KR102035802B1 - PGRP2 protein from rock bream and uses thereof - Google Patents

PGRP2 protein from rock bream and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
KR102035802B1
KR102035802B1 KR1020180125757A KR20180125757A KR102035802B1 KR 102035802 B1 KR102035802 B1 KR 102035802B1 KR 1020180125757 A KR1020180125757 A KR 1020180125757A KR 20180125757 A KR20180125757 A KR 20180125757A KR 102035802 B1 KR102035802 B1 KR 102035802B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
ofpgrp2
pgrp2
fish
leu
Prior art date
Application number
KR1020180125757A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
박찬일
최광민
Original Assignee
경상대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020180125757A priority Critical patent/KR102035802B1/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102035802B1 publication Critical patent/KR102035802B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The present invention relates to Oplegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2 (OfPGRP2) derived from Olegnathus fasciatus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and uses thereof. The OfPGRP2 protein of the present invention may be useful as an antibiotic replacement material for fish, or as a feed additive for farmed fish.

Description

돌돔 유래 PGRP2 단백질 및 이의 용도{PGRP2 protein from rock bream and uses thereof}PGRP2 protein from rock bream and uses thereof

본 발명은 돌돔 유래 PGRP2(peptidoglycan recognition protein 2) 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to peptidoglycan recognition protein 2 (PGRP2) protein and its use.

농어목(Perciformes) 돌돔과(Oplegnathidae)에 속하는 돌돔(rock bream, 학명 Oplegnathus fasciatus)은 태평양과 인도양 등지에 광범위하게 분포하며, 우리나라에서는 주로 남부이남 해역에 분포하는 경제적으로 중요한 양식대상어종으로 여겨지고 있지만, 어류의 양식이 발전함에 따라 이리도바이러스(iridovirus)에 의한 바이러스성 질병 등 많은 전염성 질병이 동반되어 왔으며, 여러 가지 제한적인 양식환경에 의한 스트레스 요인으로 인해 질병의 발생빈도가 높아져 돌돔 양식 산업에 있어서 막대한 경제적 피해를 입히고 있다.Rock bream ( Oleggtusus fasciatus ) belonging to the perciformes Oplegnathidae is widely distributed in the Pacific Ocean and the Indian Ocean, and is considered to be an economically important species of fish mainly in the southern sub-regions. As fish farming has developed, many infectious diseases such as viral diseases caused by iridovirus have been accompanied, and the incidence of disease is increased due to stress factors caused by various limited aquaculture environments, which is enormous in the sea bream farming industry. It is causing economic damage.

경골어류(teleosts)에 있어서, 후천면역 시스템은 선천면역 시스템(innate immunity)만큼 잘 발달되어 있지 않은데, 이는 어류에 있어서 병원체에 대항하기 위해 선천면역 시스템이 중요함을 의미한다. 항균 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)는 기존의 항생제에 저항성을 가지는 균주의 문제를 완화할 수 있는 새로운 항생제 대체물질로 기대되고 있는데, 이는 항균 펩티드가 기회감염균(opportunistic pathogen)으로부터 어류를 보호하는데 있어서 중요한 역할을 하며 선천면역에서 강력한 무기로 작용하기 때문이다.In tibial fish, acquired immune systems are not as well developed as innate immunity, which means that innate fish are important to fight pathogens. Antimicrobial peptides (AMPs) are expected to be new antibiotic replacements that can alleviate the problem of strains resistant to conventional antibiotics, which are important for protecting fish from opportunistic pathogens. It acts as a powerful weapon in innate immunity.

펩티도글리칸 인식 단백질(peptidoglycan recognition protein, PGRP)은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR) 패밀리에 속하며, 병원체의 인식 및 제거를 매개하여 선천면역 반응 동안에 중요한 역할을 한다. 또한, PGRP는 박테리아에 결합하여 염증 매개자, 식균작용 및 Toll 신호전달 경로 유도와 같은 다양한 생물학적 과정에도 중요한 역할을 한다.Peptidoglycan recognition protein (PGRP) belongs to the pattern recognition receptor (PRR) family and plays an important role during innate immune responses by mediating the recognition and elimination of pathogens. PGRP also binds to bacteria and plays an important role in a variety of biological processes, such as inflammatory mediators, phagocytosis and Toll signaling pathways.

PGRP2(peptidoglycan recognition protein 2; 또는 PGRP-L, PGLYRP2, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase) 단백질은 Zn2+-의존적 펩티다제(peptidase)로, 펩티도글리칸 내의 N-acetylmuramoyl 잔기와 L-알라닌 잔기 사이의 연결을 가수분해한다. 포유류에서, PGRP2는 간에서 항시 생성되고 혈액 내로 분비된다. 사람 호중성 및 호산성(eosinophilic) 과립구는 NAMLAA(N-acetylmuramoyl-L-alanine)를 포함하고 있으나, 단핵백혈구는 그렇지 않은 것으로 보고되었다. PGRP2의 혈장 내 수준은 패혈성의 환자와 비감염 환자 사이를 구별할 수 있는 바이오마커로 보고되었다. 대장균에서, 아미다제(amidase)는 딸세포와 공유되고 있는 격막(septum)을 분리하는 작용을 한다. 또한, 비브리오 앵길라룸(Vibrio anguillarum)에서 PGRP2 유전자의 불활성화는 산화 스트레스 및 유기산에 대한 감수성을 증가시키는 결과를 야기하였다. 그래서, 아미다제의 활성은 병원체와 숙주의 생존에 중요하게 관여한다. 현재까지, 부세(Pseudosciaena crocea), 홍민어(Sciaenops ocellatus), 터봇(Scophthalmus maximus L.)을 포함하는 많은 어류 종에서 PGRP2가 확인되었으나, 어류 내에서 PGRP2의 기능은 거의 알려진 바가 없다.PGRP2 (peptidoglycan recognition protein 2; or PGRP-L, PGLYRP2, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase) proteins are Zn 2+ -dependent peptidases, N-acetylmuramoyl residues in the peptidoglycan and L- Hydrolyze the link between alanine residues. In mammals, PGRP2 is always produced in the liver and secreted into the blood. Human neutrophil and eosinophilic granulocytes contain NAMLAA (N-acetylmuramoyl-L-alanine), but monocytes have not been reported. Plasma levels of PGRP2 have been reported as biomarkers that can distinguish between septic and non-infected patients. In E. coli, amidase functions to separate the septum that is shared with daughter cells. Inactivation of the PGRP2 gene in Vibrio anguillarum also resulted in increased oxidative stress and susceptibility to organic acids. Thus, the activity of amidase is critically involved in the survival of pathogens and hosts. To date, PGRP2 has been identified in many fish species, including Pseudosciaena crocea , redfish ( Sciaenops ocellatus ) and turbot ( Scophthalmus maximus L.), but little is known about the function of PGRP2 in fish.

