KR102044620B1 - Cell Therapy Composition for Preventing or Treating Immune Disease - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD1d⁺ 및 CD226d⁺ 중 적어도 하나의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리하는 방법과 이로부터 분리된 골수성 억제세포를 유효 성분으로 포함하는 세포치료제 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 골수성 억제세포는 T 세포의 활성을 효과적으로 억제하고, 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준은 높여 이식편대숙주질환, 자가면역질환 또는 베체트병 등 면역 과민 반응에 의해 야기되는 면역 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있으며, 기존의 세포치료제로 사용되던 단핵구성 골수성 억제세포가 갖는 표현형 및 기능적 측면에서의 이질성을 나타내는 문제점 또한 해소할 수 있다. The present invention relates to a method for isolating myeloid inhibitory cells having at least one phenotype of CD1d ⁺ and CD226d ⁺ and to a cell therapeutic composition comprising the myeloid inhibitory cells isolated therefrom as an active ingredient, the myeloid inhibitory cells according to the present invention. Effectively inhibits T cell activity and increases the level of expression of MyD88 and IDO, markers of immunosuppressive activity, effectively preventing or improving immune diseases caused by immune hypersensitivity reactions such as graft-versus-host disease, autoimmune disease or Behcet's disease. In addition, the problem of expressing heterogeneity in terms of phenotype and function of mononuclear myeloid suppressor cells used as a conventional cell therapy can also be solved.

Description

면역 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물{Cell Therapy Composition for Preventing or Treating Immune Disease}Cell Therapy Composition for Preventing or Treating Immune Disease

본 발명은 다양한 면역 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 세포치료제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a cell therapeutic composition capable of effectively preventing or treating various immune diseases.

이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GVHD)은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수 내의 T 림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구 감소증 등의 증상이 나타나는 질환으로 심한 경우 환자가 사망할 수 있다.Graft-versus-host disease (GVHD) is a disease in which the immune response occurs by recognizing the donor's peripheral blood or T lymphocytes in the bone marrow as being left in the patient's body. . In other words, the disease may be caused by living lymphocytes transfused, and the immune response may cause liver dysfunction, skin lesions, jaundice, diarrhea, fever and pancytopenia.

이식편대숙주질환은 크게 급성 이식편대숙주질환(acute graft-versus-host disease, aGVHD)과 만성 이식편대숙주질환(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)으로 구분된다. Graft-versus-host disease is classified into acute graft-versus-host disease (aGVHD) and chronic graft-versus-host disease (cGVHD).

만성 이식편대숙주질환은 동종이식의 경우 이식 후 보통 4~6개월이 지나서 발생하며, 이식 80일 이전이나 1년 이후 발생하는 경우는 드물다. 따라서 동종반응이 만성 이식편대숙주질환을 일으키는 주요한 전제조건이며, 만성 이식편대숙주질환의 발명과정은 긴 잠복기를 거치거나, 표적 장기에 미치는 영향이 느리게 나타난다는 것을 알 수 있다.Chronic graft-versus-host disease usually occurs 4 to 6 months after transplantation and rarely occurs 80 days before or 1 year after transplantation. Therefore, it can be seen that allogeneic reactions are a major prerequisite for the development of chronic graft-versus-host disease, and the invention process of chronic graft-versus-host disease has a long incubation period or a slow effect on the target organs.

또한 급성 이식편대숙주질환은 동종조혈세포이식의 중요한 합병증으로, 동종조혈모세포 이식 후 대게 30~40일 이내에 발생하게 되며, 피부, 간 그리고 위장관을 침범하게 된다. 이러한 급성 이식편대숙주질환은 3단계로 발생하게 되는데, 1단계에서는 골수를 이식하기 이전에 발생하는 것으로 환자의 조직이 손상되고 경우에 따라서는 박테리아 감염 등에 의해 항원제시세포(antigen presenting cell)가 활성화되는 단계이며, 2단계에서는 이식되는 골수세포 중의 T 세포가 활성화되는 단계이다. 이미 활성화된 환자의 항원제시세포가 T 세포를 Th1 세포로 분화시키며, 궁극적으로 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시킨다. 3단계에서는 환자의 장기가 파괴된다. 활성화된 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cell) 및 자연살해세포 (natural killer cell)등이 활성화되면 이들 세포는 환자의 장기를 공격하게 되어 이식편대숙주질환이 발생하게 된다.In addition, acute graft-versus-host disease is an important complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, which usually occurs within 30 to 40 days after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and affects the skin, liver and gastrointestinal tract. This acute graft-versus-host disease occurs in three stages. In stage one, it occurs before bone marrow transplantation, which damages the tissues of the patient and, in some cases, activates the antigen presenting cells due to bacterial infection. In the second step, T cells in the bone marrow cells to be transplanted are activated. Antigen-presenting cells of already activated patients differentiate T cells into Th1 cells and ultimately increase cytokine secretion of IL-2, IFN-gamma and the like. In stage three, the patient's organs are destroyed. When cytotoxic T cells are secreted from activated Th1 cells, cytotoxic T cells and natural killer cells are activated and these cells attack the organs of the patient, causing graft-versus-host disease. do.

이러한 이식편대숙주질환을 치료하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 이식되는 골수세포 중에서 T 세포를 제거하는 방법, T 세포와 항원제시세포의 반응을 억제하기 위해 CD80, CD86 등에 대한 항체를 투여하는 방법, IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인에 대한 항체를 투여하는 방법 등이 제시되고 있다. 이와 더불어 사이클로스포린 에이, 라파마이신, FK-506 스테로이드제제 등의 화합물 면역 억제제를 투여하는 방법도 사용되고 있다. 이들 방법 중에서 T 세포의 활성화를 억제하는 화합물 면역억제제 투여법이 가장 널리 사용되고 있다.Various methods have been proposed to treat such graft-versus-host disease. Method of removing T cells from transplanted bone marrow cells, administering antibodies to CD80, CD86, etc. to suppress the response of T cells and antigen-presenting cells, antibodies to cytokines such as IL-2 and IFN-gamma The administration method etc. are proposed. In addition, methods for administering compound immunosuppressants such as cyclosporin A, rapamycin, and FK-506 steroid preparations have also been used. Among these methods, the method of administering a compound immunosuppressive agent that inhibits T cell activation is most widely used.

현재까지 많은 화합물 면역 억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린 에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 급성 이식편대숙주병을 포함하여 자가면역질환, 장기이식거부반응, 다양한 염증질환에 널리 쓰이고 있다. 사이클로스포린 에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 단점을 가지고 있어, 저용량으로 사용하는 것을 권장하고 있다.Although many compound immunosuppressants have been developed to date, cyclosporin A has the best clinical effect and is widely used in autoimmune diseases, organ transplant rejection, and various inflammatory diseases including acute graft-versus-host disease. Cyclosporin A can be used to treat diseases by completely inhibiting T cell activation when used at high doses. However, cyclosporin A has the disadvantage of showing significant side effects including kidney toxicity.

본 발명의 일 목적은 T 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 골수성 억제세포를 제공하고자 한다. One object of the present invention is to provide a myeloid suppressor cell that can effectively inhibit the proliferation of T cells and increase the level of expression of MyD88 and IDO, which are markers showing immunosuppressive ability.

본 발명의 다른 목적은 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 세포치료제 조성물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing a cell therapy composition which can effectively prevent, ameliorate or treat an immune disease.

본 발명의 또 다른 목적은 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약제를 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다. It is another object of the present invention to provide a method for screening a medicament capable of effectively preventing, ameliorating or treating an immune disease.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, CD1d⁺ 및 CD226d⁺ 중 적어도 하나의 표현형을 가지는 골수성 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)에 관한 것이다. According to an embodiment of the present invention, a myeloid-derived suppressor cell (MDSC) having a phenotype of at least one of CD1d ⁺ and CD226d ⁺ .

본 발명에서 상기 골수성 억제세포는 바람직하게는 CD1d⁺의 표현형을 가진 것일 수 있고, CD226d⁺의 표현형을 선택적으로 가질 수 있다.In the present invention, the myeloid suppressor cells may preferably have a phenotype of CD1d ⁺ and may optionally have a phenotype of CD226d ⁺ .

또한, 본 발명에서 상기 골수성 억제세포는 HLA-DR^- 및 CD14⁺ 중 적어도 하나의 표현형을 가질 수 있다. In addition, the myeloid suppressor cells in the present invention may have at least one phenotype of HLA-DR ^- and CD14 ⁺ .

또한, 본 발명에서 상기 골수성 억제세포는 CD11b⁺HLA-DR^-/low CD14⁺CD15^-의 표현형을 갖는 단핵구성(monocytic) 골수성 억제세포일 수 있다. Furthermore, the myeloid suppression by the present invention cells are HLA-DR ⁺ CD11b ^- may be a mononuclear sex (monocytic) myeloid suppressor cells having a phenotype of ^{- / low} CD14 ⁺ CD15.

