KR102037506B1 - 생체활성 유리나노입자가 혼입된 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물 - Google Patents

생체활성 유리나노입자가 혼입된 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물 Download PDF

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단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
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Abstract

본 발명은 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및 폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물에 관한 것으로, 생체활성 유리나노입자가 혼입된 치과용 유리 이오노머 시멘트는 우수한 기계적 특성을 나타내며, 나아가 미네랄화 등의 우수한 생체활성을 나타낸다.

Description

생체활성 유리나노입자가 혼입된 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물 {Bioactive Glass Nanoparticle Incorporated Glass Ionomer Cement Composition}
본 발명은 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및 폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물에 관한 것이다.
치과용 유리 이오노머 시멘트(GIC)는 1960년대 말 윌슨 (Wilson)과 켄트 (Kent)가 도입한 치아 착색 물질이다(Wilson AD, Kent B. The glass-ionomer cement, a new translucent dental filling material. J Appl Chem Biotechnol1971;21:313.). GIC는 플루오로알루미노실리케이트계 유리 분말과 주로 폴리아크릴산으로 구성된 폴리산을 포함하는 액상 사이의 반응에 의해 형성된다. 상기 물질들은 GIC의 카르복실기와 에나멜 또는 상아질의 칼슘간 상호작용을 통해 치아 구조에 결합하고, 상대적으로 장기간 불소이온의 방출을 하고 이는 항우식성 특성에 유용하다. 또한, 자가 접착(self-adhesion), 불화물 방출, 및 벌크-필(bulk-fill)능력에 있어 우수하다. 상기 이점과 함께 GIC는 접착 시멘트, 회복 소재 또는 베이스, 및 최종 간접적 또는 직접적인 회복 이전의 라이너(liner)로 사용되어 왔다.
그러나, GIC는 상대적으로 낮은 물리적 기계적 특성에 문제가 있다. 특히, 인장력 및 전단력에 취약하며, 결과적으로 낮은 굴곡(굽힘) 및 직경인장 강도를 갖는다. 이와 관련하여, 첨가제를 사용하여 기계적 특성을 증가시키는 것이 연구되어 왔다. 금속 합금 (즉, 은-주석 또는 은-팔라듐/티타늄)은 기계적 성질을 향상시키기 위해 유리 분말에 성공적으로 혼입되었지만 불쾌한 금속 색상의 변화와 함께 생체 활성은 손상되었다. 또한, 국내공개특허공보 10-2016-0097267 A에서는 GIC의 충전제 변화 등을 통해 적절한 물리적 특성과 저장 안정성을 갖는 시멘트를 제공하고자 하고 있으나, 여전히 우수한 기계적 특성을 제공하지 못하며, 나아가 생체활성을 함께 증진시키고자 하는 동기가 전혀 나타나지 않는다.
따라서, 기계적 성질을 감소시키지 않으면서 생체활성 능력이 향상된 GIC를 개발하는 것은 여전히 어려운 과제이다.
한편, 키토산은 자연계에 존재하는 다당류 중 하나이고 상처 드레싱(wound dressing), 약물 전달체 및 조직 공학을 위한 스캐폴드로서 다양한 응용을 위해서 의학재료로서 널리 사용되어 왔다(Dash M, Chiellini F, Ottenbrite RM, Chiellini E. Prog Polym Sci 2011; 36: 981-1014; Jayakumar R, Manzoor DMK, Nair SV, Tamura H. Carbohydr Polym 2010; 82: 227-32). 종래에 알려진 연구는 15 중량%의 키토산(545 kD, 80% 디아세틸레이션) 및 20 중량%(470kD, 80% 디아세틸레이션)의 키토산이 GIC에 첨가된 것이 알려져 있다(Petri DFS, Donega J, Benassi AM, Bocangel JAJS. Preliminarystudy on chitosan modified glass ionomer restoratives. DentMater; 및 Limapornvanich A, Jitpukdeebodintra S, Hengtrakool C,Kedjarune-Leggat U. Bovine serum albumin release fromnovel chitosan-fluoro-aluminosilicate glass ionomer cement: stability and cytotoxicity studies. J Dent2009;37:686-90).
한편, 1969년 Hench는 특정한 분해성 유리 조성물 (Bioglass 45S5)이 Na+, Si4+ 및 Ca2 +와 같은 이온의 방출 때문에, 뼈와 화학 결합을 형성할 수 있다고 보고했다. 이러한 물질은 생체활성 유리 (bioactive glass)라고 불리우며 치아를 비롯한 손상된 경조직의 재생 생체 물질로 사용되어 왔다. 치과에서 생체 활성 유리는 뼈 이식 재료로, 또는 생체활성을 향상시키는 보철 재료, 시멘트 및 결합제의 첨가제로 광범위하게 연구되었다. 그러나, GIC에 생리활성유리를 첨가하여 기계적 특성을 유지하며 생체활성을 증진시킬 수 있을지에 대해서 알려진 바가 없다.
이러한 상황에서 본 발명자는 졸-겔 제조방법에 의해 나노 단위의 크기를 갖는 생체활성 유리나노입자를 제조하여, 이를 GIC의 폴리산을 포함하는 액상에 첨가한 후 산 반응성 무기 충전제의 분말과 혼합한 GIC 시멘트 조성물을 발명하였다. 본 발명의 GIC 시멘트는 그 자체로 또는 체액의 조건 내에서 압축강도, 인장강도, 및 굽힘 강도 모든 측면에서 우수하였음을 확인되었다. 또한, 미네랄화와 같은 생체활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 나아가, GIC의 액상에 키토산을 함께 혼입시킴으로서 기계적 특성을 보다 우수하게 할 뿐만 아니라 항균 작용까지 가능하도록 하였다.
본 발명의 하나의 목적은 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및
폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 시멘트 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 시멘트 조성물이 경화된 치과용 유리 이오노머 시멘트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 치과용 유리 이오노머 시멘트를 체액 또는 유사체액(simulated body fluid, SBF)에 침지하는 단계를 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트의 기계적 강도 증가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 치과용 유리 이오노머 시멘트를 분리된 치수 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 분리된 치수 줄기세포의 미네랄화 증가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및
폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트를 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및 폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물을 제공하는 것이다.
본원에서는 상기 유리 이오노머 시멘트를 GIC(Glass Ionomer Cement)로 표현하기도 한다.
본 발명의 유리 이오노머 시멘트는 당업계에 널리 사용되는 바와 같이 분말 부분과 액상 부분이 혼합되어 얻어질 수 있다. 분말은 필수적이거나 중요한 성분으로서 산 반응성 무기 충전제를 포함할 수 있으며, 액상은 경화 특성을 조정하기 위해 필수적이거나 중요한 성분으로서 폴리산을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 분말과 액상은 4:1 내지 1:1의 중량 비율을 가질 수 있다. 구체적으로, 3:1 내지 1:1의 중량 비율을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는, 2.5:1 내지 1.5:1의 중량비율을 가질 수 있다. 상기 비율에서 적합한 물리적 특성과 경화시간을 갖는 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물이 제공될 수 있다.