한편, 한국등록특허 제1016689호에는 갈색저거리 유래 PGRP에 관한 '펩티드글리칸 인식 신호 전달에 관여하는 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1486236호에는 돌돔 유래 TRx(Thioredoxin) 1 단백질에 관한 '돌돔 유래의 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 백신 보조제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 돌돔 유래 PGRP2단백질 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 1016689 discloses a protein involved in the transmission of peptide glycan recognition signal, gene encoding the same, and a bacterial infection detection kit comprising the same for the brown low-distance PGRP, and Korea Patent Registration No. 1486236 discloses a 'Vaccine adjuvant for fish containing a protein derived from Dol-Dome as an active ingredient' regarding Dol-Dome-derived TRx (Thioredoxin) 1 protein. .

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 돌돔으로부터 PGRP2(peptidoglycan recognition protein 2) 유전자의 cDNA 염기서열을 획득하여 염기서열을 기반으로 재조합단백질을 제작하였다. 또한, 돌돔양식에서 주요 질병의 원인이 되는 병원체의 감염에 따른 상기 PGRP2의 발현 양상을 분석한 결과, 병원체 감염에 따라 PGRP2의 발현이 유의적으로 상향 조절되는 것을 확인할 수 있었고, 재조합단백질을 이용해 병원체균에 대한 PGRP2의 결합(binding) 활성을 확인하였으며, 재조합 PGRP2 단백질이 병원체균의 성장을 억제시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived by the above-mentioned requirements, and the present inventors obtained the cDNA nucleotide sequence of the peptidoglycan recognition protein 2 ( PGRP2 ) gene from the sea bream to produce a recombinant protein based on the nucleotide sequence. In addition, as a result of analyzing the expression pattern of the PGRP2 according to the infection of the pathogen causing the major disease in the sea bream culture , it was confirmed that the expression of PGRP2 is significantly upregulated according to the pathogen infection, the pathogens using recombinant protein The binding activity of PGRP2 to bacteria was confirmed, and the present invention was completed by confirming that recombinant PGRP2 protein inhibits the growth of pathogens.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 유래의 OfPGRP2(Oplegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a protein of OfPGRP2 ( Oplegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) derived from Oplegnathus fasciatus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

또한, 본 발명은 상기 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the OfPGRP2 protein.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 OfPGRP2 단백질의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 OfPGRP2 단백질을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing OfPGRP2 protein and OfPGRP2 protein produced by the method comprising the step of transforming the host cell with the recombinant vector overexpressing the gene encoding OfPGRP2 protein.

또한, 본 발명은 OfPGRP2 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 항균 조성물 또는 어류용 사료첨가제를 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition or fish feed additive for fish containing OfPGRP2 protein as an active ingredient.

본 발명에서는 돌돔 유래 OfPGRP2 단백질의 주요 어류 질병 병원체에 대한 면역학적 기능을 확인할 수 있었다. 따라서 OfPGRP2 단백질을 어류용 항생제 대체 물질로 사용하거나, 양식 어류에 대한 사료첨가제 등으로 유용하게 활용할 수 있을 것이다.In the present invention, the immunological function of major fish disease pathogens of Doldom-derived OfPGRP2 protein was confirmed. Therefore, OfPGRP2 protein may be used as an antibiotic substitute for fish or as a feed additive for aquaculture fish.

도 1은 돌돔(rock bream) 유래 PGRP2와 다른 종의 PGRP2 단백질의 아미노산 서열을 비교분석한 결과이다. Turbot(ANO39625); 넙치, red drum(ACJ13032); 홍민어, rainbow trout(AGF29404); 무지개송어, olive flounder(GF29407); 넙치, grass carp(ADD23340); 초어, zebrafish(DQ447202); 제브라피쉬, frog(XP_012809166); 개구리, human(AAI44239); 인간, 검정색 박스; 100% 일치, 회색 박스; 75% 유사성.
도 2는 돌돔(rock bream) 유래 PGRP2의 계통수 분석 결과이다.
도 3은 건강한 돌돔 어체의 다양한 조직 및 기관에서 PGRP2 유전자의 발현수준을 RT-qPCR로 확인한 결과이다.
도 4는 에드워드시엘라 피스시시다(Edwardsiella piscicida), 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) 또는 참돔 이리도바이러스(red seabream virus)로 감염시킨 돌돔의 신장(kidney), 비장(spleen), 아가미(gill), 간(liver) 조직에서 PGRP2 유전자의 발현 수준을 시간별로 분석한 결과이다. *, p<0.05, **, p<0.01.
도 5는 돌돔 유래 PGRP2의 스트렙토코커스 이니애(S. iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis) 또는 에드워드시엘라 피스시시다(E. piscicida)에 대한 재조합 PGRP2 단백질의 결합 활성을 확인한 결과로, (A)는 아연이온(Zn2+) 존재 조건이며, (B)는 아연이온이 없는 조건의 결과이다.
도 6은 재조합 PGRP2 단백질의 스트렙토코커스 이니애(S. iniae, A) 및 에드워드시엘라 피스시시다(E. piscicida, B)에 대한 항균 활성을 확인한 결과이다. *, p<0.05, **, p<0.01.1 is a result of comparing and analyzing the amino acid sequence of PGRP2 protein of rock bream derived PGRP2 and other species. Turbot (ANO39625); Olive flounder, red drum (ACJ13032); Redfish, rainbow trout (AGF29404); Rainbow trout, olive flounder (GF29407); Olive flounder, grass carp (ADD23340); Choir, zebrafish (DQ447202); Zebrafish, frog (XP_012809166); Frog, human (AAI44239); Human, black box; 100% match, gray box; 75% similarity.
2 is a phylogenetic analysis of PGRP2 derived from rock bream.
Figure 3 shows the results confirmed by RT-qPCR expression level of PGRP2 gene in various tissues and organs of healthy sea bream .
FIG. 4 shows kidney, spleen and gill of sea bream infected with Edwardsiella piscicida , Streptococcus iniae or red seabream virus. This is the result of analyzing the expression level of PGRP2 gene in liver tissue. *, p < 0.05, **, p <0.01.
5 shows the results of confirming the binding activity of recombinant PGRP2 protein against S. iniae , Streptococcus parauberis or S. parauberis or E. piscicida of PGRP2 derived from sea bream . (A) is a zinc ion (Zn 2+ ) presence condition, (B) is a result of the condition that there is no zinc ion.
Figure 6 shows the results of confirming the antimicrobial activity of Streptococcus inae ( S. iniae, A) and Edward C. piscicida ( B) of the recombinant PGRP2 protein. *, p < 0.05, **, p <0.01.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 유래의 OfPGRP2(Oplegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) 단백질을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a protein OfPGRP2 (Olegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) derived from Oplegnathus fasciatus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명에 따른 돌돔 유래 OfPGRP2 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 어류에 감염되는 병원체균에 대한 항균 활성을 의미한다.The range of dolmen-derived OfPGRP2 protein according to the present invention includes a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein. "Functional equivalent" means at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 60% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution or deletion of the amino acid Refers to a protein having a sequence homology of 90% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. "Substantially homogeneous physiological activity" means antimicrobial activity against pathogens infected with fish.

본 발명은 또한, 상기 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the OfPGRP2 protein.