본 발명에서 제공하는 골수성 억제세포는 T 세포의 증식 또는 활성을 효과적으로 억제하고, 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준을 증가시켜 다양한 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료하는 세포치료제로서 사용될 수 있다.The myeloid suppressor cells provided by the present invention effectively inhibit the proliferation or activity of T cells and increase the level of expression of MyD88 and IDO, which are markers of immunosuppressive ability, to be used as cell therapeutics for effectively preventing, improving or treating various immune diseases. Can be.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells)에 대하여 CD1d에 대한 항체 및 CD226d에 대한 항체 중 1종 이상을 이용하여 CD1d⁺ 및 CD226d⁺ 중 적어도 하나의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리하는 단계를 포함하는, 골수성 억제세포의 분리방법에 관한 것이다. According to another embodiment of the invention, the phenotype of at least one of CD1d ⁺ and CD226d ⁺ is expressed using at least one of an antibody against CD1d and an antibody against CD226d against isolated peripheral blood mononuclear cells. Eggplant relates to a method for separating myeloid suppressor cells, comprising the step of separating the myeloid suppressor cells.

본 발명에서 바람직하게는 CD1d 또는 CD226d에 대한 항체를 이용하여 CD1d⁺ 또는 CD226d⁺의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리할 수 있다. In the present invention, myeloid inhibitory cells having a phenotype of CD1d ⁺ or CD226d ⁺ can be isolated using an antibody against CD1d or CD226d.

또한, 본 발명에서는 상기 분리하는 단계 시 HLA-DR에 대한 항체를 이용하여 HLA-DR^-의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리할 수 있다. In the present invention, the myeloid inhibitory cells having the phenotype of HLA-DR ⁻ may be separated using an antibody against HLA-DR.

또한 본 발명에서는 상기 분리하는 단계 시 CD14에 대한 항체를 이용하여 CD14⁺의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리할 수 있다.In the present invention, the myeloid inhibitory cells having the phenotype of CD14 ⁺ can be isolated using an antibody against CD14.

또한, 본 발명에서는 상기 분리하는 단계 시 CD11b에 대한 항체를 이용하여 CD11b⁺의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리할 수 있다. In the present invention, the myeloid inhibitory cells having the phenotype of CD11b ⁺ can be separated by using the antibody against CD11b.

또한, 본 발명에서는 상기 분리하는 단계 시 CD15에 대한 항체를 이용하여 CD15^-의 표현형을 가지는 골수성 억제세포를 분리할 수 있다.In the present invention, the myeloid inhibitory cells having a phenotype of CD15 ⁻ can be isolated using an antibody against CD15.

본 발명에서 상기와 같이 분리된 골수성 억제세포는 T 세포의 증식 또는 활성을 효과적으로 억제하고, 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준을 증가시켜 다양한 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료하는 세포치료제로서 사용될 수 있다.In the present invention, the isolated myeloid suppressor cells effectively inhibit the proliferation or activity of T cells and increase the expression level of MyD88 and IDO, which are markers indicating immunosuppressive ability, to effectively prevent, improve or treat various immune diseases. It can be used as a therapeutic agent.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 골수성 억제세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, the present invention relates to a cell therapy composition for preventing or treating immune diseases, including the myeloid inhibitory cells according to the present invention as an active ingredient.

상기한 바와 같이, 본 발명의 골수성 억제세포는 바람직하게는 HLA-DR^-CD14⁺CD1d⁺의 표현형, 또는 HLA-DR^-CD14⁺CD226d⁺의 표현형을 가지는 단핵구성 골수성 억제세포일 수 있다. As described above, the myeloid inhibitory cells of the present invention may be mononuclear myeloid inhibitory cells having a phenotype of HLA-DR ^- CD14 ⁺ CD1d ⁺ , or a phenotype of HLA-DR ^- CD14 ⁺ CD226d ⁺ .

일반적으로 단핵구성 골수성 억제세포는 표현형(phenotypic) 및 기능적(functional) 측면에서 이질성(heterogeneity)을 나타내는 문제점이 있어 치료제로 사용하는 데에 한계가 존재하였다. In general, mononuclear myeloid suppressor cells have a problem in that they exhibit heterogeneity in terms of phenotypic and functional aspects, and thus there is a limit in using them as therapeutic agents.

하지만, 본 발명에서는 HLA-DR^-CD14⁺CD1d⁺의 표현형, 또는 HLA-DR^-CD14⁺CD226d⁺의 표현형을 가지는 단핵구성 골수성 억제세포를 사용함으로써 종래의 골수성 억제세포의 이질성 문제점으로 인한 세포치료제로의 적용 상 한계점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 상기한 골수성 억제세포는 T 세포의 증식 또는 활성을 특이적으로 억제하고, 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준을 현저히 높여 다양한 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. However, the present invention uses a mononuclear myeloid suppressor cell having a phenotype of HLA-DR ^- CD14 ⁺ CD1d ⁺ , or a phenotype of HLA-DR ^- CD14 ⁺ CD226d ⁺ as a cell therapeutic agent due to heterogeneity of conventional myeloid suppressor cells. In addition to solving the limitations of the application, the myeloid inhibitory cells specifically inhibit the proliferation or activity of T cells and significantly increase the expression level of MyD88 and IDO, which are markers of immunosuppressive ability, to effectively prevent various immune diseases. Prevention, amelioration or treatment.

본 발명에서 상기 면역 질환은 면역 과민 반응에 의해 야기되는 이식편대숙주질환, 자가면역질환 및 베체트병으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the immune disease may be selected from the group consisting of graft-versus-host disease, autoimmune disease and Behcet's disease caused by an immune hypersensitivity reaction, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 이식편대숙주질환은 동종이식 후 발생되는 급성 이식편대숙주질환(acute graft-versus-host disease, aGVHD) 또는 만성 이식편대숙주질환(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)일 수 있다. In the present invention, the graft-versus-host disease may be acute graft-versus-host disease (aGVHD) or chronic graft-versus-host disease (cGVHD) occurring after allograft. .

본 발명에서 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쇼그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, sepsis shock, allergic asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, ulcerative colitis, lacrimitis, Alzheimer's disease, stroke, arteriosclerosis, vascular restenosis, Type I diabetes, type II diabetes, gall margin, conjunctivitis, psoriasis, systemic inflammatory syndrome, multiple myositis, dermatitis, nodular polyarthritis, mixed connective histosis, Sjogren's syndrome, gout, Parkinson's disease, muscular dystrophy, scleroderma, diabetic retinopathy Selected from the group consisting of multiple sclerosis, Crohn's disease, chronic thyroiditis, ceriac disease, myasthenia gravis, vulgaris, viral diseases, bacterial diseases, radiation-induced disorders, arteriosclerosis, hemangioma, angiofibromas, reperfusion disorders and cardiac hypertrophy It may be, but is not limited thereto.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 면역 질환을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, "prevention" means any action that inhibits or delays the progression of an immune disease by administration of a composition of the present invention.

본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 면역 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다."Treatment" and "improvement" in the present invention means all the actions that improve or beneficially change the symptoms of the immune disease by administration of the composition of the present invention.

본 발명의 조성물은 면역 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 골수성 억제세포를 포함할 수 있다. 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포치료제 조성물에 포함되는 골수성 억제세포의 함량(수)은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 예를 들면, 1X10⁴ cells/kg ~ 1X10⁸cell/kg의 골수성 억제세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The composition of the present invention may comprise a therapeutically effective amount of myeloid inhibitory cells for the treatment of immune diseases. A therapeutically effective amount means the amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician. Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder being treated. It is apparent to those skilled in the art that the content (number) of myeloid inhibitory cells included in the cell therapy composition of the present invention will vary depending on the desired effect. Therefore, the optimal cell therapy content can be readily determined by one skilled in the art and includes the type of disease, the severity of the disease, the amount of other components contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, general health, sex and diet of the patient. It can be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration and the rate of administration of the composition, the duration of treatment, the drug used concurrently, for example, 1X10 ⁴ cells / kg to 1X10 ⁸ cells / kg myeloid inhibitory cells It may be included, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 조성물은 포유동물, 바람직하게는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the composition may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, the composition may be characterized in that it is intended for mammals, preferably humans.

본 발명의 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.The composition of the present invention may be used in the form of oral dosage forms, such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. . The composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc. In the case of injections, buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used. Formulations of the compositions of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms. have. And others, solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.Examples of suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.

본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. Routes of administration of the compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual Or rectal. Oral or parenteral release is preferred.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.In the present invention, "parenteral" includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.

본 발명의 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.The compositions of the present invention vary depending on several factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed. The dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, extent of disease, drug form, route of administration and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art and may be 0.0001 to 50 mg / kg or It may be administered at 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect. The pharmaceutical compositions according to the invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.

본 발명의 조성물은 단독으로, 혹은 종전의 이식편대숙주질환, 자가면역질환 또는 베체트병의 치료제 등과 혼합하여 사용할 수 있고, 혹은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition of the present invention can be used alone or in combination with a therapeutic agent for graft-versus-host disease, autoimmune disease or Behcet's disease, or a method for using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers. It can be used together with these.

