KR102041246B1 - Zwitterionic alginate derivatives and a contrast agent composition containing the same - Google Patents

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최용두
이혜리
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Abstract

The present invention relates to zwitterionic alginate derivatives, a contrast agent composition containing the derivatives, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or inflammatory diseases, a method for preparing the derivatives, and a method for preparing the contrast agent composition or the pharmaceutical composition. The alginate derivatives of the present invention have zwitterionic properties to avoid non-specific interactions with serum proteins existing in cell cultures, blood, or the like, to inhibit non-specific intake of organs or tissues other than targeted organs or tissues to stably circulate in blood, and to form a conjugate body with an imaging contrast agent or drug to be used as a contrast agent composition or a pharmaceutical composition. In addition, delivery efficiency of a contrast agent and drug for a targeted cancer cell can be significantly increased, and imaging diagnosis and treatment effects can be dynamically improved.

Description

양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물 {Zwitterionic alginate derivatives and a contrast agent composition containing the same}Zwitterionic alginate derivatives and a contrast agent composition containing the same}

본 발명은 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체; 상기 유도체를 포함하는 조영제 조성물; 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 유도체의 제조방법 및 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.The present invention is a zwitterionic alginate derivative; Contrast composition comprising the derivative; Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases; It relates to a method for preparing the derivative and a method for preparing the contrast composition or pharmaceutical composition.

질병을 치료하는 데 있어서 질병으로 인해 야기되는 생체 내의 형태학적, 기능적인 변화를 초기 단계에 탐지하는 것이 중요한데, 예컨대, 암을 치료할 때 종양의 부위와 크기를 탐지하는 것은 효과적인 치료 설계의 상당히 중요한 요인에 해당한다. 이렇게 질병으로 인한 생체 내 변화를 탐지하기 위한 목적으로 공지된 방법으로, 천공 등에 의한 생체검사, X선 영상, 자기공명영상(MRI), 초음파 영상 및 형광영상 등의 다양한 영상화 진단법이 존재한다.In treating a disease, it is important to detect the morphological and functional changes in the body caused by the disease at an early stage.For example, detecting the location and size of a tumor when treating cancer is a very important factor in effective treatment design. Corresponds to As a known method for detecting changes in vivo due to the disease, there are various imaging diagnostic methods such as biopsy by perforation, X-ray image, magnetic resonance image (MRI), ultrasound image and fluorescence image.

이러한 영상화 진단법에는 적절한 영상 조영제가 사용되는데, 사용하는 영상법에 따라서 각 영상신호를 증폭 또는 감소시키는 특성을 갖는 아이오딘계 화합물, 금속 착물, 나노입자, 버블 또는 염료 등의 형태를 지닌 조영제를 사용한다. 일례로서, 형광영상 조영제는 특정 파장을 가지는 여기광에 노출시켜 형광을 방출하는 기능을 한다. 영상화 진단법 수행 시 개체는 체외로부터 여기광에 노출되며, 체내의 형광 조영제는 형광을 방출하여 이를 감지하는 원리로 질병의 증상, 경과 등을 진단할 수 있다.Appropriate imaging contrast agents are used in such imaging methods, and contrast agents in the form of iodine-based compounds, metal complexes, nanoparticles, bubbles, or dyes having the characteristics of amplifying or reducing each image signal according to the imaging method used are used. do. As an example, the fluorescence imaging contrast agent functions to emit fluorescence by exposure to excitation light having a specific wavelength. When the imaging method is performed, the individual is exposed to excitation light from outside the body, and the fluorescence contrast agent in the body can detect the symptoms and course of the disease by emitting fluorescence and detecting it.

그러나, 기존에 알려진 in vitro 및 in vivo 형광 영상 진단 시에 사용되는 조영제들은 세포 배양액 및 혈액 내에 존재하는 여러 종류의 혈장 단백질들과 비특이적으로 결합하면서 질병 병소에 조영제가 특이적으로 축적되는 것이 방해되거나, 정상 조직에 비특이적 축적이 일어남으로써 질병 부위의 정확한 영상 진단이 어렵게 되거나, 빠른 속도로 체외로 배출되어 단시간에 영상 진단을 해야 하는 기술적인 문제가 존재하였다.However, conventionally known contrast agents used for in vitro and in vivo fluorescence imaging diagnostics prevent the specific accumulation of contrast agent in disease lesions while non-specifically binding to various kinds of plasma proteins in cell culture and blood. As a result, nonspecific accumulation of normal tissues has made it difficult to accurately diagnose a diseased area, or it has been rapidly discharged to the outside of the body.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 혈청 단백질과의 비특이적인 상호작용이 일어나지 않아 정확한 진단을 가능하게 하고 체내에 보다 오랜 시간 동안 안정적으로 체류할 수 있는 물질을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)을 결합시킴으로써 양쪽이온성 특성을 갖는 알긴산 유도체를 사용할 경우, 목적하지 않는 기관 또는 조직에 조영제가 비특이적으로 섭취되는 것을 예방할 수 있으면서도, 일정 시간 후에도 높은 농도로 체내에 체류할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Against this background, the present inventors have made efforts to find a substance that is capable of accurate diagnosis and stably stays in the body for a longer time because no nonspecific interaction with serum proteins has occurred. As a result, lysine or arginine ( arginine) by using alginate derivatives having zwitterionic properties can be used to prevent unspecific intake of contrast agents into undesired organs or tissues, while ensuring that they remain in the body at high concentrations even after a period of time. The present invention has been completed.

한국 공개공보 10-2012-0063753 AKorean Publication 10-2012-0063753 A

본 발명의 하나의 목적은 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide zwitterionic alginate derivatives.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a contrast agent composition comprising the alginic acid derivative.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases comprising the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for preparing the alginic acid derivative.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for preparing the contrast agent composition or pharmaceutical composition.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This will be described in detail as follows. In addition, each description and embodiment disclosed in this application may apply to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in this application are within the scope of the present application. In addition, the scope of the present application is not to be limited by the specific description described below.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체를 제공하는 것으로, 상기 알긴산 유도체는 알긴산에 라이신 또는 아르기닌을 결합시킴으로써 양쪽이온성을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.One aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a zwitterionic alginate derivative, characterized in that the alginic acid derivative has zwitterionicity by binding lysine or arginine to alginic acid. Specifically, the zwitterionic alginic acid derivative may be represented by the following formula (1).

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112018129137983-pat00001
Figure 112018129137983-pat00001

상기 화학식 1에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있으며, 상기 R은 라이신 또는 아르기닌의 결합체, 즉

Figure 112018129137983-pat00002
,
Figure 112018129137983-pat00003
또는
Figure 112018129137983-pat00004
일 수 있다.In Formula 1 n may be an integer of 1 to 3000, wherein R is a lysine or arginine conjugate,
Figure 112018129137983-pat00002
,
Figure 112018129137983-pat00003
or
Figure 112018129137983-pat00004
Can be.

본 발명에서 용어 “알긴산”은 해조류에 포함된 다당류의 일종이자, β(1→4)-D-만유로닉산(mannuroinic acid)과 α(1→4)-L-글유로닉산(guluronic acid) 잔기로 구성된 선상의 우론산 중합체로서, 화학식은 (C6H8O)n이고, 분자량은 20,000 내지 240,000로 알려져 있다. 알긴산의 중합도 등 성질은 추출에 사용한 해조류의 종류, 출처, 해조류를 채집한 계절 등에 따라 달라질 수 있으며, 만유로닉산과 글유로닉산의 구성, 배열 및 함량에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용된 알긴산은 평균 분자량의 범위가 100,000 내지 1,000,000이며, 15 내지 600 mPa·s의 점도, 만유로닉산 : 글루로닉산의 함량 비율이 1.0 내지 2.0 사이의 값을 지니는 것이나, 본 발명의 알긴산 유도체의 합성에 사용될 수 있는 한 알긴산의 분자량, 점도, 만유로닉산과 글루로닉산의 배열 순서, 함량 비율 등은 특별히 제한되지 않는다.In the present invention, the term “alginic acid” is a kind of polysaccharide contained in seaweed, and β (1 → 4) -D-mannuroinic acid and α (1 → 4) -L-guluronic acid. As a linear uronic acid polymer composed of residues, the chemical formula is (C 6 H 8 O) n and a molecular weight is known to be 20,000 to 240,000. The degree of polymerization of alginic acid and the like may vary depending on the type of algae used for extraction, source, season of collecting algae, and may vary depending on the composition, arrangement and content of manuronic acid and glycuronic acid. Alginic acid used in the present invention has an average molecular weight in the range of 100,000 to 1,000,000, a viscosity of 15 to 600 mPa · s, a content ratio of euronic acid: gluronic acid is between 1.0 and 2.0, but of the present invention As long as it can be used for the synthesis of the alginic acid derivative, the molecular weight, viscosity, arranging order of manuronic acid and gluonic acid, content ratio and the like of the alginic acid are not particularly limited.

본 발명의 알긴산 유도체는 양쪽이온성을 나타내어, 조영제로 사용 시 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피할 수 있는 것을 특징으로 하며, 이는 알긴산과 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 직접 결합됨으로써 나타나는 효과이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 알긴산 유도체는 EDC/sulfo-NHS coupling 반응을 이용하여 알긴산과 라이신 또는 아르기닌이 아마이드 결합을 형성하여 합성될 수 있으며, 상기 라이신 또는 아르기닌은 L-form(즉, L-lysine 또는 L-arginine)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.The alginic acid derivative of the present invention exhibits zwitterionicity, and when used as a contrast agent, it is possible to avoid non-specific interactions with serum proteins present in cell culture medium or blood, and this is because alginic acid and lysine or arginine ( arginine) is the effect of direct binding. More specifically, the alginic acid derivative of the present invention may be synthesized by forming an amide bond between alginic acid and lysine or arginine using an EDC / sulfo-NHS coupling reaction, and the lysine or arginine may be L-form (ie, L-lysine). Or L-arginine), but is not particularly limited thereto.

또한, 본 발명의 알긴산 유도체는 EDC 및 sulfo-NHS의 커플링 반응을 이용하여 알긴산 유도체와 L-라이신 또는 L-아르기닌을 반응하여 결합시킨 것으로, 결합 후에도 알긴산 유도체가 양쪽이온성을 유지하게 되어 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용 회피할 수 있다.In addition, the alginic acid derivative of the present invention combines the alginic acid derivative with L-lysine or L-arginine by using the coupling reaction of EDC and sulfo-NHS, and the alginic acid derivative maintains zwitterionicity after binding. Nonspecific interactions with serum proteins present in culture or blood, etc. can be avoided.

본 발명의 일 실시예에서는, 인산완충액(PBS), 인도시아닌 그린(indocyanine gree, ICG), 형광염료가 결합된 음이온성 알긴산(Alg@ZWA) 및 형광염료가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 (Alg-lys@ZW38)를 준비하여 동일 용량으로 쥐의 꼬리정맥을 통하여 주사하였다. 그 결과, ICG를 주입한 경우 20분 이내에 주입한 ICG의 대부분이 간에 축적이 되어 있었으며, 24시간 이후에는 형광신호가 거의 검출되지 않는 것을 확인하였다. 형광염료가 결합된 알긴산(Alg@ZWA)의 경우에도 주입 후 20분 내에 많은 양이 소변으로 배출되고, 주입 1시간 이후에는 생체 내에서의 형광신호가 약해졌으며, 주입 3시간 이후부터는 간에서만 일부 형광신호가 관찰되었다. 반면, 형광염료가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys@ZW38)의 경우, 쥐의 몸 전체에 걸쳐서 24시간 동안 형광신호가 발생하는 것을 확인하였는바, 이는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 조영제가 결합된 경우, 간에서의 비특이적 축적이 예방되고 나아가 혈액 내 체류 시간도 현저히 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이다.In one embodiment of the present invention, phosphate buffer (PBS), indocyanine green (ICG), anionic alginic acid (Alg @ ZWA) combined with fluorescent dyes and zwitterionic alginic acid derivatives combined with fluorescent dyes ( Alg-lys @ ZW38) was prepared and injected through the tail vein of the rat at the same dose. As a result, when ICG was injected, most of the ICG injected within 20 minutes was accumulated in the liver, and after 24 hours, it was confirmed that almost no fluorescence signal was detected. Alginic acid (Alg @ ZWA) combined with fluorescent dyes was also excreted in urine within 20 minutes after injection, and the fluorescent signal in vivo was weakened after 1 hour of injection. Fluorescent signal was observed. On the other hand, in the case of the zwitterionic alginate derivative (Alg-lys @ ZW38) to which the fluorescent dye is bound, it was confirmed that the fluorescent signal is generated for 24 hours throughout the body of the mouse, which is the zwitterionic alginate derivative of the present invention. When contrast agent is bound to, it indicates that nonspecific accumulation in the liver can be prevented and further increase the residence time in the blood.

본 발명의 알긴산 유도체는 알긴산과 라이신 또는 아르기닌이 직접 결합된 화합물뿐만 아니라, 혈액 내 체류 시간 향상과 비특이적 상호작용 억제 효과를 더욱 증진시키기 위하여 상기 알긴산 유도체에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 추가로 결합된 것일 수 있다. The alginic acid derivative of the present invention is not only a compound in which alginic acid and lysine or arginine are directly bonded, but also polyethylene glycol (PEG) is added to the alginic acid derivative in order to further improve the residence time in the blood and further suppress the nonspecific interaction. It may be combined.

상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 결합되는 PEG의 분자량, 결합 위치 및 개수는 목표로 하는 생체 내 체류 시간과 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, PEG는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +)에 결합되거나 카르복실 그룹(-COO-)에 결합될 수 있다. 또한, PEG는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 최대 50% 까지 결합될 수 있으며, 보다 구체적으로 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 1 내지 20%와 결합될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.The molecular weight, binding position, and number of PEG bound in the unit compound represented by Chemical Formula 1 may be differently applied by those skilled in the art depending on the target residence time and application field. More specifically, PEG is coupled to a lysine or arginine residue of the terminal amine group (-NH 3 +) present in the unit compound represented by the formula (1) or carboxyl group (-COO -) may be coupled to. In addition, PEG may be bound up to 50% of the total amine group or carboxyl group number present per molecule of the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention, and more specifically, the total amine present per molecule of the zwitterionic alginic acid derivative It may be combined with 1 to 20% of the group or carboxyl group number, but is not particularly limited thereto.