상기 "산 반응성 무기 충전제"는 산성 성분 존재하에 화학적으로 반응하는 무기 충전제를 의미할 수 있다. 상기 산 반응성 무기 충전제는 액상에 포함된 폴리산과 약 8분 이내에, 구체적으로 7분 이내에, 보다 구체적으로 6분 이내에 경화반응을 나타낼 수 있다.
상기 산 반응성 무기 충전제로는 염기성 금속 산화물, 금속 수산화물, 알루미노실리케이트 유리, 플루오로알루미노실리케이트 유리(FAS), 또는 Si/Al 중량% 비가 1.5 미만인 유리가 있을 수 있고 이에 제한되지 않는다. 상기 염기성 금속 산화물로는 산화바륨, 산화스트론튬, 산화칼슘, 산화마그네슘, 또는 산화아연이 포함될 수 있고, 상기 금속 수산화물에는 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 또는 수산화스트론튬이 포함될 수 있다.
상기 분말에는 상기 산 반응성 무기 충전제를 10 내지 85 중량% 포함될 수 있고, 비-산 반응성 무기 충전제가 적절한 농도로 포함될 수 있다.
상기 폴리산은 복수의 산성 반복 단위 (예를 들어 10개 초과 또는 20개 초과 또는 50개 초과)를 갖는 중합체를 의미할 수 있다. 각각의 중합체의 골격에는 산성을 나타내는 작용기가 부착되어 있을 수 있다. 단일 중합체이거나 공중합체일 수도 있다. 상기 중합체의 비제한적인 예로 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산, 말레산, 글루타콘산, 아코니트산, 시트라콘산, 메사콘산, 푸마르산, 티글산의 단일중합체 및 공중합체, 또는 말레산과 에틸렌의 공중합체가 있을 수 있다.
상기 액상은 상기 폴리산 외에도 착화제를 포함할 수 있다. 착화제의 비제한적인 예로는 타르타르산, 시트르산, 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산 (EDTA), 살리실산, 멜리트산, 다이하이드록시 타르타르산, 니트릴로트라이아세트산 (NTA), 2,4 및 2,6 다이하이드록시벤조산, 포스포노 카르복실산, 또는 포스포노 석신산이 있다.
본 발명에서 GIC의 우수한 기계적 특성을 제공하며, 나아가 생체활성을 함께 증진시키기 위한 하나의 중요한 수단은, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자를 첨가하는 것이다. 본원에서는 생체활성 유리나노입자를 약어로 BG 또는 BGN(Bioactive Glass Nanoparticle)이라고 표현하기도 한다.
상기 생체활성 유리나노입자는 실리콘, 칼슘, 인 등의 무기성분으로 구성된 나노입자를 의미하는데, 상기 BGN은 PEG 용액에 칼슘을 포함하는 화합물과 실리콘을 포함하는 화합물을 가하여 반응시킴으로써, PEG, 칼슘 및 실리콘이 응결된 응집체를 수득하고, 상기 응집체를 소결시켜서, PEG를 제거함으로써 제조할 수 있다. 졸-겔 방법에 의해 분말 형태로 제공될 수 있으며, 나노크기의 입자로 제공될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 생체활성 유리나노입자는 1) PEG 또는 CTAB를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계; 2) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계; 3) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계;에 의해 제조될 수 있다.
상기 생체활성 유리나노입자는 나노 단위의 크기를 갖기 때문에 GIC의 매트릭스와 적절히 결합되어 표면적을 증가시키고 이에 따라 기계적/생물학적 특성을 증가시킬 수 있다. 상기 생체활성 유리나노입자의 크기는 1 내지 999nm의 평균 입경을 가질 수 있고, 구체적으로 1 내지 300nm의 평균 입경을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로 1 내지 200nm의 평균 입경을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 생체활성 유리나노입자는 42 ± 5 nm의 입경을 갖는 것으로 확인되었다. 여기서, 평균 입경은 입도분포곡선에서 중량 백분율의 50%에 해당하는 입경을 의미한다.
본 발명의 생체활성 유리 나노입자는 적절히 비정질(amorphous)을 나타낼 수 있으며, 이에 따라 GIC에 첨가되어 생체활성을 증가시킬 수 있다. 상기 생체활성 유리나노입자의 XRD 패턴은 2θ = 10 °와 40°사이의 넓은 비정질 피크를 나타낼 수 있고, 구체적으로 15 °와 35°사이의 피크를 나타낼 수 있다.
본 발명의 생체활성 유리나노입자는 체액 또는 유사체액에서 하이드록시 아파타이트를 형성할 수 있고 이에 따라 생체활성을 나타낼 수 있다. 또한, 체액 또는 유사 체액에서 현탁액 상태로 장기간 유지될 수 있어 생체활성을 꾸준하게 나타낼 수 있다.
상기 생체활성 유리나노입자는 75 내지 95 몰비의 SiO2 및 5 내지 25 몰비의 CaO을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 생체활성 유리나노입자는 75 내지 95 몰비의 SiO2 및 5 내지 25 몰비의 CaO로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 생체활성 유리나노입자는 인산을 추가로 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 인산을 포함하지 않더라도 체액 또는 유사 체액내에서 생체활성 유리나노입자는 하이드록시 아파타이트가 생성될 수 있고, 이에 따라 생활성을 나타낼 수 있다. 이와 다른 몰비를 가질 경우, 생체활성 유리나노입자의 생체 활성이 크게 떨어질 수 있다. 예컨대, Ca 및 Si 등의 이온 방출이 잘 되지 않을 수 있다. 따라서, 이러한 생체활성 유리를 유리 이오노머 시멘트에 첨가시 상아질 세포로의 분화촉진이 감소될 수 있다.
상기 생체활성 유리나노입자는 상기 GIC의 액상에 대해 1 내지 10 중량%로 첨가될 수 있다. 구체적으로 3 내지 7 중량%로 첨가될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 5 중량%로 첨가되었다. 만약 높은 중량으로 포함되어 있을 경우 압축강도가 오히려 상당히 저하될 수 있다. 예컨대 30 중량%로 첨가될 경우, 종래의 GIC에 비해 절반 이하의 압축강도를 나타낼 수 있다. 생체활성 유리 나노입자가 상기 농도보다 적게 함유될 경우 생체활성을 나타내지 못할 수 있다.
본 발명에서 GIC의 우수한 기계적 특성을 제공하며, 나아가 항균활성을 나타낼 수 있도록 하는 하나의 중요한 수단은, 상기 액상에 키토산을 첨가하는 것이다.
키토산은 유기 폴리머로서 D-글루코사민(2-아미노-2-데옥시-D-글루코스)의 β-(1 4)중합체이다. 천연에는 접합균류의 세포벽 중에 존재하고 있는 것을 분리하여 사용할 수도 있고, 키틴을 진한 알칼리로 처리하여, N-디아세틸 (N-deacetyl)화하여 생산된 것을 사용할 수도 있다. 상기 키토산은 분말의 형태일 수 있다. 본원에서 키토산은 CL로 표시되기도 한다.
키토산은 5000 내지 500000 정도의 저분자량을 갖는 것이 사용될 수 있고, 본 발명의 실시예에서는 50 내지 190kDa의 키토산이 사용되었다. 또한, 디아세틸레이션된 키토산을 사용할 수 있다.