또한, 본 발명은 또한 면역 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 골수성 억제세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 본 발명의 세포치료제 조성물은 면역 질환의 예방 또는 치료용 의약품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.The present invention also provides the use of a cell therapy composition comprising myeloid inhibitory cells as an active ingredient for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of immune diseases. The cell therapy composition of the present invention can be used for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of immune diseases.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 세포치료제 조성물을 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트를 제공할 수 있으며, 상기 키트는 당업계에서 사용되고 있는 키트 제조방법에 따라 제조할 수 있고, 다만 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분으로서 본 발명의 골수성 억제세포를 유효성분을 포함할 수 있다. According to another embodiment of the invention, it is possible to provide a personalized kit for the prevention or treatment of immune diseases comprising the cell therapy composition according to the present invention, the kit is prepared according to the kit manufacturing method used in the art It can be, but may include the active ingredient myeloid inhibitory cells of the present invention as an active ingredient that can induce a therapeutic effect.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 개체에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 세포치료제 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.According to another embodiment of the present invention, a method for preventing or treating an immune disease comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the cell therapy composition according to the present invention.

본 발명에서 상기 "치료를 필요로 하는 개체"란 면역 과민 반응에 의해 야기되는 이식편대숙주질환, 자가면역질환 및 베체트병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 면역 질환이 발병되었거나 그 발병이 의심되는 환자를 의미한다. In the present invention, the "individual in need" refers to a patient having or suspected of having an immune disease selected from the group consisting of graft-versus-host disease, autoimmune disease and Behcet's disease caused by an immune hypersensitivity reaction. do.

본 발명에서 "환자"는 본 발명의 세포치료제 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 원숭이, 개, 염소, 돼지, 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼 또는 영장류 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 인간(치료, 억제 또는 예방)용일 뿐만 아니라 상업적으로 유용한 다른 동물들에게도 적용될 수 있다. In the present invention, "patient" means a human and an animal such as monkey, dog, goat, pig, mouse, rat, guinea pig, rabbit or primate having a disease that can improve symptoms by administering the cell therapy composition of the present invention. . The composition according to the invention can be applied not only for humans (treatment, inhibition or prevention) but also to other commercially useful animals.

본 발명의 치료 방법에 있어서, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 조성물에 포함되는 세포치료제(골수성 억제세포)는 1X10⁴ cell/kg 내지 1X10⁸ cell/kg의 양을 포함하는 것이 바람직하다. In the treatment method of the present invention, when the cell therapy composition of the present invention is administered once to several times a day, the cell therapy agent (myeloid inhibitory cells) included in the composition may contain an amount of 1 × 10 ⁴ cells / kg to 1 × ^{10 8} cells / kg. It is preferable to include.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.In the treatment method of the present invention, the cell therapy composition of the present invention may be administered in a conventional manner through the rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular or intradermal routes.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 면역 질환 동물 모델에 면역 질환 치료용 후보 물질을 투여하는 단계; 및 According to another embodiment of the present invention, the method comprises: (1) administering a candidate substance for treating an immunological disease to an immune disease animal model; And

(2) 상기 동물 모델으로부터 골수성 억제세포의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 면역 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. (2) relates to a method for screening an immunological disease therapeutic agent comprising measuring the expression level of myeloid inhibitory cells from the animal model.

본 발명에서 상기 면역 질환 동물 모델은 인간에 있어서 면역 과민 반응에 의해 야기되는 면역 질환으로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 이식편대숙주질환, 자가면역질환 및 베체트병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 면역 질환과 유사한 임상적, 병리적, 조직학적 특징을 나타내는 어떠한 동물 모델이라도 무방하나, 바람직하게는 상기한 면역 질환이 유도된 포유동물 모델로, 예를 들면 마우스, 랫트, 기니피그, 원숭이, 개, 염소, 돼지, 토끼 또는 영장류 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the immune disease animal model is an immune disease caused by an immune hypersensitivity reaction in humans, but is not limited thereto. For example, the immune disease is selected from the group consisting of graft-versus-host disease, autoimmune disease and Behcet's disease. Any animal model exhibiting clinical, pathological and histological characteristics similar to the disease may be used, but preferably a mammalian model derived from the above-mentioned immune disease, for example, mouse, rat, guinea pig, monkey, dog, goat , Pigs, rabbits or primates, etc., but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 면역 질환 동물 모델에 면역 질환 치료용 후보물질을 투여하는 방법은 특별히 제한하지 않으며, 사용되는 후보 물질의 종류에 따라 적절한 수준으로 조절할 수 있으나, 예를 들면 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.In the present invention, the method for administering the candidate substance for the treatment of immune disease in the animal model of immune disease is not particularly limited and may be adjusted to an appropriate level depending on the type of candidate substance used, for example, rectal, intravenous, intraarterial. Administration may be by conventional methods via the intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intraocular or intradermal routes.

또한, 본 발명에서 상기 면역 질환 동물 모델에 면역 질환 치료용 후보물질을 투여하는 양 또한 질환의 종류, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으나, 예를 들면, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있고, 또한, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. In addition, in the present invention, the amount of administering a candidate substance for treating an immunological disease to the animal model of the immunological disease also depends on the type of disease, the drug form, the administration route and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. It may be administered at 0.0001 to 50 mg / kg or 0.001 to 50 mg / kg per day, or may be administered once a day or may be administered several times.

본 발명에서 상기 골수성 억제세포의 발현 수준은 동물 모델로부터 분리된 시료로, 바람직하게는 개체로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장 또는 림프로부터 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the expression level of the myeloid suppressor cells may be measured in a sample isolated from an animal model, preferably from blood, serum, plasma or lymph, isolated from an individual, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 골수성 억제세포는 HLA-DR^- 및 CD14⁺의 표현형을 가지며, CD1d⁺ 및 CD226d⁺ 중 적어도 하나의 표현형을 가지는 골수성 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)일 수 있고, 바람직하게는 HLA-DR^-, CD14⁺ 및 CD1d⁺의 표현형을 가지며, 선택적으로 CD226d⁺의 표현형을 가진 것일 수 있다.In the present invention, the myeloid suppressor cells may be myeloid-derived suppressor cells (MDSC) having a phenotype of HLA-DR ⁻ and CD14 ⁺ , and having at least one phenotype of CD1d ⁺ and CD226d ⁺ . Has a phenotype of HLA-DR ⁻ , CD14 ⁺ and CD1d ⁺ , and may optionally have a phenotype of CD226d ⁺ .

또한, 본 발명에서 상기 골수성 억제세포는 CD11b⁺HLA-DR^-/low CD14⁺CD15^-의 표현형을 갖는 단핵구성 골수성 억제세포일 수 있다.In addition, in the present invention, the myeloid suppressor cells may be mononuclear myeloid suppressor cells having a phenotype of CD11b ⁺ HLA-DR ^{− / low} CD14 ⁺ CD15 ⁻ .

본 발명에서 상기 (2) 단계, 즉 면역 질환 치료용 후보물질의 투여 후 투여 전과 비교하여 상기 동물 모델에서 본 발명에 따른 골수성 억제세포로 HLA-DR^-CD14⁺CD1d⁺의 표현형, 또는 HLA-DR^-CD14⁺CD226d⁺의 표현형을 갖는 단핵구성 골수성 억제세포의 발현 수준이 증가하는 경우 상기 후보물질을 면역 질환의 치료에 유효한 효과가 있는 치료용 약제로 선별할 수 있다. In the present invention, the phenotype of HLA-DR ^- CD14 ⁺ CD1d ⁺ , or HLA-DR as the myeloid suppressor cells according to the present invention in the animal model, compared to the step (2), ie, after administration of the candidate substance for treating an immune disease, before administration. ^When the expression level of mononuclear myeloid suppressor cells having the phenotype of CD14 ⁺ CD226d ⁺ is increased, the candidate may be selected as a therapeutic agent having an effective effect in the treatment of immune diseases.

본 발명에 따른 골수성 억제세포는 T 세포의 증식 또는 활성을 효과적으로 억제하고, 면역 억제능을 나타내는 마커인 MyD88 및 IDO의 발현 수준을 현저히 증가시켜 이식편대숙주질환, 자가면역질환 또는 베체트병 등 면역 과민 반응에 의해 야기되는 면역 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있으며, 기존의 세포치료제로 사용되던 단핵구성 골수성 억제세포가 갖는 표현형 및 기능적 측면에서의 이질성을 나타내는 문제점 또한 해소할 수 있다. Myeloid inhibitory cells according to the present invention effectively inhibit the proliferation or activity of T cells and significantly increase the level of expression of MyD88 and IDO, which are markers of immunosuppressive ability, thereby causing immune hypersensitivity reactions such as graft-versus-host disease, autoimmune disease or Behcet's disease. It can effectively prevent or improve the immune disease caused by, and can also solve the problem of heterogeneity in terms of phenotypic and functional aspects of the mononuclear myeloid suppressor cells used as a conventional cell therapy.

또한, 본 발명에서는 상기 면역 질환이 유도된 동물 모델에 상기 면역 질환을 치료하는 후보물질을 투여한 뒤 본 발명에 따른 골수성 억제세포의 발현 수준을 측정함으로써 상기 면역 질환을 실제적으로 예방 또는 치료하는 효과가 있는 유효 약제를 스크리닝할 수 있다. In addition, the present invention is effective to prevent or treat the immune disease by measuring the expression level of myeloid inhibitory cells according to the present invention after administering a candidate substance for treating the immune disease in the animal model induced the immune disease. Effective agents can be screened for.

