KR102043603B1 - Isolation of lung cancer cells and proliferation thereof using suspension culture method - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환자의 폐암조직으로부터 효과적인 폐암세포의 분리 및 증식을 위한 배양 조건 및 상기의 방법으로 배양된 폐암세포를 이용한 환자 특이적 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 단일세포로 분리하는 단계, 3) 상기 2)단계의 분리된 단일세포를 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계 및 4) 상기 3)단계의 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계를 포함하며, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식시키는 방법 및 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a culture condition for effective separation and proliferation of lung cancer cells from the lung cancer tissue of the patient and a screening method of a patient-specific cancer treatment using lung cancer cells cultured by the above method, more specifically 1) from the patient Cutting one lung cancer tissue into a size of 40 to 100 μm in diameter, 2) separating the cut tissue of step 1) into an enzyme by reacting the cut tissue of step 1), and 3) separating the single cell of step 2). And subcultured with the serum-free ACL4 or N2-added medium in the low-attachment culture dish, and 4) subcultured cells using the accutase-produced cells. Step 4) and the method for separating and proliferating lung cancer cells from lung cancer tissue, characterized in that it does not require a separate end of the accutase reaction The present invention relates to a method for screening patient-specific cancer therapeutic agents using lung cancer cells prepared by the method.

Description

폐암세포의 분리 및 부유배양 기법을 이용한 증식{Isolation of lung cancer cells and proliferation thereof using suspension culture method}Isolation of lung cancer cells and proliferation Julia using suspension culture method}

본 발명은 환자의 폐암조직으로부터 효과적인 폐암세포의 분리 및 증식을 위한 배양 조건 및 상기의 방법으로 배양된 폐암세포를 이용한 환자 특이적 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 단일세포로 분리하는 단계, 3) 상기 2)단계의 분리된 단일세포를 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계 및 4) 상기 3)단계의 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계를 포함하며, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식시키는 방법 및 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a culture condition for effective separation and proliferation of lung cancer cells from the lung cancer tissue of the patient and a screening method of a patient-specific cancer treatment using lung cancer cells cultured by the above method, more specifically 1) from the patient Cutting one lung cancer tissue into a size of 40 to 100 μm in diameter, 2) separating the cut tissue of step 1) into an enzyme by reacting the cut tissue of step 1), and 3) separating the single cell of step 2). And subcultured with the serum-free ACL4 or N2-added medium in the low-attachment culture dish, and 4) subcultured cells using the accutase-produced cells. Step 4) and the method for separating and proliferating lung cancer cells from lung cancer tissue, characterized in that it does not require a separate end of the accutase reaction The present invention relates to a method for screening patient-specific cancer therapeutic agents using lung cancer cells prepared by the method.

폐암은 폐에 생긴 악성 종양을 통틀어 말하는 것이며, 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 증식하여 발생한 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 일반적으로 폐암이라고 하는 원발성 폐암은 현미경학적으로 암세포의 형태에 따라 비소세포 폐암과 소세포 폐암으로 구분된다. 이와 같이 비소세포 폐암과 소세포 폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료 방법의 차이가 크기 때문이다. 비소세포 폐암은 조기에 진단되면 수술적 치료만으로도 완치를 기대할 수 있는 반면, 소세포 폐암은 대부분 진단 당시에 수술적 절제가 어려울 정도로 진행되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많고 급속히 성장하며 전신 전이율이 높아서 수술보다는 항암 화학요법이나 방사선치료가 선택된다. 통상적으로 폐암이라고 하면 폐암의 약 80 내지 85%를 차지하는 비소세포 폐암을 의미하며, 이러한 비소세포 폐암은 편평상피암종, 선암종, 대세포암종 및 기타 폐암으로 세분된다.Lung cancer refers to malignant tumors in the lungs, and can be divided into primary lung cancers, which first develop in the bronchus or alveoli, and metastatic lung cancers in which the cancer cells are formed in other organs and travel through the blood vessels or lymphatic vessels to proliferate into the lungs. Primary lung cancer, commonly called lung cancer, is classified microscopically into non-small cell lung cancer and small cell lung cancer according to the type of cancer cells. The differentiation between non-small cell lung cancer and small cell lung cancer is because of differences in clinical course and treatment method. Non-small cell lung cancer can be expected to be cured by surgical treatment if it is diagnosed early, whereas small cell lung cancer is often found to be surgically resected at the time of diagnosis, rapidly growing and having high systemic metastasis. Rather, chemotherapy or radiation therapy is chosen. Lung cancer generally refers to non-small cell lung cancer, which accounts for about 80 to 85% of lung cancer, which is divided into squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, large cell carcinoma and other lung cancers.

특히 폐암은 19세기까지만 해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여, 서양에서는 남성과 여성 모두에서 가장 많이 발생하는 악성 종양이 되었고 우리나라에서도 폐암 발생이 가파르게 상승하여 위암에 이어 발병률 2위의 암질환이다. 이러한 발생빈도의 증가는 흡연뿐 아니라 대기오염 및 산업공해의 증가 등에 기인한다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 어려워 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다. 완치의 기준인 5년 생존률이 15%에 지나지 않는다.In particular, lung cancer was a rare disease until the 19th century, but since the twentieth century, smoking began to increase rapidly, becoming the most common malignant tumor in both men and women in the West, and lung cancer in Korea has risen steeply. It is the second most common cancer disease. This increase in frequency is due to the increase in air pollution and industrial pollution as well as smoking. In addition, lung cancer is difficult to treat compared to other cancers, so the incidence rate is not the first, but deaths are known to be the most cancer patients. The 5-year survival rate, which is the cure criteria, is only 15%.

이러한 폐암의 치료방법은 병기에 따라 다르며 기본적으로 수술적 제거, 방사선치료, 항암화학요법의 세 가지 방법이 있다. 수술적 제거는 폐암치료에서 유일하게 완치를 기대할 수 있는 방법으로 수술 후 재발이나 전이를 줄이기 위해 방사선 치료와 화학 약물요법 등의 보조요법이 병행되고 있다. 폐암의 종류에 따라서도 적용가능한 치료 방법이 상이하다. 비소세포 폐암의 경우 조기 발견되면 수술로 완치 가능성이 높으므로 무엇보다 조기 발견이 중요하다. 그렇지 못한 경우 수술적 치료와 항암화학요법 및 방사선 치료법을 병행한다. 한편 소세포 폐암의 경우, 비교적 빨리 자라고 전신으로 원격전이가 용이하므로 대부분의 경우 수술적 치료를 시행하지 않는다. 그러나 항암화학요법 및 방사선 치료에 대한 감응성이 높아 제한성 병기의 경우 항암화학 및 방사선 병용요법을, 확장성 병기의 경우 항암화학요법을 시행하게 된다.Treatment of lung cancer varies depending on the stage and there are basically three methods: surgical removal, radiation therapy, chemotherapy. Surgical removal is the only method that can be expected in the treatment of lung cancer, with adjuvant therapy such as radiation therapy and chemotherapy to reduce recurrence or metastasis after surgery. Applicable treatment methods differ depending on the type of lung cancer. In the case of non-small cell lung cancer, early detection is likely to be cured by surgery, so early detection is important. If not, surgical treatment, chemotherapy and radiation therapy are combined. Small cell lung cancer, on the other hand, grows relatively quickly and can be easily metastasized throughout the body. However, chemotherapy and radiation therapy are highly sensitive and chemotherapy and radiation therapy for restrictive stages and chemotherapy for extended stages.