키토산 분말은 상기 액상에 대해 0.1 내지 1 중량%으로 첨가될 수 있다. 이보다 많이 첨가될 경우 압축강도가 떨어진다. 예를 들어 3 내지 5% 첨가될 경우 압축강도가 20 내지 40%정도 저하될 수 있고, 세포친화성이 저해되어 이 발명에서 보이는 세포에서의 생체활성능력을 저해할 수 있다. 이보다 적게 첨가될 경우 (0.1% 미만)는 생체활성유리를 첨가해서 나타날 압축강도 증가효과가 10% 이상 줄어들 수 있다. 키토산의 NH2기는 폴리산의 COOH기 등과 반응하여 전기적으로 상호작용할 수 있으며, 기계적 특성을 증가시키는 폴리머의 네트워크를 형성할 수 있다. 키토산을 첨가한 GIC는 그렇지 않은 대조군 GIC에 비해 지속된 압축강도를 나타냄을 확인하였다. 키토산을 첨가하는 경우 생활성이 떨어지는 문제가 발생할 수 있으나, BGN과의 동시 첨가를 통해 기계적 특성의 증가와 동시에 우수한 생활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물은 경화되어 유리 이오노머 시멘트가 될 수 있고 이는 치과용 회복재 등으로 사용될 수 있다. 경화시간은 대략 8분 이내일 수 있고, 구체적으로 7분 이내, 보다 구체적으로 6분 이내일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 BG5 + CL0.5 는 4.7분 BG5는 5.4 분 안에 경화되었다.
본 발명의 치과용 유리 이오노머 시멘트는 체액이나 유사 체액에서 생체활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 시멘트의 표면상에 막대 모양의 광물이 형성될 수 있다. 7일 이후에는 육안으로 확인할 수 있는 광물이 형성될 수 있다.
본 발명의 치과용 유리 이오노머 시멘트는 기계적 강도가 향상되어 ISO의 기준을 충족시킨다. 또한, 압축강도(CS)가 150 MPa 이상으로 증가될 수 있다. 특히, 굽힘강도(FS)가 증가되며 체액 또는 유사 체액 내에서 기간이 경과함에 따라(1주일 이상) FS가 점차 증가될 수 있다.
본 발명의 치과용 유리 이오노머 시멘트는 생체활성을 나타낼 수 있다. 먼저, 체액 또는 유사 체액에서 치수 줄기세포의 세포독성을 나타내지 않으며, 미네랄화시킬 수 있다. 특히, 치수 줄기세포와 함께 처리시 치수 줄기세포의 미네랄화를 현저히 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 GIC는 칼슘, 규소, 및 알루미늄 이온의 방출량이 종래의 GIC에 비해 증가해 우수한 생활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 제조방법은, 유리나노입자 분말을 첨가하며 교반하여 균질화된 액상을 제공하는 단계; 및 상기 균질화된 액상에 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말을 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.
여기서 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 생체활성 유리나노입자 분말은 1) PEG 또는 CTAB를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계; 2) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계; 3) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 시멘트 조성물이 경화된 치과용 유리 이오노머 시멘트를 제공하는 것이다. 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
여기서, 상기 경화된 치과용 유리 이오노머 시멘트가 체액 또는 유사체액(simulated body fluid, SBF)에 침지되어 기계적 강도가 증가된 것인, 유리 이오노머 시멘트를 제공할 수 있다. 즉, 치과용 유리 이오노머 시멘트를 실제 치과용으로 사용하기 이전에 유사 체액 등에 침지하여 기계적 강도를 증가시킨 후 이용할 수 있다.
상기 유사체액은 인체의 혈장 내의 이온상태와 유사하게 만든 인공 혈장 용액을 의미한다. 상기 유사체액은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 인산나트륨, 황산나트륨, 질산나트륨 및 탄산나트륨 등을 포함하는 용액일 수 있으며, 구체적인 일 실시예에서는 NaCl (142.0mM), KCl (5.0mM), NaHCO3 (4.2mM), CaCl2 (2.5mM), MgCl2 · 6H2O (1.5mM), K2HPO4 · 3H2O (1.0mM) 및 Na2SO4 (0.5 mM)을 증류수에 용해하고, 트리스 -HCl로 pH 7.4로 완충시킨 것을 사용하였다. 본원 실험예 3에서는 유리 이오노머 시멘트가 유사체액에 14일 혹은 28일 이상 침지되었을 경우, 기계적 강도(특히, 압축강도, 직경 인장강도, 또는 굴곡 강도)가 증가됨을 확인하였다.
본원에서 사용되는 용어 "침지"는 액체에 담가 적시는 것을 의미하는 것으로 완전히 액체에 담가지는 것뿐만 아니라 일부만 담가 적셔지는 것도 포함된다.
상기 기계적 강도는 소재에 일반적으로 통용되는 물리적으로 튼튼함 정도를 나타내는 것으로, 압축강도, 인장강도, 또는 굽힘강도 등을 의미할 수 있다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 치과용 유리 이오노머 시멘트를 체액 또는 유사체액(simulated body fluid, SBF)에 침지하는 단계를 포함하는, 분리된 치수 줄기세포의 미네랄화 증가 방법을 제공하는 것이다. 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 침지하는 단계는 구체적으로 7일 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로 14일 이상일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 해당 기간 동안 침지할 경우 기계적 강도가 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 치과용 유리 이오노머 시멘트를 치수 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 치수 줄기세포의 미네랄화 증가 방법을 제공하는 것이다. 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 치수 줄기세포는 포유류, 구체적으로 인간의 것일 수 있고, 인체에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서 미네랄화는 아파타이트 또는 하이드록시 아파타이트의 석출을 의미할 수도 있고, GIC에서의 이온 방출의 증가를 의미할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서는 상기 이오노머 시멘트를 분리된 치수 줄기세포에 처리시 치수 줄기세포의 미네랄화를 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였으며, 본 발명의 GIC는 칼슘, 규소, 및 알루미늄 이온의 방출량이 종래의 GIC에 비해 증가해 우수한 생활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및 폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트로서, 상기 액상에 생체 활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트를 제공하는 것이다. 사용되는 용어는 앞서 설명한 바와 같다.
본원에서 키트는상이한 실시 형태들로 의사에게 제공될 수 있다. 분말 부분 및 액체 부분은 (예를 들어 플라스틱 또는 유리로 제조된) 개별적인 밀봉 가능한 용기에 수용될 수 있다. 사용을 위해, 의사는 용기로부터 분말 및 액상의 적절한 일부분을 취할 것이고 그 일부분을 혼합 플레이트 상에서 수동으로 혼합할 것이다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 분말 및 액상은 치과용 캡슐의 개별적인 구획 내에 수용된다. 치과용 캡슐은 분말 및 액상을 함께 합하는 메커니즘을 사용하여 활성화된다. 상이한 메커니즘들이 당업계에 공지되어 있다. 이어서, 치과용 캡슐은 전형적으로 혼합 공정을 용이하게 하는 장치 내에 넣어질 수 있다.
본 발명은 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및 폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서, 상기 액상에 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물에 관한 것으로, 생체활성 유리나노입자가 혼입된 치과용 유리 이오노머 시멘트는 우수한 기계적 특성을 나타내며, 나아가 미네랄화 등의 우수한 생체활성을 나타낸다.