보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 양쪽이온성 알긴산 유도체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.  More specifically, the alginic acid derivative of the present invention may be a zwitterionic alginic acid derivative represented by the following Chemical Formula 2, but is not limited thereto.

[화학식 2][Formula 2]

Figure 112018129137983-pat00005
Figure 112018129137983-pat00005

상기 화학식 2에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있으며, m은 6 내지 1,000의 정수일 수 있다.In Formula 2 n may be an integer of 1 to 3000, m may be an integer of 6 to 1,000.

본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체는 화학식 1로 표시되는 알긴산 유도체에 메톡시 폴리에틸렌글리콜 석신이미딜 N-하이드록시석신이미드 에스터(methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG5K-NHS) 또는 mPEG5K-SPA를 반응시켜 합성될 수 있으나, 이를 위해 PEG를 제공하여 상기 알긴산 유도체에 결합시킴으로써 혈액 내의 체류시간을 증가시키기 위한 목적으로 사용할 수 있는 물질이라면 이에 특별히 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 알긴산 유도체는 PEG를 결합시킴으로써 개체의 혈액 내 체류시간이 보다 더 증가되고 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용이 억제되는 것을 특징으로 한다.Cationic alginic acid derivatives both of the present invention is methoxy-polyethylene glycol succinimidyl N- hydroxy succinimide ester (methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester , mPEG 5K -NHS) or mPEG 5K to alginic acid derivative represented by the formula (1) It can be synthesized by reacting SPA, but if it is a substance that can be used for the purpose of increasing the residence time in the blood by providing a PEG for binding to the alginic acid derivative for this purpose is not particularly limited thereto. That is, the alginic acid derivatives of the present invention are characterized in that by binding to PEG, the residence time in the blood of the individual is further increased and nonspecific interaction with serum proteins present in the blood is suppressed.

한편, 본 발명에서 알긴산 유도체는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 상기 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜 얻어지는 유사한 화합물로서, 양쪽이온성을 나타내며 개체 내에서 보다 긴 시간 동안 체류할 수 있는 특징을 나타내는 한 이에 제한없이 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다.On the other hand, the alginic acid derivative in the present invention is a similar compound obtained by chemically changing a part of the compound in addition to the compound represented by the formula (1), as long as it exhibits zwitterionic properties that can be retained in the individual for a longer time It will be apparent to those skilled in the art that the present invention may be included without limitation.

또한, 본 발명의 알긴산 유도체는 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체에 영상 조영제 또는 약물이 추가로 결합된 것일 수 있다. 상기 “영상 조영제”는 자기공명영상 조영제(MRI 조영제), CT(computed tomography) 조영제, 또는 형광염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the alginic acid derivative of the present invention may be an image contrast agent or drug further bound to the zwitterionic alginic acid derivative. The "image contrast agent" may be, but is not limited to, a magnetic resonance imaging contrast agent (MRI contrast agent), a computed tomography (CT) contrast agent, or a fluorescent dye.

상기 “자기공명영상 조영제”는 체내에 주입되어 조직의 이완율을 변화시킴으로써 조직간 이완도의 차이를 벌리고, MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 상기 자기공명영상 조영제로는 가돌리늄 조영제가 대표적이고, 구체적으로 이온화 가돌리늄(Gd)(Ⅲ) 착물과 중성 가돌리늄(Gd)(Ⅲ) 착물이 있으며, 보다 구체적으로 가돌리늄 착화합물, 망간 착화합물, 구리(Copper)(II) 착화합물, 산화철 나노입자 및 산화망간 나노입자일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.The magnetic resonance imaging contrast agent is injected into the body to change the relaxation rate of the tissue to widen the difference in relaxation between tissues, and to change the MRI signal to play a role of sharpening the contrast between tissues. The magnetic resonance imaging contrast agent is a gadolinium contrast agent, specifically, an ionized gadolinium (Gd) (III) complex and a neutral gadolinium (Gd) (III) complex, more specifically gadolinium complex, manganese complex, copper (Copper) (II) It may be a complex compound, iron oxide nanoparticles and manganese oxide nanoparticles, but is not particularly limited thereto.

상기 “CT 조영제”는 X선 촬영시 음영을 명확하게 하기 위해 사용하는 물질로, 요오드화 조영제 또는 바륨 조영제 등일 수 있으나 이에 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 요오드화 조영제는 X선을 통과시키지 않는 요오드를 함유하는 것으로, 질환 병변이 있는 조직과 정상 조직에 요오드가 분포되는 정도가 다르기 때문에 X선 촬영이나 X선을 사용한 CT 검사 등에서 X선 흡수 차이를 크게 나타나게 만들어서 조직이나 병변의 상태를 명확하게 대조시킬 수 있다. 상기 요오드화 조영제는 이옥시탈라민산(ioxitalamic acid), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오버솔(ioversol), 이오프로미드(iopromid), 이오메프롤(iomeprol), 이오비트리돌(iobitridol) 또는 이오딕산올(iodixanol)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 바륨은 물에 녹지 않는 흰색 가루로, 바륨 조영제는 X선을 통과시키지 않는다. 특수한 X선 검사나 CT 촬영, 소화관 조영시 바륨 조영제를 마시고 촬영을 하면 소화관 윤곽이 명확히 드러날 수 있다. 구체적으로, 상기 바륨 조영제는 황산바륨(barium sulfate)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.The "CT contrast agent" is a material used for clarity of shadows during X-ray imaging, and may be an iodide contrast agent or a barium contrast agent, but is not particularly limited thereto. Specifically, the iodinated contrast agent contains iodine that does not pass X-rays, and the difference in X-ray absorption in X-ray imaging or CT scan using X-rays is different because the degree of iodine distribution is different between tissues with diseased lesions and normal tissues. You can make it appear larger so that you can clearly contrast the condition of the tissue or lesion. The iodinated contrast agent is ioxitalamic acid, iohexol, iopamidol, ioversol, iopromide, iopromid, iomeprol, iovitolidol (iobitridol) or iodixanol, but is not limited thereto. In addition, barium is a white powder which is insoluble in water, and the barium contrast agent does not pass X-rays. Special X-ray examinations, CT scans, and drinking barium contrast media during the digestive tract contrast may reveal the outline of the digestive tract. Specifically, the barium contrast agent may be barium sulfate, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서 상기 “형광염료”는 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4, 4-디플루오로-5, 7-디메틸-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4, 4-디플루오로-1, 3, 5, 7-테트라메틸-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPYR6G(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(4-페닐-1, 3-부타디에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 (Cy5, Cy5.5, Cy7, IR820), 인도시아닌 그린(Indocyaninegreen, ICG) 또는 ZW800(ZW800 NHS ester) 등 일 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다.In the present invention, the "fluorescent dye" is Fluorescein (Fluorescein), CR110: Carboxyrrodamine 110: Rhodamine Green (trade name), TAMRA: Carboxytetrammethylamine: TMR, Carboxyrotamine 6G: CR6G, BODIPY FL (Trade name): 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 493/503 (trade name): 4, 4- Difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid, BODIPYR6G (trade name): 4, 4-difluoro-5- (4-phenyl-1,3-butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 558/568 (trade name): 4, 4-difluoro- 5- (2-thienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 564/570 ™: 4, 4-difluoro-5-styryl- 4-Vora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 576/589 ™: 4, 4-difluoro-5- (2-pyrrolyl) -4-bora-3a , 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 581/591 (trade name): 4, 4-difluoro-5- (4-phenyl-1, 3-butadienyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, EvoBlue10 (trade name), EvoBlue30 (Trade name), MR121, ATTO 655 (trade name), ATTO 680 (trade name), ATTO 700 (trade name), ATTO MB2 (trade name), Alexa Fluor 350 (trade name), Alexa Fluor 405 (trade name), Alexa Fluor 430 (trade name) , Alexa Fluor 488 (trade name), Alexa Fluor 532 (trade name), Alexa Fluor 546 (trade name), Alexa Fluor 555 (trade name), Alexa Fluor 568 (trade name), Alexa Fluor 594 (trade name), Alexa Fluor 633 (trade name), Alexa Fluor 680 (trade name), Alexa Fluor 700 (trade name), Alexa Fluor 750 (trade name), Alexa Fluor 790 (trade name), Flamma 496 (trade name), Flamma 507 (trade name), Flamma 530 (trade name), Flamma 552 (trade name) ), Flamma 560 (trade name), Flamma 575 (trade name), Flamma 581 (trade name), Flamma 648 (trade name), Flamma 675 (trade name), Flamma 749 (trade name), Flamma 774 (trade name), Flamma 775 (trade name), Rhodamine Red-X (trade name), Texas Red-X (trade name), 5 (6) -TAMRA-X (trade name), 5TAMRA ( Asserting), cyanine (Cyanine) may be a sequence such as dyes (Cy5, Cy5.5, Cy7, IR820), Indian Green (Indocyaninegreen, when ICG is not) or ZW800 (NHS ZW800 ester), is not particularly limited.

상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물에 결합되는 조영제의 결합 위치 및 개수는 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 조영제(형광염료)는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +)에 결합되거나 카르복실 그룹(-COO-)에 결합될 수 있다. 또한, 상기 조영제는 본 발명의 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 최대 50% 까지 결합될 수 있으며, 보다 구체적으로 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 1 내지 20%와 결합될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.The binding position and number of the contrast agent bound to the unit compound represented by Formula 1 may be differently applied by those skilled in the art according to the application field. Can be coupled to the - specifically, the contrast agent (fluorescent dye) or is coupled to a lysine or arginine residue of the terminal amine group (-NH 3 +) present in the unit compound represented by the formula (1) carboxyl group (-COO) have. In addition, the contrast agent may be bound up to 50% of the total number of amine groups or carboxyl groups present per molecule of the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention, more specifically per molecule of zwitterionic alginic acid derivative It may be combined with 1 to 20% of the total amine group or carboxyl group number present, but is not particularly limited thereto.

보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 상기 화학식 1로 표시되는 알긴산 유도체에 형광염료인 ZW800 NHS ester를 반응하여 결합된 형태로, 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.As a more specific example, the alginic acid derivative of the present invention is a form in which the alginic acid derivative represented by Chemical Formula 1 is reacted by reacting a fluorescent dye ZW800 NHS ester, and may be represented by Chemical Formula 3, but is not particularly limited thereto.

[화학식 3][Formula 3]

Figure 112018129137983-pat00006
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상기 화학식 3에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있다.In Chemical Formula 3, n may be an integer of 1 to 3000.

본 발명에 있어서 상기 약물은 대상 질환에 적절한 약물을 선택할 수 있으며, 예를 들어 상기 약물은 항암제, 항염증제, 마취제, 항바이러스제, 항박테리아제, 치료용 항체, 항생제, 면역치료제 또는 광감각제(광감작제)일 수 있으며, 보다 구체적으로 항암제 또는 항염증제일 수 있으나 이에 특별히 제한되지 않는다. In the present invention, the drug may select a drug suitable for the target disease, for example, the drug may be an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an anesthetic, an antiviral agent, an antibacterial agent, a therapeutic antibody, an antibiotic, an immunotherapy agent or a photosensitive agent (photo Sensitizer), and more specifically, may be an anticancer agent or an anti-inflammatory agent, but is not particularly limited thereto.

상기 “항암제”는 독소루비신, 고시폴, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The "anticancer agent" includes doxorubicin, gosipol, nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, zefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, conservinib, ill Citinib, cediranib, restautinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, biscumalboom, asparaginase, tretinoin, hyde Roxycarbamide, Dasatinib, Estramustine, Gemtuzumab Ozogamycin, Ibritumomab Tucetan, Heptaplatin, Methylaminolevulinic Acid, Amsacrine, Alemtuzumab, Procarbazine, Alprostadil, Holmium nitrate chitosan, gemcitabine, doxyfluidine, pemetrexed, tegapur, capecitabine, gimerasin, otheracil, azacytidine, methotrexate, uracil, cytarabine, fluorouracil, fludagabine, Enositabine, fluta Mead, decitabine, mercaptopurine, thioguanine, cladribine, carmofer, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, irinotecan, velotecan, topotecan, vinorelbine, etoposide, vincristine, vinblastine, teni Fosid, doxorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, mitomycin, bleomycin, daunorubicin, dactinomycin, pyrarubicin, aclarubicin, pepromycin, temsirolimus, temo Zolomide, Busulfan, Iphosphamide, Cyclophosphamide, Melparan, Altretmin, Dacazine, Chiotefa, Nimustine, Chlorambucil, Mitolactol, Leukovorin, Tretonin, Xmestan, Amino Selected from the group consisting of glutesimide, anagrelide, nabelbin, padrazole, tamoxifen, toremifene, testosterone, anastrozole, letrozole, borosol, bicalutamide, romusstin and carmustine Can be more than one B is not limited to this.

상기 “항염증제”는 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜 (ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indometha cin), 페닐타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손 (dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticoste roid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The "anti-inflammatory agents" are salicylates (ibule), ibuprofen (ibuprofen), naproxen (naproxen), fenofene (fenoprofen), indomethacin (indomethacin, phenyltazone, mesotrexate ( methotrexate, cyclophosphamide, mechlorethamine, dexamethasone, prednisolone, celecoxib, valdecoxib, nimesulide, nimesulide, cortisone (cortisone) and corticosteroid (corticosteroid) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

상기 “광감각제”는 빛에 민감한 반응을 보이는 물질을 인체 내에 투여하는 의약품으로, 주로 암 치료나 피부 질환, 관절염을 목적으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 광감각제는 헤마토 포르피린 유도체(Hemato Porphyrin Derivative), 아미노 레뷰리닉산(ALA) 또는 클로린(Chlorin)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The "photosensitive agent" is a medicine for administering a light-sensitive substance in the human body, and may be mainly used for cancer treatment, skin disease, or arthritis. Specifically, the photosensitive agent may be, but is not limited to, Hemato Porphyrin Derivative, Amino Levulinic Acid (ALA) or Chlorin.