항암화학요법은 효과적인 암치료 방법 중 하나이지만 항암제의 지속적인 투여는 항암화학요법의 실패를 초래하는 원인으로 지적되고 있다. 이는 세포가 항암제에 내성을 획득하게 되기 때문이며, 한 항암제에 내성을 획득하면 구조가 다른 항암제에 대해서도 내성을 갖게 되는 교차내성을 가진다. 이와 같이 암세포가 항암제 구조에 상관없이 비 특이적인 내성을 획득하는 것을 다중약물내성(multidrug resistance; MDR)이라 한다(Gottesman et al., Nat . Rev . Cancer, 2: 48-58, 2002; Ambudkar et al., Oncogene, 22: 7468-85, 2003). 이러한 암세포의 MDR 획득은 항암화학요법 실패의 가장 큰 원인 중 하나로 잘 알려져 있다. 항암제 내성은 크게 2가지로 분류될 수 있는데 하나는 약물이 세포 내로 유입되지 못해 생기는 것이고, 또 다른 하나는 암세포 자체가 유전적 또는 후생유전적 변화에 의해 항암제에 대한 감수성이 떨어져 나타날 수 있는 것이다. 또한 항암제는 특유의 부작용도 가진다. 가장 중요한 것이 골수 기능 억제에 의한 백혈구 및 혈소판의 감소로 이는 면역기능과 관련되어 감염으로 연결될 수 있는 환자에게 치명적인 부작용이다. 이 외에도 소화기계 또는 생식기계에서의 이상을 초래하거나 탈모증을 유발하는 등의 부작용이 항암제의 적용을 제한한다.Chemotherapy is one of the effective methods of cancer treatment, but continued administration of chemotherapy has been pointed out as a cause of failure of chemotherapy. This is because the cells acquire resistance to anticancer drugs, and if the resistance to one anticancer agent is obtained, the structure is cross-resistant to the other anticancer drugs. In this way, cancer cells acquire non-specific resistance regardless of the structure of the anticancer agent is called multidrug resistance (MDR) (Gottesman et. al ., Nat . Rev. Cancer , 2: 48-58, 2002; Ambudkar et al ., Oncogene , 22: 7468-85, 2003). MDR acquisition of these cancer cells is well known as one of the biggest causes of chemotherapy failure. Anticancer drug resistance can be classified into two categories. One is that the drug is not introduced into the cell. The other is that the cancer cell itself may be insensitive to the anticancer drug due to genetic or epigenetic changes. Anticancer drugs also have unique side effects. Most important is the reduction of white blood cells and platelets due to bone marrow suppression, which is a fatal side effect in patients associated with immune function that may lead to infection. In addition, side effects such as causing abnormalities in the digestive or reproductive systems or causing alopecia limit the application of anticancer drugs.

폐암의 치료가 어려운 가장 중요한 이유는 다양성이다. 종양마다 다양한 유전적 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 동일한 환자의 동일한 종양내에도 다양한 종류의 유전적 특성을 가진 암세포들이 다양한 정상세포들과 섞여있기 때문에 한가지 약물이 특정 암세포를 죽이는 효과가 있어서 종양의 크기가 줄어드는 효과가 나타나더라도 다른 특성을 가진 암세포들까지 모두 죽이지 못하기 때문에 소수의 세포들이 다시 분열해서 종양이 성장을 하면, 항암치료 이후에는 항암제에 내성이 있는 세포들로 바뀌는 결과가 발생한다. 현재 이러한 다양한 암세포의 성장기전을 차단하는 200여종의 항암제들이 개발되고 있으나, 어떤 종양에 어떤 약제를 사용해야 하는지를 결정하는데 필요한 시험방법은 전무한 상태여서, 환자당 약 6종의 약제밖에 사용하지 못하는 실정이다. 따라서, 폐암 환자별로 적합한 항암제를 처치하는 것이 매우 중요한 문제로 대두되고 있으며, 미리 환자 맞춤형의 항암제를 스크리닝하기 위한 환자의 세포 확보가 필요한 실정이다. 그러나, 폐암 환자로부터 폐암세포의 분리 및 증식에 효과적인 방법이 아직까지 보고가 미미한 실정이다.
The most important reason for the treatment of lung cancer is diversity. Not only does each tumor have a variety of genetic characteristics, but because the cancer cells with various genetic characteristics in the same tumor of the same patient are mixed with various normal cells, one drug has the effect of killing specific cancer cells, thus the size of the tumor. Even if the effect of reducing the number of cancer cells with different characteristics is not killed, a few cells divide again and the tumor grows. After chemotherapy, the result is that the cells become resistant to the cancer drug. Currently, about 200 anticancer drugs are developed to block the growth mechanisms of various cancer cells, but there are no test methods for deciding which drugs should be used for which tumors, so only about 6 drugs are used per patient. . Therefore, the treatment of appropriate anti-cancer drugs for each lung cancer patient has emerged as a very important problem, the situation is required to secure the cells of the patient in order to screen the patient-specific anti-cancer drugs in advance. However, there are few reports on effective methods for separating and proliferating lung cancer cells from lung cancer patients.

이에 본 발명자들은 환자에 대한 약효가 검증되지 않은 항암물질의 무분별한 사용으로 인한 부작용을 방지하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 폐암형태와 무관하게 적용하여 환자의 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리, 배양, 증식할 수 있는 최적의 배양조건을 확립하였고, 상기 방법으로 배양된 세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have made diligent research to prevent side effects due to the indiscriminate use of anti-cancer substances whose efficacy on patients has not been verified. Therefore, the present inventors can separate, culture, and proliferate lung cancer cells from lung cancer tissues of patients by applying them regardless of lung cancer type. Optimal culture conditions were established, and a method of screening patient-specific cancer treatments using the cells cultured by the above method was confirmed and the present invention was completed.

본 발명의 하나의 목적은 하기 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법으로서, 1) 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 단일세포로 분리하는 단계, 3) 상기 2)단계의 분리된 단일세포를 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계 및 4) 상기 3)단계의 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계를 포함하며, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is a method for separating and proliferating lung cancer cells from lung cancer tissue, comprising the steps of: 1) cutting the isolated lung cancer tissue to a size of 40 to 100 μm in diameter, 2) step 1) Reacting the dissected tissue of the enzyme into a single cell by reacting with the enzyme, 3) Proliferation of the isolated single cell of step 2) by floating culture in serum-free ACL4 or N2 addition medium in a low-attach culture dish and 4) And subcultured by using the accutase of the cells proliferated by the suspension culture of step 3), wherein step 4) does not require a separate end of the accutase reaction. To provide.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 배양하는 단계 및 상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method for screening a patient-specific cancer treatment agent, comprising the step of culturing the lung cancer cells prepared by the method and treating the cancer treatment candidates to the lung cancer cells.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법으로서, 1) 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 단일세포로 분리하는 단계, 3) 상기 2)단계의 분리된 단일세포를 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계 및 4) 상기 3)단계의 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계를 포함하며, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
As one embodiment for solving the above problems, the present invention provides a method for separating and proliferating lung cancer cells from lung cancer tissues comprising the steps of: 1) cutting the isolated lung cancer tissues to a size of 40 to 100 μm in diameter, 2) separating the cut tissue of step 1) with an enzyme to separate the cells into single cells, 3) floating culture of the separated single cells of step 2) with serum-free ACL4 or N2 medium in a low adhesion culture dish. Proliferating and 4) subcultured cells by proliferating the suspension culture of step 3) using accutase, and step 4) does not require a separate end of the accutase reaction. It provides a method characterized in that.