도 1은 생체활성 유리나노입자의 특성을 나타내는 도이다. 도 1A는 나노크기 (42 ± 5 nm) 의 BGN의 구형 형태를 보여주는 고배율 이미지를 갖는 TEM 이미지이다. 도 1B는 BGN의 성분이 초기성분과 일치함을 확인시켜주는 EDS 결과이다(85:15의 Si:Ca의 원자비). 도 1C는 제공된 BGN(0일)이 비정질 생체활성 유리의 전형적인 특성인 넓은 비정질 피크를 보여주는 XRD 패턴 데이터이다. SBF에서 28일 후, BGN은 26, 32, 40, 47, 50, 및 53의 2θ에서 하이드록시 아파타이트의 여러 피크를 나타내었다. 즉, BGN의 생체활성을 나타내었다. 도 1D는 24시간 동안 10 내지 30mm 사이에서 지속된 투과율 (~87.5%)과 후방 산란(16-17%)을 보여주는 Turbiscan 결과를 나타낸 도이다. 이는 BGN이 24시간 동안 용액(DW) 내에서 현탁액 상태로 꾸준함을 보인다. 모든 분석은 3 배로 독립적으로 수행되었으며 대표 결과가 표시된다.
도 2는 BGN이 혼입된 GIC의 성공적인 제조 및 일반적인 특성에 대한 조사를 나타낸 도이다. 도 2A는 GIC의 구성을 확인하기 위해 수행된 FTIR을 나타낸 도이다 (n = 5). 도 2B는 ISO9917-1에 따른 최대의 경화시간(8분)보다 짧은 경화시간을 나타낸 도이다. 도 2C는 SBF에 침지된 이후의 무게 변화를 나타낸 도이다 (n = 5). 모든 분석은 3 배로 독립적으로 수행되었으며 대표 결과가 표시된다.
도 3은 BGN이 혼입된 GIC의 SBF의 침지 이후 1, 7, 및 14일 동안 표면 형태(morphology) 변화를 나타낸 도이다(A: 대조군, B: CL0.5, C: BG5+CL0.5, D: BG5). 14일 이후, BG5+CL0.5 및 BG5 사이에 형태적 변화가 관찰되었다. 막대 모양의 미네랄이 BG5+CL0.5 표면에 나타났으며, 완전히 침전된 아파타이트 미네랄은 BG5에서 뿌리 나무 모양으로 나타났다. 모든 분석은 3 배로 독립적으로 수행되었으며 대표 결과가 표시된다.
도 4는 SBF에 침지한 후 28일까지의 BGN이 혼입된 GIC의 기계적 특성에 대한 도이다. 37℃의 SBF용액 내에서 28일까지 배양시간을 증가함에 따라 압축강도(도 4A), 직경 인장강도(도 4B)가 측정되었다. 모든 분석은 독립적으로 3 회 수행되었고 SD를 사용한 대표적인 수단이 제시되었다. 인큐베이터 배양 일의 다른 문자는 두 군간에 유의한 차이가 있음을 나타낸다(p <0.05).
도 5는 28일까지 SBF에 침지된 BGN이 혼입된 GIC의 굽힘강도 특성을 나타낸 도이다. 37℃의 SBF용액 내에서 28일까지 배양시간을 증가함에 따라 굽힘강도(도 5A) 및 굽힘 탄성계수(도 5B)가 측정되었다. 모든 분석은 독립적으로 3 회 수행되었으며 SD를 사용한 대표적인 방법이 제시되었다. 배양 일마다 각기 다른 문자가 유의미한 차이를 보였다 (p <0.05).
도 6은 BGN이 혼입된 GIC가 불멸화된 인간 치수 줄기세포(ihDPSC)의 생존 가능성에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 세포 생존율(n=6)이 다른 추출 용액을 사용하여 MTS에 의해 평가되었고, 대조군으로 정상화 되었다(성분이 포함되지 않은 GIC). 70%의 세포 생존율을 붉은색으로 표시하였다. 모든 분석은 독립적으로 3 회 수행되었으며, SD를 사용한 대표적인 수단이 제시되었다. 각각의 추출물 농도에 대한 다른 글자들은 그들 사이의 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
도 7은 A BGN이 혼입된 GIC가 ihDPSC와 함께 나타낸 생미네랄화가 RS 염색법에 의해 평가된 도이다. 도 7A는 이미지를 나타낸 것인데, BG5+CL0.5 및 BG5에서 미네랄화된 결절(적색 점)이 음성 대조군(NM) 및 양성 대조군(DM)에서보다 많이 나타났다. 도 7B은 붉은색으로 염색된 미네랄화 결절을 탈색 분석으로 정량화하였다. 모든 분석은 독립적으로 3 회 수행되었으며, SD를 사용한 대표적인 수단이 제시되었다. 각각의 추출물 농도에 대한 다른 글자들은 그들 사이의 유의한 차이를 나타낸다 (p <0.05).
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예
생체활성 유리나노입자의 제조
테트라에틸 오쏘 실란 (TEOS), 질산칼슘 4수화물 (Ca(NO3)2·4H2O), 암모니아 용액 (28%), 및 PEG-PPG-PEG 트리블록 공중합체(Pluronic 123, P123)를 BGN (85% SiO2-15% CaO)의 합성을 위한 전구체로 사용하였다. 모든 화학 물질은 별도의 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 우리는 알려진 방법 [El-Fiqi A, Kim T-H, Kim M, Eltohamy M, Won J-E, Lee E-J,et al. Capacity of mesoporous bioactive glass nanoparticlesto deliver therapeutic molecules. Nanoscale 2012;4:7475-88.]에 따라 템플레이트의 존재 하에 염기촉매 졸-겔(sol-gel) 방법을 통해 85SiO2/15CaO (mol%)를 함유하는 구형 생체활성 유리나노입자를 합성하였다. 증류수 100mL, 에탄올 25mL, 및 암모니아 용액 (28 %) 25mL를 함유한 150mL 용액에, 질산칼슘 (4.23 mM) 1 g 및 P123 10 g을 50℃에서 30분간 50rpm(rotations perminute)으로 기계적으로 교반하면서 용해시켰다. NH4OH를 첨가하여 pH를 12.5로 조절한 후, Ca(NO3)2·4H2O 1g을 상기 투명한 용액에 용해시켰다. 다른 용기에서 5.36 mL의 TEOS (24 mM)를 40 mL의 무수 메탄올에 희석하고 상기 제조된 pH 12.5의 용액에 천천히 넣고 음향리액터 (LH700S ultra-sonicpower generator, ㈜울쏘하이텍, 청원, 한국)에서 20 kHz와 700 W에서 30 분 동안 교반하였다. 기계적 교반을 밤새 유지한 후, 유백색 BGN (백색 침전물)을 5000 rpm에서 원심 분리하여 수집하였다. BGN은 증류수 (DW), 아세톤 및 70% 에탄올로 반복 세척 하였다. 미세한 BGN은 70℃에서 밤새 건조되었고 일정한 (1℃/분) 가열 속도로 600℃에서 5시간 동안 최종 소성되었다. 상기 공정으로부터 BGN의 생산량은 1.35g이었다.