본 발명의 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. The gene encoding OfPGRP2 protein of the present invention may comprise a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene encoding the OfPGRP2 protein is at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include a base sequence having a. The "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).

본 발명은 또한, 상기 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene encoding the OfPGRP2 protein.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.The term “vector” is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector". The term “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. In principle, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host. An important feature of the expression vector is that it has a origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element. Enhancers, ribosomal binding sites, termination signals, polyadenylation signals and promoters available in eukaryotic cells are known in the art. The expression vector can be constructed by methods well known in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, in vivo recombinant techniques, and the like. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include ribosomal binding moieties and transcription terminators as translation initiation sites.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파지(λ)의 좌향 프로모터(pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter (for example, a pLλ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.) capable of promoting transcription, It is common to include ribosomal binding sites and transcription / detox termination sequences for initiation of translation. When E. coli is used as a host cell, a promoter and an operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway, and a phage left promoter (pLλ promoter) can be used as regulatory sites.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, etc.) often used in the art, phage (e.g., λgt4.λB , λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (eg SV40, etc.). On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the mammalian cell genome (eg metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.Vectors of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as optional markers, for example ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(E. coli) JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X1776, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.The host cell capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may use any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, Bacillus strains, such as E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis , Bacillus thuringiensis , Salmonella typhimurium , Serratia marcescens , and Enterobacteria and strains such as various Pseudomonas species.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.In addition, when transforming a vector of the present invention into eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) as host cells. , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells and the like can be used.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973) when the host cell is a prokaryotic cell). ), Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation method (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection method (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)), Electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)), DEAE- Dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)) and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) The vector can be injected into the host cell by, for example.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 OfPGRP2 단백질의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 OfPGRP2 단백질을 제공한다.The present invention also provides a method for producing OfPGRP2 protein and OfPGRP2 protein produced by the method comprising the step of transforming the host cell with the recombinant vector overexpressing the gene encoding OfPGRP2 protein.

본 발명의 단백질을 생산하는 방법은 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소, 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.The method of producing a protein of the present invention may be to culture the host cell (transformer) transformed with the recombinant vector in a medium suitable for the production of the recombinant protein using a known technique. For example, the cells can be cultured by small or large scale fermentation, shake flask culture in a laboratory or industrial fermentor conducted under conditions that allow for the expression and / or isolation of suitable media and proteins. Cultivation takes place in a suitable medium containing carbon, nitrogen sources and inorganic salts using known techniques. Suitable media can be obtained commercially or according to the components and compositional ratios described in publications such as, for example, the catalog of the American Type Culture Collection (ATCC).

상기 생산방법에서는 발현된 단백질을 당업계에 공지된 단백질 분리방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 영양배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.In the production method, the expressed protein can be recovered by using a protein separation method known in the art. For example, proteins may be separated from nutrient media by conventional methods, including but not limited to centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation. Further, the protein may be purified through a variety of known methods, including chromatography (e.g. ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion), electrophoresis, fractional solubility (e.g. ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE or extraction. It can be purified.

본 발명의 상기 OfPGRP2 단백질은 아연(zinc) 이온 존재하에서 그람 양성균 또는 그람 음성균에 결합할 수 있으며, 상기 그람 양성균 또는 그람 음성균의 성장을 저해시키는 활성이 있는 단백질이다.The OfPGRP2 protein of the present invention can bind to Gram-positive bacteria or Gram-negative bacteria in the presence of zinc ions, and is an active protein that inhibits the growth of the Gram-positive or Gram-negative bacteria.

본 발명은 또한, OfPGRP2 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 항균 조성물 및 어류용 사료첨가제를 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition for fish and a feed additive for fish containing OfPGRP2 protein as an active ingredient.

본 발명에 따른 어류용 항균 조성물은 추가로 아연 이온을 함유할 수 있으나, 이에 제한도지 않는다.The antimicrobial composition for fish according to the present invention may further contain zinc ions, but is not limited thereto.

용어 "항균(antimicrobial)"은, 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미하며, 바람직하게는 항세균(anti-bacterial)을 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있고, 바람직하게는 상기 그람 양성균은 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae)이고, 그람 음성균은 에드워드시엘라 피스시시다(Edwardsiella piscicida)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "antimicrobial" means the ability to reduce, prevent, inhibit, or eliminate the growth or survival of microorganisms at certain concentrations, and may preferably mean anti-bacterial. The bacteria of the present invention may be Gram-positive bacteria or Gram-negative bacteria, preferably the Gram-positive bacteria may be Streptococcus iniae , and the Gram-negative bacteria may be Edwardsiella piscicida , but It is not limited.

본 발명의 사료첨가제는 바람직하게는 면역증강용이며, 어류용 사료첨가제로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The feed additive of the present invention is preferably for immune boosting and may be used as a feed additive for fish, but is not limited thereto.

본 발명의 사료첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.Feed additives of the present invention include adjuvant components such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antibacterial substances, antioxidants, antifungal enzymes, microbial preparations of other types of live bacteria; Grains such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feed, such as rape, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Dry ingredients consisting of sugars and dairy products such as various powdered milk and whey powders; Main components such as lipids, for example animal fats and vegetable fats, optionally liquefied by heating; Additives such as nutritional supplements, digestive and absorption enhancers, growth promoters, and disease preventive agents may further be included.

본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Feed additives of the present invention may be in the form of powder or liquid formulations, and may include excipients for feed addition. Excipients for feed addition may include, for example, calcium carbonate, powder, zeolite, jade powder or rice bran, but is not limited thereto.

본 발명의 사료첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해 효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.The feed additive of the present invention may further comprise one or more enzyme preparations. For example, alpha-1,4-glycosidic bonds (α-1), which are contained in lipolytic enzymes such as lipases, phytases that break down phytic acid to form phosphates and inositol phosphates, and starch and glycogen. Amylase, an enzyme that hydrolyzes and 4-glycoside bonds, phosphatase, an enzyme that hydrolyzes organic phosphate esters, maltase that hydrolyzes maltose into two molecules of glucose, and glucose to fructose by hydrolysis of saccharose Conversion enzymes to make a toss mixture, and the like.

본 발명의 사료첨가제는 어류에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.Feed additives of the present invention can be administered to fish alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. Typically, a single daily intake or divided daily intake may be used, as is well known in the art.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and methods

1. 서열 정렬 및 계통학적 분석1. Sequence alignment and phylogenetic analysis

돌돔 유래 PGRP2 서열을 포함하는 ORF(open reading frame)는 돌돔 창자(intestine) 시료의 NGS(next generation sequencing) 분석을 통해 획득하였고, Sanger 시퀀싱으로 서열을 검증하였다. BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 사용하여 공지된 다른 염기 서열과의 유사성을 조사하였고, 아미노산 서열을 예측하였다. 아미노산 도메인은 SMART 툴(http://smart.embl-heidelberg.de/)을 사용하여 조사하였으며, DNAMAN 프로그램 버전 10(Lynnon Biosoft, Canada)을 다중 서열 정렬을 위해 사용하였다. 계통발생학적 위치를 확인하기 위해 MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 버전 6.0으로 neighbour-joining method을 사용하여 계통수를 제작하였으며, bootstrap 샘플링은 2,000번 반복 수행하였다.An open reading frame (ORF) containing PGRP2 sequence derived from dolme was obtained through next generation sequencing (NGS) analysis of dorme intestine samples, and the sequence was verified by Sanger sequencing. Similarity with other known base sequences was investigated using the BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) and amino acid sequences were predicted. Amino acid domains were investigated using the SMART tool (http://smart.embl-heidelberg.de/) and DNAMAN program version 10 (Lynnon Biosoft, Canada) was used for multiple sequence alignment. To identify the phylogenetic location, phylogenetic tree was prepared using the neighbor-joining method with MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 6.0, and bootstrap sampling was repeated 2,000 times.

