결합의 동력학적 시뮬레이션 그래프에서, 2개의 시뮬레이션 트라젝토리의 본래의 구조와 관련하여 단백질 스캐폴드의 평균 제곱근 편차는 80나노초 후 안정화하는 경향이 있고, 여기서, 상기 구조적 변화는 C1844S에서 보다 크다.
실시예 11: 마우스에서 바이러스 생성 및 미세주사
렌티바이러스는 EmGFP와 함께 BLOCK-iTTM HiPerformTM 렌티바이러스 Pol II miR RNAi 발현 시스템을 사용하여 invitrogen (Shanghai)에 의해 제조하였다. Efr3a를 표적화하는 4개의 miRNA 올리고스를 합성하고 pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi 벡터에 삽입하였다. 녹다운 효율은 RT-PCR 또는 웨스턴 블롯 방법에 의해 시험하였다. 결과는 벡터 중 하나가 EFR3a 유전자를 과발현하는 HEK293T 세포에서 Efr3a 발현을 녹다운시키는데 가장 효과적임을 보여주었다. 최고 녹다운 효율을 갖는 벡터의 서열은 AGGTATCATTCAGGTTCTGTT이다. 가장 효과적인 miRNA 벡터는 Gateway® 재조합 반응을 통해 pDONRTM221 및 pLenti6/V5 DEST와 재조합하여 pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA 벡터를 제조하였다. 렌티바이러스는 pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNA 벡터 및 팩키징 믹스의 동시 형질감염에 의해 제조하였다. 바이러스 역가는 HEK293T 세포에서 연속 희석에 의해 수득하였다. EGFP-양성 세포는 3일마다 계수하였다. 녹다운 효율은 추가로 렌티바이러스-형질감염된 1차 해마 뉴런에서 수득하였다.
수컷 유전자전이 APP/PS1 마우스 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (MMRRC ID 034832-JAX)는 C57BL 마우스에 교배시킴에 의해 유지하였다. 6개월령에서, 마우스는 100 mg/kg의 케타민 + 20 mg/kg의 크실라진으로 마취시키고 이의 복부 밑에 놓인 전기 블랭킷을 갖는 뇌정위고정장치 상에 복부 측면을 아래로 탑재하였다. 머리에 있는 모발을 제거하고 피부를 개방 절개하고 두개골에 소형 구멍을 만들었다. 2 μL의 렌티바이러스 용액 (바이러스 역가: 6×10-7)은 주사기 펌프 (Harvard Apparatus)로 브레그마 후방의 2.1 mm에서, 측면 2.3 mm에서 및 복부 1.9 mm에서 캐뉼라 시스템 (외부 직경, 0.29 mm, 내부 직경, 0.1 mm, RWD Life Science Co., Ltd)을 통해 20분 이내에 주사하였다. 주사한지 5분 후, 바늘을 제거하고 피부를 봉합하고 마우스를 음식물 및 물의 공급과 함께 25 ℃ 환경으로 이동시켰다. 12개월령에서, 마우스는 다시 마취시키고 PBS 중 4 % 파라-포름알데하이드 (PFA)를 사용하여 관류에 적용하였다. 실험은 동물의 사용에 대한 기관 (Society for Neuroscience (USA))의 정책을 준수하였다.
실시예 12: EFR3a 녹다운은 마우스 뇌 슬라이스내 GFP 염색에 의해 시험된, APP/PS1 마우스에서 뉴런 수상돌기의 위축증을 복구시킬 수 있다
마우스 뇌 슬라이스내 GFP 염색:
뇌 슬라이스 (60 ㎛ 두께)는 1시간 동안 PBS-0.3 % triton-5 % BSA로 차단시키고, 이어서 4 ℃에서 밤새 토끼 항-GFP 항체 (A11122, invitrogen, 1:100 희석)로 항온처리하였다. 이어서 PBS로 세척하고, 4 ℃에서 밤새 비오티틸화된 염소 항-토끼 IgG 항체 (H+L) (AbboMax, Inc, 1:100 희석)로 항온처리하였다. 다시 PBS 세척하고, 실온에서 2시간 동안 Cy3-스트렙타비딘(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, 1:1000 희석)으로 항온처리하였다. 이미지는 Zeiss LSM 511 공초점 현미경하에 촬영하였고, AutoQuant X2로 디컨벌루션하고, NeuronStudio 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 뇌 슬라이스의 유전자형 및 수상돌기의 이미지는 각각 이미지화 및 분석 요원에게 알리지 않았다.