제조된 생체활성 유리나노입자의 특성 분석
(1) 분석 방법
BGN의 표면 형태는 3kV의 주사현미경(SEM, Sigma 500, ZEISS, Jena, 독일)을 사용하여 조사되었으며, 성분은, 종래의 절차(Lee J-H, El-Fiqi A, Jo J-K, Kim D-A, Kim S-C, Jun S-K, et al.Development of long-term antimicrobial poly(methylmethacrylate) by incorporating mesoporous silicananocarriers. Dent Mater 2016;32:1564-74.)에 따라, 이온 스퍼터링 장비(ion sputterer) (IB-3 Eiko, 도쿄, 일본)를 사용하여 5분동안 플라즈마 코팅을 한 후, 15kV의 에너지 분산 분광기 (EDS, UltraDry, Thermo Fisher, Waltham, MA, 미국)에 의해 분석되었다.
BGN의 입자 크기와 형태(morphology)는 투과 전자 현미경 (TEM; 7100, JEOL, 일본) 에 의해 조사되었다.
밀도는, 종래의 절차 (Asaoka K, Bae JY, Lee HH. Porosity of dental gypsum-bondedinvestments in setting and heating process. Dent Mater J2012;31:120-4.)에 따라, 중량에 대해 0.01mg의 정밀도를 갖는 마이크로저울(AUW220D; Shimadzu, Kyoto,Japan)과 1cm3에 대해 0.02%의 정확도를 갖는 가스 비중병(AccuPyc 1330, Shimadzu, Kyoto, Japan)으로 측정되었다.
나노입자의 위상을 X 선 회절 (XRD, Rigaku, Ultima IV, Japan)으로 CuK 방사선(= 1.5418Å)을 사용하여 분석 하였다. X 선은 40 kV와 40 mA에서 생성되었고, 2θ가 0.02°의 스텝 크기로 4 내지 70 °까지 얻어졌다.
BGN의 시험관내 아파타이트-형성 능력이 37℃의 유사 체액(SBF)내에서 시험되었다. SBF는 NaCl (142.0mM), KCl (5.0mM), NaHCO3 (4.2mM), CaCl2 (2.5mM), MgCl2 · 6H2O (1.5mM), K2HPO4 · 3H2O (1.0mM) 및 Na2SO4 (0.5 mM)을 증류수에 용해하여 제공되었고, 트리스 -HCl로 pH 7.4로 완충시켰다. SBF 용액의 이온 농도는 인체 혈장의 이온 농도와 거의 같았다. SBF 용액은 7 일마다 새로운 용액으로 대체되었다.
SBF에 담가진 후의 나노입자의 위상을 위에서 설명한 동일한 방법대로 X- 선 회절을 사용하여 분석했다.
제타 전위 (ζ) 측정은 동적 광산란을 기반으로 25 ° C에서 Zetasizer (ZEN 3600, Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 수행되었다.
5wt %의 BGN이 혼입된 DW 용액 (50mg / ml)의 분석을 위해 일회용 폴리스티렌 큐벳(cuvette)에 넣었다. Turbiscan (LAB Science)을 사용하여 25 ℃에서 매체의 나노입자 안정성을 측정 하였다. 큐벳의 상단부터 아래까지 흐림정도(turbidity)의 변화를 투과율 (%) 및 후방 산란 (%)값으로 1시간 간격으로 24시간 동안 조사하였다. BGN이 혼입된 DW 용액 (200㎍ / mL, 40mL)은 24 시간 동안 액체에서 BGN의 일반적인 분산 능력을 조사하기 위해 대표 농도로 준비되었다.
각 분석에 대해 3 번의 반복 시험을 수행되었고, 대표 데이터 및 이미지를 제시한다.
(2) 결과
나노 입자 BGN은 TEM 이미지에서 구형 형태를 가지며 42 ± 5 nm (도 1a)의 입경을 갖도록 졸-겔 법에 의해 합성되었다(도 1a). EDS 결과를 통해 BGN의 조성이 처음 설계된 것과 잘 일치 함을 확인할 수 있었다(도 1B, 85:15의 Si:Ca 원자비율). 준비된 BGNs로부터의 XRD 패턴(도 1C, 아래)은 2θ = 15 °와 35°사이의 넓은 비정질 피크를 나타내어, 비정질의 생체활성 유리의 특성을 확인할 수 있었다. BGN의 밀도는 2.51 ± 0.02 g / cm3이었고, 후술하는 구매된 유리 이오노머 시멘트의 분말은 3.06 ± 0.01 g / cm3이었다. SBF에 28 일 동안 침지한 후의 XRD 패턴 (도 1C, 상단)은 26, 32, 40, 47, 50 및 53의 2 θ 에서 여러 개의 하이드록시 아파타이트 피크를 보였고, 이는 BGN의 생체 활성을 나타낸다. BGN의 순 전하(net charge)는 -21 ± 2.1 mV였다. Turbiscan 결과는 24 시간 동안 10nm 및 30nm 사이에서 지속된 투과율 (~ 87.5 %)과 후방 산란 (16-17 %)을 나타내며, 이를 통해 BGN의 용액(DW)의 서스펜션 상태로의 24시간 이상 꾸준함을 확인할 수 있었다(도 1D).
유리 이오노머 시멘트의 제조
표 1에 따라 4그룹의 유리 이오노머 시멘트를 준비하였다: 대조군, CL0.5(키토산 저분자량 분말 0.5%), BG5(BGN 5%), 및 BG5+CL0.5(BGN 5% + 키토산 저분자량 분말 0.5%).
대조군으로서 유리 이오노머 시멘트 (HY-BOND GLASIONOMER CX, Shofu, 교토, 일본)를 사용하였다. CL0.5의 경우, 저 분자량 키토산 분말(50-190 kDa, 75-85% 디아세틸레이션, Sigma, St. Louis, Missouri, 미국)이 0.5 중량%의 농도로, 물(40-50%), 폴리(아크릴산)(40-50%) 및 타르타르산(1 내지 10%)을 포함하는 대조군 시멘트의 제공된 액체(제조번호: 050904)에 첨가되었다. BG5의 경우, BGN이 5.0 중량%으로 시멘트 액체에 첨가되었다. BG5+CL0.5는 키토산 분말(0.5 중량%) 및 BGN(5 중량%)을 모두 시멘트 액체에 용해시켰다.
첨가제를 액체에 혼입시킨 후, 액체를 초음파 처리하고 균질화를 위해 1분 동안 교반하였다. 액체에 첨가제의 균질화는 분말과 혼합하기 직전에 이루어졌다. 시멘트화 이전에 액체의 균질성을 광학 현미경으로 육안 확인하였다. 유리 이오노머 시멘트는 제조업체의 지시에 따라 경화되었다. 간략히 말해, 시멘트의 혼합비율은 플루오로알루미노실리케이트(fluoroaluminosilicate) 유리를 포함하는 분말(제조번호: 051162) 대 액상의 비율을 2:1(중량)로 설정되었으며, 30초 동안 혼합되었다. 모든 단계가 오염을 방지하기 위해 깨끗한 벤치에서 수행되었다.