2. 실시간 정량적 PCR 분석(Real-time quantitative PCR analysis)2. Real-time quantitative PCR analysis

2.1 실험 어류 및 병원균 인위감염2.1 Experimental Fish and Pathogen Artificial Infection

건강한 돌돔(무게: 140.4±39.7 g, 길이: 19.0±1.8 cm)은 통영의 지역 시장으로부터 구매하였으며, 실험이 종료될 때까지 20~22℃의 통기 조건의 바닷물에서 사육하였다.Healthy sea bream (weight: 140.4 ± 39.7 g, length: 19.0 ± 1.8 cm) was purchased from Tongyeong's local market and was bred in aerated seawater at 20-22 ° C until the end of the experiment.

병원균 인위감염 실험은 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5228 (3×106 세포/어체), 에드워드시엘라 피스시시다(Edwardsiella piscicida) FSW910410 (2×106 세포/어체) 또는 참돔 이리도바이러스(red seabream virus, RSIV) (1.04×104 copies/어체)를 건강한 돌돔의 복강 내로 주사하여 감염시켰으며, 실험 기간 동안 23±1℃의 바닷물에서 사육하였다. 스트렙토코커스 이니애 FP5228와 에드워드시엘라 피스시시다 FSW910410은 국립수산과학원으로부터 분양받았으며, 이리도바이러스는 감염된 어체로부터 분리하여 사용하였다.Pathogen-borne infection experiments include Streptococcus iniae FP5228 (3 × 10 6 cells / fish), Edwardsiella piscicida FSW910410 (2 × 10 6 cells / fish) or red snapper iridovirus (red) seabream virus (RSIV) (1.04 × 10 4 copies / fish) was injected by intraperitoneal injection of healthy sea bream and was bred in seawater at 23 ± 1 ° C. during the experiment. Streptococcus Inea FP5228 and Edward Ciella Piscisida FSW910410 were distributed from the National Fisheries Research and Development Institute. Iriviruses were isolated from infected fish bodies.

2.2 건강한 돌돔 어체의 각 조직별 2.2 Each Organization of Healthy Sea Breed Fish PGRP2PGRP2 유전자 발현 수준 분석 Gene expression level analysis

돌돔 유래 PGRP2 유전자(이하, OfPGRP2)의 발현 수준을 평가하기 위해, 3마리의 건강한 돌돔으로부터 몸통 신장(trunk kidney), 전신(head kidney), 아가미(gill), 비장(spleen), 심장(heart), 간(liver), 뇌(brain), 위(stomach), 창자(intestine), 피부(skin), 근육(muscle) 및 전혈(whole blood)을 분리하였고, 53% 퍼콜(Sigma-Aldrich, 미국)을 이용한 밀도-구배 원심분리를 통해 전혈로부터 말초혈액 림프구(peripheral blood leukocyte, PBL)를 분리하였다. 분리한 모든 조직은 총 RNA 추출 전까지 -80℃에 보관하였다. 총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 추출하였으며, 총 RNA 시료에는 게노믹 DNA 오염을 막기 위해 DNase I(Takara, 일본)을 처리하였다. 추출한 총 RNA 시료의 농도와 순도는 NanoVue 분광광도계(GE Healthcare, 영국)를 사용하여 측정하였다. cDNA 합성은 PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis 키트(TaKaRa)를 이용하여 수행하였으며, 각 조직별 PGRP2 유전자의 발현 경향은 정량적 실시간 PCR을 통해 분석하였다. EF-1α(elongation factor 1 alpha)는 OfPGRP2 유전자의 상대적인 발현양을 결정하기 위한 대조유전자로 사용하였다. 각 프라이머 세트의 정보는 하기 표 1과 같다. 상대적인 mRNA 발현 수준은 상대적인 Ct(2-△△CT) 방법으로 계산하였으며, EF-1α로 표준화하였다.To assess the expression level of PGRP2 gene derived from sea bream (OfPGRP2), trunk kidney, head kidney, gill, spleen and heart from three healthy sea bream , Liver, brain, stomach, intestine, skin, muscle and whole blood, and 53% Percol (Sigma-Aldrich, USA) Peripheral blood leukocytes (PBLs) were isolated from whole blood by density-gradient centrifugation. All tissues isolated were stored at -80 ° C until total RNA extraction. Total RNA was extracted using TRIzol reagent (Invitrogen, USA), and total RNA samples were treated with DNase I (Takara, Japan) to prevent genomic DNA contamination. The concentration and purity of the extracted total RNA samples were measured using a NanoVue spectrophotometer (GE Healthcare, UK). cDNA synthesis was performed using PrimeScript ™ 1st strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa), and the expression trend of PGRP2 gene for each tissue was analyzed by quantitative real-time PCR. EF-1α (elongation factor 1 alpha) was used as a control gene to determine the relative expression of OfPGRP2 gene. Information on each primer set is shown in Table 1 below. Relative mRNA expression levels were calculated by the relative Ct (2 −ΔΔCT ) method and normalized to EF-1α.

본 발명에 사용된 PCR 프라이머 정보PCR primer information used in the present invention 용도Usage 프라이머명Primer Name 염기서열(5'→3')Sequence (5 '→ 3') RT-qPCR (control)RT-qPCR (control) EF-1α (F)EF-1α (F) CCCCTGCAGGACGTCTACAA (서열번호 3)CCCCTGCAGGACGTCTACAA (SEQ ID NO: 3) EF-1α (R)EF-1α (R) AACACGACCGACGGGTACA (서열번호 4)AACACGACCGACGGGTACA (SEQ ID NO: 4) RT-qPCRRT-qPCR OfPGRP2 (F)OfPGRP2 (F) CTCCTCAGGTCTTCACCCTC (서열번호 5)CTCCTCAGGTCTTCACCCTC (SEQ ID NO: 5) OfPGRP2 (R)OfPGRP2 (R) GAGACCTCCATCCCTAGAAC (서열번호 6)GAGACCTCCATCCCTAGAAC (SEQ ID NO: 6) 재조합 단백질Recombinant protein rOfPGRP2 (F)rOfPGRP2 (F) CTGTTCCACTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC (서열번호 7)CTGTTCCAC TCTAGA AATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC (SEQ ID NO: 7) rOfPGRP2 (R)rOfPGRP2 (R) GATAAGGCTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACGTTTAACCTCACCGAAAT (서열번호 8)GATAAGGC TCTCGAG TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACGTTTAACCTCACCGAAAT (SEQ ID NO: 8)

2.3 병원균 감염 후 발현 수준 분석2.3 Expression level analysis after pathogen infection

OfPGRP2 유전자의 병원균 감염 후 발현 수준은 면역 관련 조직인 신장, 아가미, 간 및 비장을 대상으로 감염 후 1, 3, 6, 12, 24, 36 및 48 시간째에 측정하였다. 대조군은 동량의 PBS 완충용액을 주입한 어체를 이용하였다.Expression levels of the pathogen of infection of OfPGRP2 were measured at 1, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 hours after infection in the immune tissues of kidney, gill, liver and spleen. As a control, a fish body injected with the same amount of PBS buffer solution was used.