도 11에서, RT-PCR은 HEK293 세포에서 마우스 EFR3a-gfp 재조합 유전자 (c) 및 마우스의 1차 해마 뉴런에서 내부 Efr3a 유전자 (d)를 과발현하는 HEK293 세포에서 내부 EFR3a (a) 및 PI4KA 유전자 (b)의 녹다운 효율을 분석하기 위해 채택하였다. 대표적인 이미지는 상부에 있고 정상화된 정량은 하부에 있다. Efr3a 및 PI4KA 유전자 녹다운 RNAi를 작제하기 위해 사용되는 서열은 각각 5'-GGTTATTGAAATTCGAACT-3' (서열번호 5) 및 5'-TGCTCATTAGCAGTAAAGA-3' (서열번호 6)이다. 각각의 데이터에 대해 n=3-5이고, t-시험하여 P 값을 수득한다.
도 5a에서, 공초점 이미지는 항-GFP 면역염색된 전체 해마 슬라이스 (상부) 및 CA3 절편에서 렌티바이러스-형질감염된 피라미드 세포 (하부)를 보여준다. 약 30 ㎛의 수상동기 단편은 수상돌기 직경 및 척추 밀도의 정량을 위해 선택하였다. 스케일 막대는 각각 500 ㎛ (상부) 및 50 ㎛ (하부)를 나타낸다. APP/PS1 마우스 및 대조군 한배새끼의 CA3 절편 피라미드 뉴런 (도 5b) 및 CA3 절편 과립 뉴런 (도 5c)에서, EFR3a 유전자 녹다운은 수상돌기 직경 및 척추 밀도에 영향을 준다. CA3 및 DG 절편 수상돌기의 대표적인 이미지는 상부에 있고 수상돌기 직경 및 척추 밀도의 정량은 하부에 있다. 각각의 데이터 포인트는 3 내지 4마리의 동물의 n≥25 슬라이스로부터 수득하였고, P 값은 원-웨이 ANOVA 분석에 의해 수득하였다. 도 5b-5c에서, 스케일 막대는 1.0 ㎛를 나타낸다.
마우스 및 인간은 2개의 rbo 동족체, EFR3a 및 EFR3b를 소유하고 상기 둘다는 AD에 고도로 민감한 해마 및 유사 영역(Allen Brain Atlas)에 풍부하다. 본원 발명자는 EFR3a 유전자의 하향조절이 EGFP-태그된 RNAi 방법을 사용함에 의해 APP/PS1 마우스에서 해마 뉴런을 보호할 수 있는지를 조사하였다. RNAi 녹다운 효율은 도 11a-11b에 나타내었다. 공초점 이미지화는 EGFP-발현 렌티바이러스가 CA3 및 DG 절편에서 소수의 뉴런을 감염시킴을 밝혔다 (도 11a). 수상돌기 직경 및 척추 밀도는 2차 정점 수상돌기의 무작위로 선택된 인접 절편 (길이에서 약 30 ㎛) 상에서 측정하였다. 대조군 렌티바이러스로 감염된 APP/PS1 마우스의 CA3 및 DG 절편 둘다의 2개의 파라미터의 값은 야생형 대조군 마우스 및 APP/PS1 마우스에서의 것들 보다 상당히 감소하였고 (도 5b-5c), 이는 APP/PS1 마우스에서 해마 뉴런의 수상돌기 및 척추의 위축증을 지적한다. APP/PS1 마우스 간을 비교하면서, 2개의 파라미터의 값은 RNAi 렌티바이러스로 감염된 뉴런에서 상당히 증가하였고, 야생형 마우스에서 값에는 어떠한 유의적 차이가 없었다 (도 5b-5c). 따라서, APP/PS1 마우스에서 해마 뉴런내 rbo 동족체 EFR3a의 하향조절은 또한 뉴런을 보호한다.
실시예 13: PAO는 CSF 및 분획화된 마우스 뇌의 막의 조성 분석에 의해 검출된, 학습 및 기억을 개선시키고 CSF에서 Aβ42를 증가시키지만 APP/PS1 마우스의 뇌막에서 Aβ42를 감소시킨다
뇌척수액 수거:
마우스는 케타민 및 크실라진으로 마취시키고 헤드 어댑터로 고정시켰다. 목의 피부를 면도하고 개방 절단하고 하부 피하 조직 및 근육은 핀셋으로 측면으로 분리시켜 소뇌연수조 상의 경막을 노출시켰다. 미세주사 시린지에 연결된 평활 말단을 갖는 예리한 팁 유리 모세관을 사용하여 경막을 관통시켰다. 모세관 튜브 삽입에 대하 저항에서의 주지할만한 변화 후, 모세관을 소뇌연수조에 진입시키고 대략 10 내지 20 μL가 수거될 때까지 CSF가 모세관 튜브로 흘러들어가도록 하였다. 수거된 CSF는 프로테아제 억제제를 함유하는 에펜도르프 튜브로 이전시키고 사용때까지 -80 ℃에서 저장하였다.