분말 액상 P/L 비율
(중량%)
제조업체 제공 키토산 BGN
대조군(GIC) 제조업체 제공 100 2:1
CL0.5 제조업체 제공 99.5 0.5 2:1
BG5+CL0.5 제조업체 제공 94.5 0.5 5 2:1
BG5 제조업체 제공 95 5 2:1
제조된 유리 이오노머 시멘트에 대한 FTIR 분석
(1) 분석방법
알려진 방법론 (Lee J-H, El-Fiqi A, Jo J-K, Kim D-A, Kim S-C, Jun S-K, et al.Development of long-term antimicrobial poly(methylmethacrylate) by incorporating mesoporous silicananocarriers. Dent Mater 2016;32:1564-74.)에 따라 실험 유리 이오노머의 제작의 성공을 확인하기 위해 감소된 총 반사율-푸리에 변환 적외선 분광기(ATR-FTIR, Varian 640-IR, 호주)가 사용되었다.　디스크 시편이 분석에 사용되었다. Gladi ATR 다이아몬드 크리스탈 액세서리 (PIKE Technolo-gies, USA)를 사용하여 4 cm-1의 분해능으로 스펙트럼 (4000-400 cm-1 범위)을 얻었다. 세 가지 측정 값을 반영하여 대표 데이터가 표시된다.
(2) 결과
FTIR은 실험 GIC의 조성을 확인하기 위해 디스크 시편으로 수행되었다. BG5는 1064cm-1 피크(Si-O-Si 스트레칭에 해당)에서 강도가 대조군의 강도보다 높았으며 이는 BGNs의 결합을 나타냈다. CL0.5는 키토산에서 관찰되는 아마이드(N-C=O) 스트레칭에 해당하는 1654 cm-1에서 작은 피크를 보였다. BG5+CL0.5 1064 cm-1에서 강한 피크를 보였으며 1654 cm-1에서 상대적으로 작은 피크를 나타내어 BGN과 키토산의 결합을 확인했다
실험예 1. 경화시간 및 중량 변화
(1) 분석방법
시멘트의 순 경화시간은 길모어 바늘을 이용하여 치과용 유리 폴리알케노에이트 시멘트에 대한 ISO9917-1 (치과용 수성 시멘트 (분말/액체 산 염기 시멘트))에 따라 측정되었다.
혼합이 끝난 후 (~ 60 초) 시멘트는 직사각형 금속 몰드 (8mm (h) x 10mm (v) x 5mm (t))에 채워졌다. 편평한 끝 (φ = 1.0 ± 0.1 mm)을 가진 압흔기 바늘 (400 ± 5 g)을 시멘트 표면에 10 초 간격으로 5초 동안 수직으로 낮추었다. 측정은 약 95 %의 상대 습도에서 37 ± 1 ℃의 온도에서 수행되었다.
순 경화시간은 혼합이 끝난 시점과 바늘이 완전히 원형 압흔에 실패한 시점 사이의 경과된 시간으로 기록되었다. 3개의 디스크 샘플 (φ = 12 mm 및 t = 5 mm)에 기초하여, 37±1℃의 SBF에 담근 후의 중량 변화는 준비된 시료의 것과 비교하여 전자 발란스를 사용하여 28 일까지 측정되었다.　무게는 0.0001g의 정확도로 분석저울 (Explorer, Ohaus)을 사용하여 가시적인 모든 물기를 제거한 후 측정되었다.
(2) 결과
혼합 된 시멘트는 모든 그룹에서 4-6 분 내에 경화되었으며, 이는 ISO9917-1 (도 2A)에서 유리 이오노머 시멘트의 최대경화 시간인 8분 미만이었다. 그러나 BGN 함유 군은 BG5 + CL0.5에서 4.7 ± 0.2 분으로, BG5에서 5.4 ± 0.3 분으로 나타나, 대조군의 4.3 ± 0.3 분에 비해 순 경화시간이 유의하게(p <0.05) 증가하였다.
SBF에 침지 한 후의 체중 변화는 초기에는 모든 그룹에서 ~ 2 %의 손실되었다 (그림 2B). 최대 28 일간의 배양 시간의 증가에 따라 체중 변화의 값은 그룹간에 유의한 변화 없이 ~ 1 %의 손실로 감소되었다 (그림 2B, p> 0.05).
실험예 2. 유사 체액내의 생체활성
(1) 분석방법
디스크 시편의 표면 생물 활성도 (φ = 10 mm 및 t = 2 mm)는 37℃에서 1, 7, 및 14 일 동안 SBF 50 ml에 담가서 평가하였다. SBF 용액은 매일 7 일 동안 교체되었다. SEM 이미지는 위에서 설명한 방법을 사용하여 촬영하였다.
(2) 결과
도 3은 SBF에 1, 7, 14 일 동안 침지한 후의 유리 이오노머 시멘트의 표면 형태 변화를 보여준다. 1일 침지 후, 약간의 균열을 갖는 부드러운 표면이 관찰되었다. 그러나 7 일 후, BG5 + CL0.5 및 BG5는 표면 상에 아파타이트와 같은 막대 모양의 광물이 나타났다. 14 일 후, BG5 + CL0.5와 BG5 사이에 형태 학적 차이가 관찰되었다. 막대 모양의 미네랄은 BG5 + CL0.5 표면에 나타났으며, 완전히 석출된 아파타이트 광물은 뿌리줄기처럼 보였다.
실험예 3. 기계적 특성
(1) 측정 방법
ISO 9917-1에 따라 압축 강도 (CS; φ = 4 mm 및 h = 6 mm) 및 직경 인장 강도 (DTS; φ = 6 mm 및 h = 4 mm)에 대한 원통형 시편이 제작되었다.　굽힘 강도 (FS)와 모듈러스 (FM)측정을 위해 바 시편 (2 × 2 × 25mm)이 제조되었다. 시편은 혼합 종료 후 24 시간 동안 약 90 %의 상대 습도에서 37℃로 보관하였고, 주형에서 꺼내어 SBF 50 mL에 담갔다. SBF는 기계적 특성 측정 전 23 시간, 7 일, 14 일 및 28 일 동안 인큐베이터에서 37 ℃로 유지되었다.　각 시편마다 10 개의 시편이 만들어졌다. 정해진 저장 시간이 지난 후, 시편을 압축강도 CS 및 직경 인장 강도DTS 측정을 위해 1.0 mm/min의 크로스 헤드 속도로 범용 시험기 (Instron 8871, Instron, MA, USA)에서 파단되도록 하중을 가했다. 압축강도 CS는 방정식 CS = P /πd2으로 계산되었다(여기서 P (N)은 파단시의 하중, d (mm)는 0.01 mm의 정확도에서 샘플 실린더의 반경). 직경 인장 강도는 DTS = 2P /πdt의 관계로부터 결정되었으며, 여기서 d (mm)는 직경이고 t (mm)는 0.01 mm의 정밀도에서 실린더의 두께이다. 굴곡된 시편은 100 N 하중 셀 (Instron 3344)을 사용하여 1.0mm/분의 로딩 속도에서 3점 굴곡 테스트(3-point flexural test)를 받았다. 3 점 굽힘에서의 굽힘 강도는 FS = 3P1 / 2bd2 식을 사용하여 얻어졌으며, 여기서 l (mm)은 두 받침 간의 거리, b (mm)는 폭, d (mm)는 시험편의 깊이이다. 기계적 특성 시험에 대한 자세한 내용은 다른 문헌(Kim DA, Abo-Mosallam H, Lee HY, Lee JH, Kim HW, Lee HH.Biological and mechanical properties of an experimentalglass-ionomer cement modified by partial replacement ofCaO with MgO or ZnO. J Appl Oral Sci 2015;23:369-75.)에서도 설명되어있다.