3. 재조합 OfPGRP2 단백질의 발현 및 정제3. Expression and Purification of Recombinant OfPGRP2 Protein

돌돔 유래 OfPGRP2 단백질의 ORF는 프라이머 세트를 이용하여(표 1 참고) 증폭시켰다. PCR 산물을 XbaI과 XhoI 제한효소로 자른 후, pET-22b (+) 벡터(Novagen, 독일)로 클로닝하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하고, 암피실린을 포함하고 있는 LB(Luria Bertani) 배지에서 25℃, 150rpm의 조건으로 배양한 후, IPTG(Isopropyl-β-Dthiogalactoside)를 최종 농도 0.5mM이 되도록 넣고 단백질 발현을 유도하였다. 배양이 끝난 세포를 원심분리를 통해 수득하고, 수득된 세포를 변성 버퍼(50mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, 5mM EDTA 및 2M Urea, pH 8.0)에 재현탁시킨 후, 30분간 초음파분쇄시켰다. 상기 초음파분쇄물을 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 Ni-NTA 레진(Qiagen, 독일)에 로딩하였다. 재조합 단백질의 용출을 위해, 상기 컬럼을 평형화 버퍼(50mM Tris-HCl, 0.2M NaCl 및 10% glycerol, pH 7.4)로 세척한 후, 용출 버퍼(평형화 버퍼에 0.5M 이미다졸 첨가)를 사용하여 정제하였다. 용출된 단백질은 17% SDS-PAGE로 전개하고, 쿠마시에 브릴리언트 블루 R-250으로 겔을 염색하여 확인하였다. 확인 결과, 재조합 OfPGRP2 단백질의 크기는 52.9 kDa으로 확인되었다.The ORF of Doldom's OfPGRP2 protein was amplified using a primer set (see Table 1). PCR products were cut with Xba I and Xho I restriction enzymes and cloned into pET-22b (+) vector (Novagen, Germany). The recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain, cultured in LB (Luria Bertani) medium containing ampicillin at 25 ° C. and 150 rpm, and then IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactoside) was added at a final concentration of 0.5 mM was added and protein expression was induced. The cultured cells were obtained by centrifugation, and the obtained cells were resuspended in denatured buffer (50 mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, 5 mM EDTA and 2M Urea, pH 8.0), and then sonicated for 30 minutes. After centrifugation of the sonicates, the supernatant was recovered and loaded into Ni-NTA resin (Qiagen, Germany). For elution of the recombinant protein, the column was washed with equilibration buffer (50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl and 10% glycerol, pH 7.4) and then purified using elution buffer (0.5 M imidazole added to equilibration buffer). It was. The eluted protein was developed by 17% SDS-PAGE and confirmed by staining the gel with Brilliant Blue R-250 in Coomassie. As a result, the size of the recombinant OfPGRP2 protein was 52.9 kDa.

4. 박테리아 결합(binding) 활성 실험4. Bacterial binding activity experiment

박테리아에 대한 결합 활성 실험은 잘 알려진 병원균인 스트렙토코커스 이니애(S. iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis) PH0710과 에드워드시엘라 피스시시다(E. piscicida)를 사용하여 수행하였다. 각 병원균의 세포는 BHI(brain heart infusion) 배지에서 OD600 값이 0.8이 될 때까지 배양시킨 후, 회수하여 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 108 CFU/㎖이 되도록 중탄산염-탄산염 버퍼(bicarbonate-carbonate buffer)에 재현탁시켰다. ELISA 플레이트의 각 웰을 병원균으로 코팅시키고, 5% BSA(bovine serum albumin)/TBS(Tris-buffered saline)로 22℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 그 후, 플레이트를 TBST(TBS with 0.05% Tween 20)로 3회 세척하고, 다른 농도의 재조합 OfPGRP2 단백질을 10μM ZnCl2 첨가 또는 무첨가 조건으로 처리하였다. 22℃에서 90분 반응시킨 후, Hig-tag 항체(1:1,000 in TBS)를 처리하고 22℃에서 1시간 반응시킨 다음, AP-conjugated 항-마우스 IgG(1:2,000 in TBS, Sigma-Aldrich, 미국)으로 1시간 반응시켰다. 반응 결과는 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase)를 첨가하여 405nm에서의 흡광도를 측정하여 계산하였다.Binding activity experiments on bacteria were carried out using the well-known pathogens S. iniae , S. parauberis PH0710, and Edward C. pirascicida . Cells of each pathogen were cultured in BHI (brain heart infusion) medium until the OD 600 value was 0.8, recovered, and washed three times with PBS. The washed cells were resuspended in bicarbonate-carbonate buffer to 10 8 CFU / mL. Each well of the ELISA plate was coated with pathogens and blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) / Tris-buffered saline (TBS) at 22 ° C. for 2 hours. Plates were then washed three times with TBST (TBS with 0.05% Tween 20) and different concentrations of recombinant OfPGRP2 protein were treated with 10 μM ZnCl 2 addition or no addition conditions. After reacting at 22 ° C. for 90 minutes, Hig-tag antibody (1: 1,000 in TBS) was treated and reacted at 22 ° C. for 1 hour, followed by AP-conjugated anti-mouse IgG (1: 2,000 in TBS, Sigma-Aldrich, 1 hour). The reaction result was calculated by measuring the absorbance at 405 nm by adding alkaline phosphatase.

5. 항균 활성 분석5. Antimicrobial Activity Assay

병원균인 스트렙토코커스 이니애(S. iniae)와 에드워드시엘라 피스시시다(E. piscicida)를 BHI 배지에 접종하고 OD600 값이 0.6에서 1.0이 되도록 27℃에서 배양한 후, 세포 농도가 104 CFU/㎖이 되도록 희석하였다. 희석한 배양액 100㎕를 96웰 플레이트의 각 웰에 넣어준 후, 50㎍/㎖의 재조합 OfPGRP2 단백질, 50㎍/㎖의 BSA 또는 PBS를 100㎕씩 첨가하였다. 이 때, 10μM ZnCl2의 첨가 또는 무첨가 조건으로 준비하였다. 27℃에서 1 또는 2시간 동안 반응시킨 후, 각 반응물의 분액(aliquot)을 BHI 고체배지에 플레이팅하였다. 세포 생존율은 BHI 고체배지 상의 CFU(colony forming unit)를 결정하여 평가하였다.Pathogen Streptococcus am Ke (S. iniae) and Edward when Ella piece when let (E. piscicida) to inoculate BHI medium and then incubated at 27 ℃ to 1.0 in the OD 600 value of 0.6, a concentration of 10 4 cells Dilute to CFU / mL. 100 μl of the diluted culture was placed in each well of a 96 well plate, and then 100 μl of 50 μg / ml of recombinant OfPGRP2 protein, 50 μg / ml of BSA or PBS was added. At this time, it was prepared under the condition of addition or no addition of 10 μM ZnCl 2 . After reacting at 27 ° C. for 1 or 2 hours, aliquots of each reactant were plated on BHI solid medium. Cell viability was assessed by determining the colony forming unit (CFU) on the BHI solid medium.