상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물에 결합되는 약물의 결합 위치 및 개수는 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 약물(광감각제)는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +) 또는 카르복실 그룹(-COO-)에 결합할 수 있으며, 알긴산 유도체에 대해 1 내지 20 w/w % 비율로 결합할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. The binding position and number of the drug to be bound to the unit compound represented by the formula (1) may be differently applied by those skilled in the art depending on the application field. Specifically, the drug (the optical sense) is a terminal amine group of a lysine or arginine residue (-NH 3 +) or carboxyl group (-COO -) present in a unit of the compound represented by Formula 1 can be coupled to, and In addition, the alginic acid derivative may be bound in a ratio of 1 to 20 w / w%, but is not particularly limited thereto.

보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 하기 화학식 4로 표시될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. More specifically, the alginic acid derivative of the present invention may be represented by the following Chemical Formula 4, but is not particularly limited thereto.

[화학식 4][Formula 4]

Figure 112018129137983-pat00007
Figure 112018129137983-pat00007

상기 화학식 4에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있다.In Formula 4, n may be an integer of 1 to 3000.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다. Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a contrast agent composition comprising the alginic acid derivative. The alginic acid derivative is as described above.

본 발명에서 용어 “조영제 조성물”은 영상진단 검사 또는 시술 시 특정 조직이나 혈관이 잘 보일 수 있도록 인체에 투여하는 물질을 의미하는 것으로, 성분에 따라 요오드화 조영제, 가돌리늄 조영제, 바륨 조영제 등으로 구분되며, 일반적으로 X선 촬영 및 CT 촬영에는 요오드화 조영제와 바륨 조영제가 사용되고, MRI(magnetic resonance imaging, 자기공명검사)에는 가돌리늄 조영제가 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 조영제 조성물은 상기 알긴산 유도체에 영상 조영제가 추가로 결합된 화합물을 포함하는 것일 수 있다. In the present invention, the term "contrast composition" refers to a substance to be administered to the human body so that specific tissues or blood vessels can be easily seen during an imaging test or procedure, and is classified into an iodide contrast agent, a gadolinium contrast agent, a barium contrast agent, etc. In general, iodide and barium contrast agents are used for X-ray and CT imaging, and gadolinium contrast agents are used for magnetic resonance imaging (MRI). In the present invention, the contrast agent composition may include a compound in which an image contrast agent is further bound to the alginic acid derivative.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다. Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases, comprising the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The alginic acid derivative is as described above.

즉, 상기 약학 조성물은 본 발명의 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염를 약제학적으로 유효한 양만큼 포함할 수 있으며, 상기 알긴산 유도체는 상기 영상 조영제 및/또는 약물이 결합된 형태를 의미하는 것일 수 있다. That is, the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically effective amount of the alginic acid derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the alginic acid derivative may mean a form in which the imaging contrast agent and / or drug are combined. have.

구체적으로, 상기 약학적 조성물은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암 등의 암; 녹내장, 백내장, 노인성 황반병성 등의 안과질환; 동맥경화, 뇌경색, 혈관 재협착 등의 혈관질환; 관절염; 자가면역질환; 충치, 치주농양, 치조골염, 만성 치주염, 치은염 등의 치과질환; 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.Specifically, the pharmaceutical composition is cerebrospinal cancer, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovary Cancers such as cancer, cervical cancer, endometrial cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma or skin cancer; Ophthalmic diseases such as glaucoma, cataracts, and age-related macular disease; Vascular diseases such as arteriosclerosis, cerebral infarction, and vascular restenosis; arthritis; Autoimmune diseases; Dental diseases such as caries, periodontal abscess, alveolar osteoarthritis, chronic periodontitis, gingivitis; Or it may be for the prevention or treatment of diabetes, but is not particularly limited thereto.

본 발명에서 용어 “약학적으로 허용 가능한 염”은 투여되는 본 발명의 알긴산 유도체가 갖는 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 제형을 의미한다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염을 포함한다. 보다 구체적으로, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to a formulation that does not impair the biological activity and the properties of the alginic acid derivatives of the present invention administered. Specifically, the pharmaceutically acceptable salts include acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions, such as inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, and the like, Organic carboxylic acids such as tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trichloroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- Acid addition salts formed by sulfonic acids such as toluenesulfonic acid and the like. More specifically, pharmaceutically acceptable carboxylic acid salts include metal salts or alkaline earth metal salts formed by lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, amino acid salts such as lysine, arginine, guanidine, dicyclohexylamine, and N-. Organic salts such as methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, diethanolamine, choline and triethylamine and the like.

본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯하여, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, generally in an amount of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to The amount of 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg may be administered once to several times daily. For the purposes of the present invention, the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the age, weight, general health, sex and diet of the patient, including the type and extent of the reaction to be achieved and whether other agents are used in some cases. It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including the time of administration, the route of administration, the rate of administration of the composition, the duration of treatment, and the drugs used concurrently.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명의 용어 “약학적으로 허용 가능한 담체”란, 생물체를 자극하지 않으면서 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 이때, 상기 담체는 비자연적인 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘 카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 약학 조성물의 유효성분인, 약물에 결합된 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 독립적으로, 또는 조합하여 추가될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated with the carrier to provide food, medicine, feed additives and drinking water additives. As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” may refer to a carrier or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of the compound to be injected without stimulating the organism. The type of the carrier usable in the present invention is not particularly limited, and any carrier can be used as long as it is a conventionally used and pharmaceutically acceptable carrier in the art. Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof. The composition comprising the pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. In this case, the carrier may include a non-naturally occuring carrier. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used. The carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, saline, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, dextrin, calcium carbonate, propylene glycol and liquid paraffin, but There is no limitation, and any conventional carrier, excipient or diluent can be used. The components may be added independently or in combination with the alginic acid derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof bound to the drug, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Solid form preparations for oral administration may include tablet pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or It may be prepared by mixing lactose, gelatin and the like. In addition to the simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like can also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories It can have any one formulation.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount. There is no particular restriction on the dosage, and it may be changed according to body absorption, weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of disease. The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in consideration of the effective amount range, and the unit dosage form formulated in this way uses a specialized dosage method according to the judgment of an expert and the needs of an individual to monitor or observe the administration of the drug as necessary. Or several times at regular time intervals.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다.Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a method for producing the alginic acid derivative. The alginic acid derivative is as described above.

구체적으로, 상기 제조방법은 (a) 알긴산에 EDC 및 sulfo-NHS를 처리하는 단계; 및 (b) EDC 및 sulfo-NHS가 처리된 알긴산을 라이신(lysine) 또는 아르기닌(alginine)과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. Specifically, the preparation method comprises the steps of: (a) treating the alginic acid with EDC and sulfo-NHS; And (b) reacting the alginic acid treated with EDC and sulfo-NHS with lysine or arginine.

상기 “EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)”는 일반적으로 하이드로클로라이드(hydrochloride)로 얻어지는 수용성 카르보디이미드(carbodiimide)로서, 펩타이드 합성, 핵산에 대한 단백질 가교결합 등에 사용될 수 있으며, 대형 생체 분자의 고정화를 위해 N-하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide)와 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 NHS는 “sulfo-NHS(N-hydroxysulfoxuccinimide)”일 수 있다.The “EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)” is a water-soluble carbodiimide generally obtained as a hydrochloride, and can be used for peptide synthesis, protein crosslinking to nucleic acids, and the like. It can be used with N-hydroxysuccinimide (NHS) for the immobilization of large biomolecules. Specifically, the NHS may be “sulfo-NHS (N-hydroxysulfoxuccinimide)”.

본 발명의 일 실시예에서는 EDC 및 sulfo-NHS의 커플링 반응을 이용하여 알긴산 유도체와 L-라이신을 반응하여 결합시켰고, 이를 통해 결합 후에도 알긴산 유도체가 양쪽이온성을 유지하게 되어 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용 회피할 수 있다. In one embodiment of the present invention by using the coupling reaction of EDC and sulfo-NHS and the alginic acid derivative and L- lysine by the reaction, the alginic acid derivative maintains the zwitterionic even after binding through the cell culture solution or blood Nonspecific interactions with serum proteins present may be avoided.

또한, 상기 알긴산 유도체의 제조방법은 상기 (b) 단계 이후에 (c) 라이신 또는 아르기닌이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 또는 알긴산에 폴리에틸렌글리콜 먼저 결합시키고 상기 (b) 단계를 거쳐 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조 하는 것일 수 있다.In addition, the method of preparing the alginic acid derivative may further include a step of reacting the polyethylene glycol (PEG) with the alginic acid derivative to which (c) lysine or arginine is bound after step (b), or polyethylene to alginic acid Glycol may be combined first to prepare a zwitterionic alginic acid derivative through step (b).

상기 (c) 라이신 또는 아르기닌이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 반응시키는 단계는 상기 알긴산 유도체에 메톡시 폴리에틸렌글리콜 석신이미딜 N-하이드록시석신이미드 에스터(methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG5K-NHS) 또는 mPEG5K-SPA를 반응시키는 것일 수 있으나, 이외에도 PEG를 제공하여 상기 알긴산 유도체에 결합시킴으로써 혈액 내의 체류시간을 증가시키기 위한 목적으로 사용할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 유도체는 PEG가 결합된 것으로서 개체의 혈액 내 체류시간이 보다 더 증가되는 것을 특징으로 한다.The step (c) of reacting lysine or arginine-bound alginic acid derivatives with polyethylene glycol may include methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG 5K , to the alginic acid derivatives. -NHS) or mPEG 5K -SPA, but is not limited to any substance that can be used for the purpose of increasing the residence time in the blood by providing PEG to bind to the alginic acid derivative. That is, the alginic acid derivatives prepared by the above method are PEG-bound, and the residence time in the blood of the individual is further increased.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체, 조영제 및 약학 조성물은 전술한 바와 같다.Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a method for producing a contrast agent composition or a pharmaceutical composition comprising the alginic acid derivative. The alginic acid derivatives, contrast agents and pharmaceutical compositions are as described above.

구체적으로, 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법은 상기 알긴산 유도체의 제조방법에 따라 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체와, 영상 조영제 또는 약물을 반응시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이를 통해 제조된 알긴산 유도체는 영상 조영제 또는 광감각제를 비롯한 약물이 결합된 화합물 형태로, 상기 영상 조영제 및 약물은 전술한 바와 같다.Specifically, the method for preparing the contrast composition or pharmaceutical composition may include reacting the zwitterionic alginic acid derivative prepared according to the method for preparing the alginic acid derivative, an image contrast agent or a drug, and the alginic acid derivative prepared therefrom. Is in the form of a compound combined with a drug, including an imaging contrast agent or a photosensitizer, the imaging contrast agent and drug is as described above.

본 발명의 알긴산 유도체는 양쪽이온성을 가짐으로써 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피하고, 목적으로 하는 기관 또는 조직 이외의 다른 기관 또는 조직에 대한 비특이적 섭취가 저해되어 혈액 내에서 안정적인 순환이 가능하면서도, 영상 조영제 또는 약물과 결합체를 형성하여 조영제 조성물 또는 약학적 조성물로 활용될 수 있다. 또한, 표적으로 하는 암세포에 대한 조영제와 약물의 전달 효율을 획기적으로 높일 수 있을 뿐 아니라, 영상 진단 및 치료 효과도 크게 향상 시킬 수 있다.Alginate derivatives of the present invention have zwitterionicity to avoid nonspecific interactions with serum proteins present in cell culture or blood, and to inhibit nonspecific intake of organs or tissues other than the target organs or tissues, thereby inhibiting blood While stable circulation is possible in the present invention, it can be used as a contrast agent composition or a pharmaceutical composition by forming a conjugate with an imaging contrast agent or drug. In addition, the delivery efficiency of contrast agents and drugs to target cancer cells can be dramatically improved, and the imaging and treatment effects can be greatly improved.