마우스 뇌막의 분획화:
일련의 추출을 통해 세제-가용성 Aβ42를 수득한다. 마우스 뇌 반구 용적의 5배의 Tris-완충 식염수 (TBS)를 분쇄 및 균질화를 위해 첨가하고 60분 동안 100,000 g에서 원심분리하고 상등액은 TBS 추출물이었다. 침전물을 수거하고 분쇄를 위해 1 % 폴리에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르를 함유하는 5배 용적의 TBS를 첨가하고 원심분리하고 상등액은 TBS-Triton 추출물이었다. 침전물을 다시 수거하고 분쇄를 위해 1 % SDS를 함유하는 TBS를 5배 용적으로 첨가하고 원심분리하고 상등액은 TBS-SDS 추출물이었다. 모든 3개의 상등액을 수거하고 분취하고 ELISA 검정을 위해 -80 ℃ 냉장고에 저장하였다.
배양된 세포에서 이전의 결과 및 파리는 PAO가 Aβ42 분비를 촉진시키고, 뉴런내 Aβ42 축적을 감소시키고, 시냅스 실패를 완화시킴을 입증하고, 이는 PAO가 Aβ42 분비를 촉진시킴에 의해 AD를 치료하기 위한 잠재적 약물임을 지적한다. 이를 시험하기 위해, 본원 발명자는 상이한 용량으로 PAO가 위관영양법으로 투여된 APP/PS1 마우스를 사용한 행동 및 생화학적 실험을 수행하였다.
도 6a는 상이한 용량으로 PAO로 처리된 APP/PS1 마우스 (좌측) 및 야생형 한배새끼 (우측)의 모리스 워터 메이즈 훈련 곡선 (Morris Water Maze training curves)을 보여준다. 비교 목적을 위해, 0 PAO가 위관영양법으로 투여된 APP/PS1 마우스의 학습 곡선은 좌측 및 우측 그래프에 나타내었다. 도 6b는 대조군 및 훈련 후 APP/PS1 마우스의 총 검색 시간에 대해 표적 4분원에 소비된 검색 시간의 %를 보여준다. ELISA 정량을 사용하여 상이한 PAO 농도로 처리된 APP/PS1 마우스의 CSF에서 (도 6c), 및 1 % Triton 및 1 % SDS를 함유하는 TBS로 추출된 분획화된 뇌 막에서 (도 6d) Aβ42 수준을 분석하였다. 도 6e는 APP/PS1 마우스의 CSF (좌측) 및 1 % SDS를 함유하는 TBS로 추출된 분획화된 뇌막 (우측)의 ELISA 정량에서 측정된 Aβ42 값에 대해 100 ℃에서 열 처리 시간의 효과를 보여준다. 도 6f는 60분 동안 100 ℃에서 열 처리 후 1 % Triton 및 1 % SDS로 추출된 분획화된 뇌막의 ELISA 정량에서 Aβ42 수준을 보여준다. 도 6g는 총 Aβ42에 대한 1 % 트리톤 및 1 % SDS를 함유하는 TBS로 추출된 분획화된 뇌막에서 60분 동안 100 ℃에서 열 처리 후 방출된 Aβ42의 %를 보여준다. 도 6a-6b에서, 야생형 대조군에 대해 n=6-8이고, 각각의 APP/PS1 그룹에 대해 n=7-8이다. 도 6e에서, 좌측 그래프에 대해 n=3이고 우측 그래프에 대해 n=23이다. 도 6c, 6d 및 6f에서, n=5-6이다. 모든 P 값은 원-웨이 ANOVA 분석에 의해 수득하였다.
실시예 8에서 기재된 바와 같은 야생형 마우스에서 PAO 위관영양법의 독성을 조사하였고 후속 실험은 0, 0.1, 0.3 및 1.0 mg/kg의 농도 구배로 수행하였다. 4개월령 APP/PS1 마우스 및 야생형 마우스는 연속 6주 동안 월요일부터 금요일까지 마다 하루 1회 PAO 위관영양법에 적용하였다. 이어서, PAO 투여는 1주 동안 중단하고 마우스의 학습 및 기억 능력은 보르히스 및 윌리암스 (Vorhees and Williams)에 따른 수중 미로에 의해 시험하였다. 야생형 대조군과 비교하여, PAO 처리 없는 APP/PS1 마우스는 손상된 공간 학습 및 기억 능력을 나타냈다 (도 6a-6b). 이러한 손상은 가장 주지할만하게 0.3 mg/kg의 용량에서 PAO-처리된 APP/PS1 마우스에서 상당히 감소하였다 (도 6a-6b). 이러한 결과는 PAO가 APP/PS1 마우스에서 학습 및 기억 기능부전을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지적한다. 행동 시험 후, CSF를 수거하고 뇌 막 분획물은 각각의 APP/PS1 마우스로부터 추출하였다. 상기 뇌는 ELISA 정량 검정을 위해 1 % Triton X-100 또는 1 % SDS를 함유하는 2개의 TBS 완충액으로 막-결합된 Aβ42를 추출하기 위한 분획화에 적용하였다. PAO는 CSF 중에 함유된 Aβ42 수준을 증가시키고 (도 6c), 또한 가장 주지말한하게 0.3 mg/kg의 용량으로 뇌 막에서 Aβ42 수준을 예상치않게 증가시키는 것 (도 6d)으로 밝혀졌다. 그러나, 도 6f는 PAO 처리가 가장 주지할만하게 0.3 mg/kg의 용량으로 뇌 막에서 응집된 Aβ42 수준을 감소시킴을 보여준다.