6. 통계처리6. Statistical Processing

모든 시료는 3반복으로 수행하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 결과값은 SPSS 프로그램 버전 19를 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법으로 평가하였다(*p<0.05, **p<0.01).All samples were performed in three replicates and the results are expressed as mean ± standard deviation. The results were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) method using SPSS program version 19 (* p <0.05, ** p <0.01).

실시예 1. 돌돔 유래 Example 1 Derived from Sea Bream PGRP2PGRP2 유전자의 서열 분석 Sequence Analysis of Genes

돌돔(Oplegnathus fasciatus) 유래 PGRP2 유전자(GenBank accession number: MH643948; 이하, OfPGRP2)는 470개의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 코딩하는 것으로 예측되었으며, 분자량은 52.1 kDa, 이론적인 등전점은 7.65인 것으로 예측되었다. OfPGRP2 단백질은 300번째~446번째 아미노산 위치에 펩티드글리칸 인식 도메인이 위치하는 것으로 추정되었다(도 1). OfPGRP2 단백질의 아미노산 서열을 다른 종의 PGRP2 단백질 아미노산 서열과 정렬한 결과, 37.6~53.6%의 유사성을 보이는 것으로 확인되었다.The PGRP2 gene derived from Oplegnathus fasciatus (GenBank accession number: MH643948; hereinafter OfPGRP2) was predicted to encode a peptide consisting of 470 amino acids with a molecular weight of 52.1 kDa and a theoretical isoelectric point of 7.65. OfPGRP2 protein was estimated to be located in the peptide glycan recognition domain at the 300th ~ 446th amino acid position (Fig. 1). The amino acid sequence of OfPGRP2 protein was aligned with the amino acid sequence of PGRP2 protein of other species, and showed 37.6-53.6% similarity.

계통수 분석 결과, OfPGRP2 단백질은 경골어류(teleosts)의 PGRP2 단백질들과 클러스터를 이뤘으며, 무지개송어(rainbow trout, AGF29404)와 가장 높은 유사성(53.5%)을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 2).As a result of phylogenetic analysis, OfPGRP2 protein clustered with PGRP2 proteins of tibialis (teleosts), it was confirmed that the highest similarity (53.5%) with rainbow trout (rainbow trout, AGF29404) (Fig. 2).

실시예 2. 돌돔 유래 Example 2. Originating Stone Dome PGRP2PGRP2 유전자의 조직별 발현 수준 분석 Analysis of gene expression level by tissue

건강한 돌돔 어체를 대상으로 OfPGRP2 유전자의 각 조직별 발현 수준을 분석한 결과, 다양한 조직에서 흔하게 발현되는 것으로 확인되었으며, 말초혈액 림프구(PBLs)와 비교하여 간 조직에서 OfPGRP2 유전자가 가장 높게(1470.8배) 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).As a result of analyzing the expression levels of the OfPGRP2 genes in healthy sea bream bodies, it was found that they are commonly expressed in various tissues. OfPGRP2 genes were highest in liver tissues compared to peripheral blood lymphocytes (PBLs) (1470.8 times). Expression was confirmed (Fig. 3).

실시예 3. 병원균 인위감염 후 돌돔 유래 Example 3 Derivation of Stone Dome After Human Pathogen PGRP2PGRP2 유전자의 발현 수준 분석 Gene expression level analysis

스트렙토코커스 이니애(S. iniae), 에드워드시엘라 피스시시다(E. piscicida) 및 참돔 이리도바이러스(RSIV) 인위감염 후 OfPGRP2 유전자의 발현 수준을 분석한 결과, 테스트한 모든 조직에서 병원균 무 감염과 대비하여 OfPGRP2 유전자의 발현 수준이 증가되는 것이 확인되으나, 신장 조직에서는 바이러스 감염 조건에서 발현 수준이 감소되는 것으로 관찰되었다(도 4).Expression levels of the OfPGRP2 gene after S. iniae , Edward ciella piscicida , and red sea bream iridovirus (RSIV) artificial infection were analyzed. In contrast, it was confirmed that the expression level of OfPGRP2 gene was increased, but the kidney tissue was observed to decrease the expression level under viral infection conditions (FIG. 4).

실시예 4. 돌돔 유래 PGRP2 단백질의 병원성 세균에 대한 결합 활성 분석Example 4 Analysis of Binding Activity of Rockfish-derived PGRP2 Protein Against Pathogenic Bacteria

병원성 세균인 스트렙토코커스 이니애, 스트렙토코커스 파라우베리스 및 에드워드시엘라 피스시시다에 대해서 재조합 OfPGRP2 단백질이 아연 이온의 존재 하에, 단백질 농도 의존적으로 세균에 결합하는 것이 확인되었다(도 5A). 반면, 아연 이온이 존재하지 않는 경우에는 재조합 OfPGRP2 단백질의 세균에 대한 결합 활성은 미미한 것으로 확인되었다(도 5B). 이를 통해, OfPGRP2 단백질이 세균 감염에 대하여 선천 면역에 중요한 역할을 하며, OfPGRP2의 활성은 아연 이온에 의해 조절받음을 유추할 수 있었다.Regarding the pathogenic bacteria Streptococcus inae, Streptococcus parauberis and Edwardcyella piscisida, it was confirmed that the recombinant OfPGRP2 protein binds to bacteria in a protein concentration dependent manner in the presence of zinc ions (FIG. 5A). On the other hand, in the absence of zinc ions, the binding activity of the recombinant OfPGRP2 protein to bacteria was found to be insignificant (FIG. 5B). This suggests that OfPGRP2 protein plays an important role in innate immunity against bacterial infection and that OfPGRP2 activity is regulated by zinc ions.

실시예 5. 돌돔 유래 PGRP2 단백질에 의한 세균의 성장 억제 효과Example 5 Growth Inhibition Effect of Bacteria by Dolphin-Derived PGRP2 Protein

스트렙토코커스 이니애 및 에드워드시엘라 피스시시다의 성장에 미치는 재조합 OfPGRP2 단백질의 영향을 분석하였다. 그 결과, 아연 이온의 존재 하에서 재조합 OfPGRP2 단백질이 병원성 세균의 성장을 억제하는 것이 확인되었으며, 스트렙토코커스 이니애에 대한 재조합 OfPGRP2 단백질의 성장 억제 효과(도 6A)가 에드워드시엘라 피스시시다에 대한 성장 억제 효과(도 6B)보다 우수한 것으로 확인되었다.The effect of recombinant OfPGRP2 protein on the growth of Streptococcus inae and Edwards. As a result, it was confirmed that the recombinant OfPGRP2 protein inhibits the growth of pathogenic bacteria in the presence of zinc ions, and the growth inhibitory effect of the recombinant OfPGRP2 protein on Streptococcus ina (FIG. 6A) was grown on Edward C. pisiscidae. It was confirmed to be superior to the inhibitory effect (FIG. 6B).