도 1은 7명의 allo-HSCT 환자의 PB 유래 PBMNCs로부터 분리 및 정제된 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSC 세포의 세포 표면 마커를 확인하기 위한 실험 모식도를 개략적으로 나타낸 것이다. 단, HLA-DR- 서브세트에서 CD14 발현 수준과의 상관 관계에 근거하여, 세포 표면 분자의 발현 패턴을 음성; 희미함(dim) 또는 낮음(low); 밝음(bright) 또는 높음(high);의 3가지 군으로 분류하였다.
도 2는 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs 세포에서 CD11b, CD13, CD33, CD34, CD38, CD39, CD40, CD80, 및 CD83 마커의 발현 수준을 양성(positive), 희미한(dim) 또는 음성(negative)으로 분류한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs 세포에서 CD1d, CD11c, CD24, CD42b, CD46, CD49a, CD49e, CD49d, CD49f, CD52, CD53, CD54, CD56, CD62L, CD62P, CD66a/c/e, CD69, CD71, CD81, CD84, CD85d, CD85h, CD85j, CD85k, CD220, CD226, CD244, CD317, 및 CD328 마커의 발현을 FACS 플럿(plot)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs 세포에서 상기 29개 마커의 빈도를 유세포 분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs 세포에서 상기 29개 마커의 MFI를 나타낸 것이다.
도 6은 상기 29개 마커 양성 세포군에서 CD14⁺ 세포와 CD14^- 세포의 분포를 나타낸 것이다.
도 7은 추가의 15명의 allo-HSCT 환자의 PB 유래 PBMNCs로부터 분리 및 정제된 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSC 세포에서 CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328의 6개의 마커의 빈도를 유세포 분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 상기 6개 마커 양성 세포군에서 CD14⁺ 세포와 CD14^- 세포의 분포를 나타낸 것이다.
도 9는 qRT-PCR을 이용하여 G-MDSCs과 비교하여 M-MDSCs에서 CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328의 6개의 마커의 전사 수준의 비율을 그래프로 나타낸 것이다. 그래프에서 각 바(bar)는 3번의 독립된 실험의 평균과 표준 편차로 나타낸 것이다(*p<0.05).
도 10은 분리된 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포와 HLA-DR^-CD1d^- 세포에서 면역 억제능과 관련된 유전자인 MyD88, ARG1, IDO, iNOS, 및 NOX2의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 평균 발현 값은 GAPDH로 정규화하였다.
도 11은 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포와 HLA-DR^-CD1d^- 세포 각각을 T 세포와 1:1의 비율로 혼합하여 5일간 배양한 후 CD3+ T 세포의 증식율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 그래프에서 각 바(bar)는 3번의 독립된 실험의 평균과 표준 편차로 나타낸 것이다(*p<0.01).
도 12는 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포와 HLA-DR^-CD1d^- 세포 각각을 T 세포와 1:1의 비율로 혼합하여 5일간 배양한 후 CD4+ T 세포의 증식율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 그래프에서 각 바(bar)는 3번의 독립된 실험의 평균과 표준 편차로 나타낸 것이다(*p<0.01).
도 13은 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포와 HLA-DR^-CD1d^- 세포 각각을 T 세포와 1:1의 비율로 혼합하여 5일간 배양한 후 CD28+ T 세포의 증식율을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 그래프에서 각 바(bar)는 3번의 독립된 실험의 평균과 표준 편차로 나타낸 것이다(*p<0.01).1 schematically shows an experimental schematic for identifying cell surface markers of HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSC cells isolated and purified from PB-derived PBMNCs of seven allo-HSCT patients. Provided that the expression pattern of cell surface molecules is negative based on the correlation with CD14 expression levels in the HLA-DR- subset; Dim or low; Bright or high;
2 shows positive, dim or negative expression levels of CD11b, CD13, CD33, CD34, CD38, CD39, CD40, CD80, and CD83 markers in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs cells. The results are classified into).
Figure 3 shows CD1d, CD11c, CD24, CD42b, CD46, CD49a, CD49e, CD49d, CD49f, CD52, CD53, CD54, CD56, CD62L, CD62P, CD66a / c / e, in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs cells. Expression of CD69, CD71, CD81, CD84, CD85d, CD85h, CD85j, CD85k, CD220, CD226, CD244, CD317, and CD328 markers is analyzed by FACS plot.
Figure 4 shows the results of measuring the frequency of the 29 markers in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs cells by flow cytometry.
5 shows the MFI of these 29 markers in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs cells.
Figure 6 shows the distribution of CD14 ⁺ cells and CD14 ^- cells in the 29 marker positive cell population.
7 shows the frequency of six markers of CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSC cells isolated and purified from PB derived PBMNCs of an additional 15 allo-HSCT patients. The results measured by flow cytometry are shown.
8 shows the distribution of CD14 ⁺ cells and CD14 ⁻ cells in the six marker positive cell populations.
9 graphically depicts the ratio of transcription levels of six markers of CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 in M-MDSCs compared to G-MDSCs using qRT-PCR. Each bar in the graph represents the mean and standard deviation of three independent experiments (* p <0.05).
10 shows the results of analyzing the expression levels of MyD88, ARG1, IDO, iNOS, and NOX2 genes related to immunosuppressive activity in isolated HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and HLA-DR ^- CD1d ^- cells by qRT-PCR. will be. Mean expression values were normalized to GAPDH.
11 shows the results of analyzing the proliferation rate of CD3 + T cells after 5 days of incubation by mixing HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and HLA-DR ^- CD1d ^- cells at a ratio of 1: 1 with T cells. Each bar in the graph represents the mean and standard deviation of three independent experiments (* p <0.01).
FIG. 12 shows the results of analyzing the proliferation rate of CD4 + T cells after 5 days of incubation by mixing HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and HLA-DR ^- CD1d ^- cells at a ratio of 1: 1 with T cells. Each bar in the graph represents the mean and standard deviation of three independent experiments (* p <0.01).
FIG. 13 shows the results of analyzing the proliferation rate of CD28 + T cells after 5 days of incubation by mixing HLA-DR ⁻ CD1d ⁺ cells and HLA-DR ⁻ CD1d ⁻ cells at a ratio of 1: 1 with T cells. Each bar in the graph represents the mean and standard deviation of three independent experiments (* p <0.01).

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example

1. 혈액 샘플 채취1. Blood Sample Collection

하기 표 1에 나타낸 조건을 갖는 동종조혈모세포 이식술(allo-HSCT)을 받은 40명 환자로부터 말초 혈액을 채취하였다. 동종조혈모세포 이식술(allo-HSCT)은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoid leukemia) 및 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 환자에 대하여 수행되었다.Peripheral blood was collected from 40 patients who underwent allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) with the conditions shown in Table 1 below. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) was performed in patients with acute myeloid leukemia, acute lymphoid leukemia and myelodysplastic syndrome.

조건Condition 환자 (n = 40) (%)Patient (n = 40) (%) Age (y), median (range)Age (y), median (range) 48 (22-70)48 (22-70) 성별, 남성/여성Gender, male / female 25 (62.5)/15 (37.5)25 (62.5) / 15 (37.5) 진단
AML/ALL/MDS
림프종(Lymphoma)/기타Diagnosis
AML / ALL / MDS
Lymphoma / Other
19 (47.5)/6 (15)/9 (22.5)
4 (10)/2 (5)
19 (47.5) / 6 (15) / 9 (22.5)
4 (10) / 2 (5) Pre-HSCT 질환 상태
표준(Standard)/진행(Advanced*)Pre-HSCT Disease Status
Standard / Advanced *
29 (72.5)/11 (27.5)
29 (72.5) / 11 (27.5) 공여자
형제자매/무관/FMTDonor
Siblings / Anyone / FMT
12 (30)/16 (40)/12 (30)
12 (30) / 16 (40) / 12 (30) 이식 근원
BM/PBSCTransplant source
BM / PBSC
1 (2.5)/39 (97.5)
1 (2.5) / 39 (97.5) 전처치
TBI 기반/비-TBI 기반Pretreatment
TBI-based / non-TBI-based
31 (77.5)/9 (22.5)
31 (77.5) / 9 (22.5) 처치 강도
MAC/RICAid strength
MAC / RIC
13 (32.5)/27 (67.5)
13 (32.5) / 27 (67.5) ATG 함유
Yes/NoContains ATG
Yes / No
30 (75)/10 (25)
30 (75) / 10 (25) GVHD 예방
CS 기반/FK506 기반GVHD Prevention
CS based / FK506 based
12 (30)/28 (70)
12 (30) / 28 (70) 이식 후 진행 상태란 첫 관해(remission) 후 급성 백혈병(acute leukemia), 고위험성 골수 이형성 증후군(high-risk myelodysplatic syndrome) (international prognostic scoring system≥intermediate-2), 항생제 내성 림프종이 발생한 것을 의미한다. Progression after transplantation means acute leukemia, high-risk myelodysplatic syndrome (international prognostic scoring system≥intermediate-2), and antibiotic-resistant lymphoma after remission.