본 발명에서 "폐암"은 폐에서 시작되는 암으로써, 대부분은 기관지 안쪽에서 시작되지만 폐의 다른 부분에서도 시작될 수 있다. 먼저 폐에서 전암성 변화가 발생하며 시간에 따라 이러한 전암성 부위가 진행하여 암이 될 수 있는데, 폐암으로 발전하기까지는 수년이 걸리기도 한다. 다른 부위에서 발생하는 암과 마찬가지로 폐암세포는 폐에서 분리되어 나가 혈관이나 림프관 등을 통해 다른 조직으로 전이될 수 있다. 폐암은 크게 두 종류로 구분되며 서로 다르게 치료된다. 상기 두 가지 종류는 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC)과 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)이며, 이 두 가지의 특징을 모두 가진 경우를 혼합성 대소세포암(mixed small cell/large cell cancer)이라 한다. 본 발명에서 상기 폐암은 소세포폐암, 비소세포암 또는 혼합성 대소세포암일 수 있다.In the present invention, "lung cancer" is a cancer that starts in the lungs, most of which start inside the bronchus but may also start in other parts of the lung. First, precancerous changes occur in the lungs, and over time, these precancerous sites can progress to cancer, which may take years to develop into lung cancer. Like cancers that occur elsewhere, lung cancer cells can separate from the lungs and spread to other tissues through blood vessels or lymphatic vessels. Lung cancer is divided into two types and is treated differently. The two types are small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), and mixed small cell cancer (SCLC) having both characteristics. large cell cancer). In the present invention, the lung cancer may be small cell lung cancer, non-small cell cancer or mixed large cell cancer.

종래 폐암세포주를 확립하기 위하여 세포를 배양 증식시키는 방법은 유래를 구분하여 수행되었다. 예컨대, 소세포폐암 조직으로부터 분리한 세포는 부유배양으로, 비소세포폐암 조직으로부터 분리한 세포는 부착배양으로 배양 증식시켰으며, 배지도 각각에 대해 최적화된 것을 사용하였다. 그러나, 본 발명의 부유배양방법은 세포의 유래와 무관하게 적용할 수 있으며, 배지 또한 세포의 유래와 무관하게 공통적으로 무혈청 ACN 또는 N2 배지를 사용할 수 있다. 이에 관해 이후 보다 상세히 설명할 것이다.In order to establish a conventional lung cancer cell line, a method of culturing and proliferating cells was performed by distinguishing the origin. For example, cells isolated from small cell lung cancer tissues were cultured and grown in suspension culture, cells isolated from non-small cell lung cancer tissues were adherent culture, and media optimized for each were used. However, the suspension culture method of the present invention can be applied irrespective of the origin of the cells, and the medium can also be used in common without serum ACN or N2 medium. This will be described in more detail later.

본 발명의 용어 "소세포폐암"은 전체 폐암의 10 내지 15%를 차지하는 것으로 "귀리세포암종" 또는 "소세포성 미분화암종"이라고도 한다. 흉부 중앙에 위치하는 기관지에서 시작되는 경우가 많다. 암세포는 작지만 빠르게 증식하여 전신으로 전이되어 큰 종양을 형성할 수 있다. 소세포폐암의 경우는 항암제 치료에 반응을 보이는 비율을 나타내는 관해율이 60 내지 80%로 비교적 높고 수술용법의 적용증에 대한 논란이 많아 외과적 수술로 제거하는 경우는 드물고 주로 항암화학요법을 이용하며 방사선 치료를 병용하기도 한다. 그러나, 항암화학요법을 반복적으로 수행하다 보면 암세포가 해당 항암제에 대한 내성을 갖게 되어 약효를 나타내지 못하는 경우가 발생하고 이러한 경우, 다른 약물로 바꾸어 투여하게 된다. 따라서, 불필요한 시행착오를 줄이고 환자에 적합한 약물을 선별하기 위하여 환자 특이적인 약물 스크리닝 방법이 요구된다.The term "small cell lung cancer" of the present invention accounts for 10 to 15% of all lung cancers and is also referred to as "oat cell carcinoma" or "small cell undifferentiated carcinoma". It often begins in the bronchi located in the center of the chest. Cancer cells can grow small but rapidly proliferate and spread throughout the body to form large tumors. In the case of small cell lung cancer, the rate of response to chemotherapy is 60-80%, which is relatively high, and there is a lot of controversy over the application of surgical methods. Surgery is rarely removed and is mainly used for chemotherapy. Sometimes treatment is used. However, if the chemotherapy is repeatedly performed, cancer cells become resistant to the anticancer drug and thus do not exhibit the drug effect. In this case, the drug is replaced with another drug. Therefore, a patient-specific drug screening method is required to reduce unnecessary trial and error and to select a drug suitable for the patient.

한편, 본 발명의 용어 "비소세포폐암"은 전체 폐암의 80 내지 90%를 차지하는 것으로, 세포의 크기, 모양 및 화학적 구성에 따라 "편평세포암종(squamous cell carcinoma)", "대세포암종(large cell carcinoma)" 또는 "선암종(adenocarcinoma)"의 세 종류로 구분될 수 있다. 먼저, 편평세포암종은 전체 폐암의 약 25 내지 30%에 해당하는 것으로 흡연과 관련있으며, 폐 중간의 기관지 가까이에서 발견되는 경향이 있다. 그리고, 대세포암종은 전체 폐암의 약 10 내지 15%에 해당하는 것으로 폐의 어느 부분에서도 시작될 수 있으며, 성장 및 전이가 빨라 치료하기 어렵다. 마지막으로 선암은 전체 폐암의 약 40%를 차지하는 것으로 일반적으로 폐의 외부에서 발견된다. 상기 비소세포폐암의 치료를 위해서는 수술이 가능한 경우 즉, 초기에는 치료 확률이 높으므로 수술을 시행하여 암조직 및 이와 인접한 전이 가능한 임파선 조직을 절제한다. 필요에 따라, 항암화학요법, 방사선 요법 등을 병용할 수 있다. 수술이 불가능한 경우 항암화학요법을 단독으로 수행하거나 방사선 요법과 병행하여 수행할 수 있다. 초기에 발견하여 수술로 암조직을 제거한 환자에서도 재발 방지를 위해 보조 항암화학요법을 시행할 수 있다. 소세포폐암과 마찬가지로 항암화학요법의 반복적인 수행은 항암제에 대한 내성을 야기하고 다른 약물로 바꾸어야 하는 경우가 발생한다. 따라서, 비소세포폐암의 경우에도 불필요한 시행착오를 줄이고 환자에 적합한 약물을 선별하기 위하여 환자 특이적 약물 스크리닝 방법이 요구된다.
On the other hand, the term "non-small cell lung cancer" of the present invention occupies 80 to 90% of the total lung cancer, "squamous cell carcinoma", "large cell carcinoma (large cell carcinoma)," depending on the size, shape and chemical composition of the cells cell carcinoma "or" adenocarcinoma ". First, squamous cell carcinoma accounts for about 25-30% of all lung cancers and is associated with smoking and tends to be found near the bronchus in the middle of the lungs. In addition, large cell carcinoma corresponds to about 10 to 15% of all lung cancers and can be started in any part of the lung, and is difficult to treat because of its rapid growth and metastasis. Finally, adenocarcinoma accounts for about 40% of all lung cancers and is usually found outside the lungs. For the treatment of non-small cell lung cancer, when the operation is possible, that is, since the initial treatment probability is high, surgery is performed to excise the cancer tissue and the metastatic lymph node tissue adjacent thereto. As needed, anticancer chemotherapy, radiation therapy, etc. can be used together. If surgery is not possible, chemotherapy may be performed alone or in combination with radiation therapy. Adjuvant chemotherapy may be used to prevent recurrence even in patients with early detection and surgical removal of cancerous tissue. As with small cell lung cancer, repeated chemotherapy results in resistance to anticancer drugs and may require replacement with other drugs. Therefore, even in the case of non-small cell lung cancer, a patient-specific drug screening method is required in order to reduce unnecessary trial and error and to select a drug suitable for the patient.