실시예 14: PAO 위관영양법은 보다 많은 월령에서 APP/PS1 마우스의 인지 손상을 완화시킨다
이미 확인가능한 학습 및 기억 기능부전을 갖는 APP/PS1 마우스에 대한 PAO의 치료 효과를 연구하기 위해, 8월령 APP/PS1 마우스 및 야생형 한배새끼를 0 또는 0.3 mg/kg 체중의 용량으로 PAO 위관영양법에 적용하였고, 연속 6주 동안 월요일에서 금요일까지 마다 하루 1회 적용하였다. 이어서, 투여는 1주 동안 중단하였고, 마우스는 신규 대상 인지 시험 (NOR)에 적용하였다. 상기 결과는 PAO 처리된 마우스가 하루 전에 탐구된 늙은 대상 보다 신규 대상을 탐구하는데 보다 많은 시간을 소비함을 보여주었다. 마우스에 대한 장기 투여의 독성 뿐만 아니라 보다 늙은 월령의 APP/PS1 마우스에 대한 PAO의 연구 효과를 연구하기 위해, 18월령에서 20마리의 APP/PS1 마우스를 무작위로 2개의 그룹으로 나누고 각각 그룹에 10마리의 마우스가 있다. 하나의 그룹은 월요일에서 금요일까지 마다 하루 1회 0.3 mg/kg 체중의 용량으로 PAO 위관영양법에 적용하였고, 다른 그룹은 물 위관영양법에 적용하였고 주말에 투여하지 않았다. 연속 8개월 후, 투여는 1주 동안 중단하고 마우스는 NOR 시험에 적용하였다. 위관영양법의 8개월 동안, 2마리의 마우스는 각각의 그룹에서 죽었다. NOR 시험은 PAO 처리 그룹에서 마우스가 다른 그룹에서의 마우스 보다 신규 대상을 탐구하는데 상당히 보다 많은 시간을 소비함을 보여주었다 (도 18).
NOR 시험 디자인 및 도 18: 제1 아침에, 마우스를 후문으로부터 20×20×32 cm 투명한 아크릴 유리 박스에 위치시킴에 이어서 30분 동안 거주시킨 후 꺼내고 박스를 세정하지 않는다. 같은 날의 오후에, 카메라를 박스 앞에 위치시키고 2개의 동일한 대상을 카메라와 대면하는 박스의 2개의 구석에 위치시켰다. 하나의 마우스를 상기 박스에 위치시키고; 7분 후, 상기 마우스 및 2개의 대상을 꺼내었다. 다시, 상기 박스를 세정하지 않고; 또 다른 2개의 동일한 대상을 위치시킴에 이어서 2번째 마우스를 위치시킨다. 상기 방식으로 모든 마우스가 훈련을 마칠때까지 반복한다. 제2 일의 오후에, 동일한 박스를 사용하여 시험을 수행하였다. 2개의 대상을 상기 박스에 위치시키고, 여기서, 하나의 대상은 제1 일에 마우스에 의해 탐구되었고 다른 대상은 마우스에게 새로웠다. 시험이 7분 후 종료될 때까지 박스에 진입하는 마우스로부터의 전체 공정을 비디오 녹화하였다. 전체 시험 과정 동안에, 상기 박스는 세정하지 않았다. 오프라인 분석에서, 컴퓨터에서 비디오를 재생하고 신규하고 오래된 대상을 탐구하는데 소비되는 시간을 NOR 시험에 관여하지 않는 개인에 의해 별도로 계수하였다.
도 18에서, 상부 열은 마우스 NOR 시험 디자인의 도식적 다이아그램이다. 하부열은 NOR 시험에서 마우스에 의해 신규하고 오래된 대상 둘다를 탐구하는 총 시간과 비교하여 신규 대상을 탐구하는데 소비되는 시간의 %이다. 좌측 그래프에서 데이터 각각의 그룹은 9마리 마우스의 평균 및 SEM이다. 우측 그래프에서 데이터 각각의 그룹은 8마리 마우스의 평균 및 SEM이다. T-시험, 단일 테일드.