(2) 결과
먼저, ISO 9917-1에 따라 압축 강도가 그룹간에 비교되었다. 도 4a는 CS가 122.6에서 200.1 MPa로 변화되었음을 나타낸다. BG5 + CL0.5 또는 BG5가 7 일, 14 일 또는 28 일 (p <0.05)에서 가장 높은 값을 보인 반면, 대조군 GIC 및 CL0.5는 모든 기간 또는 대부분의 기간 동안 가장 낮은 값을 보였다. 특히 14 일 후, BG5는 대조군 GIC (151.3 ± 21.6 MPa)보다 훨씬 우수한 CS (200.1 ± 15.9 MPa)를 보였다.
다음으로 인장 강도 및 굽힘 강도를 평가하기 위해 DTS, FS 및 FM을 측정했다(그림 4B 및 5).
DTS 값은 14 일까지 그룹간에 유의미한 변화가 없었다. 그러나 28 일 후에 BG5의 DTS (11.3 ± 1.9 MPa)는 다른 것의 DTS와 비교하여 유의하게 증가 하였다 (p <0.05,8.2-9.5 MPa).
FS의 경우 대조군 GIC는 모든 잠복기에서 최저값을 보였으나 CL0.5는 1일째 유의하게 증가한 값을 보였으며 (p <0.05), BG5 + CL0.5와 BG5는 1, 7 일, 14 일 또는 28 일에서 GIC에 비해 상당히 증가하였다(p<0.05). 14 일 후 대조군 GIC의 FS는 14.3 ± 1.6 MPa이었고 CL0.5, BG5 + CL0.5 및 BG5의 값은 각각 13.2 ± 1.9, 15.3 ± 5 및 24.2 ± 2.2 MPa였다 (p <0.05 ).
FM값은, CL0.5 (21.0 ± 4.5 GPa)에서 1일에, BG5 (20.6 ± 2.3 및 19.1 ± 4.7 GPa)에서 1일 및 7일에 대조군(11.6 ± 3.3 및 15.9 ± 4.3 GPa) (p <0.05)에 비해 유의하게 증가 하였다. 14일과 28일 후에 대조군과 BG5 사이에 유의한 변화는 없었지만(p>0.05), CL0.5의 값은 BG5+CL0.5 및 BG와 비교하여 유의하게(p<0.05) 감소되었다.
실험예 4. 생물학적 활성
(1) 측정 방법
세포 배양
인간 치수 줄기세포 (human Dental Pulp Stem Cell, hDPSC)는 단국대학교의 치과 병원에서 성인 환자로부터 채취한 인간의 3 번째 대구치에서 제공되었으며 (윤리적 승인 IRB 번호 H-1407 / 009 / 004), 인간 텔로머라아제 전사 효소 유전자로 트랜스펙션하여 불멸화된 ihDPSC를 준비하였다. ihDPSCs는 생물 미네랄화(biomineralization) 활성 및 치아형성(odontogenic) 분화에 대해 일차 배양된 hDPSC의 그것과 비교할 수 있기 때문에 선택되었다.
상기 세포를 10% 태아 소 혈청 (Gibco, Waltham, MA, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) 및 0.1mM의 l-아스코르브산 (Sigma-Aldrich)이 보충된 유지배지(DMEM/ F12 3:1 혼합물)에서 37 ℃에서 5 % CO2의 가습 공기하에 배양하였다.
마우스의 전 조골세포 (MC3T3-E1, ATCC, USA)를 10% 태아 소 혈청 (Gibco) 및 1% 페니실린 / 스트렙토마이신 (Invitrogen)이 보충된 알파 최소 필수배지 (알파 MEM)에서 배양하였다.
세포 독성 테스트 및 세포 생존율
세포 독성 시험은 ISO 10093-5에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 1 x 104cells / well을 96-well 플레이트 (SPL Life Sciences)에서 보충 배지 100μL로 24 시간 배양하였다.
인산염으로 완충된 생리 식염수 (PBS, Gibco)로 세척한 후, 세포를 유지배지에서 추출물 또는 연속적으로 희석된 추출물로 별도로 24 시간 동안 공동 배양하였다.
제조업체(PERSON-EO50, Person Medical, 군포, 한국)의 지침에 따라 5시간 동안 에틸렌 옥사이드에 의해 멸균된 GIC 시편은, MC3T3-E1의 알파 MEM이 3 cm2/mL의 비율로 보충된 ihDPSC의 유지배지에서 추출되었다. 추출은 유지배지를 사용하여 ISO10993-12의 권고에 따라 37℃에서 24 시간 동안 진탕 배양기 (120rpm)에서 24 시간 수행하였다. 배양 배지에서 추출물의 최종 농도는 100%, 50%, 25%, 12.5% 및 6.25%이었고, 신선한 유지배지 및 보충된 알파 MEM을 대조군으로 사용하였다.　
세포 생존율을 MTS 분석법 (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였으며, 결과는 각 대조군과 비교하여 각 시험군의 광학 밀도 백분율로 표시하였다. 광학 밀도는 마이크로 플레이트 판독기 (SpectraMax M2e, Molecular Devices)를 사용하여 490 nm에서 측정하였다.
알리자린 레드 염색
ihDPSCs의 생체 미네랄화(biomineralization)를 연구하기 위해, 12-well 플레이트 내 부착용 유지배지에서 24시간 동안 배양한 세포 (105 /mL이 1.2mL)를 50μg/mL의 아스코르브산, 100nM의 덱사메타손, 및 10mM의 β- 글리세로 포스페이트를 포함하는 치아형성 분화배지(OM)를 이용하여 추가 분화시켰다. 비 세포독성 추출물 (100 %) + OM 또는 유지배지 (음성 대조군)의 최대 농도로 세포를 배양했다. 3 일마다 배지-추출물 혼합물을 바꾸었다. 14일째에, 성장된 세포를 10% 파라포름알데히드로 30 분간 고정시키고, 증류수로 헹구었다. 그 다음 세포를 40 mM 알리자린 레드 염색 (ARS) 용액 (pH 4.2)으로 30 분 동안 염색하였다. 염색하고 DW로 5 번 세척한 후, 광학 현미경 (Olympus lX71, Shinjuku, Tokyo, Japan)으로 이미지를 촬영하였다. 정량 분석은 10 mM 인산 나트륨 (pH 7.0) 중 10 % 세틸피리디늄 클로라이드 (Sigma Aldrich)로 탈색한 후에 수행하였다. ARS의 농도는 마이크로 플레이트 판독기 (SpectraMax M2e)에서 562 nm의 흡광도 측정에 근거하여 결정되었다. 방법론의 세부 사항은 다른 문헌(Lee J-H, Kang M-S, Mahapatra C, Kim H-W. Effect of aminated mesoporous bioactive glass nanoparticles on the differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One2016;11:e0150727.)에서 보고되었다. 모든 분석은 독립적으로 3회 수행되었으며 대표적인 평균값(±5) ± 표준편차(SD) 또는 이미지가 표시되었다.