상기 1)단계는, 환자로부터 분리한 조직에서 폐암세포를 효과적으로 단일세포로 분리시키기 위해 조직을 절개하는 단계로서, 최적의 분리조건을 얻을 수 있는 조직 절개 크기는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 40 내지 70 μm, 40 내지 100 μm, 70 내지 100 μm이며, 가장 바람직하게는 40 내지 100 μm일 수 있다. 절개된 조직이 높은 비율로 배양접시에 부착될 수 있도록 조직을 자르고 다공성 막을 이용하여 최적 크기 즉 40 내지 100 μm 크기의 조각을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 40 내지 100 μm 크기의 조직을 이용하였을 때 이후 2)단계에서 단일세포로의 분리가 가장 효율적으로 수행되는 것을 확인하였다(도 2).
Step 1) is a step of dissecting the tissue in order to effectively separate lung cancer cells into a single cell in the tissue separated from the patient, the tissue incision size to obtain the optimal separation conditions include, but is not limited to 40 To 70 μm, 40 to 100 μm, 70 to 100 μm, most preferably 40 to 100 μm. The tissue can be cut so that the dissected tissue can be attached to the culture dish at a high rate and a porous membrane can be used to obtain an optimal size, ie 40-100 μm sized pieces. According to one embodiment of the present invention, when using a tissue of 40 to 100 μm size in step 2) it was confirmed that the separation into single cells is most efficiently performed (Fig. 2).

상기 2)단계는, 1)단계에서 절개되고 여과된 일정 범위의 크기를 갖는 조직에 효소를 처리하여 단일세포로 분리하는 단계이다. 상기 효소로는 디스파제와 제4형 콜라게나제를 혼합하여 사용할 수 있다.Step 2) is a step of separating the cells into a single cell by treating the enzyme having a predetermined range of sizes cut and filtered in step 1). As the enzyme, it is possible to use a mixture of dispase and type 4 collagenase.

본 발명의 용어 "디스파아제(Dispase)"란 피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 적지만 콜라겐 I을 절단하는 단백질 분해효소이다. 디스파아제는 몇몇 박테리아에서 발견되고, 바실러스 폴리믹사의 배양 여과액으로부터 분리될 수 있다. 또한 연구의 목적으로 추출, 정제되어 사용될 수 있다.As used herein, the term "dispase" is a protease that cleaves fibronectin, collagen IV and at least collagen I. Dispase is found in some bacteria and can be isolated from the culture filtrate of Bacillus polymix. It can also be extracted and purified for research purposes.

본 발명의 용어 "제4형 콜라게나제(collagenase type 4)"는 Pro-X-Glyc-Pro의 서열에서 중성 아미노산(X)과 Glyc 사이의 결합에 특이적으로 작용하는 단백질 분해효소이다. 상기 서열은 콜라겐에서 빈번히 발견된다. 콜라게나제에 의한 분해는 인간 종양, 마우스 신장, 인간 성체 및 태아 뇌 및 외피를 포함하는 많은 다른 조직의 배양에 적합하다. 비교적 순하여 생리학적 온도 및 pH에서 작용하며 다른 기계적 자극이나 특별한 기기를 필요로 하지 않는다.The term "collagenase type 4" of the present invention is a protease that specifically acts on the binding between neutral amino acid (X) and Glyc in the sequence of Pro-X-Glyc-Pro. Such sequences are frequently found in collagen. Degradation by collagenase is suitable for the culture of many other tissues, including human tumors, mouse kidneys, human adult and fetal brains, and the cortex. It is relatively mild and operates at physiological temperature and pH and does not require any other mechanical stimulation or special equipment.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 두 가지 효소를 혼합하여 사용함으로써 세포에 손상을 최소화하면서 다양한 조직의 가벼운 분리 및 배양 세포의 회수를 달성하였다.
In a specific embodiment of the present invention by using a mixture of the two enzymes to achieve a light separation of various tissues and recovery of cultured cells while minimizing damage to the cells .

상기 3)단계는, 2)단계에서 분리된 단일세포를 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계이다.Step 3) is a step of propagating the single cells separated in step 2) by floating culture with serum-free ACL4 or N2 addition medium in a low adhesion culture dish.

본 발명의 용어 "부유배양(suspension culture)"이란 세포가 어떠한 표면에 부착되지 않고 배지 중에 떠 있는 상태로 배양되는 것을 의미하는 것으로 3D 배양이라고도 한다. 이때, 일정 수의 세포가 서로 응집되어 세포괴를 형성하여 증식할 수 있다. 생체 외 배양시에는 배양접시에 부착되는 것을 억제하기 위하여 저부착 배양접시를 사용할 수 있다. 상기 저부착 배양접시로는 상용화하여 판매되고 있는 코닝사의 초 저부착 배양접시(ultra low attachment culture plate)를 사용할 수도 있고, 페트리접시 등의 일반 배양접시에 세포부착을 억제하는 물질로 미리 코팅된 배양 접시를 사용하기도 한다. 상기 부착을 억제하기 위한 코팅물질로는 플루로닉 F127(Pluronic F127) 등의 물질이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "suspension culture" of the present invention means that the cells are cultured in a floating state without attaching to any surface, also referred to as 3D culture. At this time, a certain number of cells may aggregate with each other to form a cell mass and proliferate. In in vitro culture, a low adhesion culture plate may be used to suppress attachment to the culture plate. As the low adhesion culture dish, Corning's ultra low attachment culture plate, which is commercially available for sale, may be used, and the culture is pre-coated with a substance that suppresses cell adhesion in a general culture dish such as a petri dish. Some use plates. As a coating material for inhibiting the adhesion, a material such as Pluronic F127 may be used, but is not limited thereto.

본 발명의 용어 "무혈청 ACN4 배지"란 혈청이 배제되어 있는 기본 배양배지에 인슐린, 트랜스페린, 셀레나이트, 히드로코르티손, EGF(epithelial growth factor), 트리아이오도타이로닌(triiodothyronine), 에탄올아민, 포스포릴에탄올아민, 파이루베이트, BSA(bovine serum albumin), HEPES 및 글루타민을 포함하는 배지이다. 상기 기본 배양배지는 폐암세포 증식배양에 사용할 수 있는 배지는 제한없이 사용할 수 있으며, 그 예로 RPMI1640, DMEM, DMEM/F12일 수 있다.The term "serum-free ACN4 medium" of the present invention means insulin, transferrin, selenite, hydrocortisone, EGF (epithelial growth factor), triiodothyronine (triiodothyronine), ethanolamine, phosphate in a basic culture medium without serum. It is a medium containing foryl ethanolamine, pyruvate, bovine serum albumin (BSA), HEPES and glutamine. The basic culture medium may be used as a medium for lung cancer cell proliferation culture without limitation, for example, may be RPMI1640, DMEM, DMEM / F12.