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> PGRP2 protein from rock bream and uses thereof <130> PN18378 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1413 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Oplegnathus fasciatus <400> 1 atggataaag gctgctggaa acagaccctg gcccttgtgg tggtcttggt cagcacgtat 60 gcagaagctt ctctttcctg gcacatggat gacttcatca aggcggtgaa gcaggtggag 120 gacggggacc cagggtccga gccagtggct gtgctgagga ggctgcgcag ggcagctggc 180 cttaatgatg cgttcattca gaaatacctc ggtaaagccg actccggtgg tcctgaaatg 240 gacgctagcc tctcagttta catcagcaag gctgtgaacc acagggtgac tgaagacgct 300 gaagaggaag gtgtggtcct gacttctgat ggcaccactg ttgccctcat gccgctcctc 360 ctgggcatcg aggctggttt cctctccaac tctacggagc gtgttcgggg tctgtaccag 420 ctcactctgg ccaaagacct cgacctttct ttcaagcaca tctctcctct catccagttt 480 ctgggacctg acggctgctg ggacagtgta acctctcctc aggtcttcac cctcttggac 540 agcccctccc tgctcaccac tgctcaggtc aacggaggca tggacggcgt ggttctaggg 600 atggaggtct ctgccaaatc cacacatccc ctcaagctca gcagtctgct gacagactac 660 tactgccacc agctggagaa aggactggac accgccccgc acctcatcag ccgacgtcgc 720 agggagaact tcagagggct ggtcgtccct ccagtgctga caagaaaggt ggtcaaatca 780 gtagagctgc agcgcagact gaaggggcgc ccaaagatgg acgtgaagga gaagaagcag 840 ctgatggctg tggtgaaaga gggagtgaga gagtttgtcc ataagtacat ggattgccca 900 cccatcatac ctcgctgtat gtggggtgca aagccgtaca gtggaacccc caccaacctt 960 tcccttcctc tctccttcat gtacatccac cacactcaca ctccgagcca gccctgtctc 1020 accttccagc agtgctctgc agacatgcgc tccatgcagc gcttccacca ggaggacaga 1080 ggctgggatg acataggata cagcttcgtc gcaggctctg acgggtacat ctacgagggc 1140 cgaggctggc actggcgagg agcccacacc ctcggacaca actccatagg ctacggcgtc 1200 tccttcatcg gagactacac caccagtctg ccctcccagc attccatggg gctggtgaga 1260 gatcagctgg catcctgcgc cgtcggcggc gggcgactgg tagcaaactt caccgtgcag 1320 gggcacagac aggtggtgaa cacttcctgc cccggggatg ctctctataa tgagatcaga 1380 agctgggaac actttgggga ggtgaagaga tga 1413 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Oplegnathus fasciatus <400> 2 Met Asp Lys Gly Cys Trp Lys Gln Thr Leu Ala Leu Val Val Val Leu 1 5 10 15 Val Ser Thr Tyr Ala Glu Ala Ser Leu Ser Trp His Met Asp Asp Phe 20 25 30 Ile Lys Ala Val Lys Gln Val Glu Asp Gly Asp Pro Gly Ser Glu Pro 35 40 45 Val Ala Val Leu Arg Arg Leu Arg Arg Ala Ala Gly Leu Asn Asp Ala 50 55 60 Phe Ile Gln Lys Tyr Leu Gly Lys Ala Asp Ser Gly Gly Pro Glu Met 65 70 75 80 Asp Ala Ser Leu Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ala Val Asn His Arg Val 85 90 95 Thr Glu Asp Ala Glu Glu Glu Gly Val Val Leu Thr Ser Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Ala Leu Met Pro Leu Leu Leu Gly Ile Glu Ala Gly Phe Leu 115 120 125 Ser Asn Ser Thr Glu Arg Val Arg Gly Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Ala 130 135 140 Lys Asp Leu Asp Leu Ser Phe Lys His Ile Ser Pro Leu Ile Gln Phe 145 150 155 160 Leu Gly Pro Asp Gly Cys Trp Asp Ser Val Thr Ser Pro Gln Val Phe 165 170 175 Thr Leu Leu Asp Ser Pro Ser Leu Leu Thr Thr Ala Gln Val Asn Gly 180 185 190 Gly Met Asp Gly Val Val Leu Gly Met Glu Val Ser Ala Lys Ser Thr 195 200 205 His Pro Leu Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Tyr Cys His Gln 210 215 220 Leu Glu Lys Gly Leu Asp Thr Ala Pro His Leu Ile Ser Arg Arg Arg 225 230 235 240 Arg Glu Asn Phe Arg Gly Leu Val Val Pro Pro Val Leu Thr Arg Lys 245 250 255 Val Val Lys Ser Val Glu Leu Gln Arg Arg Leu Lys Gly Arg Pro Lys 260 265 270 Met Asp Val Lys Glu Lys Lys Gln Leu Met Ala Val Val Lys Glu Gly 275 280 285 Val Arg Glu Phe Val His Lys Tyr Met Asp Cys Pro Pro Ile Ile Pro 290 295 300 Arg Cys Met Trp Gly Ala Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Leu 305 310 315 320 Ser Leu Pro Leu Ser Phe Met Tyr Ile His His Thr His Thr Pro Ser 325 330 335 Gln Pro Cys Leu Thr Phe Gln Gln Cys Ser Ala Asp Met Arg Ser Met 340 345 350 Gln Arg Phe His Gln Glu Asp Arg Gly Trp Asp Asp Ile Gly Tyr Ser 355 360 365 Phe Val Ala Gly Ser Asp Gly Tyr Ile Tyr Glu Gly Arg Gly Trp His 370 375 380 Trp Arg Gly Ala His Thr Leu Gly His Asn Ser Ile Gly Tyr Gly Val 385 390 395 400 Ser Phe Ile Gly Asp Tyr Thr Thr Ser Leu Pro Ser Gln His Ser Met 405 410 415 Gly Leu Val Arg Asp Gln Leu Ala Ser Cys Ala Val Gly Gly Gly Arg 420 425 430 Leu Val Ala Asn Phe Thr Val Gln Gly His Arg Gln Val Val Asn Thr 435 440 445 Ser Cys Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Asn Glu Ile Arg Ser Trp Glu His 450 455 460 Phe Gly Glu Val Lys Arg 465 470 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cccctgcagg acgtctacaa 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aacacgaccg acgggtaca 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcctcaggt cttcaccctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagacctcca tccctagaac 20 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgttccact ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatac 49 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gataaggctc tcgagttagt ggtggtggtg gtggtgacgt ttaacctcac cgaaat 56 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> PGRP2 protein from rock bream and uses <130> PN18378 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1413 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Oplegnathus fasciatus <400> 1 atggataaag gctgctggaa acagaccctg gcccttgtgg tggtcttggt cagcacgtat 60 gcagaagctt ctctttcctg gcacatggat gacttcatca aggcggtgaa gcaggtggag 120 gacggggacc