이온 및 pH 검출
알려진 프로토콜(El-Fiqi A, Lee JH, Lee EJ, Kim HW. Collagen hydrogels incorporated with surface-aminated mesoporous nano bioactive glass: improvement of physicochemical stability and mechanical properties is effective for hard tissue engineering. Acta Biomater 2013;9:9508-21.)에 따라, 고주파유도결합형 플라즈마 발광분석법 (ICP-AES) (Optima 4300DV, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)을 이용하여 추출물로부터 칼슘(Ca), 규소(Si), 및 알루미늄(Al) 이온의 방출을 측정하였다. 검출 한계는 0.1ppm으로 결정되었다. OH 이온 방출을 평가하기 위해, 배양 배지를 사용하여 본래 추출물의 pH를 디지털 pH 미터(Orion 4 Star, Thermo Scientific Pierce, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 배양액의 pH는 제조업체의 프로토콜에 따라 보정을 수행한 후 블랭크 대조군(7.6 ± 0.1)으로 측정하였다. F 이온은 표준 F 이온 용액 (2, 10, 20, 50 ppm)을 사용하여 보정을 수행한 후, 디지털 F 이온 선택 전극 (HI 4222, HANNA, Woonsocket, RI, USA)으로 측정 하였다. 각 샘플에서 3 회 측정 (n = 3)을 수행했으며, 모든 분석은 재현성을 확인하기 위해 3 회 반복하여 수행되었다. 대표 평균값 (n = 3) ± 표준 편차를 기록하였다.
(2) 결과
세포 생존율은 MTS 분석에 의해 평가되었으며 도 6에 나타내었다. 이 연구에서 ihDPSCs에 대한 독성 효과가 GIC에 첨가된 BGN 또는 키토산에 대해 결정되었다. 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 % 및 6.25 % 추출 배양에서 세포 생존율은 약 100 % 였고 모든 군간에 유의한 차이가 없었다 (p> 0.05). MC3T3-E1와 함께인 경우, 모든 그룹에서 유의한 차이가 없었으며 (p> 0.05), 약 100 % 세포 생존률을 보였다.
ARS 염색에 의한 ihDPSC의 생체 미네랄화 결과로, 도 7A는 BG5 + CL0.5와 BG5에서 광물화된 결절(적색 점)이 음성 대조군 (MM)와 양성 대조군(DM) 보다 더 많음을 보여주었다. 탈 염색에 의해 정량화하였다 (도 7B). 생체 미네랄 효과의 순위는 BG5 + CL0.5와 BG5> C> DM 및 CL0.5> MM (p <0.05)이었다.
대조군, BG5, 및 BG5 + CL0.5의 추출물의 pH는 7.8 (± 0.1)으로 이는 블랭크 용액으로 사용된 유지배지의 pH(7.6 ± 0.1)보다 높았다 (p <0.05). 그러나 CL0.5 (7.4 ± 0.1) 추출물의 pH는 다른 것의 pH보다 유의적으로 낮았다 (p <0.05).
Ca 이온 방출량은 CL0.5 (22.1 ± 0.8)에서 가장 낮았고, 대조군 (43.0 ± 2.3) <BG5 + CL0.5 (45.1 ± 1.2) <BG5 (49.1 ± 2.1)의 순서로 올라갔다(p <0.05).
대조적으로, 방출된 Si 및 Al 이온은 CL0.5에서 각각 7.4 ± 0.8 및 1.9 ± 0.2으로, 대조군 (2.7 ± 0.3 및 0.5 ± 0.1), BG5 (2.8 ± 0.3 및 0.5 ± 0.2) 0.1), 및 BG5 + CL0.5 (2.9 ± 0.2 및 0.5 ± 0.1)보다 상당히 증가되었다 (p <0.05).
방출된 F 이온의 농도는 CL0.5 (7.0 ± 0.5) <대조군 (8.7 ± 0.6) <CL0.5 + BG5 (9.8 ± 0.5) <BG5 (12.3 ± 1.2)의 순서로 증가하였다 (p <0.05).
※ 통계
모든 데이터는 독립된 실험 후에 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 이미지는 최소한 3 배로 독립적 인 실험 세트를 대표한다. 통계 분석은 정상성을 확인하기 위해 Shapiro-Wilk 검사를 수행 한 후 편차 분석 (ANOVA)과 0.05의 유의 수준으로 Tukey 사후 검사를 사용하여 수행되었다
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및
    폴리산을 포함하는 액상;
    을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물로서,
    상기 액상에 SiO2 및 CaO를 포함하는 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것으로,
    상기 생체활성 유리나노입자의 크기는 1 내지 200 nm의 평균 입경을 가지는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액상은 키토산을 추가로 포함하는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생체활성 유리나노입자는 75 내지 95 중량비의 SiO2 및 5 내지 25 중량비의 CaO를 포함하는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서, 상기 키토산은 상기 액상에 대해 0.1 내지 1 중량%으로 함유되는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체활성 유리나노입자는 상기 액상에 대해 3 내지 7 중량%으로 첨가되는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 산 반응성 무기 충전제는 염기성 금속 산화물, 금속 수산화물, 알루미노실리케이트 유리, 플루오로알루미노실리케이트 유리, Si/Al 중량% 비가 1.5 미만인 유리 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리산은 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산, 말레산, 글루타콘산, 아코니트산, 시트라콘산, 메사콘산, 푸마르산, 티글산의 단일중합체 및 공중합체, 말레산과 에틸렌의 공중합체 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분말 및 상기 액상은 3:1 내지 1:1의 중량 비율인 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 액상은 타르타르산, 시트르산, 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산 (EDTA), 살리실산, 멜리트산, 다이하이드록시 타르타르산, 니트릴로트라이아세트산 (NTA), 2,4 및 2,6 다이하이드록시벤조산, 포스포노 카르복실산, 포스포노 석신산 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 착화제를 포함하는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물.
  11. 폴리산을 포함하는 액상에 SiO2 및 CaO를 포함하는 생체활성 유리나노입자 분말을 첨가하며 교반하여 균질화된 액상을 제공하는 단계; 및
    상기 균질화된 액상에 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말을 혼합하는 단계를 포함하는,
    치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물의 제조방법으로,
    상기 생체활성 유리나노입자의 크기는 1 내지 200 nm의 평균 입경을 가지는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    1) PEG 또는 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide: (C16H33)N(CH3)3]Br)를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
    2) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
    3) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및
    4) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계;
    를 포함하는 상기 생체활성 유리나노입자 분말을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 치과용 유리 이오노머 시멘트 조성물이 경화된 치과용 유리 이오노머 시멘트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 치과용 유리 이오노머 시멘트는 유리 이오노머 시멘트 조성물을 경화한 후 분리된 체액 또는 유사 체액에 침지하여 제조된 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트.
  15. 삭제
  16. 산 반응성 무기 충전제를 포함하는 분말; 및
    폴리산을 포함하는 액상;을 포함하는, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트로서, 상기 액상에 SiO2 및 CaO를 포함하는 생체활성 유리나노입자가 첨가된 것으로,
    상기 생체활성 유리나노입자의 크기는 1 내지 200 nm의 평균 입경을 가지는 것인, 치과용 유리 이오노머 시멘트 제조용 키트.
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