도 1은 알긴산으로부터 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하는 과정 및 양쪽이온성 알긴산 유도체에 조영제 또는 약물을 결합하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2a는 알긴산과 라이신(lysine)을 결합시켜 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하는 개략도이다.
도 2b는 알긴산과 아르기닌(arginine)을 결합시켜 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하는 개략도이다.
도 3의 A는 라이신을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys)의 1H-NMR 측정 결과이며, 도 3의 B는 라이신을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 측정 결과이다.
도 4의 A는 아르기닌을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-arg)의 1H-NMR 측정 결과이며, 도 4의 B는 아르기닌을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 측정 결과이다.
도 5는 라이신이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 염료를 결합시키는 합성 개략도이다.
도 6a는 ZW-800 형광염료, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 UV-vis 흡광 스펙트럼이고, 도 6b는 ZW-800 형광염료, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 형광 스펙트럼이며, 도 6c는 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11 및 Alg-lys@ZW38에 대한 형광 소광 비율을 분석한 표이다.
도 7a은 ZW-800 NHS ester 형광물질의 농도별 흡광도 검정곡선이며, 도 7b는 ZW-800 NHS ester 형광물질의 농도별 형광 스펙트럼이다.
도 8은 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11 및 Alg-lys@ZW38를 인산완충액(PBS)에 용해시킨 후 촬영한 사진이다.
도 9은 인산완충액(PBS), ICG, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38이 담긴 튜브를 촬영한 근적외선 형광 영상(λex=780 nm, λem=845 nm)이다.
도 10은 알긴산에 ZW-800 amine dye를 결합시킨 Alg@ZWA의 합성 개략도이다.
도 11a는 ZW-800 amine 형광물질과 Alg-lys@ZWA의 수용액을 동일한 형광염료 농도(2.1μM)로 준비하고 측정한 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 11b는 ZW-800 amine 형광물질과 Alg-lys@ZWA의 수용액을 동일한 형광염료 농도(2.1μM)로 준비하고 측정한 형광 스펙트럼이다.
도 12a는 인산완충액, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주입하고, 등 쪽 방향에서 촬영한 시간별 형광영상 사진이며, 도 12b는 쥐의 심장 부근에서의(Region of interest, ROI) 시간에 따른 형광세기 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13는 인산완충액, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주입하고, 배 쪽 방향에서 촬영한 시간별 형광영상 사진이다.
도 14a는 KIMICA사의 알긴산에 대한 1H-NMR 분석 결과이며, 도 14b는 KIMICA사의 알긴산에 라이신을 결합시켜 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체에 대한 1H-NMR 분석 결과이다.
도 15a는 ZW-800 형광물질이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg(KIMICA)-lys@ZW-800)와 ZW-800 NHS ester 형광물질(2.9 μM)에 대한 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 15b는 ZW-800 형광물질이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg(KIMICA)-lys@ZW-800)와 ZW-800 NHS ester 형광물질(2.9 μM)에 대한 형광 스펙트럼이다.
도 16은 양쪽이온성 알긴산 유도체에 폴리에틸렌글리콜을 결합시켜서 Alg-lys-mPEG5K를 합성하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 17a는 합성된 Alg-lys-mPEG5K의 1H-NMR 분석 결과이며, 도 17b는 합성된 알긴산, 양쪽이온성 알긴산 및 mPEG5K가 결합된 양쪽이온성 알긴산(Alg-lys-mPEG5K)의 FT-IR 분석 결과이다.
도 18a는 Alg-lys-mPEG5K에 ZW-800를 결합시킨 Alg-lys-mPEG5K@ZW-800과 ZW-800 NHS ester 형광물질에 대한(3.9 μM) UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 18b는 Alg-lys-mPEG5K에 ZW-800를 결합시킨 Alg-lys-mPEG5K@ZW-800과 ZW-800 NHS ester 형광물질에 대한 (3.9 μM) 형광 스펙트럼이다.
도 19는 양쪽이온성 알긴산 유도체와 광감각제인 chloroin e6를 결합시킨 Alg-lys@Ce6의 합성과정에 대한 개략도이다.
도 20a는 인산완충액(PBS)에 용해된 광감각제 (Ce6) 및 Alg-lys@Ce6의 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 20b는 인산완충액(PBS)에 용해된 광감각제 (Ce6) 및 Alg-lys@Ce6의 형광 스펙트럼이다. 도 20c는 일항산소 분석 키트를 이용하여 빛을 조사한 경우 Alg-lys@Ce6로부터 일항산소 생성을 분석한 결과이다.
도 21은 암세포에 광감각제(Ce6)와 Alg-lys@Ce6를 동일 농도로 처리한 후에 얻은 공초점 형광 현미경 사진이다. Ce6를 처리한 경우에 비해 Alg-lys@Ce6를 처리한 경우 암세포 내로 섭취 및 전달되는 양이 크게 향상됨을 알 수 있다.
도 22는 암세포에 광감작제(Ce6)와 Alg-lys@Ce6를 처리하고, 670 nm 파장의 빛을 조사한 후, 세포 생존율을 분석한 결과이다.1 is a schematic diagram showing a process of preparing a zwitterionic alginic acid derivative from alginic acid and a process of binding a contrast agent or a drug to the zwitterionic alginic acid derivative.
2A is a schematic diagram of synthesizing zwitterionic alginic acid derivatives by combining alginic acid and lysine.
2B is a schematic diagram of synthesizing zwitterionic alginic acid derivatives by combining alginic acid and arginine.
3A shows the results of 1 H-NMR measurement of zwitterionic alginic acid derivatives (Alg-lys) synthesized by combining lysine, and FIG. 3B is FT-IR of zwitterionic alginic acid derivatives synthesized by combining lysine. It is a measurement result.
FIG. 4A shows the results of 1 H-NMR measurement of zwitterionic alginic acid derivatives (Alg-arg) synthesized by combining arginine, and FIG. 4B is FT-IR of zwitterionic alginic acid derivatives synthesized by combining arginine. It is a measurement result.
5 is a synthetic schematic diagram of binding ZW-800 NHS ester dye to lysine bound zwitterionic alginic acid derivative.
Figure 6a is a UV-vis absorption spectrum of ZW-800 fluorescent dyes, Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11, Alg-lys @ ZW38, Figure 6b is ZW-800 fluorescent dyes, Alg-lys @ ZW4, Alg Fluorescence spectra of -lys @ ZW11, Alg-lys @ ZW38, Figure 6c is a table analyzing the fluorescence extinction ratio for Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11 and Alg-lys @ ZW38.
FIG. 7A shows absorbance calibration curves of concentrations of ZW-800 NHS ester phosphors, and FIG. 7B shows fluorescence spectra of concentrations of ZW-800 NHS ester phosphors.
8 is a photograph taken after dissolving Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11 and Alg-lys @ ZW38 in phosphate buffer (PBS).
9 is a near-infrared fluorescence image taken of a tube containing phosphate buffer (PBS), ICG, Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11, Alg-lys @ ZW38 (λ ex = 780 nm, λ em = 845 nm). to be.
10 is a schematic of the synthesis of Alg @ ZWA incorporating ZW-800 amine dye into alginic acid.
Figure 11a is a UV-vis absorption spectrum prepared and measured by the same fluorescent dye concentration (2.1μM) of the aqueous solution of ZW-800 amine and Alg-lys @ ZWA, Figure 11b is a ZW-800 amine phosphor and Alg- An aqueous solution of lys @ ZWA was prepared at the same fluorescent dye concentration (2.1 μM) and measured.
Figure 12a is a phosphate buffer, ICG, Alg-lys @ ZW38, Alg @ ZWA injected through the tail vein of the rat, is a time-lapse fluorescence image taken in the dorsal direction, Figure 12b is near the heart of the rat (Region of interest (ROI) is a graph showing the change in fluorescence intensity value with time.
Figure 13 is a phosphate buffer, ICG, Alg-lys @ ZW38, Alg @ ZWA injection through the tail vein of the rat, is a time-lapse fluorescence image taken in the ventral direction.
Figure 14a is a 1 H-NMR analysis of the alginate's KIMICA, Figure 14b are both synthesized by coupling lysine to the alginate's KIMICA a 1 H-NMR analysis of the alginate ionic derivatives.
FIG. 15A is a UV-vis absorption spectrum of zwitterionic alginic acid derivatives (Alg (KIMICA) -lys @ ZW-800) and ZW-800 NHS ester phosphors (2.9 μM) bound to ZW-800 phosphors. 15b shows fluorescence spectra for zwitterionic alginic acid derivatives (Alg (KIMICA) -lys @ ZW-800) and ZW-800 NHS ester phosphors (2.9 μM) bound to ZW-800 phosphors.
FIG. 16 is a schematic view illustrating a process of synthesizing Alg-lys-mPEG 5K by binding polyethylene glycol to an amphoteric alginic acid derivative.
Figure 17a is the result of 1 H-NMR analysis of the synthesized Alg-lys-mPEG 5K , Figure 17b is a zwitterionic alginic acid (Alg-lys-mPEG 5K ) combined with the synthesized alginic acid, zwitterionic alginic acid and mPEG 5K FT-IR analysis results.
Figure 18a is a Alg-lys-mPEG 5K ZW- 800 was Alg-lys-mPEG 5K @ ZW -800 and ZW-800 (3.9 μM) UV -vis absorption spectra of the NHS ester fluorophore combine, as shown in Fig. 18b is Alg-lys-mPEG Alg-lys -mPEG that combines ZW-800 to 5K 5K @ ZW-800 and a ZW-800 (3.9 μM) the fluorescence spectrum of the fluorophore NHS ester.
19 is a schematic diagram illustrating the synthesis of Alg-lys @ Ce6 in which a zwitterionic alginic acid derivative is combined with chloroin e6 as a photosensitizer.
FIG. 20A is a UV-vis absorption spectrum of photosensitive agent (Ce6) and Alg-lys @ Ce6 dissolved in phosphate buffer solution (PBS), and FIG. 20B is a photosensitive agent (Ce6) and Alg dissolved in phosphate buffer solution (PBS). Fluorescence spectrum of -lys @ Ce6. Figure 20c is the result of analysis of the singlet oxygen production from Alg-lys @ Ce6 when the light is irradiated using the singlet oxygen analysis kit.
21 is a confocal fluorescence micrograph obtained after treatment of cancer cells with the same concentration of photosensitive agent (Ce6) and Alg-lys @ Ce6. Compared with the case of Ce6 treatment, Alg-lys @ Ce6 treatment significantly improves the amount of ingested and delivered into cancer cells.
22 is a result of analyzing the cell viability after treating a cancer cell with a photosensitizer (Ce6) and Alg-lys @ Ce6, irradiated with light of 670 nm wavelength.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited only to these examples.

실시예 1: 라이신(Lysine)이 결합된 양쪽이온성(zwitterionic) 알긴산 유도체의 제조 및 분석Example 1 Preparation and Analysis of Zwitterionic Alginic Acid Derivatives Conjugated with Lysine

1-1: 라이신이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 제조1-1: Preparation of Zwitterionic Alginate Derivatives

양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하기 위해, 알긴산의 카르복시기에 커플링제를 이용해 라이신의 아민기와의 결합을 통해 공유 결합체를 형성함으로써 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하였다. 유도체 제조에 사용된 알긴산은 씨그마알드리치사의 알긴산 나트륨염(cas no. 9005-38-3, average molecular weight = 190,000) 제품을 사용하였다(도 2a).In order to synthesize the zwitterionic alginic acid derivatives, zwitterionic alginic acid derivatives were prepared by forming covalent bonds with the amine groups of lysine using a coupling agent to the carboxyl groups of alginic acid. Alginic acid used in the preparation of the derivative was a product of sodium alginate salt (cas no. 9005-38-3, average molecular weight = 190,000) of Sigma Aldrich (FIG. 2A).

구체적으로, 알긴산에 라이신을 결합시키기 위하여 다양한 커플링제를 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 1-ehtyl-3-(3-dimethylaminorpropyl)carbodiimide (EDC)와 sulfo-N-hydroxysuccinimide(sulfo-NHS)을 사용하여 알긴산의 카르복시기를 활성화하여 알긴산-NHS ester를 얻고 여기에 라이신을 결합하는 과정을 수행하였다. 알긴산 50 mg을 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰수에 해당하는 EDC와 1.3배 몰수에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액에서 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol(14.3 M)을 7μL(최종농도 20 mM)을 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, 인산완충액 (PBS, 0.1 M, pH 7.4)으로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 라이신을 첨가하고 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 라이신 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 수득하였다.Specifically, various coupling agents may be used to bind lysine to alginic acid. In the present invention, 1-ehtyl-3- (3-dimethylaminorpropyl) carbodiimide (EDC) and sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) are used. The alginic acid-NHS ester was obtained by activating the carboxyl group of alginic acid to bind lysine. 50 mg of alginic acid was dissolved in 10 mL of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7), followed by 1.2 times mole of EDC and 1.3 times mole of alginate reaction. NHS was added and stirred for about 30 minutes at room temperature. After injecting 7 μL (final concentration 20 mM) of 2-mercaptoethanol (14.3 M) to inactivate the unreacted EDC in the solution and stirred for 20 minutes at room temperature. For the solution, unreacted materials and impurities in the solution were removed using a PD-10 column, and solvent exchange was performed with phosphate buffer (PBS, 0.1 M, pH 7.4). Then lysine corresponding to 5 times the number of moles of alginic acid was added and stirred at room temperature for one day. Dialysis was performed on the solution after completion of the reaction in distilled water for one day to remove unreacted materials and by-products in the composite, and lyophilized to obtain a lysine-bonded zwitterionic alginate derivative in powder form.

1-2: 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 구조 분석1-2: Structural Analysis of the Prepared Zwitterionic Alginate Derivatives

상기 실시예 1-1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(lysine conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)와 적외선분광광도계(FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 구조를 분석하였다(도 3).For the zwitterionic alginic acid derivatives (lysine conjugated alginic acid) prepared in Example 1-1, 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer ( 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan) and infrared spectrophotometer (FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA) to analyze the structure (Fig. 3).

구체적으로, 알긴산(alginate)과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼을 비교하였을 때 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 2.8 ppm 부근에서 보이는 lysine 수소 피크의 알긴산 대비 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기의 약 100%가 라이신과 결합되어 있는 것으로 확인되었다(도 3의 A). 한편, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 그래프로부터, 알긴산의 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리가 3300 cm-1 및 1619 cm-1 에서 나타났으며, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 알긴산의 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의하여 나타나던 1600 cm-1과 1409 cm-1과 부근의 피크가 사라지고, 1645 cm-1의 amide I 및 1550 cm-1의 amide II 와 같이 -CONH-에 의한 피크가 나타난 것을 확인하였다(도 3의 B). 이로부터, 알긴산의 카르복시기와 라이신의 아민기가 아마이드 결합을 형성하며 알긴산과 라이신 사이에 공유 결합이 형성된 것을 확인하였다.Specifically, alginic acid (alginate) and on both sides via a lysine alginate contrast ratio of the hydrogen peak seen in the vicinity of 2.8 ppm of the 1 H-NMR spectrum of the ionic alginate derivative calculation when both the comparison of 1 H-NMR spectrum of the ionic alginic acid derivatives It was confirmed that about 100% of the carboxyl groups of alginic acid are combined with lysine (FIG. 3A). On the other hand, from the graph showing the FT-IR spectrum of alginic acid and zwitterionic alginic acid derivatives, the characteristic peaks of alginic acid according to the hydroxyl group of the alginic acid and -OH stretching of the carboxyl group appeared at 3300 cm -1 and 1619 cm -1 . In the case of zwitterionic alginic acid derivatives, peaks around 1600 cm -1 and 1409 cm -1 disappeared due to symmetrical and asymmetric stretching of -COO- of alginic acid, and amide I and 1550 cm -1 of 1645 cm -1 disappeared. It was confirmed that the peak by -CONH- appeared as amide II (FIG. 3B). From this, it was confirmed that the carboxyl group of alginic acid and the amine group of lysine form an amide bond, and a covalent bond was formed between alginic acid and lysine.