실시예 15: PI4KIIIα 돌연변이는 수중미로 실험에 의해 시험된, APP/PS1 마우스에서의 학습 및 기억 결함을 완화시킨다
Aβ42-발현 파리에서 PI4KIIIα 발현 수준의 유전학적 하향조절 또는 PAO를 사용한 이의 효소 활성의 억제 둘다는 신경 기능부전을 완화시키고; APP/PS1 마우스에서 PAO를 사용한 PI4KIIIα 효소 활성의 억제는 또한 학습 및 기억 능력을 개선시킨다. APP/PS1 마우스에서 신경퇴행에서 PI4KIIIa의 역할을 추가로 명백하게 하기 위해, APP/PS1 마우스에서 수중미로 실험에 대한 I4KIIIα의 이형접합성 돌연변이(Pi4kaGt(RRO073)Byg/+: PI4KA 유전자의 하나의 카피로의 트랜스포존 pGT2Lxf의 삽입은 유전자 카피의 전사를 방해할 수 있고, 수득된 mRNA는 PI4KIIIα의 N-말단 상에 처음 약 265 아미노산에 의해 형성된 절단된 단백질 및 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 해독할 수 있다) 효과를 조사하였다. Pi4kaGt(RRO073)Byg/+ 돌연변이 이형접합체 (MMRRC, Cat. #016351-UCD)는 APP/PS1 마우스와 교배하여 4개 그룹의 유전자형 마우스를 수득하였다: 야생형 (WT), PI4KIIIa 돌연변이 이형접합체 (PI4K*/+), APP/PS1 (TG) 및 PI4KIIIa 이형접합 돌연변이를 갖는 APP/PS1 (TG;PI4K*/+). 4개 그룹에서 마우스가 5개월령에 도달하는 경우, 수중미로 실험은 보르히스 및 윌리엄스에 따라 수행하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, PI4KIIIa 이형접합성 돌연변이는 5개월령 APP/PS1 마우스의 공간 학습 및 기억 결함을 상당히 완환시킬 수 있다. 도 12의 좌측은 유전자형 마우스의 4개 그룹의 학습 곡선을 보여주고, 도 12의 우측은 유전자형 마우스의 4개 그룹의 훈련일 후 첫째 날에 총 시간에 대한 표적 사분면에서 수영 시간의 %를 보여준다.
실시예 16: PAO에 의한 PI4KIIIα 발현 수준의 하향조절 및 PI4KIIIα 효소 활성의 억제 둘다는 APP/PS1 마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 손상을 상당히 완화시킨다
마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 손상에 대한 PAO에 의한 PI4KIIIα 발현 수준의 하향조절 및 PI4KIIIα 효소 활성의 억제의 효과를 검출하기 위해, 본원 발명자는 마우스 뇌 슬라이스에서 해마 CA3-CA1 시냅스의 장기 강화 (LTP)를 유도하고 기록하였다. 4월령 APP/PS1 마우스 및 야생형 한배새끼는 연속 4주 동안 월요일부터 금요일까지 마다 하루 1회 0 또는 0.3 mg/kg 체중의 용량으로 PAO 위관영양법에 적용하였다. 이어서, 투여는 1주 동안 중단하였다. 본원 발명자는 PAO 처리 없는 APP/PS1 마우스의 LTP 진폭이 PAO로 처리된 야생형 마우스 및 APP/PS1 마우스의 LTP 진폭 보다 상당히 낮음을 발견하였고 (도 19a), 이것은 PAO 처리가 APP/PS1 마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 손상을 완화시킴을 지적했다. 일관되게, 하나의 적은 카피를 갖는 PI4KA 유전자는 또한 APP/PS1 마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 손상을 상당히 완화시키고 (도 19b), 하나의 적은 카피를 갖는 PI4KA는 LTP 자체에 영향을 주지 않았다 (도 19c).