본 발명의 용어 "무혈청 N2 배지"란 혈청이 배제되어있는 기본 배양배지에 N2 보충물을 첨가한 배지이다. 상기 "N2 보충물"은 보텐스타인의 N-1 제형을 기초로한 화학적으로 합성된 무혈청 보충물이다. 인간 홀로 트랜스페린 및 재조합 인슐린의 단백질과 프로게스테론, 푸트레신 및 셀레나이트를 유효성분으로 포함한다. 일반적으로 Neurobasal 배지 또는 DMEM에 성장인자와 함께 첨가되어 신경세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용된다. 기본 배양배지는 폐암세포 증식배양에 사용할 수 있는 배지는 제한없이 사용할 수 있으며, 그 예로 RPMI1640, DMEM, DMEM/F12일 수 있다. 그러나 본 발명에서는 폐암세포의 초기배양에, 섬유아세포로부터 폐암세포를 정제하기 위하여, 바람직하게 L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신, 비필수 아미노산 및 머캅토에탄올을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 기본 배양배지로 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면 폐암세포의 부유배양을 위하여 기본배지에 무혈청 ACL4 또는 N2 배지를 이용하였을 때, 10% FBS를 첨가한 배지에서 보다 높은 세포괴 형성률을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).The term "serum-free N2 medium" of the present invention refers to a medium in which N2 supplement is added to a basic culture medium in which serum is excluded. The "N2 supplement" is a chemically synthesized serum-free supplement based on the N-1 formulation of Bottenstein. Proteins of human holotransferrin and recombinant insulin and progesterone, putrescine and selenite are included as active ingredients. Generally, it is added to Neurobasal medium or DMEM together with growth factors to induce differentiation into neurons. The basic culture medium may be used without limitation as a medium for lung cancer cell proliferation culture, for example, RPMI1640, DMEM, DMEM / F12. However, in the present invention, in order to purify lung cancer cells from fibroblasts in the initial culture of lung cancer cells, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium containing L-glutamine, penicillin-streptomycin, non-essential amino acids and mercaptoethanol is preferred. Can be used as a basic culture medium. According to the embodiment of the present invention, when serum-free ACL4 or N2 medium was used as the primary medium for suspension culture of lung cancer cells, it was confirmed that the cell mass formation rate was higher in the medium to which 10% FBS was added (FIG. 4).

이외에도 FBS는 다양한 성장인자를 포함하는 것으로 알려져 있으며 특히, 다량의 TGF-β를 포함하는 것으로 알려져 있고, 상기 TGF-β는 EMT(endothelial-mesenchymal transition)을 유발하는 것이 보고되어 있다(J. Cell Sci., 2002, 115(Pt 22):4227-4236). 따라서, 본 발명에 따른 배양방법은 무혈청 배지를 사용함으로 부유배양에 따른 EMT 저해와 더불어 배지 중에 첨가된 FBS에 함유된 TGF-β에 의한 EMT 유발을 예방할 수 있으므로, 폐암세포의 특성을 유지하는데 용이하게 이용될 수 있다.In addition, FBS is known to include a variety of growth factors, in particular, it is known to include a large amount of TGF-β, it has been reported that the TGF-β causes endothelial-mesenchymal transition (EMT) (J. Cell Sci , 2002, 115 (Pt 22): 4227-4236). Therefore, the culture method according to the present invention can prevent the EMT induced by TGF-β contained in the FBS added to the medium in addition to the inhibition of EMT in suspension culture by using a serum-free medium, to maintain the characteristics of lung cancer cells It can be used easily.

이와 같이 본 발명에 따른 배양방법은 무혈청 배지를 사용한 부유배양법을 이용하므로 혈청에 다량 포함된 성장인자 특히, TGF-β에 의해 유도될 수 있는 EMT를 배제하고, 부착배양시 유발될 수 있는 EMT 현상을 최소화함으로써, 암세포로서의 특성을 유지하는 폐암세포의 배양 및 증식을 가능하게 한다.
As described above, the culturing method according to the present invention uses a suspension culture method using a serum-free medium, thereby excluding EMT that can be induced by growth factors, particularly TGF-β, which are contained in a large amount of serum, and can be induced during adhesion culture. By minimizing the phenomenon, it is possible to culture and proliferate lung cancer cells that maintain their characteristics as cancer cells.

상기 4)단계는, 3)단계에서 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계로서, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 한다. Step 4) is a step of subcultured using the accutase cells proliferated by the suspension culture in step 3), wherein step 4) does not require a separate end of the accutase reaction step It is done.

본 발명의 용어 "계대배양(subculture)"은 세포증식 방법의 하나로 3 내지 7일마다 주기적으로 이전 배양으로부터 새로운(fresh) 배지에 옮겨 배양하는 방법으로, 세포주를 보존하고 세포의 대를 이어나가는 배양방식을 의미한다. 이러한 방법은 subculturing 또는 passaging이라고 한다. 이러한 계대배양을 통해 축적되는 독성 대사물질을 제거하고 고갈된 영양분을 공급하여 세포 사멸을 억제하고 성장 및 증식을 촉진할 수 있다.The term "subculture" of the present invention is a method of cell proliferation, which is a method of culturing the cell culture and preserving the cell line by periodically transferring it from the previous culture to fresh medium every 3 to 7 days. Means the way. This method is called subculturing or passaging. Such passage can remove toxic metabolites that accumulate and supply depleted nutrients to inhibit cell death and promote growth and proliferation.

본 발명의 용어 "아큐타제(Accutase)"는 세포 탈착을 위한 용액의 일종으로 단백질분해성 및 콜라겐분해성 효소 용액이다. 일반적으로 부착배양 세포를 배양접시로부터 탈착시키기 위해 사용되지만 세포괴 내에서 세포 간의 응집을 저해하여 단일세포로 전환시킬 수 있다. 세포주에 따라 반응 조건 및 시간 등의 차이는 있을 수 있으나, 제한없이 다양한 세포주에 사용될 수 있다. 비교적 순한 세포 탈착 용액으로 사용 후에도 세포 생존률이 높다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 아큐타제를 이용하여 계대배양한 세포와 일반적으로 널리 사용되는 세포 탈착 용액인 트립신-EDTA를 사용하여 계대배양한 세포를 비교한 결과, 아큐타제를 이용한 경우 세포 생존률이 높을 뿐만 아니라 이후 부유배양에서 세포괴 형성능이 높음을 확인하였다(도 5). 또한 아큐타제는 억제제를 필요로 하지 않는 세포 탈착 효소이다. 일반적으로 트립신-EDTA를 이용하여 계대배양하는 경우 반응을 종결시키기 위하여 트립신을 불활성화시키는 성분을 포함하는 FBS 즉, 혈청을 이용한다. 그러나, 본 발명의 계대배양에 사용되는 아큐타제는 이러한 반응을 종결시키는 과정을 필요로 하지 않으므로, 과정이 간결하고 혈청의 사용도 배제할 수 있다.
The term "Accutase" of the present invention is a proteolytic and collagenase enzyme solution as a kind of solution for cell desorption. Generally used to detach adherent culture cells from the culture dish, but can be converted to single cells by inhibiting aggregation between cells in the cell mass. Depending on the cell line, there may be a difference in reaction conditions and time, but may be used in various cell lines without limitation. Cell viability is high even after use as a relatively mild cell desorption solution. In a specific embodiment of the present invention as a result of comparing cells passaged using the accutase with cells passaged using trypsin-EDTA, which is a cell desorption solution that is generally used, the cell survival rate when using the accutase is Not only high but also confirmed that the cell mass formation ability is high in suspension culture (Fig. 5). Accutase is also a cell detachment enzyme that does not require an inhibitor. In general, when passaged using trypsin-EDTA, FBS, or serum, containing a component that inactivates trypsin is used to terminate the reaction. However, the accutase used in the subculture of the present invention does not require a process to terminate this reaction, so the process is concise and the use of serum can be excluded.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법으로 제조한 폐암세포를 배양하는 단계; 및 상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.As another aspect, the present invention comprises the steps of culturing the lung cancer cells prepared by the method of separating and proliferating lung cancer cells from the lung cancer tissue; And it provides a method for screening a patient-specific cancer treatment, comprising the step of treating the lung cancer cells with a cancer treatment candidate.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 세포 분리 및 배양 조건으로 제조한 폐암세포는 환자의 폐암조직과 동일한 세포이다. 구체적으로 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 폐암세포는 부착배양시 발생될 수 있는 EMT(epithelial-mesenchymal transition; 상피-중간엽 전이) 현상을 최소화하여 상피세포의 특성을 유지함으로써 부착배양한 세포에 비해 부유배양된 세포군에서 상피 형태의 세포가 보다 많이 존재하는 것을 육안으로 확인할 수 있었고, EPCAM 발현 또한 현저히 높은 것을 확인하였다(도 6).According to an embodiment of the present invention, the lung cancer cells prepared under the cell separation and culture conditions of the present invention are the same cells as the lung cancer tissue of the patient. Specifically, according to another embodiment of the present invention, the lung cancer cells prepared by the method of the present invention to minimize the epithelial-mesenchymal transition (ETM) phenomenon that can occur during adhesion culture characteristics of epithelial cells By maintaining the presence of more epithelial cells in the cultured cells compared to the cells cultured, it was confirmed by the naked eye, it was confirmed that EPCAM expression is also significantly high (Fig. 6).