2. 세포 선별(Cell sorting)2. Cell sorting

상기 실시예 1에서 채혈 후 4시간 안에 분별 밀도 구배 분리법(Ficoll-Paque, GE Healthcare)에 의하여 인간 말초혈액 단핵세포(Human peripheral blood mononuclear cells)를 분리하였다. HLA-DR, CD14, 및 CD1d 항체(Miltenyi Biotech)를 사용하여 자기-활성화 세포 분리 시스템(magnetic-activated cell sorting system, MACS)를 이용해 골수성 억제세포를 분리하였다. In Example 1, human peripheral blood mononuclear cells were isolated by fractional density gradient separation (Ficoll-Paque, GE Healthcare) within 4 hours after blood collection. Myeloid suppressor cells were isolated using a magnetic-activated cell sorting system (MACS) using HLA-DR, CD14, and CD1d antibodies (Miltenyi Biotech).

3. 세포 표면 마커 스크리닝3. Cell Surface Marker Screening

HLA-DR^-CD14⁺ 표현형을 갖는 단핵구성 MDSC(M-MDSC) 서브세트의 마커를 확인하기 위하여, HLA-DR^- 분리된 세포를 CD14 항체로 염색하였다. 342개의 정제된 단일클론항체를 포함하는 LEGENDScreen 인간 세포 스크리닝 키트(BioLegend)를 이용하여 세포를 특징화하였다. 96 웰 플레이트에 세포를 1% FBS-PBS를 포함하는 각 웰당 3X10⁵ 세포수로 분주하였다. 염색 후 즉시 BD FACSCanto II (BD bioscience)를 사용하여 분석을 수행하였다. 분석은 7명의 도너(donors)를 이용하여 수행하였다. To identify markers of the mononuclear MDSC (M-MDSC) subset with the HLA-DR ^- CD14 ⁺ phenotype, HLA-DR ^- isolated cells were stained with CD14 antibody. Cells were characterized using the LEGENDScreen Human Cell Screening Kit (BioLegend) containing 342 purified monoclonal antibodies. Cells were dispensed in 96 well plates at ³ × 10 ⁵ cell numbers per well containing 1% FBS-PBS. The assay was performed immediately after staining using BD FACSCanto II (BD bioscience). Analysis was performed using seven donors.

4. 유세포 분석(Flow cytometry analysis)4. Flow cytometry analysis

유세포 분석기를 이용하여 면역 표현형 특성화(immunophenotypic characterization)를 수행하였다(B. An, E. Kim, H. Song, K.S. Ha, E.T. Han, W.S. Park, T.G. Ahn, S.R. Yang, S. Na, S.H. Hong, Gestational Diabetes Affects the Growth and Functions of Perivascular Stem Cells, Mol Cells 40 (2017) 434-439.). 간략히는 세포를 1% FBS-PBS에 재부유시킨 뒤 형광 색소가 컨쥬게이트된 항체로, CD14-APC (BD Bioscience), HLA-DR-FITC, CD1d-PE, CD49a-PE, CD226-PE, CD244-PE, CD317-PE, 및 CD328-PE (all BioLegend)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 세포 표면을 염색하였다. 면역 염색 후 세포를 세척한 뒤 사멸한 세포를 제거하기 위하여 세포를 7-아미노 악티노마이신(7-amino actinomycin, 7AAD)으로 염색하였다. 음성 대조군은 대응되는 세포로부터 비특이적 IgG에 해당한다. BD FACSCanto II 및 FlowJo software(Tree Star)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. Immunophenotypic characterization was performed using flow cytometry (B. An, E. Kim, H. Song, KS Ha, ET Han, WS Park, TG Ahn, SR Yang, S. Na, SH Hong, Gestational Diabetes Affects the Growth and Functions of Perivascular Stem Cells, Mol Cells 40 (2017) 434-439.). Briefly, the cells were resuspended in 1% FBS-PBS and then conjugated with fluorescent dyes to CD14-APC (BD Bioscience), HLA-DR-FITC, CD1d-PE, CD49a-PE, CD226-PE, CD244 Cell surface was stained for 1 hour at 4 ° C. using -PE, CD317-PE, and CD328-PE (all BioLegend). After washing the cells after immunostaining, the cells were stained with 7-amino actinomycin (7AAD) to remove dead cells. Negative controls correspond to nonspecific IgG from the corresponding cell. Flow cytometry was performed using BD FACSCanto II and FlowJo software (Tree Star).

5. RNA 추출 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)5. RNA extraction and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)

RNeasy 미니 키트(Qiagen, Limburg, Netherlands)를 이용하여 정제된 MDSCs로부터 총 RNA를 추출하였다. TOPscriptTM RT Dry mix (Enzynomics)를 이용하여 cDNA 합성을 위한 역전사를 수행하였다. StepONE plus real-time PCR system (Applied Biosystems)에서 TOPreal qPCR 2X PreMIX with SYBR Green (Enzynomics)을 이용하여 실시간 정량적 PCR을 3회 수행하였다. 증폭(amplification)은 하기의 조건 하에서 수행되었다: 95℃에서 5분, 95℃에서 15초 동안 40 사이클, 60℃에서 1분. 상대적인 유전자 발현 수준은 GAPDH를 이용하여 정규화하였다. 프라이머는 하기 표 2에 나타낸 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. Total RNA was extracted from purified MDSCs using the RNeasy mini kit (Qiagen, Limburg, Netherlands). Reverse transcription for cDNA synthesis was performed using TOPscriptTM RT Dry mix (Enzynomics). In the StepONE plus real-time PCR system (Applied Biosystems), real-time quantitative PCR was performed three times using TOPreal qPCR 2X PreMIX with SYBR Green (Enzynomics). Amplification was performed under the following conditions: 5 minutes at 95 ° C., 40 cycles for 15 seconds at 95 ° C., 1 minute at 60 ° C. Relative gene expression levels were normalized using GAPDH. The primers used forward and reverse primers shown in Table 2 below.

유전자gene 방향direction 서열order CD1dCD1d FF ATCAGTACCTCACGGCTGCTATCAGTACCTCACGGCTGCT RR TGGGTATCTCAGGCATCTCCTGGGTATCTCAGGCATCTCC CD49aCD49a FF CTGTCCTGCGTGTTGAAAGACTGTCCTGCGTGTTGAAAGA RR TTCTGCTTGAGAGGTGCTGATTCTGCTTGAGAGGTGCTGA CD226CD226 FF TACCCCCAGGAGAAGATTCCTACCCCCAGGAGAAGATTCC RR TTTTCTGCCAGTGCCTCTTTTTTTCTGCCAGTGCCTCTTT CD244CD244 FF GTGCAGTTTTGCCAAGGAGGTGCAGTTTTGCCAAGGAG RR CTCTGCACCCAGTTTTCCTTCTCTGCACCCAGTTTTCCTT CD317CD317 FF AACCTCCTCTCTGCCATCAAAACCTCCTCTCTGCCATCAA RR CCAAAGTAGACCTGCCCAGACCAAAGTAGACCTGCCCAGA CD328CD328 FF TGCTTGTCTGGAACAACTGCTGCTTGTCTGGAACAACTGC RR TGAGCATCTACGGTTTGCTGTGAGCATCTACGGTTTGCTG iNOSiNOS FF AAGATTGGAAGACCCGTTTGAGAAGATTGGAAGACCCGTTTGAG RR GCAAGACCATATTTGCTGGCTGCAAGACCATATTTGCTGGCT ARG1ARG1 FF TGCTGTGACAACGACATCAACTGCTGTGACAACGACATCAAC RR GTGAGGGTTCGTGACCAGGGTGAGGGTTCGTGACCAGG IDOIDO FF CAGATCCATTTTACGCTGATCCACAGATCCATTTTACGCTGATCCA RR TCCTCGCAAAACAGGCTGAGTCCTCGCAAAACAGGCTGAG MyD88Myd88 FF GAAAAAGAGCCGGTTGAAAAGCGAAAAAGAGCCGGTTGAAAAGC RR ACTGTACGTTGTCTGCAAGGTACTGTACGTTGTCTGCAAGGT GAPDHGAPDH FF TGCACCACCAACTGCTTAGCTGCACCACCAACTGCTTAGC RR GGCATGGACTGTGGTCATGAGGGCATGGACTGTGGTCATGAG

6. T 세포 억제능 분석6. T cell inhibitory assay

동종조혈모세포 이식술(allo-HSCT)을 받은 환자에게서 분리한 PBMNCs로부터 분리 및 정제한 HLA-DR^-CD1d⁺ 및 HLA-DR^-CD1d^- 세포를 T 세포와 공배양하여 이들의 T 세포 억제능을 확인하였다. 인간 T 세포를 2.5 μM CellTrace™ CFSE (Invitrogen)으로 표지화한 뒤 96 웰 플레이트에 1X10⁵ 세포/웰로 분주하였다. 이후 상기 T 세포를 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포 및 HLA-DR^-CD1d^- 세포 각각과 1:1의 비율로 혼합한 뒤 5일간 배양하였다. 항-CD3/CD28 (eBioscience) 2 μg/mL와 재조합 인간 IL-2 (R&D systems) 5 ng/mL로 T 세포를 자극하였다. 5일 배양 후 세포를 항-CD3-APC-Cy7, 항-CD4-PE, 및 항-CD8-PE (eBioscience)로 염색하였다. T 세포의 증식능은 LSRII (BD Pharmingen) 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.HLA-DR ^- CD1d ⁺ and HLA-DR ^- CD1d ^- cells isolated and purified from PBMNCs isolated from patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplant (allo-HSCT) were co-cultured with T cells to confirm their T cell inhibitory ability. . Human T cells were labeled with 2.5 μΜ CellTrace ™ CFSE (Invitrogen) and aliquoted at 1 × 10 ⁵ cells / well in 96 well plates. Thereafter, the T cells were mixed with HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and HLA-DR ^- CD1d ^- cells at a ratio of 1: 1, and then cultured for 5 days. T cells were stimulated with 2 μg / mL of anti-CD3 / CD28 (eBioscience) and 5 ng / mL of recombinant human IL-2 (R & D systems). After 5 days culture cells were stained with anti-CD3-APC-Cy7, anti-CD4-PE, and anti-CD8-PE (eBioscience). Proliferative capacity of T cells was analyzed using LSRII (BD Pharmingen) and FlowJo software.