방법: 마우스 해마 슬라이스의 제조 및 해마 CA3-CA1의 LTP의 기록: 약 6월령, 30 g의 체중, 세정 등급의 마우스를 취한다. 1 % 펜토바르비탈 나트륨의 복강내 주사에 의해 마우스를 마취시킨다. 혼수 상태로 마취시키고 개흉술로 수술하여 전체 심장을 노출시키고; 절단하여 우측 외이를 개방하고; 30 mL의 4 ℃ PBS를 좌심실을 통해 50 mL 주사기 및 #3 바늘을 사용하여 신속하게 주사하고; 참수하고; 머리를 고정하고 가위로 두개골 중앙선을 따라 그리고 두개골 기반의 양쪽 측면을 따라 절단하여 두개골을 개방하고, 뇌를 ~0 ℃ 해부 유체 (해부 유체는 30분 동안 95 % O2 + 5 % CO2를 포함하는 혼합 가스로 미리 채운다)를 사용하여 연속하여 세척하고; 이어서 ~0 ℃ 해부 유체를 함유하는 플레이트 상에 전체 뇌를 위치시키고; 수술 칼 및 굴곡 트위저로 후구 및 소뇌를 제거하고; 두개골선을 따라 2개의 뇌 반구를 분리하고; 뇌 블록을 손질한 후, 소량의 에틸 α-시아노아크릴레이트 아교를 기재에 첨가하여 해마 조직이 안정하게 위치하도록 보장하고; 상기 기재를 ~0 ℃ 해부 유체를 함유하는 슬라이서 탱크내에 신속하게 위치시키고 혼합 가스를 연속으로 채우고; 시상으로 절단하여 400 ㎛의 두께를 갖는 뇌 슬라이스를 수득하고; 뇌 슬라이스를 인공 뇌척추액 (ACSF, 30분 동안 혼합 가스로 미리 채워진)을 함유하는 유리컵에 위치시키고; 사용 전 1 내지 2시간 동안 실온 (~25 ℃)에서 항온처리한다. (ACSF mM: 124 NaCl, 2 KCl, 2 MgSO4, 1.25 KH2PO4, 2 CaCl2, 26 NaHCO3, 10 D-글루코스 [pH 7.4], 300 mOsm).
표준 과정에 따라 해마 CA1 영역에서 필드 흥분 시냅스후 전위 (fEPSP)를 기록하고: 해마 CA3 영역의 샤퍼 콜레트랄에 2개의 시뮬레이팅 프로브 (FHC Inc., Bowdoin, ME)를 위치시키고, 하나의 유리 미세전극 및 하나의 기록 전극을 CA1 영역의 방사층에 위치시킨다. 시뮬레이팅 프로브와 기록 프로브간의 거리는 약 200~300 ㎛이다. 시뮬레이팅 강도는 fEPSP의 최대 진폭을 유도하기 위한 시뮬레이팅 강도의 30-50 %이고; 시뮬레이팅 주파수는 0.05 Hz이다. 유도된 fEPSP의 진폭이 20분 동안 안정화된 후, 100 Hz에서 고주파 자극은 시뮬레이팅 프로브를 통해 주어지고 20초 후 반복하였다. 시뮬레이팅 후, 0.05 Hz 시뮬레이션을 계속하고 80분 동안 fEPSP를 기록한다. 1 kHz에서 고주파 필터, 20 kHz에서 기록 주파수, 예비-증폭기는 Heka EPC 10 증폭기 (Harvard Bioscience Inc., Ludwigshafen, HRB)이다.
도 19는 PAO에 의한 PI4KIIIα 발현 수준의 하향조절 및 PI4KIIIα 효소 활성의 억제 둘다가 APP/PS1 마우스의 해마에서 시냅스 전달 가소성 장애 손상을 상당히 완화시킴을 보여준다. A-C에서, 상부 열은 고주파 시뮬레이션 전 (회색) 및 후 (검정)의 CA1의 대표적 fEPSP 기록이고, 하부 열은 정량적 분석이다. 마우스 뇌 슬라이스는 6월령에서 한배새끼 마우스의 3개 그룹으로부터 유래하거나: PAO 처리된 야생형 마우스 (WT 0.3), 비처리된 APP/PS1 마우스 (Tg 0), 및 PAO 처리된 APP/PS1 마우스 (Tg 0.3); 한배새끼 마우스의 4개의 그룹으로부터 유래하였다: 야생형 (WT), PI4KA-/+, APP/PS1 (Tg) 및 APP/PS1; PI4KA-/+ (Tg;PI4KA-/+). 각각의 데이터 포인트는 3 내지 4마리의 마우스로부터 7 내지 9개 뇌 슬라이스의 평균 및 SEM으로부터 유래한다. 원-웨이 ANNOVA 분석.
실시예 17: 리포좀 실험에 의해 시험된, 리포좀에서 Aβ42 응집/올리머고화에 대한 PI, PI4P, PI4,5P의 효과
리포좀 실험:
1) 1:1 (mg:mL)의 비율로 헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP)을 사용함에 의해 합성 Aβ42를 용해시킴에 이어서 균질화를 위해 15분 동안 실온에서 50 Hz 초음파 처리한다. 초음파기는 KUDOS 초음파 장비 (Model SK250HP)이다.
2) 별도로 클로로포름으로 상기 지질 (표 1)을 용해시켜 1:1 (mg:mL)의 비율로 리포좀을 생성하기 위해 사용된 지질 (표 3)을 제조하고 이어서 균질화를 위해 15분 동안 실온에서 50 Hz 초음파처리한다.