따라서, 이와 같은 방법으로 얻어진 환자의 폐암세포에 일련의 암치료 후보물질을 처리하여 이들의 환자특이적 항암활성을 확인하여 효과적인 치료를 위한 환자에 적합한 암치료제를 찾을 수 있다. 즉, 본 발명의 분리 및 배양 조건을 이용하여 제조된 환자의 폐암세포에 치료물질을 처리하여 암세포가 사멸하면 해당 암치료물질이 폐암세포를 분리한 환자에게 맞춤형 항암제이고, 암세포가 사멸하지 않는 경우 해당 암치료물질은 본 환자에게 부적절한 항암제라 판단할 수 있다.Therefore, by treating a series of cancer treatment candidates to the lung cancer cells of the patient obtained by the above method to confirm their patient specific anti-cancer activity can find a cancer treatment agent suitable for the patient for effective treatment. That is, when cancer cells are killed by treating a therapeutic material to lung cancer cells of a patient prepared using the isolation and culture conditions of the present invention, the cancer therapeutic material is a customized anticancer agent to patients who have separated the lung cancer cells, and the cancer cells do not die. The cancer treatment agent may be considered to be an inappropriate anticancer agent for the patient.

본 발명의 용어 "암치료 후보물질"이란 암환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 항암제, 항종양 항생제 등 상기 특성을 나타내는 물질은 제한없이 포함될 수 있다.The term "cancer treatment candidate" of the present invention means a substance that can be applied to cancer patients to improve or beneficially change the symptoms of a patient caused by cancer, and any substance that exhibits the above characteristics, such as an anticancer agent and an antitumor antibiotic, is not limited. May be included.

바람직하게 상기 암치료 후보물질은 원발 비소세포암 및 소세포암 외에도 전이성 폐암, 폐전이 대장암, 유방암, 임파절 전이, 및 육종 등 폐에서 성장하는 모든 원발암과 전이암의 치료에 선택되는 암치료제 일 수 있다. 현재 폐암 치료에 사용되는 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴(vincristine), 이포스파미드(ifosphamide), 타세바(tarceva), 이레사(iressa) 또는 닥티노마이신(dactinomycin) 뿐만 아니라, 다른 암종에서 선택되는 암치료제일 수 있다.
Preferably, the cancer treatment candidate may be a cancer treatment agent selected for the treatment of all primary cancers and metastatic cancers growing in the lung such as metastatic lung cancer, lung metastasis colon cancer, breast cancer, lymph node metastasis, and sarcoma, in addition to primary non-small cell and small cell cancer. . Carboplatin (paraplatin), Cisplatin, Cyclophosphamide, Ifosfamide, Nidran, Nitrogen Mustard (Caraplatin) Niclogen mustar (Mechlorethamine HCL), Bleomycin, Doxorubicin, Mitomycin C, Cytarabine, Flurouracil, Gemcitabine ), Trimetrexate, methotrexate, etoposide, etoposide, vinblastine, vinorelbine, alimta, altretamine, Procarbazine, Taxol, Taxotere, Topotecan, Irinotecan, Bevacizumab, Gefitinib, Erlotinib, Fishibnil Picibanil Vial, Aclarubicin, Tegafur, Epi Epirubicin, Berotecan, Anthracycline, Idarubicin, Adriamycin, Vincristine, Iposphamide, Tarceva, Iresa (iressa) or dactinomycin, as well as cancer treatments selected from other carcinomas.

본 발명의 방법은 폐암의 종류와 무관하게 적용하여 폐암 환자로부터 채취한 조직으로부터 효과적으로 폐암세포만을 분리 및 증식시킬 수 있는 방법으로, 환자 특유의 폐암세포주 확립에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 폐암세포는 부유배양함으로써 부착배양시 발생할 수 있는 EMT(endothelial-mesenchymal transition)을 차단하여 암 특유의 특성을 잃지 않고 있다. 따라서, 이와 같은 폐암세포주는 환자 맞춤형 치료제의 선택에 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라 항암제 내성이 있는 환자에게 최적의 항암제를 제공할 수 있는 환자 맞춤형 치료에 효과가 있을 것이다.
Regardless of the type of lung cancer, the method of the present invention can effectively separate and proliferate only lung cancer cells from tissues collected from lung cancer patients, and can be effectively used for establishing patient-specific lung cancer cell lines. Lung cancer cells isolated by the method of the present invention is suspended in culture by blocking the endothelial-mesenchymal transition (EMT) that can occur during adherent culture without losing the characteristics of cancer. Therefore, such lung cancer cell lines can be usefully used for the selection of patient-specific therapeutics. This will be effective in patient-specific treatments that can provide optimal anticancer drugs to patients with anticancer drug resistance.

도 1은 (A) 종래 암조직으로부터 세포를 분리하는 방법과 본 발명에 따른 폐암조직유래 폐암세포의 분리 및 배양방법을 비교하여 나타낸 도이다.
도 2는 절개된 폐암조직 및 이를 디스파제 및 콜라게나제로 처리하여 획득한 단일세포를 나타낸 도이다.
도 3은 부유배양시 형성된 세포괴의 형태 및 초 저부착 배양접시와 Pluronic F-127을 코팅한 배양접시에서 상기 세포괴의 형성률을 나타낸 도이다.
도 4는 배지조건에 따른 세포배양 형태 및 세포괴 형성률을 나타내는 도이다.
도 5는 계대배양시 사용하는 효소에 따른 세포괴의 형태를 나타내는 도이다.
도 6은 대조군으로서 부착배양시킨 폐암세포와 부유배양시킨 세포의 형태 및 이로부터의 EPCAM 발현율을 나타낸 도이다.Figure 1 (A) is a diagram showing a comparison between the conventional method for separating cells from cancer tissue and lung cancer tissue-derived lung cancer cells according to the present invention.
Figure 2 is a diagram showing the incision lung cancer tissue and single cells obtained by treating it with dispase and collagenase.
Figure 3 is a diagram showing the form of the cell mass formed during suspension culture and the formation rate of the ultra-low adhesion culture plate and the culture plate coated with Pluronic F-127.
Figure 4 is a diagram showing the cell culture form and cell formation rate according to the medium conditions.
5 is a diagram showing the shape of the cell mass according to the enzyme used in subculture.
FIG. 6 is a diagram showing the types of lung cancer cells adhering cultured and suspended cells cultured and EPCAM expression rate therefrom as a control.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, but the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1: 조직 절개 1: tissue incision

환자로부터 최적의 조건으로 조직을 분리하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiments were performed to separate tissues from patients optimally.