7. 통계적 분석7. Statistical Analysis

모든 데이터는 평균±표준편차로 나타내었고, 모든 실험에서 비교는 스튜던트 t-검정으로 수행하였다. p<0.05일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다. All data are expressed as mean ± standard deviation and comparisons were performed with Student's t-test in all experiments. It was judged that there was statistical significance when p <0.05.

8. HLA-DR-CD14+ 세포에서 발현되는 세포 표면 마커 후보자 세트를 규명하기 위한 고효율 스크리닝(High-content screening)8. High-content screening to identify cell surface marker candidate sets expressed in HLA-DR-CD14 + cells

이하의 실험에서는 면역 억제 활성을 갖는 M-MDSCs를 분리하기 위한 신규 세포 표면 마커는 동종조혈모세포 이식술(allo-HSCT)을 받은 환자로부터 분리한 PB의 HLA-DR^- 단핵 세포 분획 내에 존재하는 것으로 가정하였다. 신규 세포 표면 마커를 확인하기 위하여, 환자 각 혈액 샘플의 백혈구 연층 분획(buffy coat fraction)으로부터 PBMNC 분획을 회수하고, MACS 시스템을 이용하여 HLA-DR^- 세포 군집을 분리하였다. 이후 상기 HLA-DR^- 세포를 기존에 M-MDSC 마커로 알려진 APC-컨쥬게이트된 CD14 항체로 염색한 뒤 342 PE-표지된 정제 단일클론성 항체가 포함된 플레이트에 접종하였다. HLA-DR^- 서브세트에서 CD14 발현 수준의 상관 관계에 근거하여 세포 표면 분자의 발현 패턴을 3가지 그룹으로 분류하였다: 음성, 희미하거나 낮음, 밝거나 높음(도 1). 상기한 분석을 통하여 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSC 서브세트에서 밝은 강도 및/또는 높은 주기(frequency)를 보이는 32개의 양성 마커를 확인하였다(표 3). 고효율 스크리닝에서 리오플레이트 분석(lyoplate analysis) 결과, HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs에서 통상의 M-MDSCs의 발현 마커인 CD11b, CD33, 및 CD39의 발현을 관찰할 수 있었다. 따라서, 앞으로의 실험에서 이들 세 마커는 제외하고 수행하였다. 또한, 앞선 보고에서 M-MDSCs에서 매우 약하게 또는 음성으로 나타내는 마커인 CD40, CD80, 및 CD83의 발현을 확인한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 상기 HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs에서 이들 마커는 검출되지 않았거나, 매우 약하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로, G-MDSCs의 마커인 CD15 및 CD66b 또한 검출되지 않거나 매우 낮은 수준으로 검출되었다. 초기 스크리닝 분석을 통하여 효율적인 세포 분리 및 면역 염색이 수행된 것을 확인할 수 있었는 바, HLA-DR^-CD14⁺ M-MDSCs에서 발현되는 29개의 양성의 표면 분자에 대하여 이하에서 추가적으로 확인하였다(도 3). The following experiments assume that a novel cell surface marker for isolating M-MDSCs with immunosuppressive activity is in the HLA-DR ^- monocyte cell fraction of PB isolated from patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). It was. To identify new cell surface markers, PBMNC fractions were recovered from the leukocyte coat fraction of each patient's blood sample and the HLA-DR ⁻ cell population was isolated using a MACS system. The HLA-DR ⁻ cells were then stained with APC-conjugated CD14 antibodies, previously known as M-MDSC markers, and then inoculated into plates containing 342 PE-labeled purified monoclonal antibodies. Expression patterns of cell surface molecules were classified into three groups based on the correlation of CD14 expression levels in the HLA-DR ^- subset: negative, faint or low, bright or high (FIG. 1). The analysis identified 32 positive markers showing bright intensity and / or high frequency in the HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSC subset (Table 3). As a result of lyoplate analysis in high efficiency screening, expression of CD11b, CD33, and CD39, which are expression markers of conventional M-MDSCs, was observed in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs. Therefore, these three markers were excluded in future experiments. In addition, in the previous report, the expression of CD40, CD80, and CD83, which are very weak or negative markers in M-MDSCs, was confirmed. As shown in FIG. 2, these markers were detected in the HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs. It could not be confirmed, or was expressed very weakly. In addition, markers of G-MDSCs, CD15 and CD66b, were also not detected or detected at very low levels. Initial screening analysis confirmed that efficient cell separation and immunostaining were performed, and 29 positive surface molecules expressed in HLA-DR ^- CD14 ⁺ M-MDSCs were additionally identified below (FIG. 3).

HLA-DR^-CD14⁺ HLA-DR ^- CD14 ⁺ 강도burglar 세포 표면 항원Cell surface antigen 음성voice CD1a/b/c, CD3, CD5, CD6, CD8a, CD15, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD31, CD35, CD43, CD44, CD45, CD49c, CD55, CD57, CD58, CD62E, CD64, CD70, CD79b, CD80, CD82, CD85a/g, CD88, CD89, CD90, CD94, CD97, CD99, CD102, CD103, CD108, CD117, CD123, CD127, CD132, CD134, CD135, CD137, CD137L, CD138, CD140a, CD143,
CD148, CD150, CD152, CD154, CD156c, CD158a/h, CD158e1, CD158f, CD161, CD162, CD163, CD167a, CD169, CD170, CD172a/g, CD178, CD179b, CD180, CD181, CD183, CD193, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD206, CD207, CD213a2, CD215, CD229, CD235ab, CD253, CD254, CD255, CD257, CD261, CD263, CD266, CD267, CD268, CD271, CD273, CD275, CD278, CD279, CD286, CD290, CD294, CD303, CD304, CD307, CD307d,
CD314, CD318, CD324, CD325, CD326, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD340, CD351, CD352, CD355, CD360, CLEC9A, 6-opoid receptor, DLL4, EGFR, erbB3/HER3, FcεRIα, FcRL6, Galectin-9, IFN-γ R βCD1a / b / c, CD3, CD5, CD6, CD8a, CD15, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD31, CD35, CD43, CD44, CD45, CD49c, CD55, CD57, CD58, CD62E, CD64, CD70, CD79b, CD80, CD82, CD85a / g, CD88, CD89, CD90, CD94, CD97, CD99, CD102, CD103, CD108, CD117, CD123, CD127, CD132, CD134, CD135, CD137, CD137L, CD138, CD140a, CD143,
CD148, CD150, CD152, CD154, CD156c, CD158a / h, CD158e1, CD158f, CD161, CD162, CD163, CD167a, CD169, CD170, CD172a / g, CD178, CD179b, CD180, CD181, CD183, CD193, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD206, CD207, CD213a2, CD215, CD229, CD235ab, CD253, CD254, CD255, CD257, CD261, CD263, CD266, CD267, CD268, CD271, CD273, CD275, CD278, CD279, CD286, CD290, CD294, CD303, CD304, CD307, CD307d,
CD314, CD318, CD324, CD325, CD326, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD340, CD351, CD352, CD355, CD360, CLEC9A, 6-opoid receptor, DLL4, EGFR, erbB3 / HER3, FcεRIα, FcRL6, Galectin -9, IFN-γ R β 희미함 또는 낮음Faint or low CD2, CD4, CD7, CD9, CD10, CD11a/b, CD13, CD16, CD26, CD29, CD32, CD34, CD36, CD38, CD40, CD41, CD45RA, CD45RB, CD48, CD50, CD51, CD59, CD61, CD63, CD66b, CD73, CD74, CD83, CD86, CD87, CD93, CD95, CD96, CD100, CD101, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD109, CD111, CD112, CD114, CD115, CD116, CD119, CD122, CD124, CD126, CD129, CD131, CD140b, CD141, CD144, CD146, CD155, CD158b/d, CD164, CD165, CD166, CCD172b, CD179a, CD182, CD184, CD195, CD196, CD197, CD200R, CD205, CD209, CD210, CD218a, CD221, CD231, CD243, CD245, CD252, CD258, CD262, CD270, CD274, CD276, CD277, CD282, CD284, CD300e, CD301, CD319, CD344, CD298, CD300e/f, CD317, CD344, CD354, CD357, BTLA, C3AR, C5L2, CCR10, CXCR7, DLL1, DR3, GARP, IL-28RA, CLEC12ACD2, CD4, CD7, CD9, CD10, CD11a / b, CD13, CD16, CD26, CD29, CD32, CD34, CD36, CD38, CD40, CD41, CD45RA, CD45RB, CD48, CD50, CD51, CD59, CD61, CD63, CD66b, CD73, CD74, CD83, CD86, CD87, CD93, CD95, CD96, CD100, CD101, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD109, CD111, CD112, CD114, CD115, CD116, CD119, CD122, CD124, CD126, CD129, CD131, CD140b, CD141, CD144, CD146, CD155, CD158b / d, CD164, CD165, CD166, CCD172b, CD179a, CD182, CD184, CD195, CD196, CD197, CD200R, CD205, CD209, CD210, CD218a, CD221, CD231, CD243, CD245, CD252, CD258, CD262, CD270, CD274, CD276, CD277, CD282, CD284, CD300e, CD301, CD319, CD344, CD298, CD300e / f, CD317, CD344, CD354, CD357, BTLA, C3AR, C5L2, CCR10, CXCR7, DLL1, DR3, GARP, IL-28RA, CLEC12A 밝음 또는 높음Bright or high CD1d, CD11b(activated), CD11c, CD14, CD24, CD33, CD39, CD42b, CD46, CD49a, CD49d, CD49e, CD49f, CD52, CD53, CD54, CD56, CD62L, CD62P, CD66a/c/e, CD69, CD71, CD81, CD84, CD85d/h/j/k, CD220, CD226, CD244, CD328CD1d, CD11b (activated), CD11c, CD14, CD24, CD33, CD39, CD42b, CD46, CD49a, CD49d, CD49e, CD49f, CD52, CD53, CD54, CD56, CD62L, CD62P, CD66a / c / e, CD69, CD71 , CD81, CD84, CD85d / h / j / k, CD220, CD226, CD244, CD328