3) 표 3에 열거된 바와 같은 조성에 따라 지질을 혼합함에 이어서 동결건조기로 용액으로부터 유기 용매를 제거한다.
4) 1.0 mL Tris 완충액 (50 mM Tris, 120 mM NaCl, pH 7.0)으로 동결건조시킨 후 침전물을 재현시킴에 이어서 균질화를 위해 30분 동안 빙수 중에서 초음파처리하였다. 면역블롯 분석을 위해 48시간 동안 4 ℃에 유지한다 (1차 항체는 항인간화된 Aβ 모노클로날 항체 6E10이다. 1:1000 희석). 면역블롯 분석 전에, 초음파 15분은 균질화를 위해 요구된다.
Figure 112017130717360-pct00014
리포좀에서 Aβ42의 응집/올리고머화에 대한 PI, PI4P, PIP2의 효과를 분석하고 비교하였다. 도 13에서, 좌측 칼럼은 PI4P가 농도 의존적 방식으로 리포좀에서 Aβ42의 올리고머화를 촉진시킴을 보여주고, 여기서, 상부 및 하부는 각각 짧고 긴 광 노출하에 동일한 면역블롯팅 막의 결과이고; 80 μM의 PI4P 농도에서, Aβ42의 올리고머화에 대한 촉진 효과는 40 μM의 농도와 비교하여 감소하는 것으로 주지된다. 도 13의 우측 칼럼은 리포좀에서 Aβ42 응집에 대한 PI, PI4P, 및 PIP2의 촉진 효과를 보여주고, 여기서, 상부 및 하부는 각각 짧고 긴 광 노출하에 동일한 면역블롯팅 막의 결과이고; PI4P의 효과는 PI 및 PIP2 보다 상당히 강하고, Aβ42 3량체의 올리고머화에 대한 PI4P의 촉진 효과는 PI 및 PIP2의 것 보다 강한 것으로 주지된다.
실시예 18: 세포막 상에 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B, PI4KIIIa, 및 TTC7의 복합체 형성
효모 EFR3 단백질은 세포막 상에 PI4KIIIα 및 스캐폴드 단백질 YYP1 (2개의 동족체 TTC7A 및 TTC7B를 포함하는, 포유동물에서 TC7로서 언급됨)과 복합체를 형성하고 PIK가 패치함으로서 응집하고 외형질막 PI4P 수준 및 심지어 PI4,5P 수준을 함께 조절한다. YYP1은 효모 PI4KIIIa 단백질의 N-말단 및 중추 영역과 직접적으로 상호작용하여 따라서 PIK 패치의 작제 및 안정화에 중요한 역할을 수행한다 (문헌참조: Baird D, Stefan C, et al., 2008, J Cell Biol). PIK 패치의 형성 및 기능은 또한 포유동물 세포에서 보존성이다 (문헌참조: Nakatsu F, Baskin JF, et al., 2012, J Cell Biol). 파리에서 TTC7의 드로소필라 동족체는 치사 (2) k14710 (l(2) k14710) 유전자에 의해 암호화되어 있다.
뉴런내 Aβ 축적에 의해 유발된 신경퇴행에서 TTC7 단백질의 역할을 시험하기 위해, 2개의 트랜스포존 매개된 전이유전자를 Aβarc 파리에 도입하였다. P{lacW}l(2)k14710k15603 트랜스포존(Bloomington Cat. #11134)을 l(2) k14710의 전사를 예방하기 위해 l(2) k14710 유전자의 제1 엑손으로 삽입하였고; 다른 하나는 P{EPgy2}bin3EY09582 (Bloomington Stock # 20043)이다. 4개 그룹의 파리를 상기 실험에서 작제하였다: 대조군 파리 (ctrl), Aβarc 파리 (Aβarc), P{lacW}l(2) k14710k15603 (Aβarc-dttc7 +/- , TTC7 하향조절)의 하나의 카피를 갖는 Aβarc 파리 및 P{EPgy2}bin3EY09582 (Aβarc-dttc7-OE, TTC7 과발현)의 하나의 카피를 갖는 Aβarc 파리. 4개 그룹의 성인 파리가 5 내지 10일령 및 30 내지 35일령의 령 (age) 기간에 도달하는 경우, GF 경로에서 EJP의 기록은 100 Hz 뇌 자극하에 수행하였다.
도 15는 Aβarc 파리에서 신경 전달 상의 ttc7 하향조절 및 과발현의 효과의 정량 분석을 보여준다. 5 내지 10일령에서, 100 Hz 뇌 자극-유도된 신경 전달의 성공율에서는 어떠한 유의적 차이가 없지만; 30-35일령에서, Aβarc 파리의 성공율은 대조군 파리 (ctrl)의 성공율 보다 상당히 낮고, TTC7 과발현 (Aβarc-dttc7-OE)은 상기 성공율을 추가로 감소시키고, TTC7 하향조절 (Aβarc-dttc7+/-)은 신경 전달의 성공율을 증가시킨다.