실시예 2: 아르기닌(Arginine)이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조 및 분석Example 2: Preparation and analysis of zwitterionic alginic acid derivatives bound to arginine

2-1: 아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 제조2-1: Preparation of Zwitterionic Alginate Derivatives Containing Arginine

아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하기 위해, 알긴산의 카르복시기에 커플링제를 이용해 아르기닌의 아민기와의 결합을 통해 공유 결합체를 형성함으로써 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하였다(도 2b).In order to synthesize an arginine-bonded zwitterionic alginic acid derivative, a zwitterionic alginic acid derivative was prepared by forming a covalent bond through bonding to an amine group of arginine using a coupling agent to a carboxyl group of alginic acid (FIG. 2B).

구체적으로, 상기 실시예 1-1과 같이 EDC/sulfo-NHS 커필링제를 사용해 알긴산을 활성화시켜 알긴산-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 아르기닌을 결합하는 과정을 수행하였다. 알긴산 50 mg을 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer(MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰수에 해당하는 EDC와 1.3배 몰수에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액에서 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol(14.3 M)을 7μL(최종농도 20 mM)을 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 9.0)으로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 아르기닌을 첨가하여 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 수득하였다.Specifically, activating alginic acid using an EDC / sulfo-NHS capillary agent as in Example 1-1 to obtain an alginic acid-NHS ester conjugate and arginine binding thereto. 50 mg of alginic acid was dissolved in 10 mL of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7), followed by 1.2 times mole of EDC and 1.3 times mole of sulfo- NHS was added and stirred for about 30 minutes at room temperature. After injecting 7 μL (final concentration 20 mM) of 2-mercaptoethanol (14.3 M) to inactivate the unreacted EDC in the solution and stirred for 20 minutes at room temperature. For the solution, unreacted materials and impurities in the solution were removed using a PD-10 column, and solvent exchange was performed with sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 9.0). Then arginine corresponding to 5 times the number of moles of alginic acid was added and stirred at room temperature for one day. Dialysis was performed on the solution after completion of the reaction in distilled water for one day to remove unreacted substances and by-products in the composite, and lyophilized to obtain zwitterionic alginate derivatives bound to arginine in powder form.

2-2: 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 구조 분석2-2: Structural Analysis of the Prepared Zwitterionic Alginate Derivatives

상기 실시예 2-1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(arginine-conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)와 적외선분광광도계(FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 구조를 분석하였다(도 4).For the zwitterionic alginic acid derivative (arginine-conjugated alginic acid) prepared in Example 2-1, 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer ( 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL , Japan) and infrared spectrophotometer (FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA) to analyze the structure (Fig. 4).

구체적으로, 알긴산(alginate)과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼을 비교하였을 때 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 1.6 ppm과 1.8 ppm 부근에서 보이는 아르기닌의 수소 피크 대비 알긴산 피크의 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기의 약 100%가 아르기닌이 결합되어 있는 것으로 확인되었다(도 4의 A). 한편, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 그래프로부터, 알긴산의 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리가 3300 cm-1 및 1619 cm-1 에서 나타났으며, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 1580 cm-1과 1400 cm-1에서 아르기닌 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의한 피크가 나타났으며, 1690 cm-1의 -CONH-에 의한 피크가 나타난 것을 확인하였다(도 4의 B). 이로부터, 알긴산의 카르복시기와 아르기닌의 아민기가 amide 결합을 형성하며 알긴산과 아르기닌 사이에 공유 결합이 형성된 것을 확인하였다.Specifically, alginic acid (alginate) and both the hydrogen peak compared to alginate of arginine on both sides seen in the vicinity of 1.6 ppm and 1.8 ppm in 1 H-NMR spectrum of the ionic alginic acid derivatives, as compared to 1 H-NMR spectrum of the ionic alginate derivative peak By calculating the ratio of, it was confirmed that about 100% of the carboxyl groups of alginic acid are bound with arginine (FIG. 4A). On the other hand, from the graph showing the FT-IR spectrum of alginic acid and zwitterionic alginic acid derivatives, the characteristic peaks of alginic acid according to the hydroxyl group of the alginic acid and -OH stretching of the carboxyl group appeared at 3300 cm -1 and 1619 cm -1 . , In the case of zwitterionic alginic acid derivatives, peaks by symmetrical and asymmetric stretching of arginine -COO- were observed at 1580 cm -1 and 1400 cm -1 , and peaks by -CONH- of 1690 cm -1 were observed. (B of FIG. 4). From this, it was confirmed that the carboxyl group of alginic acid and the amine group of arginine form an amide bond, and a covalent bond was formed between alginic acid and arginine.

실시예 3: 양쪽이온성 알긴산 유도체에 근적외선 형광염료인 ZW-800을 결합한 형광영상 조영제 제조 및 분석Example 3: Preparation and analysis of fluorescence imaging contrast agent combining ZW-800, a near-infrared fluorescent dye, with zwitterionic alginic acid derivatives

3-1: 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800을 결합한 형광영상 조영제의 제조3-1: Preparation of Fluorescent Contrast Contrast with ZW-800 to Zwitterionic Alginate Derivatives

근적외선 형광염료인 ZW-800의 NHS ester와 양쪽이온성의 아민기와의 공유결합체를 제조하였다(도 5). ZW-800 NHS ester는 몰질량 1001.28 g/mol, 최대 여기 파장 754 nm, 최대 방출 파장 775 nm를 갖는 근적외선 형광물질이다.A covalent conjugate of NHS ester of ZW-800, a near-infrared fluorescent dye, with an amphoteric amine group, was prepared (FIG. 5). ZW-800 NHS ester is a near-infrared fluorescent substance with a molar mass of 1001.28 g / mol, a maximum excitation wavelength of 754 nm and a maximum emission wavelength of 775 nm.

구체적으로, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 근적외선 형광물질을 결합하기 위하여, 실시예 1에서 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체 대비 근적외선 형광염료 ZW-800 NHS ester의 반응 몰 비율을 1:10, 1:50, 1:100로 하여 각각 합성을 진행하였다. 먼저 15 mg의 알긴산 유도체를 3 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 용해하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하고, 상기 반응 비율과 같이 0.86, 3.87, 8.65 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 각각 첨가하고 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 용액을 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 넣고, 2일 동안 PBS(0.1 M, pH 7.4)와 증류수에서 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 이후, 동결 건조를 통하여 분말 형태의 ZW-800이 공유 결합된 형광염료-양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys@ZW)를 수득하였다.Specifically, in order to bind the ZW-800 NHS ester near infrared fluorescent substance to the zwitterionic alginic acid derivative, the reaction molar ratio of the near infrared fluorescent dye ZW-800 NHS ester compared to the zwitterionic alginic acid derivative synthesized in Example 1 was 1:10. , 1:50, 1: 100 were synthesized. First, 15 mg of alginic acid derivative was dissolved in 3 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5), mixed homogeneously at a concentration of 5 mg / mL, and 0.86, 3.87, 8.65 mg of ZW as described above. Each -800 NHS ester fluorescent dye was added and stirred for 1 day. The reaction solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10kDa), and unreacted material was removed by dialysis in PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days. Thereafter, a freeze-dried fluorescent dye-zwitterionic alginic acid derivative (Alg-lys @ ZW) to which ZW-800 was covalently bound was obtained.

3-2: 형광 영상 조영제의 분광학적 특성 분석3-2: Spectroscopic Characterization of Fluorescent Image Contrast Agents

광학측정 분석을 통해, 양쪽이온성 알긴산 유도체체 대비 ZW-800 형광염료의 반응몰수의 비율이 1:10인 경우, 알긴산 유도체 한 분자당 약 4개의 ZW-800 형광염료가 결합되었으며, 반응몰수의 비율이 1:50의 경우 알긴산 유도체 한 분자 당 약 11개의 ZW-800 형광염료가 결합되었고, 반응몰수의 비율이 1:100의 경우 알긴산 유도체 한 분자 당 약 38개의 ZW-800 형광염료가 결합되었음을 확인하였다(도 6c).When the ratio of moles of ZW-800 fluorescent dyes to zwitterionic alginate derivatives was 1:10 by optical measurement analysis, about 4 ZW-800 fluorescent dyes were bound per molecule of alginic acid derivatives. When the ratio is 1:50, about 11 ZW-800 fluorescent dyes are bound per molecule of the alginic acid derivative, and when the ratio of the molar ratio is 1: 100, about 38 ZW-800 fluorescent dyes are bound per molecule of the alginic acid derivative. It was confirmed (FIG. 6C).

이러한 결과를 바탕으로, 알긴산 유도체 대비 ZW-800 형광염료의 반응몰수 비율이 1:10, 1:50, 1:100인 형광염료-알긴산 유도체를 각각 실제 반응한 ZW-800 형광염료의 몰수로 나타낸 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 UV-vis 흡광 스펙트럽을 측정하였다(도 6a). 또한, 각각의 형광염료-알긴산 유도체의 형광 스펙트럼(λex = 660 nm)으로부터 모든 결합체에서 강한 형광이 발생하였으며 형광소광(fluorescence quenching)은 거의 일어나지 않음을 확인하였다(도 6b 및 6c).Based on these results, the mole ratio of the ZW-800 fluorescent dyes to the alginate derivatives is expressed as the number of moles of the ZW-800 fluorescent dyes which are actually reacted with the fluorescent dye-alginic acid derivatives having a ratio of 1:10, 1:50, and 1: 100, respectively. UV-vis absorption spectra of Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11 and Alg-lys @ ZW38 were measured (FIG. 6A). In addition, from the fluorescence spectrum (λ ex = 660 nm) of each of the fluorescent dye-alginic acid derivatives, strong fluorescence was generated in all the conjugates, and it was confirmed that fluorescence quenching hardly occurred (FIGS. 6B and 6C).

0.1M PBS 수용액 상에서 ZW-800 형광염료의 농도에 따른 흡광 교정 곡선 및 형광염료의 농도별 스펙트럼을 확인하였으며(도 7a 및 7b), 인산완충액(PBS)에 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38을 각각 용해시킨 경우 합성된 모든 결합체가 수용액에 잘 분산되어 있음을 확인하였다(도 8).Absorption calibration curve and the concentration spectrum of the fluorescent dye according to the concentration of ZW-800 fluorescent dye in 0.1M PBS aqueous solution was confirmed (Figs. 7a and 7b), Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ in phosphate buffer (PBS) When ZW11 and Alg-lys @ ZW38 were dissolved, it was confirmed that all of the synthesized binders were well dispersed in the aqueous solution (FIG. 8).

또한, 인산완충액, ICG 및 제조된 각각의 형광염료-양쪽이온성 알긴산 유도체 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38를 1.5 mL 튜브에 1 mL씩 담은 후, 근적외선 형광 영상 장비로 촬영한 결과, ICG는 수용액 상에서 서로 응집이 일어나면서 형광이 약하게 발생하였고, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 결합시킨 경우 결합체가 수용액상에서 골고루 잘 녹아있고 강한 형광을 발생시킴을 확인하였다(도 9).In addition, near-infrared fluorescence image after phosphate buffer, ICG and each prepared fluorescent dye-cationic alginate derivatives Alg-lys @ ZW4, Alg-lys @ ZW11, Alg-lys @ ZW38 in 1 mL of 1.5 mL tube As a result of the photographing, the ICG showed that the fluorescence was weakly generated as the aggregation occurred in the aqueous solution, and when the fluorescent dye was bonded to the zwitterionic alginic acid derivative, the binder was dissolved evenly in the aqueous solution and produced strong fluorescence ( 9).

실시예 4: 알긴산에 ZW-800 amine 염료를 결합시킨 형광영상 조영물 제조, 분석 및 동물실험 결과Example 4 Preparation, Analysis, and Animal Experiment Results of Fluorescence Imaging Containing Alginate to ZW-800 Amine Dye

4-1: 알긴산에 ZW-800 amine 염료를 결합시킨 형광영상 조영물 제조4-1: Preparation of Fluorescent Imaging Conjugates of Alginate with ZW-800 Amine Dye

양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 결합시킨 결합체의 대조군으로, 알긴산에 ZW-800염료를 결합시킨 Alg@ZWA를 제조하였다(도 10). 구체적으로, 알긴산의 카르복시기를 EDC/sulfo-NHS 커플링제와 반응시키고, 이를 ZW-800 amine과 반응시킴으로써 ZW-800과 알긴산의 결합체인 Alg@ZWA를 제조하였다. 상기 ZW-800 amine(분자량 887 g/mol)는 최대 여기 파장 753nm, 최대 방출 파장 772nm를 갖는 근적외선 형광물질이며, 알긴산은 씨그마알드리치사 분자량 190,000 Da의 제품(cas no. 9005-38-3)을 사용하였다.Alg @ ZWA was prepared by binding ZW-800 dye to alginic acid as a control of the conjugate in which the fluorescent dye was bound to the zwitterionic alginic acid derivative (FIG. 10). Specifically, Alg @ ZWA, which is a combination of ZW-800 and alginic acid, was prepared by reacting a carboxylic group of alginic acid with an EDC / sulfo-NHS coupling agent and reacting it with ZW-800 amine. The ZW-800 amine (molecular weight 887 g / mol) is a near-infrared fluorescent substance having a maximum excitation wavelength of 753 nm and a maximum emission wavelength of 772 nm, and alginic acid is a product having a molecular weight of 190,000 Da of Sigma Aldrich Co. (cas no. 9005-38-3) Was used.