환자의 폐암조직을 수술용 가위를 이용하여 0.5 내지 1 cm 크기로 약 5 내지 10분간 절개한 후, 적절한 크기의 절개된 조직을 확보하기 위하여 40 및 100 μm 다공성 막(Strainer, BD Bioscience)을 이용하여, 절개된 조직의 크기가 40 μm 내지 100 μm인 절개조직을 획득하였다.
The patient's lung cancer tissue was incision about 0.5 to 1 cm in size for 5 to 10 minutes using surgical scissors, and then 40 and 100 μm porous membranes (Strainer, BD Bioscience) were used to secure appropriate sized tissue. Thus, an incision was obtained in which the size of the incised tissue was 40 μm to 100 μm.

실시예Example 2: 폐암세포의 분리 2: Isolation of Lung Cancer Cells

절개한 폐암조직으로부터 폐암세포를 단일세포로 분리하기 위하여 효소로 처리하였다.Lung cancer cells were treated with enzymes to separate them into single cells from the excised lung cancer tissues.

실시예 1에서 획득한 절개된 조직을 1 mg/ml 농도의 디스파제(Dispase, GIBCO)와 1% 제4형 콜라게나제(GIBCO)를 1:1로 혼합한 효소 용액에 넣어 18 내지 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 세포의 부착을 억제하기 위하여 100 mm 직경의 페트리 접시(BD)를 사용하였다. 약 24시간 후 효소 처리를 통해 분리된 조직을 1mM L-글루타민(GIBCO-BRL), 1% 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO-BRL), 1% 비필수 아미노산(GIBCO-BRL) 및 0.1 mM 머캅토에탄올(GIBCO-BRL)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO-BRL) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone)을 첨가하여 15 ml Falcon 튜브에서 육안으로 확인하면서 피펫팅하여 단일세포로 분리하고 1000RPM에서 5분간 원심분리하여 최종 분리된 폐암세포군을 획득하였다. 상기 FBS는 피펫팅 시 세포의 손상을 최소화 하기 위하여 첨가하였다. 상기 방법에 의해 폐암조직으로부터 분리된 단일세포의 형태를 도 2에 나타내었다.The dissected tissue obtained in Example 1 was placed in an enzyme solution containing 1 mg / ml of dispase (GIBCO) and 1% type 4 collagenase (GIBCO) in a 1: 1 mixture for 18 to 24 hours. Were incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. At this time, a 100 mm diameter Petri dish (BD) was used to inhibit cell adhesion. After about 24 hours, tissues isolated through enzyme treatment were separated into 1 mM L-glutamine (GIBCO-BRL), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO-BRL), 1% non-essential amino acids (GIBCO-BRL) and 0.1 mM mercaptoethanol. 10% FBS (fetal bovine serum; Hyclone) was added to DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO-BRL) medium containing (GIBCO-BRL) and pipetted visually in a 15 ml Falcon tube to isolate into single cells. And centrifuged at 1000 RPM for 5 minutes to obtain a final isolated lung cancer cell group. The FBS was added to minimize cell damage during pipetting. The morphology of single cells isolated from lung cancer tissues by the above method is shown in FIG. 2.

상기 실시예 1에 제시된 크기로 절개된 조직을 이용함으로써 세포 손상을 최소화하는 수준에서 디스파제 및 콜라게나제 등의 효소를 처리하는 농도 및 시간을 조절하여 효과적으로 단일세포로 분리할 수 있다.
By using the tissue dissected to the size shown in Example 1 can be effectively separated into a single cell by adjusting the concentration and time of processing enzymes such as dispase and collagenase at a level that minimizes cell damage.

실시예Example 3: 부유배양을 위한  3: for floating culture 배양접시Culture Plate

부유배양을 위한 필수 조건은 적절한 재질의 배양접시를 선택하여 세포부착을 방지하는 것이다. 이를 위하여 상용화되고 있는 초 저부착 배양접시(코닝)을 사용할 수 있으며, 또는 페트리 접시에 플루로닉 F127(Pluronic F127)(Sigma)을 코팅하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 두 가지 접시를 사용하고 그 결과를 비교하였다. 플루로닉 F127 코팅은 배양접시의 바닥을 충분히 덮을 수 있을 정도로 0.05% 플루로닉 F127을 가하여 20분간 처리하고 여분의 용액을 제거한 후 건조시켜 사용하였다.A prerequisite for suspension culture is to select cell culture plates of appropriate material to prevent cell adhesion. To this end, commercially available ultra-low adhesion plates (Corning) can be used, or Pluronic F127 (Sluma) can be used to coat Petri dishes. In the present invention, the two dishes were used and the results were compared. Pluronic F127 coating was used for 20 minutes by adding 0.05% Pluronic F127 to sufficiently cover the bottom of the culture dish, removing excess solution, and drying.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 두 가지 배양접시에 세포를 배양한 후 세포괴 형성능력을 비교하였다. 상기 두 가지 배양접시에서 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 이후 실험을 위하여 보다 경제적인 플루로닉 F127을 코팅하여 사용하였다.
The results are shown in FIG. After culturing the cells in the two culture dishes was compared the ability to form a cell mass. No significant difference was observed in the two culture dishes. Therefore, more economical Pluronic F127 was coated and used for later experiments.

실시예Example 4: 최적의 배양액 선별 4: Optimal Media Selection

초기 절개된 조직의 배양으로부터 폐암세포의 정제 및 정제된 폐암세포의 배양 및 증식을 위한 적절한 배양액을 찾기 위하여 하기 조성의 배양액을 사용하여 실험하였다. 기본 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco-BRL)에 1 mM의 L-글루타민(Gibco-BRL), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco-BRL), 1% 비필수 아미노산(Gibco-BRL), 및 0.1 mM 머캅토에탄올(Gibco-BRL)을 포함하는 배지를 사용하였다. 대조군으로는 상기 기본배지에 10% FBS를 첨가한 배양액을 사용하였으며, 실험군으로는 상기 기본 배지에 각각 ACL4[N. Masuda et al., CHEST, 1991; 100: 429-438] 및 N2(Gibco-BRL)를 첨가하여 사용하였다. 상기 배지를 사용하여 실시예 3에서 제조한 플루로닉 F127 코팅 접시 상에서 부유배양하고 증식여부를 관찰하였다.In order to find a suitable culture medium for the purification of lung cancer cells and the culture and proliferation of purified lung cancer cells from the culture of the initially dissected tissue, the experiment was carried out using the culture medium of the following composition. The basal medium contained 1 mM L-glutamine (Gibco-BRL), 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL), and 1% non-essential amino acid (Gibco-BRL) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco-BRL). , And a medium containing 0.1 mM mercaptoethanol (Gibco-BRL) was used. As a control, a culture solution containing 10% FBS was added to the basal medium, and in the experimental group, ACL4 [N. Masuda et al ., CHEST , 1991; 100: 429-438] and N2 (Gibco-BRL) were added and used. The culture medium was suspended on the Pluronic F127 coated dish prepared in Example 3 and observed for growth.

도 4에 나타낸 결과에서 보듯이, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 부유배양을 했을 때, 10% FBS를 포함하는 혈청배지 보다 ACN4 또는 N2를 첨가한 무혈청 배지에서 배양한 경우 세포괴 형성률이 유의적으로 높았고 이는 현미경을 통해서도 확인할 수 있었다.
As shown in the results shown in Figure 4, when the suspension culture for 5 days in 37 ° C 5% CO 2 incubator, the cell mass formation rate when cultured in serum-free medium containing ACN4 or N2 than serum medium containing 10% FBS Was significantly higher and could be confirmed by microscopy.