본 발명을 수행하기 위해 바람직한 구현예는 본원에 기재되어 있다. 본 발명은 상기 구현예에 제한되지 않는다. 본 발명의 취지 및 원리로부터 벗어나는 것 없이 임의의 변화, 변형, 치환, 조합 및 단순화는 본 발명의 등가물에 속하고 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU NUO-BETA PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO., LTD. <120> Application of PI4KIIIA protein and related membrane protein complex in treating Alzheimer's disease <130> IPA171335-CN <150> PCT/CN2015/078058 <151> 2015-04-30 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 65 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 1 Met Ala Ser Lys Val Ser Ile Leu Leu Leu Leu Thr Val His Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Gln Thr Phe Ala Gln Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly 35 40 45 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile 50 55 60 Ala 65 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Ratus norvegicus <400> 2 Met Ala Gln Phe Leu Arg Leu Cys Ile Trp Leu Leu Ala Leu Gly Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Ala Thr Val Gln Ala 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 3 Lys Arg Ser Asn Arg Ser Lys Arg Leu Gln Tyr Gln Lys Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 aggtatcatt caggttctgt t 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 ggttattgaa attcgaact 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 tgctcattag cagtaaaga 19

Claims (15)

  1. PI4KIIIα를 특이적으로 표적화하는 PI4KIIIα 억제제를 포함하는 알츠하이머 질환를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, PI4KIIIα 억제제가 PI4KIIIα에 대해 특이적인 항체, PI4KIIIα에 특이적인 억제 뉴클레오타이드 또는 PI4KIIIα에 특이적인 소분자 화합물 억제제인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, PI4KIIIα에 특이적인 억제 뉴클레오타이드가 PI4KIIIα를 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, or shRNA인, 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, PI4KIIIα에 특이적인 억제 뉴클레오타이드가 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, PI4KIIIα에 특이적인 소분자 화합물 억제제가 소분자 화합물 억제제 G1 또는 A1 중 하나 이상으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, PI4KIIIα에 특이적인 소분자 화합물 억제제가 하기 소분자 화합물 억제제 PAO 및 PAO 유도체 중 하나 이상으로부터 선택되며, 상기 PAO 유도체가 다음을 포함하는, 약제학적 조성물:
    Figure 112019041363315-pct00061

    Figure 112019041363315-pct00062

    Figure 112019041363315-pct00063

    Figure 112019041363315-pct00064
  7. PI4P 억제제를 포함하는 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 PI4P 억제제가 PI4P에 대한 항체, OSH2-PH2X 융합 단백질 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항, 제2항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PI4P 억제제 및 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하며, 상기 PI4P 억제제가 PI4P에 대한 항체, OSH2-PH2X 융합 단백질 또는 OSH2-2x-PH 융합 단백질이고, 상기 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 억제제가 EFR3A에 특이적인 억제성 뉴클레오타이드인, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, Aβ에 대한 항체 하나 이상을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 뉴런외 Aβ 플라크 또는 침착물을 제거할 수 있는 화합물을 추가로 포함하며, 상기 뉴런외 Aβ 플라크 또는 침착물을 제거할 수 있는 화합물이 해양-유래된 황산화된 올리고사카라이드 HSH971, 아캄프로세이트, 및 에다라본으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 담체를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 표적으로서 PI4KIIIα 단백질의 키나제 활성을 사용하여 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 의약의 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성에 대한 후보 의약의 효과를 관측하는 단계를 포함하고, 상기 후보 의약이 PI4KIIIα의 포스포키나제 활성을 억제할 수 있는 경우, 상기 후보 의약이 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 잠재적 의약임을 나타내는 것인, 방법.
  13. 표적으로서 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질, TTC7 단백질 및 PI4KIIIα 단백질간의 상호작용을 사용하여 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 의약을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질 및 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용에 대한 후보 의약의 효과를 관측하는 단계를 포함하고, 상기 후보 의약이 RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B 단백질과 PI4KIIIα 단백질 간의 상호작용을 억제하여, RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B-PI4KIIIα 단백질 복합체의 형성을 감소시킬 수 있는 경우, 상기 후보 의약이 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 잠재적 의약임을 나타내는 것인, 방법.
  14. 표적으로서 외형질막 PI4P 수준을 사용하여 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 의약을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 후보 의약이 외형질막 PI4P 수준에 영향을 미치는지의 여부에 대해 관측하는 단계를 포함하고, 상기 후보 의약이 외형질막 PI4P 수준을 억제할 수 있는 경우, 상기 후보 의약이 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 잠재적 의약을 나타내는 것인, 방법.
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