먼저, 20 mg의 알긴산을 0.1 M 농도의 MES buffer에 녹인 뒤 10.37 mg의 EDC와 3.68 mg의 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후 PD-10 컬럼을 이용하여 미반응물을 분리하고, 4.9 mg의 ZW-800 amine 형광물질을 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 용액에 대하여 증류수에서 2일 동안 투석(dialysis, MWCO 10kDa)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하였다. 이후 동결건조 실시하여 분말 형태의 ZW-800이 공유 결합된 형광염료-알긴산 결합체(Alg@ZWA)를 수득하였다.First, 20 mg of alginic acid was dissolved in 0.1 M MES buffer, and 10.37 mg of EDC and 3.68 mg of sulfo-NHS were added and stirred at room temperature for 30 minutes. After the reaction, the unreacted material was separated by using a PD-10 column, and 4.9 mg of ZW-800 amine fluorescent substance was added thereto, followed by stirring for one day. Dialysis (MWCO 10kDa) was performed for 2 days on the finished solution in distilled water to remove unreacted materials and by-products in the composite. After lyophilization, a powder dye-linked fluorescent dye-alginic acid conjugate (Alg @ ZWA) was obtained.

4-2: 형광염료-알긴산 결합체(Alg@ZWA)의 분광학적 특성 분석4-2 Spectroscopic Characterization of Fluorescent Dye-Alginic Acid Conjugate (Alg @ ZWA)

광학 측정 분석을 통하여 알긴산 한 분자 당 실제 반응한 ZW-800 amine 몰수를 측정하였다. 그 결과, Alg@ZWA 결합체의 UV-vis 흡광 측정을 통해 알긴산 한 분자 당 약 1.2개의 ZW-800 amine이 반응하여 결합되어 있음을 확인하였다(도 11a). 또한, 알긴산에 ZW-800이 공유 결합된 Alg@ZWA 결합체의 형광 평가(λex = 660 nm, λfl = 774 nm)를 수행한 결과, 합성된 Alg@ZWA 내의 형광염료는 형광소광(quenching)없이 형광 발생이 잘 되는 것을 확인하였다(도 11b).Through optical measurement analysis, the number of moles of ZW-800 amine actually reacted per molecule of alginic acid was measured. As a result, the UV-vis absorbance measurement of the Alg @ ZWA conjugate confirmed that about 1.2 ZW-800 amines were reacted and bound per molecule of alginic acid (FIG. 11A). In addition, as a result of fluorescence evaluation (λ ex = 660 nm, λ fl = 774 nm) of Alg @ ZWA conjugate covalently bonded to alginic acid, fluorescent dyes in the synthesized Alg @ ZWA were quenched. It was confirmed that fluorescence was generated well (FIG. 11B).

4-3: 양쪽이온성 알긴산 유도체-형광염료 결합체와 알긴산-형광염료 결합체(Alg@ZWA)의 동물 시험 성능 평가4-3: Animal Test Performance Evaluation of Zwitterionic Alginate Derivatives-Fluorescent Dye Complex and Alginic Acid-Fluorescent Dye Complex (Alg @ ZWA)

양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 형광염료를 공유결합 시킨 Alg-lys@ZW38와 알긴산에 ZW-800 amine 형광염료를 결합시킨 Alg@ZWA의 생체 내 거동을 동물실험을 통하여 분석하였다. 구체적으로, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA에 대하여 10 nmol dye/100 μL의 농도로 녹이고, 이를 누드마우스의 꼬리 정맥을 통하여 투여한 뒤 20 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 24 시간째에 IVIS 영상장비를 사용하여 근적외선 형광 영상을 촬영하였다(λex=780 nm, λem=845 nm).The in vivo behavior of Alg-lys @ ZW38 covalently bonded to zwitterionic alginic acid derivatives with ZW-800 NHS ester fluorescent dyes and Alg @ ZWA combined with ZW-800 amine fluorescent dyes with alginic acid were analyzed through animal experiments. Specifically, it was dissolved in ICG, Alg-lys @ ZW38, and Alg @ ZWA at a concentration of 10 nmol dye / 100 μL, and after administration through the tail vein of nude mouse, 20 minutes, 1 hour, 3 hours, 6 hours, Near-infrared fluorescence images were taken at 24 hours using IVIS imaging equipment (λ ex = 780 nm, λ em = 845 nm).

그 결과, ICG는 정맥 투여 후 빠른 속도가 혈액에서 제거가 되면서 간을 제외한 다른 곳에서의 형광 신호가 급격히 감소하였다. Alg@ZWA는 한 시간까지는 형광신호가 몸 전체에 걸쳐서 나타났으나 그 이후에는 몸에서의 형광신호가 매우 낮아진 것으로 나타났는데, 이것은 혈액에 순환중인 결합체가 거의 없다는 것을 나타내는 결과이다. 반면, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 공유결합 시킨 Alg-lys@ZW38 결합체의 경우, 24시간 까지 몸 전체에 걸쳐서 형광신호가 발생함을 관찰 할 수 있었다. 이는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 이용한 결합체가 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피할 수 있고, 목적으로 하는 기관 또는 조직 외에 간 등에 대한 비특이적 섭취가 저해되어 혈액 내에서 안정적인 순환이 가능하며, 혈액 내 체류 시간이 획기적으로 향상됨을 나타내는 결과이다(도 12a).As a result, ICG was rapidly removed from the blood after intravenous administration, and the fluorescence signal was dramatically reduced except for the liver. Alg @ ZWA showed fluorescence signals throughout the body for up to an hour, but after that the fluorescence signal in the body was very low, indicating that there are few circulating binders in the blood. On the other hand, in the case of Alg-lys @ ZW38 conjugate covalently bonded with a fluorescent dye to the zwitterionic alginic acid derivative, the fluorescent signal was generated throughout the body for up to 24 hours. This is because the conjugate using the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention can avoid the nonspecific interaction with the protein, the nonspecific intake of the liver, etc., in addition to the target organ or tissue is inhibited, which enables stable circulation in the blood, This is a result showing that the retention time in the remarkably improved (Fig. 12a).

또한, 마우스의 등쪽의 심장 부근에서의 형광 ROI 값을 수치화하여 그래프로 나타낸 경우, 각 형광물질들의 체내 주입 20분 후 Alg-lys@ZW38 결합체는 ICG의 ROI 값 대비 약 3.8배 높은 형광 수치를 나타낸 반면, Alg@ZWA 결합체의 ROI 값은 ICG 형광 값과 거의 유사한 형광 수치(ICG 의 형광 수율의 0.998배)임을 확인하였다. 특히, 24시간째의 ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA의 형광 ROI 값을 비교하였을 때 Alg-lys@ZW38 결합체의 경우에 월등한 형광 세기뿐만 아니라 장시간 동안 체내 전 영역에서 순환되는 것을 확인하였다(도 12b).In addition, when the fluorescence ROI value near the dorsal heart of the mouse was quantified and graphed, the Alg-lys @ ZW38 conjugate showed a fluorescence value about 3.8 times higher than the ROI value of the ICG 20 minutes after the infusion of each fluorescent substance. On the other hand, the ROI value of the Alg @ ZWA conjugate was confirmed to be a fluorescence value (0.998 times the fluorescence yield of ICG) almost similar to the ICG fluorescence value. In particular, when comparing the fluorescence ROI values of ICG, Alg-lys @ ZW38, and Alg @ ZWA at 24 hours, it was confirmed that the Alg-lys @ ZW38 conjugate circulated in the whole body region for a long time as well as the superior fluorescence intensity. (FIG. 12B).

나아가, 각 형광물질들의 체내 주입 후 생체 내 거동을 더욱 명확히 확인하고자 마우스의 배 쪽을 촬영한 형광 영상을 비교하였다(도 13). 그 결과, ICG의 경우 투여 20분 째에 투여한 ICG가 대부분 간에 섭취되어 있었으며, 그 이후에는 소장으로 배출되어 사라지는 양상을 나타내었다. Alg@ZWA의 경우 투여 1시간까지 체내 전 영역에 순환하며 점차 소변으로 배출되었고, 투여 3시간째에는 Alg@ZWA 결합체 대부분이 사라지고 일부 적은 양의 형광물질이 간에서 잔존하는 형광 신호를 보이며, 24시간까지 간 조직 부근에서만 형광 신호가 지속되었다. 반면, Alg-lys@ZW38 결합체는 체내 주입 24시간 후까지 혈류를 통해 체내에 순환되며, 체내의 전 영역에 걸쳐 형광 신호가 관찰되었다. 즉, 체내에 주입된 Alg-lys@ZW38은 간 조직에 대한 비특이적 섭취가 억제되고 주입 후 24시간에 걸쳐 서서히 방광을 통해 체외로 배출되었다. 이로부터 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체는 알긴산을 사용하였을 경우보다 결합된 조영제 또는 약물의 혈액 내 체류 시간을 획기적으로 향상 시켜 줄 수 있음을 확인하였다.Furthermore, in order to more clearly confirm the in vivo behavior of each fluorescent substance after injection in the body, the fluorescence image of the mouse side was compared (Fig. 13). As a result, in the case of ICG, ICG administered at 20 minutes after administration was ingested in the liver, and after that, it was discharged into the small intestine and disappeared. Alg @ ZWA was circulated throughout the body until 1 hour of administration and gradually excreted in the urine. At 3 hours of administration, most of the Alg @ ZWA conjugate disappeared and some small amount of fluorescent substance remained in the liver. The fluorescence signal persisted only in the vicinity of liver tissue by time. In contrast, the Alg-lys @ ZW38 conjugate circulated through the bloodstream up to 24 hours after infusion, and fluorescent signals were observed throughout the body. That is, Alg-lys @ ZW38 injected into the body was suppressed nonspecific intake of liver tissue and was discharged through the bladder slowly over 24 hours after injection. From this, it was confirmed that the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention can significantly improve the residence time in the blood of the bound contrast agent or drug than when alginic acid was used.

실시예 5: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조 및 분석Example 5 Preparation and Analysis of High Molecular Weight zwitterionic Alginate Derivatives-Near-Infrared Fluorescent Conjugates

5-1: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조5-1: Preparation of high molecular weight zwitterionic alginic acid derivative-near infrared fluorescent substance conjugate

결합체의 혈액 내 체류시간은 분자량이 커질수록 증가하는 것으로 알려져 있는바, 상기 실시예 1에서 사용한 씨그마알드리치사의 190kDa 알긴산보다 고분자량의 일본 KIMICA사의 알긴산 제품 I-5(viscosity of 1 w/v% aqeous solution at20oC = 500 to 600 mPa·s average molecular weight = 800kDa)를 이용하여 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하고, 형광염료 결합체의 합성도 잘 되는지를 시험하였다.It is known that the residence time in the blood increases as the molecular weight increases. Alginic acid product I-5 (viscosity of 1 w / v% of KIMICA, Japan) is higher in molecular weight than 190 kDa alginic acid from Sigma Aldrich Co., Ltd. Zwitterionic alginic acid derivatives were synthesized using aqeous solution at 20 o C = 500 to 600 mPas average molecular weight = 800 kDa) and tested for the synthesis of fluorescent dye conjugates.

상기 실시예 1과 같이 EDC/sulfo-NHS 커플링제를 사용하여 알긴산을 활성화시켜 알긴산-NHS ester 결합물을 얻고, 여기에 라이신을 결합하였다. 구체적으로, 알긴산 50 mg을 MES buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰에 해당하는 EDC와 1.3배 몰에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액의 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol (14.3 M)을 7uL(최종농도 20 mM) 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, phosphate buffer (PBS, 0.1 M, pH 7.4)로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 과량의 라이신을 첨가하고 이를 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 라이신 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 (Alg(KIMICA)-lys)를 수득하였다.Alginate was activated using an EDC / sulfo-NHS coupling agent as in Example 1 to obtain an alginic acid-NHS ester conjugate, to which lysine was bound. Specifically, 50 mg of alginic acid was dissolved in 10 mL of MES buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7), followed by addition of 1.2 times mole of the moles of alginic acid and 1.3 times mole of sulfo-NHS. Stir for about 30 minutes. After injecting 7mer of 2-mercaptoethanol (14.3 M) (final concentration 20 mM) to inactivate the unreacted EDC of the solution and stirred for 20 minutes at room temperature. For the solution, unreacted substances and impurities in the solution were removed using a PD-10 column, and solvent exchange was performed with phosphate buffer (PBS, 0.1 M, pH 7.4). Thereafter, an excess of lysine corresponding to 5 times the number of moles of alginic acid was added and stirred at room temperature for one day. The reaction solution was dialyzed in distilled water for one day to remove unreacted substances and by-products in the composite, and lysine-bound zwitterionic alginate derivative (Alg (KIMICA) -lys) in lyophilized form. ) Was obtained.

나아가, 상기 실시예 1에서 사용한 하버드 의과대학 최학수 교수 연구팀의 ZW-800의 NHS ester 형광물질(MW 1001.28 g/mol, 최대 여기 파장 754 nm, 최대 방출 파장 775 nm)과 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체가 결합된 결합체를 제조하였다.Furthermore, the NHS ester fluorescent substance (MW 1001.28 g / mol, maximum excitation wavelength 754 nm, maximum emission wavelength 775 nm) of ZW-800 and the amphoteric alginic acid derivative of Harvard Medical School Professor Hak Soo Choi's research team used in Example 1 Bound conjugates were prepared.

구체적으로, 상기 결합체를 제조하기 위하여 10 mg의 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체를 2 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 용해하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하였다. 이후 5.64 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 첨가하고 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 상기 용액은 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 담아 2일 동안 PBS(0.1 M, pH 7.4)와 증류수로 투석함으로써 미반응 화학물질을 제거하였다. 상기 용액을 동결 건조하여 분말 상태의 결합체를 얻었다.Specifically, to prepare the binder, 10 mg of the zwitterionic alginic acid derivative was dissolved in 2 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5) and mixed homogeneously at a concentration of 5 mg / mL. Then, 5.64 mg of ZW-800 NHS ester fluorescent dye was added and stirred for 1 day to react. After completion of the reaction, the solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10 kDa) and dialyzed with PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days to remove unreacted chemicals. The solution was lyophilized to obtain a powdery binder.