9. M-MDSC 서브세트에 대한 CD1d 및 CD226의 신규 마커9. New Markers for CD1d and CD226 for the M-MDSC Subset

M-MDSC의 잠재적이고 특징적인 마커를 선별하기 위하여, 다른 혈액 세포 종류와의 표현형 중복성과, CD14 발현, 빈도 및 평균적 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)와의 상관관계에 근거하여 상기 도 3의 29개의 표면 마커를 추가적으로 분석하였다. CD49a/f, CD52, CD81, CD84, 및 CD85h는 단핵구 및 대식세포에서 발현되는 것으로, 적혈구, T 세포, B 세포, 자연 살상 세포(natural killer cells, NK cells) 및 수지상 세포와 같은 다른 혈액 세포에서도 표현형 중복을 나타내었다. CD11c, CD46, CD53, CD62L, CD69, CD85d/j/k, 및 CD220는 과립성 백혈구(granulocytes)와 같은 다른 혈액 세포에서 표현형 중복을 보였고, CD49d 및 CD85j 또한 다른 혈액 세포와 표현형 중복을 나타내었지만, 과립성 백혈구에서는 발현되거나 확인되지 않았다. 몇몇 양성 후보군은 특정 혈액 세포에 대한 마커로 알려진 것으로, 예를 들어 CD24 및 CD56는 B 세포와 NK 세포 각각에 특이적 마커이고, CD42b 및 CD62P는 혈소판에 대한 마커이며, CD62a/c/e는 상피세포 및 과립성 백혈구에 대한 마커에 해당한다. CD71는 적혈구 전구체의 특이 마커로 알려진 것인데, HLA-DR^- 서브세트에서 높은 빈도를 보였지만, 다른 마커에 비하여 낮은 MFI를 나타내었다(도 4 및 5). 그 외의 6개 마커로, CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328는 T 세포, B 세포 및 수지상 세포와 표현형 중복을 보였으나, 과립성 백혈구에서는 확인되지 않았다. 즉, 이는 염증성 질환 및 면역 질환에 연관된 것을 알 수 있었다. 또한, CD226 및 CD328는 HLA-DR^- 서브세트에서 낮은 빈도를 보였으나, 다른 마커에 비하여 높은 MFI를 나타냈다(도 4 및 5). CD1d 및 CD49a는 HLA-DR^- 서브세트에서 높은 빈도를 보였고, CD14 발현과 양성의 상관관계를 보였다(도 4 및 6). 따라서, 이하의 실험에서는 상기 6개의 마커를 M-MDSC 서브세트에 대한 잠재적 신규 바이오마커 후보군으로 선별하고, 그 발현 수준을 추가로 분석하였다. In order to screen for potential and characteristic markers of M-MDSC, 29 of FIG. 3 is based on correlation with phenotypic overlap with other blood cell types and CD14 expression, frequency, and mean fluorescence intensity (MFI). Surface markers were further analyzed. CD49a / f, CD52, CD81, CD84, and CD85h are expressed in monocytes and macrophages, and in other blood cells such as red blood cells, T cells, B cells, natural killer cells (NK cells) and dendritic cells. Phenotype duplication was shown. CD11c, CD46, CD53, CD62L, CD69, CD85d / j / k, and CD220 showed phenotypic overlap in other blood cells, such as granulocytes, while CD49d and CD85j also showed phenotypic overlap with other blood cells. It was not expressed or confirmed in granulocytes. Some positive candidates are known as markers for specific blood cells, for example CD24 and CD56 are specific markers for B cells and NK cells, CD42b and CD62P are markers for platelets, and CD62a / c / e are epithelium Corresponds to markers for cellular and granular leukocytes. CD71 is known as a specific marker of erythrocyte precursors, with a high frequency in the HLA-DR ^- subset, but low MFI compared to other markers (FIGS. 4 and 5). With six other markers, CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 showed phenotypic overlap with T cells, B cells, and dendritic cells, but no granulocytes were identified. That is, it was found that it is related to inflammatory diseases and immune diseases. In addition, CD226 and CD328 showed low frequency in the HLA-DR ^- subset, but showed higher MFI compared to other markers (Figures 4 and 5). CD1d and CD49a showed high frequency in the HLA-DR ⁻ subset and showed a positive correlation with CD14 expression (FIGS. 4 and 6). Thus, in the experiments below, the six markers were selected as potential new biomarker candidates for the M-MDSC subset and their expression levels were further analyzed.

유세포 분석기를 이용하여 추가적 HSCT 공여자(n=15)의 PBMNCs로부터 정제된 HLA-DR^-CD14⁺ 세포에 있어서 상기 CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328 마커의 빈도를 측정하였다. 그 결과, HLA-DR^- 서브세트에서 CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328 마커의 빈도와 CD14 M-MDSC 마커와의 상관관계는 모두 비슷한 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 8). Flow cytometry was used to determine the frequency of the CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 markers in HLA-DR ^- CD14 ⁺ cells purified from PBMNCs of additional HSCT donors (n = 15). As a result, it was confirmed that the correlation between the frequency of the CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 markers and the CD14 M-MDSC markers in the HLA-DR ^- subsets appeared at similar levels (FIGS. 7 and 8). ).

다음으로 qRT-PCR을 이용하여 M-MDSCs와 G-MDSCs 사이 상기 CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, 및 CD328 마커의 전사 수준을 비교하였다. CD1d 및 CD226의 발현 수준은, G-MDSCs와 비교하여 M-MDSCs에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(*p<0.05). CD49a, CD317, 및 CD328는 G-MDSCs와 비교하여 M-MDSCs에서 약간 증가하였으나, 큰 차이는 없었다. 한편, CD244는 G-MDSCs와 비교하여 M-MDSCs에서 오히려 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이러한 결과로부터 CD1d 및 CD226 마커는 T 세포 억제능을 가진 M-MDSCs의 특이적 마커에 해당함을 알 수 있었다. Next, qRT-PCR was used to compare the transcription levels of the CD1d, CD49a, CD226, CD244, CD317, and CD328 markers between M-MDSCs and G-MDSCs. Expression levels of CD1d and CD226 were confirmed to be significantly increased in M-MDSCs compared to G-MDSCs (* p <0.05). CD49a, CD317, and CD328 increased slightly in M-MDSCs compared to G-MDSCs, but there was no significant difference. On the other hand, CD244 was found to be reduced in M-MDSCs rather than G-MDSCs (Fig. 9). These results indicate that CD1d and CD226 markers correspond to specific markers of M-MDSCs having T cell inhibitory ability.