실시예Example 5: 부유배양 세포의  5: suspension of cultured cells 계대배양Subculture

상기 실시예 4에서 부유배양하여 증식시킨 세포를 계대배양하기 위하여 세포 손상을 줄일 수 있는 효소를 탐색하였다. 일반적으로 계대배양에 사용되는 0.25% 트립신-EDTA(GIBCO)를 대조군으로, 억제제를 필요로 하지 않는 효소인 1% 아큐타제(Accutase; Millipore)를 실험군으로 사용하여 효과를 비교 분석하였다. 먼저, 세포괴를 회수하여 PBS로 기존 배양액을 제거한 후 페트리 배양접시에 각각의 효소를 떨어뜨려 3 내지 5개 정도의 방울을 만든 후 그 안에 세포괴를 넣어주고, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 5분간 반응시킨 후, 무혈청 배지를 이용하여 피펫팅하여 단일세포로 만들어 주었다. 단일세포로 분리되어 세포괴가 보이지 않는 것을 육안으로 확인하고, 1000 RPM에서 5분간 원심분리하여 0.05% 플루로닉 F127이 코팅된 접시에 다시 부유배양을 시작하였다.In Example 4, in order to passaging cells proliferated by suspension culture, an enzyme capable of reducing cell damage was searched. In general, 0.25% trypsin-EDTA (GIBCO), which is used for subculture, was used as a control group, and 1% accutase (Mipipore), an enzyme that does not require an inhibitor, was used as an experimental group. First, the cell mass was collected, the existing culture solution was removed with PBS, and each enzyme was dropped in a Petri culture dish to make 3 to 5 drops, and then the cell mass was put therein. Then, the cell mass was placed in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. After reacting for a minute, the cells were pipetted using a serum-free medium to make single cells. It was visually confirmed that the cell mass was not seen as a single cell, and centrifuged at 1000 RPM for 5 minutes to start suspension culture again on a plate coated with 0.05% Pluronic F127.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 1% 아큐타제를 처리하여 계대배양한 세포는 대조군 즉, 트립신-EDTA를 이용하여 계대배양한 세포보다 세포 손상이 적기 때문에 24시간 내에 세포괴를 재형성하여 배양 증식하는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 5, cells passaged with 1% accutase were less likely to damage cells than cells passaged with control, that is, trypsin-EDTA. It was confirmed that.

실시예Example 6: 배양된 폐암세포의 특성 분석 6: Characterization of cultured lung cancer cells

상기 실시예 1 내지 5를 통해 확립한 최적의 배양 조건으로 분리되고 증식된 즉 플루로닉 F127(Pluronic F127)이 코팅된 배양접시에서 40 내지 100 μm 크기의 절개된 조직을 디스파제와 콜라게나제 혼합 효소를 이용하여 단일세포로 분리한 폐암세포를 무혈청 ACN4 또는 N2 첨가 배지에 부유배양하여 세포괴를 얻고 이와 같이 증식된 세포괴를 아큐타제로 처리하여 계대배양함으로써 세포괴를 재형성하면서 지속적으로 증식시켰다. 대조군으로는 동일한 조직으로부터 분리한 세포를 부착배양한 세포를 이용하였다. 일정기간 배양 증식시킨 후 세포 형태 및 EPCAM 발현을 비교 분석하였다.Dispase and collagenase were cut into 40-100 μm incised tissues in a culture dish coated with Pluronic F127, which was isolated and expanded under optimal culture conditions established through Examples 1 to 5. Lung cancer cells isolated as a single cell using a mixed enzyme was suspended in serum-free ACN4 or N2 medium to obtain a cell mass, and the cell mass thus grown was treated with accutase and subcultured to continuously grow and repopulate the cell mass. . As a control, cells cultured with cells isolated from the same tissue were used. After culturing for a period of time, cell morphology and EPCAM expression were compared.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 부유배양한 세포에서 상피세포 형태의 세포가 다수 관찰되었으며, 상피세포에서 특이적으로 발현되는 EPCAM의 발현이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 분리 및 배양된 폐암세포가 EMT 또는 혈청에 의한 세포특성의 변화 없이 암세포의 특성을 유지하는 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Figure 6, a large number of cells in the form of epithelial cells were observed in the cells cultured in suspension, it was confirmed that the expression of EPCAM specifically expressed in epithelial cells is significantly high. Therefore, it was confirmed that the lung cancer cells isolated and cultured by the method of the present invention maintain the characteristics of the cancer cells without changing the cell characteristics by EMT or serum.

Claims (7)

하기 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법:
1) 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계;
2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 디스파제와 제4형 콜라게나제의 혼합 효소와 반응시켜 단일세포로 분리하는 단계;
3) 상기 2)단계의 분리된 단일세포를, 세포가 배양접시에 부착되는 것을 억제시키는 저부착 배양접시에서 무혈청 ACL4 또는 N2 첨가 배지로 부유배양하여 증식시키는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 부유배양하여 증식시킨 세포를 아큐타제(Accutase)를 이용하여 계대배양하는 단계로서, 상기 4)단계는 별도의 아큐타제 반응 종결 단계를 필요로 하지 않는 것을 특징으로 함.
A method of isolating and propagating lung cancer cells from lung cancer tissue comprising the steps of:
1) cutting the isolated lung cancer tissue to a size of 40 to 100 μm in diameter;
2) separating the cut tissue of step 1) into a single cell by reacting with a mixed enzyme of dispase and type 4 collagenase;
3) propagating the isolated single cells of step 2) by suspension culture with serum-free ACL4 or N2 addition medium in a low adhesion culture dish that inhibits the cells from adhering to the culture dish; And
4) Passaging the cells proliferated by the suspension culture in step 3) using Accutase, wherein step 4) does not require a separate end of the accutase reaction.
제1항에 있어서,
상기 폐암은 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC), 비소세포암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 또는 혼합성 대소세포암(mixed small cell/large cell cancer)인 것인 방법.
The method of claim 1,
Wherein the lung cancer is small cell lung cancer (SCLC), non-small cell lung cancer (NSCLC) or mixed small cell / large cell cancer.
제2항에 있어서,
상기 비소세포암은 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 대세포암종(large cell carcinoma) 및 선암종(adenocarcinoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method of claim 2,
Wherein said non-small cell carcinoma is selected from the group consisting of squamous cell carcinoma, large cell carcinoma and adenocarcinoma.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 3)단계의 저부착 배양접시는 상용화된 초 저부착 배양접시 또는 플루로닉 F127(Pluronic F127)을 코팅한 배양접시인 것인 방법.
The method of claim 1,
The low adhesion culture dish of step 3) is a commercially available ultra low adhesion culture dish or a culture dish coated with Pluronic F127 (Pluronic F127).
제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식하는 단계; 및
상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법.
Separating and propagating lung cancer cells from lung cancer tissue by the method of any one of claims 1 to 3 and 5; And
And treating the lung cancer cells with cancer treatment candidates.
제6항에 있어서,
상기 암치료 후보물질은 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Niindran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴(vincristine), 이포스파미드(ifosphamide), 타세바(tarceva), 이레사(iressa) 및 닥티노마이신(dactinomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 암치료제인 것인 방법.
The method of claim 6,
The cancer treatment candidates are carboplatin (paraplatin), cisplatin (Cisplatin), cyclophosphamide (Cyclophosphamide), ifosfamide, Nidran (Niindran), nitrogen mustard ( Niclogen mustar (Mechlorethamine HCL), Bleomycin, Doxorubicin, Mitomycin C, Cytarabine, Flurouracil, Gemcitabine ), Trimetrexate, methotrexate, etoposide, etoposide, vinblastine, vinorelbine, alimta, altretamine, Procarbazine, Taxol, Taxotere, Topotecan, Irinotecan, Bevacizumab, Gefitinib, Erlotinib, Fishibnil Picibanil Vial, Aclarubicin, Tegafur, Epi Epirubicin, Belotecan, anthracycline, idarubicin, adriamycin, vincristine, ifosphamide, tarceva, and iresa iressa) and dactinomycin.
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