5-2: 5-2: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체의 구조 분석Structural Analysis of High Molecular Weight zwitterionic Alginate Derivatives-Near-Infrared Fluorescent Conjugates

상기 실시예 5-1에서 사용한 알긴산 및 이를 이용하여 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(lysine conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)를 이용하여 구조를 분석하였다. 그 결과, KIMICA사의 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 비교하였을 때, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 2.8 ppm 부근에서 보이는 라이신 수소 피크의 알긴산 대비 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기마다 라이신이 약 100%가 라이신과 결합되어 있는 것으로 계산되었다(도 14a 및 14b).For the alginic acid used in Example 5-1 and the zwitterionic alginic acid derivative (lysine conjugated alginic acid) prepared using the same, 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer ( 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM- LA400 with LFG, JEOL, Japan) was used to analyze the structure. As a result, when the 1 H-NMR spectrum of the alginic acid and the zwitterionic alginic acid derivative of KIMICA was compared, the ratio of the lysine hydrogen peak to the alginic acid of the lysine hydrogen peak shown in the 1 H-NMR spectrum of the zwitterionic alginic acid derivative was calculated. It was calculated that about 100% of lysine is bound to lysine per carboxyl group of alginic acid (FIGS. 14A and 14B).

또한, 형광염료 결합체인 Alg(KIMIKA)-lys@ZW-800에 대한 분광학적 특성 평가를 수행한 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 1.1개의 ZW-800 형광물질이 결합됨을 확인하였다(도 15a). 한편, 흡광 최대 파장이 763 nm에서 770 nm로 장파장 쪽으로 7 nm 이동되었으며, 동일 농도의 형광염료와 비슷한 형광 세기를 보임을 확인하였다(도 15b).In addition, the results of spectroscopic evaluation of Alg (KIMIKA) -lys @ ZW-800, a fluorescent dye binder, showed that 1.1 ZW-800 phosphors were bound per molecule of the zwitterionic alginic acid derivative (FIG. 15A). ). On the other hand, the maximum absorption wavelength was shifted by 7 nm toward the long wavelength from 763 nm to 770 nm, it was confirmed that the fluorescence intensity similar to the fluorescent dye of the same concentration (Fig. 15b).

실시예 6: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조 및 분석Example 6 Preparation and Analysis of PEG-Amphoteric Alginate Derivatives-Near-Infrared Fluorescent Conjugates

6-1: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조6-1: Preparation of Zwitterionic Alginate Derivatives-Near-Infrared Fluorescent Compounds Conjugated with PEG

상기 실시예 1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K (mPEG5K-SPA, succiinimidyl PEG, NANOCS, MW 5000Da)를 추가로 결합시킴으로써, 결합체의 분자량을 증가시키고 단백질과의 비특이적 상호작용을 더욱 예방할 수 있는 PEG 결합 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체 15 mg을 5 mL의 Tris buffer (0.1 M, pH 8.5) 용액에 넣어 녹인 뒤, 34 mg의 mPEG-NHS (molecular weight 5 KDa)를 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 상기 용액 내의 미반응 분자 및 불순물을 제거하기 위하여 증류수에서 2일 동안 투석(MWCO 10kDa)을 진행하였고, 정제된 상기 용액에 대해 동결건조를 실시하여 분말 형태의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 결합되어 있는 Alg-lys-mPEG5K를 수득하였다.By further binding mPEG 5K (mPEG 5K- SPA, succiinimidyl PEG, NANOCS, MW 5000Da) to the zwitterionic alginic acid derivatives prepared in Example 1 above, the molecular weight of the conjugates will be increased and the nonspecific interaction with the protein will be further prevented. PEG-bonded zwitterionic alginic acid derivatives were synthesized. Specifically, 15 mg of the zwitterionic alginic acid derivative prepared in Example 1 was dissolved in 5 mL of Tris buffer (0.1 M, pH 8.5) solution, and then 34 mg of mPEG-NHS (molecular weight 5 KDa) was added thereto. The reaction was stirred for one day. Dialysis (MWCO 10 kDa) was performed in distilled water for 2 days to remove unreacted molecules and impurities in the solution after the reaction, and lyophilization was performed on the purified solution to mPEG in a zwitterionic alginate derivative in powder form. 5K that are combined to give a Alg-lys-mPEG 5K.

나아가, 상기 PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys-mPEG5K)에 ZW-800 NHS ester 근적외선 형광물질을 결합하기 위하여, 상기 실시예 3과 유사한 방법을 사용하였다. 구체적으로, 10 mg의 Alg-lys-mPEG5K를 2 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 첨가하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하였다. 이후 5.48 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응을 진행하였다. 반응을 마친 상기 용액은 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 담아 2일 동안 PBS (0.1 M, pH 7.4)와 증류수로 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 투석막 튜브로 빼낸 용액을 동결 건조하여 분말 형태의 고분자량 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체(Alg-lys-mPEG5K@ZW-800)를 수득하였다.Furthermore, in order to bind the ZW-800 NHS ester near infrared fluorescent substance to the PEG-bonded zwitterionic alginic acid derivative (Alg-lys-mPEG 5K ), a method similar to Example 3 was used. Specifically, 10 mg of Alg-lys-mPEG 5K was added to 2 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5) and mixed homogeneously at a concentration of 5 mg / mL. Thereafter, 5.48 mg of ZW-800 NHS ester fluorescent dye was added thereto, followed by stirring for one day. After the reaction, the solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10kDa) and dialyzed with PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days to remove unreacted material. The solution taken out of the dialysis membrane tube was lyophilized to obtain a high molecular weight zwitterionic alginic acid derivative-near infrared fluorescent substance conjugate (Alg-lys-mPEG 5K @ ZW-800) in powder form.

6-2: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체의 구조 분석6-2: Structural Analysis of Cationic Zwitterionic Alginate Derivatives-Near-Infrared Fluorescent Conjugates

양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체 (Alg-lys-mPEG5K)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer)와 적외선분광광도계(FT-IR)를 이용하여 구조를 분석하였다. 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체(Alg-lys-mPEG5K)의 1H-NMR 스펙트럼 비교에서, 3.6 ppm에서 보이는 PEG backbone의 특정 피크의 위치 확인 및 피크의 알긴산 고유피크의 면적 대비 비율 계산을 통해 양쪽이온성 알긴산 유도체 단량체 하나 당 약 9%의 mPEG5K가 결합되며 있음을 확인하였다(도 17a). 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer ( 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer) and infrared spectrophotometer (FT-) for the conjugate (Alg-lys-mPEG 5K ) in which mPEG 5K is covalently bonded to the zwitterionic alginic acid derivative IR) was used to analyze the structure. In the 1 H-NMR spectrum comparison of the conjugate (Alg-lys-mPEG 5K ) in which the mPEG 5K is covalently bonded to the prepared zwitterionic alginic acid derivative, the identification of the specific peak of PEG backbone and the intrinsic alginate of the peak at 3.6 ppm By calculating the ratio of the area to the peak, it was confirmed that about 9% of mPEG 5K is bound per one zwitterionic alginic acid derivative monomer (FIG. 17A).

또한, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체 및 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체의 FT-IR 스펙트럼을 비교하였다(도 17b). 구체적으로, 알긴산 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리는 3300 cm-1 및 1619 cm-에서 나타났다. 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 알긴산의 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의하여 나타나던 1599 cm-1과 1409 cm-1과 부근의 피크가 사라지고, 1645 cm-1의 amide I 및 1550 cm-1의 amide II 와 같이 -CONH-에 의한 피크가 확인되었다. 이로부터 알긴산의 카르복시기와 라이신의 아민이 아마이드 결합을 형성하며 알긴산과 라이신 사이에 결합이 일어난 것을 확인하였다. 특히, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체의 IR 스펙트럼의 경우, 2883 cm-1과 1720 cm-1과 부근에서 새로운 피크가 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 mPEG5K-SPA의 특정 피크로서 이와 같은 결과를 바탕으로 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5k가 공유 결합하여 결합체가 형성되었음을 확인하였다.In addition, FT-IR spectra of the conjugates in which mPEG 5K is covalently bonded to alginic acid, zwitterionic alginic acid derivatives, and zwitterionic alginic acid derivatives were compared (FIG. 17B). Specifically, in the case of alginic acid, characteristic peaks of -OH stretching of hydroxyl and carboxyl groups of alginic acid were found at 3300 cm −1 and 1619 cm − . In the case of zwitterionic alginic acid derivatives, the peaks around 1599 cm -1 and 1409 cm -1 disappeared due to symmetrical and asymmetric stretching of -COO- of alginic acid, and amide I of 1645 cm -1 and amide of 1550 cm -1 Like II, the peak by -CONH- was confirmed. From this, it was confirmed that the carboxyl group of the alginic acid and the amine of the lysine form an amide bond, and the bond occurred between the alginic acid and the lysine. In particular, in the IR spectrum of the conjugate covalently bonded to mPEG 5K to the zwitterionic alginic acid derivative, new peaks appeared in the vicinity of 2883 cm -1 and 1720 cm -1 , which is a specific peak of mPEG 5K -SPA. As a result, it was confirmed that mPEG 5k was covalently bonded to the zwitterionic alginic acid derivative to form a conjugate.

6-3: Alg-lys@mPEG6-3: Alg-lys @ mPEG 5K5K 와 형광염료 결합체(Alg-lys-mPEGAnd fluorescent dye conjugates (Alg-lys-mPEG 5K5K @ZW-800)의 분광학적 특성 평가@ ZW-800) spectroscopic characterization

Alg-lys-mPEG5K와 형광염료의 결합체(Alg-lys-mPEG5K@ZW-800)에 대한 흡광 및 형광 스펙트럼을 분석한 결과, 흡광 스펙트럼을 통해 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 59개의 ZW-800 형광물질이 결합됨을 확인하였으며(도 18a), 형광 스펙트럼을 통해 형광염료 결합체 형성 후 자유 염료 대비 약 29% 정도의 형광 감소가 있었으나 결합체 형성이 잘 되었고 강한 형광을 발생할 수 있음을 확인하였다(도 18b).Absorption and fluorescence spectra of the combination of Alg-lys-mPEG 5K and fluorescent dyes (Alg-lys-mPEG 5K @ ZW-800) were analyzed and the absorption spectra showed 59 ZW- per molecule of zwitterionic alginic acid derivatives. It was confirmed that the 800 fluorescent material was bound (FIG. 18a), and after the formation of the fluorescent dye conjugate through the fluorescence spectrum, there was about 29% reduction in fluorescence compared to the free dye, but it was confirmed that the formation of the conjugate was good and strong fluorescence could be generated (Fig. 18A). 18b).

실시예 7: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 제조 및 분광학적 특성 평가Example 7: Preparation and Spectroscopic Characterization of Zwitterionic Alginate Derivatives-Photosensitive Agents (Alg-lys @ Ce6)

7-1: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 제조7-1: Preparation of Zwitterionic Alginate Derivatives-Photosensitive Agent (Alg-lys @ Ce6)

양쪽이온성 알긴산 유도체와 조영제(또는 약물)의 결합체 합성에 관한 일 예로서, 광감각제인 chlorin e6(Ce6)와 양쪽이온성 알긴산 유도체의 결합체(Alg-lys@Ce6)를 제조하였다(도 19). 제조시 사용된 알긴산은 190kDa 분자량의 씨그마알드리치사의 알긴산나트륨염 (cas no. 9005-38-3) 제품을 구매하여 사용하였다.As an example of the synthesis of the conjugate of the zwitterionic alginic acid derivative and the contrast agent (or drug), a combination of the photosensitive chlorin e6 (Ce6) and the zwitterionic alginic acid derivative (Alg-lys @ Ce6) was prepared (FIG. 19). . The alginic acid used in the preparation was purchased from a sodium alginate salt (cas no. 9005-38-3) of Sigma Aldrich Co., Ltd. having a molecular weight of 190 kDa.

구체적으로, 양쪽이온성 알긴산 유도체 내에 존재하는 라이신 말단기 숫자의 3%에 해당하는 비율(알긴산 유도체 한 분자 당 약 32개의 Ce6)로 Ce6와 공유결합을 형성하도록 합성을 진행하였다. 먼저 Ce6의 카르복시기를 활성화시키기 위하여 2.03 mg의 Ce6을 1 mL의 PBS buffer (0.1 M, pH 7.4)에 녹여 0.78 mg의 EDC와 1.11 mg의 sulfo-NHS을 첨가한 후 30분 동안 교반하여 반응하였다. 20 mg의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 3 mL의 MES buffer (0.1 M, pH 7.4)에 용해하여 Ce6 반응용액과 섞어준 뒤 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액 내의 미반응 분자 및 불순물을 제거하기 위하여 phosphate buffer (PB, 0.1M, pH 7.5)와 증류수를 이용하여 2일 동안 투석(MWCO 10kDa)을 진행하고, 정제된 상기 용액에 대해 동결건조를 실시하여 분말 형태의 결합체를 수득하였다.Specifically, the synthesis was carried out to form covalent bonds with Ce6 in a proportion corresponding to 3% of the number of lysine end groups present in the zwitterionic alginic acid derivative (about 32 Ce6 per molecule of the alginic acid derivative). First, 2.03 mg of Ce6 was dissolved in 1 mL of PBS buffer (0.1 M, pH 7.4) in order to activate the carboxy group of Ce6, and 0.78 mg of EDC and 1.11 mg of sulfo-NHS were added, followed by stirring for 30 minutes. 20 mg of zwitterionic alginic acid derivative was dissolved in 3 mL of MES buffer (0.1 M, pH 7.4), mixed with Ce6 reaction solution, and stirred for one day. To remove unreacted molecules and impurities in the solution after the reaction, dialysis (MWCO 10kDa) was performed for 2 days using phosphate buffer (PB, 0.1M, pH 7.5) and distilled water, and the frozen solution was frozen. Drying was carried out to obtain the binder in powder form.