10. CD1d-발현하는 M-MDSCs의 유전적 발현 및 기능적 평가10. Genetic Expression and Functional Evaluation of CD1d-Expressing M-MDSCs

qRT-PCR을 사용하여 HLA-DR^-CD1d⁺ 및 HLA-DR^-CD1d^- 서브세트 사이에 면역 억제능과 관련된 유전자의 발현 수준을 비교하였다. HLA-DR^-CD1d⁺ 및 HLA-DR^-CD1d^- 분획에서 ARG1, iNOS, 및 NOX2의 전사는 동등한 수준으로 관찰되었다. 하지만, 인간 골수 분화 인자(myeloid differentiation factor 88, MyD88)와 인돌아민-피롤 2,3-디옥시qRT-PCR was used to compare the expression levels of genes involved in immunosuppressive activity between the HLA-DR ^- CD1d ⁺ and HLA-DR ^- CD1d ^- subsets. Transcription of ARG1, iNOS, and NOX2 in the HLA-DR ^- CD1d ⁺ and HLA-DR ^- CD1d ^- fractions was observed at equivalent levels. However, human myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and indolamine-pyrrole 2,3-dioxy

제네이즈(indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO)의 전사 수준은 HLA-DR^-CD1d^- 세포에 비하여 HLA-DR^-CD1d⁺ 세포에서 대략 3배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 10). HLA-DR^-CD1d⁺ 세포에서 MyD88 및 IDO 의 높은 발현과 이러한 세포에서의 면역억제 활성의 기능적 상관관계를 분석하기 위하여, HLA-DR^-CD1d⁺ 세포와 HLA-DR^-CD1d^- 세포의 T 세포 증식능을 비교하였다. 구체적으로는 allo-HSCT 환자 유래 PBMNCs로부터 분리 및 정제된 HLA-DR^-CD1d⁺ 및 HLA-DR^-CD1d^- 분획을, 1:1 비율의 항-CD3/CD28 항체와 rhIL-2로 자극시킨 CFSE-표지된 나이브(naive) T 세포와 공동 배양하였다. 도 11 내지 13에서 보는 바와 같이, HLA-DR^-CD1d⁺ 세포만이 CD3+, CD4+, 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 면역 질환 및 염증의 진행 과정에서 CD1d를 발현하는 M-MDSCs의 유전자 발현 프로파일과 면역 억제 기능을 알 수 있었다. The transcription level of tyrosinase (indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase, IDO) are HLA-DR ^- it was confirmed that increase of approximately three times or more in CD1d ⁺ cells (Fig. 10) ^- CD1d ^- HLA-DR as compared to cells. To analyze the functional correlation between high expression of MyD88 and IDO in HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and immunosuppressive activity in these cells, T cell proliferative capacity of HLA-DR ^- CD1d ⁺ cells and HLA-DR ^- CD1d ^- cells Was compared. Specifically, the HLA-DR ^- CD1d ⁺ and HLA-DR ^- CD1d ^- fractions isolated and purified from PBMNCs derived from allo-HSCT patients were stimulated with a 1: 1 ratio of anti-CD3 / CD28 antibody and rhIL-2. Co-cultures with labeled naïve T cells. As shown in FIGS. 11 to 13, only HLA-DR ⁻ CD1d ⁺ cells were found to inhibit the proliferation of CD3 +, CD4 +, and CD8 + T cells. Based on these results, gene expression profile and immunosuppressive function of M-MDSCs expressing CD1d in the course of immune disease and inflammation can be identified.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims (20)

분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells)에 대하여 HLA-DR에 대한 항체 및 CD1d에 대한 항체를 이용하여, HLA-DR^- CD1d⁺ 의 표현형을 가지는 골수성 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)를 분리하는 단계를 포함하는, 골수성 억제세포의 분리방법.Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) with a phenotype of HLA-DR ^- CD1d ⁺ , using antibodies against HLA-DR and antibodies against CD1d against isolated peripheral blood mononuclear cells A method for separating myeloid inhibitory cells, the method comprising the step of: separating). 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 분리하는 단계 시 CD14에 대한 항체를 이용하여 CD14⁺의 표현형을 더 가지는 골수성 억제세포를 분리하는, 분리방법.The method of claim 1,
Separating the myeloid suppressor cells further having a phenotype of CD14 ⁺ using an antibody against CD14 in the separating step. 제1항에 있어서,
상기 분리하는 단계 시 CD11b에 대한 항체를 이용하여 CD11b⁺의 표현형을 더 가지는 골수성 억제세포를 분리하는, 분리방법.The method of claim 1,
Separating the myeloid suppressor cells further having a phenotype of CD11b ⁺ using an antibody against CD11b in the separating step. 제1항에 있어서,
상기 분리하는 단계 시 CD15에 대한 항체를 이용하여 CD15^-의 표현형을 더 가지는 골수성 억제세포를 분리하는, 분리방법. The method of claim 1,
Separating the myeloid suppressor cells further having a phenotype of CD15 ⁻ using an antibody against CD15 in the separating step. HLA-DR^- CD1d⁺ 의 표현형을 가지는 골수성 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)를 유효 성분으로 포함하는, 면역 질환의 예방 또는 억제용 세포치료제 조성물로서,
상기 면역 질환은 면역 과민 반응에 의해 야기되는 이식편대숙주질환, 자가면역질환 및 베체트병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포치료제 조성물.A cell therapeutic composition for preventing or inhibiting immune diseases, comprising as an active ingredient a myeloid-derived suppressor cell (MDSC) having a phenotype of HLA-DR ^- CD1d ⁺ ,
The immune disease is selected from the group consisting of graft-versus-host disease, autoimmune disease and Behcet's disease caused by immune hypersensitivity reactions, cell therapy composition. 제6항에 있어서,
상기 골수성 억제세포는 CD14⁺의 표현형을 더 가지는, 세포치료제 조성물. The method of claim 6,
The myeloid inhibitory cells further have a phenotype of CD14 ⁺ , cell therapy composition. 제6항에 있어서,
상기 골수성 억제세포는 CD11b⁺ HLA-DR^low CD14⁺ CD15^-의 표현형을 더 갖는 단핵구성(monocytic) 골수성 억제세포인, 세포치료제 조성물.The method of claim 6,
The myeloid inhibitory cells are mononuclear marrow myeloid inhibitory cells having a phenotype of CD11b ⁺ HLA-DR ^low CD14 ⁺ CD15 ⁻ , cell therapy compositions. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제6항에 있어서,
상기 이식편대숙주질환은 동종이식 후 발생되는 급성 이식편대숙주질환(acute graft-versus-host disease, aGVHD) 또는 만성 이식편대숙주질환(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)인, 세포치료제 조성물.The method of claim 6,
The graft-versus-host disease is acute graft-versus-host disease (aGVHD) or chronic graft-versus-host disease (cGVHD) that occurs after allograft. 제6항에 있어서,
상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쇼그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 선택되는, 세포치료제 조성물. The method of claim 6,
The autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, septic shock, allergic asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, ulcerative colitis, lacrimitis, Alzheimer's disease, stroke, arteriosclerosis, vascular restenosis, type I diabetes , Type II diabetes, gallbladder, conjunctivitis, psoriasis, systemic inflammatory syndrome, multiple myositis, dermatitis, nodular polyarthritis, mixed connective histosis, Sjogren's syndrome, gout, Parkinson's disease, muscular dystrophy, diabetic retinopathy, multiple sclerosis , Cells selected from the group consisting of Crohn's disease, chronic thyroiditis, ceria disease, myasthenia gravis, vulgaris ulcer, viral disease, bacterial disease, radiation disorders, arteriosclerosis, hemangiomas, angiofibromas, reperfusion disorders and cardiac hypertrophy Therapeutic composition. (1) 면역 질환 동물 모델에 면역 질환 치료용 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(2) 상기 동물 모델으로부터 골수성 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)의 MyD88 및 IDO 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 골수성 억제세포는 HLA-DR^- CD1d⁺ 의 표현형을 가지는, 면역 질환 치료제의 스크리닝 방법으로서,
상기 면역질환은 면역 과민 반응에 의해 야기되는 이식편대숙주질환, 자가면역질환 및 베체트병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역 질환 치료제의 스크리닝 방법.(1) administering a candidate substance for the treatment of immune disease to an immune disease animal model; And
(2) measuring the expression levels of MyD88 and IDO genes of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) from the animal model;
The myeloid inhibitory cells have a phenotype of HLA-DR ^- CD1d ⁺ , as a method for screening an immune disease therapeutic agent,
The immune disease is selected from the group consisting of graft-versus-host disease, autoimmune disease and Behcet's disease caused by immune hypersensitivity reactions, the method for screening an immune disease therapeutic agent. 제14항에 있어서,
상기 골수성 억제세포는 CD14⁺ 의 표현형을 더 가지는, 스크리닝 방법. The method of claim 14,
The myeloid inhibitory cells further have a phenotype of CD14 ⁺ , the screening method. 제14항에 있어서,
상기 골수성 억제세포는 CD11b⁺ HLA-DR^low CD14⁺ CD15^-의 표현형을 더 갖는 단핵구성(monocytic) 골수성 억제세포인, 스크리닝 방법.The method of claim 14,
The myeloid suppressor cells are mononuclear marrow myeloid suppressor cells having a phenotype of CD11b ⁺ HLA-DR ^low CD14 ⁺ CD15 ⁻ , the screening method. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제14항에 있어서,
상기 (2) 단계에 후속적으로,
상기 면역 질환 치료용 후보 물질의 투여 후 상기 골수성 억제세포의 MyD88 및 IDO 유전자의 발현 수준이 증가하는 경우 상기 면역 질환 치료용 후보물질을 면역 질환의 치료에 유효한 치료용 약제로 선별하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.The method of claim 14,
Following step (2) above,
If the level of expression of MyD88 and IDO genes of the myeloid suppressor cells increases after administration of the candidate substance for the treatment of the immune disease, further comprising selecting the candidate substance for the treatment of the immune disease as a therapeutic agent effective for the treatment of the immune disease. Screening method.

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