7-2: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 분광학적 특성 평가7-2: Spectroscopic Characterization of Zwitterionic Alginate Derivatives-Photosensitive Agents (Alg-lys @ Ce6)

상기 결합체(Alg-lys@Ce6)의 합성을 확인하기 위해 이에 대한 분광학적 특성 평가를 실시하였다. 광감각제인 Ce6와 상기 결합체를 인산완충액(PBS)에 녹이고 UV-vis 흡광분석을 실시한 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 약 22개의 Ce6가 결합됨을 확인하였다(도 20a). 또한, 형광 스펙트럼을 분석한 결과, 결합체 형성 후 광감각제의 광학 특성이 잘 유지가 되었음을 알 수 있었으며, 이는 결합체의 광역학 치료 효과가 잘 보존됨을 나타내는 결과이다(도 20b).In order to confirm the synthesis of the conjugate (Alg-lys @ Ce6), spectroscopic characteristics were evaluated. The photosensitive agent Ce6 and the binder were dissolved in phosphate buffer (PBS) and subjected to UV-vis absorption analysis. As a result, it was confirmed that about 22 Ce6 were bound per molecule of the zwitterionic alginic acid derivative (FIG. 20A). In addition, as a result of analyzing the fluorescence spectrum, it was found that the optical properties of the photosensitizer were well maintained after the formation of the binder, which indicates that the photodynamic therapeutic effect of the binder was well preserved (FIG. 20B).

또한, 제조된 양쪽이온성 알긴산유도체-광감각제 결합체의 일항 산소 발생 특성을 확인하기 위해 일항산소 검출 시약인 SOSG(Singlet oxygen sensor green, Molecular Probe Inc. Eugene, OR, USA)룰 이용하여 670 nm 레이저를 조사하면서 30초 간격으로 일항 산소 발생을 측정하였다. 그 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 결합된 광감각제의 일항산소 발생이 단독의 광감각제를 사용한 경우보다 약간 더 높음을 확인하였다(도 20c). 이러한 결과는 Ce6가 수용액상에서 제한된 용해도 때문에 응집 현상이 일어나고, 응집된 광감각제 간의 소광(quenching) 효과로 인하여 일항 산소 발생이 원래 보다 낮게 나타났기 때문이다. 또한, Alg-lys@Ce6의 경우 광감각제가 알긴산 유도체에 결합 후 친수성이 높아지고 광감각제 간의 응집현상이 억제되었기 때문에 Ce6보다 일항산소의 발생량이 더 높게 측정이 되었다. 즉, 이는 광감각제가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체가 안정한 결합체를 형성하여 향후 광역학 치료제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.In addition, 670 nm using a singlet oxygen sensor green, Molecular Probe Inc. Eugene, OR, USA (SOSG), which is a monooxygen detection reagent, was used to confirm the singlet oxygen generation characteristics of the prepared zwitterionic alginate-photosensitive agent conjugate. Singlet oxygen generation was measured at 30 second intervals while irradiating the laser. As a result, it was confirmed that the monooxygen generation of the photosensitizer bound to the zwitterionic alginic acid derivative was slightly higher than when using the photosensitizer alone (FIG. 20C). This result is due to the limited solubility of Ce6 in the aqueous solution, due to the aggregation phenomenon, due to the quenching effect between the aggregated photo-sensing agent, the singlet oxygen generation was lower than the original. In addition, in the case of Alg-lys @ Ce6, since the photosensitizer was bound to the alginic acid derivative, the hydrophilicity was increased, and the aggregation phenomenon between the photosensitizers was suppressed. In other words, this indicates that the zwitterionic alginic acid derivative to which the photosensitizer is bound forms a stable conjugate and can be used as a photodynamic therapeutic agent in the future.

7-3: 암세포에 대한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 섭취 시험7-3: Intake test of zwitterionic alginic acid derivative-photosensitizer conjugate (Alg-lys @ Ce6) on cancer cells

생쥐 편평세포 암종(mouse squamous cell carcinoma) 세포주인 SCC7은 우태아혈청 (FBS) 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 및 표준 습도 조건하에서 배양하였다. 이후 SCC7 세포를 LabTek II Chambered Coverglass의 각 웰마다 5×104개씩 넣고, 세포가 잘 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)와 자유 광감각제(free Ce6)를 Ce6기준 2.5 μM 농도로 세포에 5시간 동안 처리하였다. 그 후 세포에 섭취되지 않은 광감각제를 세척을 통해 제거하고, 새로운 세포배양액을 첨가한 후에 공초점 형광 현미경을 통해 세포 섭취를 확인하였다(λex 633 nm, λem 650 nm long-pass filter). 광감각제를 처리하지 않은 암세포주를 대조군(control)로 사용하였다. 그 결과, 도 21에 도시한 바와 같이 기존의 free Ce6를 처리한 것과 비교하여 Alg-lys@Ce6의 형광세기가 무려 25.5배 높은 것으로 분석되었으며, 이것은 free Ce6에 비교하여 Alg-lys@Ce6의 암세포 내로의 섭취량이 25배 이상 높다는 것을 나타내는 결과이다.SCC7, a mouse squamous cell carcinoma cell line, was treated with 37 ° C., 5% carbon dioxide, using Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin. Incubated under standard humidity conditions. Thereafter, SCC7 cells were placed in each well of 5 × 10 4 cells of the LabTek II Chambered Coverglass, and cultured for 24 hours to allow the cells to adhere well. Zwitterionic alginic acid derivative-photosensitizer conjugate (Alg-lys @ Ce6) and free photosensitizer (free Ce6) were treated with cells at a concentration of 2.5 μM based on Ce6 for 5 hours. After that, the photosensitizers not ingested in the cells were removed by washing, and after the addition of the new cell culture medium, the cell intake was confirmed by confocal fluorescence microscopy (λ ex 633 nm, λ em 650 nm long-pass filter). . Cancer cell lines not treated with the photosensitizers were used as controls. As a result, as shown in FIG. 21, the fluorescence intensity of Alg-lys @ Ce6 was analyzed to be 25.5 times higher than that of the conventional free Ce6, which is compared with the free Ce6 cancer cells of Alg-lys @ Ce6. The results indicate that the intake into the stomach is more than 25 times higher.

7-4: 암세포에 대한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 항암효과 측정7-4: Measurement of anticancer effect of zwitterionic alginic acid derivatives-photosensitizer conjugate (Alg-lys @ Ce6) on cancer cells

SCC7 암세포에 대조군인 free Ce6와 본 발명에 의한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)를 농도별(각각 1, 2.5 및 5 μM)로 처리한 후 5시간 동안 암조건(dark condition)에서 배양하고, 세척한 후 새로운 세포 배지로 교환하였다. 이후 670 nm 레이져를 이용하여 암세포에 빛을 조사해 주었다(10 J/cm2). 추가로 24시간 동안 배양한 뒤, CCK-8 assay 분석방법을 이용하여 각각에서 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도22에 도시한 바와 같이 기존의 free Ce6는 5 μM 농도에서도 광역학 치료 후 암세포가 거의 죽지 않았으나, Alg-lys@Ce6는 2.5 μM 농도로 처리 후 광역학 치료를 시행한 경우에도 대부분의 암세포가 사멸하였음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 광감각제를 결합시킨 경우 암세포 내로의 광감각제 전달 및 섭취가 매우 향상될 수 있을 뿐 아니라, 암세포 치료 효과도 현저히 향상이 될 수 있음을 알 수 있다.SCC7 cancer cells treated with free Ce6 and the zwitterionic alginic acid derivative-photosensitive agent conjugate (Alg-lys @ Ce6) according to the present invention at different concentrations (1, 2.5 and 5 μM, respectively) for 5 hours The cells were incubated in dark conditions, washed and then replaced with fresh cell medium. Then, light was irradiated to cancer cells using a 670 nm laser (10 J / cm 2 ). After incubation for an additional 24 hours, cell viability was measured in each using the CCK-8 assay method. As a result, as shown in FIG. 22, the conventional free Ce6 showed almost no cancer cell death after photodynamic treatment even at 5 μM concentration. However, Alg-lys @ Ce6 was treated at 2.5 μM concentration and treated with photodynamic treatment. It was confirmed that the cancer cells of died. From these results, when the photosensitiser is bound to the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention, it can be seen that the delivery and intake of the photosensitizer into cancer cells can be greatly improved, and the cancer cell therapeutic effect can be remarkably improved. have.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims and equivalent concepts rather than the detailed description are included in the scope of the present invention.

Claims (10)

하기 화학식 1로 표시되는, 양쪽이온성 특성을 갖는 알긴산(alginate) 유도체:
[화학식 1]
Figure 112018129137983-pat00008

상기 화학식 1에서 n은 1 내지 3000의 정수이며, 상기 R은
Figure 112018129137983-pat00009
,
Figure 112018129137983-pat00010
또는
Figure 112018129137983-pat00011
이다.
Alginate derivatives having zwitterionic properties represented by Formula 1 below:
[Formula 1]
Figure 112018129137983-pat00008

In Formula 1 n is an integer of 1 to 3000, wherein R is
Figure 112018129137983-pat00009
,
Figure 112018129137983-pat00010
or
Figure 112018129137983-pat00011
to be.
제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 추가로 결합된 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
The zwitterionic alginic acid derivative of claim 1, wherein polyethylene glycol (PEG) is further bound.
제1항에 있어서, 영상 조영제 또는 약물이 추가로 결합된 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
The zwitterionic alginic acid derivative according to claim 1, wherein the imaging contrast agent or drug is further bound.
제3항에 있어서, 상기 영상 조영제는 자기공명영상 조영제(MRI 조영제), CT(computed tomography) 조영제, 또는 형광염료인 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
The zwitterionic alginic acid derivative according to claim 3, wherein the imaging contrast agent is a magnetic resonance imaging contrast agent (MRI contrast agent), a computed tomography (CT) contrast agent, or a fluorescent dye.
제3항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항염증제, 마취제, 항바이러스제, 항박테리아제, 치료용 항체, 항생제, 면역치료제 또는 광감각제인 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
The zwitterionic alginate derivative according to claim 3, wherein the drug is an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an anesthetic agent, an antiviral agent, an antibacterial agent, a therapeutic antibody, an antibiotic, an immunotherapeutic agent, or a photosensitive agent.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 포함하는, 조영제 조성물.
The contrast agent composition containing the zwitterionic alginic acid derivative of any one of Claims 1-5.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 양쪽이온성 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or inflammatory disease, comprising the zwitterionic alginic acid derivative of any one of claims 1 to 5 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(a) 알긴산에 EDC 및 sulfo-NHS를 처리하는 단계; 및
(b) EDC 및 sulfo-NHS가 처리된 알긴산을 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응시키는 단계를 포함하는, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조방법.
(a) treating alginic acid with EDC and sulfo-NHS; And
(b) reacting the alginic acid treated with EDC and sulfo-NHS with lysine or arginine, to prepare a zwitterionic alginic acid derivative.
제8항에 있어서, (c) 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조방법.
According to claim 8, (c) lysine (lysine) or arginine (arginine) further comprises the step of reacting the alginic acid derivative bonded polyethylene glycol, the method of producing a zwitterionic alginic acid derivative.
제8항 또는 제9항의 제조방법에 따라 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체와 영상 조영제 또는 약물을 반응시키는 단계를 포함하는, 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법.A method for preparing a contrast agent composition or a pharmaceutical composition comprising reacting an amphoteric alginic acid derivative prepared according to the method of claim 8 or 9 with an imaging contrast agent or drug.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020130489A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 국립암센터 Zwitterionic alginate derivative and contrast medium composition containing same

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667141B (en) * 2021-07-09 2023-10-03 深圳华源再生医学有限公司 Protein adhesion resistant alginate hydrogel and preparation method and application thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110126912A (en) * 2010-05-18 2011-11-24 중앙대학교 산학협력단 Systems for preparing embolic microsphere
KR20120063753A (en) 2010-12-08 2012-06-18 한국과학기술원 Composition and methods for the treatment of atherosclerosis and other related diseases
KR20130135104A (en) * 2012-05-31 2013-12-10 한국교통대학교산학협력단 Compounds of catechol grafted copolymers and its appication for hemostatic and anti-adhesive materials
KR101867455B1 (en) * 2017-03-09 2018-06-15 광주과학기술원 Nanocarrier, the preparation method thereof and ultrasound enhanced contrast agent comprising the same

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013185032A1 (en) * 2012-06-07 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Nanotherapeutics for drug targeting
CN103848925B (en) * 2014-03-20 2016-01-20 华侨大学 Methionin grafting alginates (ALG-g-Lys) material and synthetic method
WO2018127819A1 (en) * 2017-01-03 2018-07-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nitric oxide-releasing alginates as biodegradable antibacterial scaffolds and methods pertaining thereto
CN107693803B (en) * 2017-11-03 2020-03-06 东华大学 Preparation method of manganese oxide-loaded hybrid sodium alginate nanogel
KR102041246B1 (en) * 2018-12-21 2019-11-06 국립암센터 Zwitterionic alginate derivatives and a contrast agent composition containing the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110126912A (en) * 2010-05-18 2011-11-24 중앙대학교 산학협력단 Systems for preparing embolic microsphere
KR20120063753A (en) 2010-12-08 2012-06-18 한국과학기술원 Composition and methods for the treatment of atherosclerosis and other related diseases
KR20130135104A (en) * 2012-05-31 2013-12-10 한국교통대학교산학협력단 Compounds of catechol grafted copolymers and its appication for hemostatic and anti-adhesive materials
KR101867455B1 (en) * 2017-03-09 2018-06-15 광주과학기술원 Nanocarrier, the preparation method thereof and ultrasound enhanced contrast agent comprising the same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2020130489A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 국립암센터 Zwitterionic alginate derivative and contrast medium composition containing same

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