cagggtccga gccagtggct gtgctgagga ggctgcgcag ggcagctggc 180 cttaatgatg cgttcattca gaaatacctc ggtaaagccg actccggtgg tcctgaaatg 240 gacgctagcc tctcagttta catcagcaag gctgtgaacc acagggtgac tgaagacgct 300 gaagaggaag gtgtggtcct gacttctgat ggcaccactg ttgccctcat gccgctcctc 360 ctgggcatcg aggctggttt cctctccaac tctacggagc gtgttcgggg tctgtaccag 420 ctcactctgg ccaaagacct cgacctttct ttcaagcaca tctctcctct catccagttt 480 ctgggacctg acggctgctg ggacagtgta acctctcctc aggtcttcac cctcttggac 540 agcccctccc tgctcaccac tgctcaggtc aacggaggca tggacggcgt ggttctaggg 600 atggaggtct ctgccaaatc cacacatccc ctcaagctca gcagtctgct gacagactac 660 tactgccacc agctggagaa aggactggac accgccccgc acctcatcag ccgacgtcgc 720 agggagaact tcagagggct ggtcgtccct ccagtgctga caagaaaggt ggtcaaatca 780 gtagagctgc agcgcagact gaaggggcgc ccaaagatgg acgtgaagga gaagaagcag 840 ctgatggctg tggtgaaaga gggagtgaga gagtttgtcc ataagtacat ggattgccca 900 cccatcatac ctcgctgtat gtggggtgca aagccgtaca gtggaacccc caccaacctt 960 tcccttcctc tctccttcat gtacatccac cacactcaca ctccgagcca gccctgtctc 1020 accttccagc agtgctctgc agacatgcgc tccatgcagc gcttccacca ggaggacaga 1080 ggctgggatg acataggata cagcttcgtc gcaggctctg acgggtacat ctacgagggc 1140 cgaggctggc actggcgagg agcccacacc ctcggacaca actccatagg ctacggcgtc 1200 tccttcatcg gagactacac caccagtctg ccctcccagc attccatggg gctggtgaga 1260 gatcagctgg catcctgcgc cgtcggcggc gggcgactgg tagcaaactt caccgtgcag 1320 gggcacagac aggtggtgaa cacttcctgc cccggggatg ctctctataa tgagatcaga 1380 agctgggaac actttgggga ggtgaagaga tga 1413 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Oplegnathus fasciatus <400> 2 Met Asp Lys Gly Cys Trp Lys Gln Thr Leu Ala Leu Val Val Val Leu   1 5 10 15 Val Ser Thr Tyr Ala Glu Ala Ser Leu Ser Trp His Met Asp Asp Phe              20 25 30 Ile Lys Ala Val Lys Gln Val Glu Asp Gly Asp Pro Gly Ser Glu Pro          35 40 45 Val Ala Val Leu Arg Arg Leu Arg Arg Ala Ala Gly Leu Asn Asp Ala      50 55 60 Phe Ile Gln Lys Tyr Leu Gly Lys Ala Asp Ser Gly Gly Pro Glu Met  65 70 75 80 Asp Ala Ser Leu Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ala Val Asn His Arg Val                  85 90 95 Thr Glu Asp Ala Glu Glu Glu Gly Val Val Leu Thr Ser Asp Gly Thr             100 105 110 Thr Val Ala Leu Met Pro Leu Leu Leu Gly Ile Glu Ala Gly Phe Leu         115 120 125 Ser Asn Ser Thr Glu Arg Val Arg Gly Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Ala     130 135 140 Lys Asp Leu Asp Leu Ser Phe Lys His Ile Ser Pro Leu Ile Gln Phe 145 150 155 160 Leu Gly Pro Asp Gly Cys Trp Asp Ser Val Thr Ser Pro Gln Val Phe                 165 170 175 Thr Leu Leu Asp Ser Pro Ser Leu Leu Thr Thr Ala Gln Val Asn Gly             180 185 190 Gly Met Asp Gly Val Val Leu Gly Met Glu Val Ser Ala Lys Ser Thr         195 200 205 His Pro Leu Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Tyr Cys His Gln     210 215 220 Leu Glu Lys Gly Leu Asp Thr Ala Pro His Leu Ile Ser Arg Arg Arg 225 230 235 240 Arg Glu Asn Phe Arg Gly Leu Val Val Pro Pro Val Leu Thr Arg Lys                 245 250 255 Val Val Lys Ser Val Glu Leu Gln Arg Arg Leu Lys Gly Arg Pro Lys             260 265 270 Met Asp Val Lys Glu Lys Lys Gln Leu Met Ala Val Val Lys Glu Gly         275 280 285 Val Arg Glu Phe Val His Lys Tyr Met Asp Cys Pro Pro Ile Ile Pro     290 295 300 Arg Cys Met Trp Gly Ala Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Leu 305 310 315 320 Ser Leu Pro Leu Ser Phe Met Tyr Ile His His Thr His Thr Pro Ser                 325 330 335 Gln Pro Cys Leu Thr Phe Gln Gln Cys Ser Ala Asp Met Arg Ser Met             340 345 350 Gln Arg Phe His Gln Glu Asp Arg Gly Trp Asp Asp Ile Gly Tyr Ser         355 360 365 Phe Val Ala Gly Ser Asp Gly Tyr Ile Tyr Glu Gly Arg Gly Trp His     370 375 380 Trp Arg Gly Ala His Thr Leu Gly His Asn Ser Ile Gly Tyr Gly Val 385 390 395 400 Ser Phe Ile Gly Asp Tyr Thr Thr Ser Leu Pro Ser Gln His Ser Met                 405 410 415 Gly Leu Val Arg Asp Gln Leu Ala Ser Cys Ala Val Gly Gly Gly Arg             420 425 430 Leu Val Ala Asn Phe Thr Val Gln Gly His Arg Gln Val Val Asn Thr         435 440 445 Ser Cys Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Asn Glu Ile Arg Ser Trp Glu His     450 455 460 Phe Gly Glu Val Lys Arg 465 470 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cccctgcagg acgtctacaa 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aacacgaccg acgggtaca 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcctcaggt cttcaccctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagacctcca tccctagaac 20 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgttccact ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatac 49 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gataaggctc tcgagttagt ggtggtggtg gtggtgacgt ttaacctcac cgaaat 56

Claims (10)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 유래의 OfPGRP2(Oplegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) 단백질.OfPGRP2 (Olegnathus fasciatus peptidoglycan recognition protein 2) protein derived from Oplegnathus fasciatus consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 제1항의 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자.The gene encoding the OfPGRP2 protein of claim 1. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.According to claim 2, wherein the gene is a gene, characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.Recombinant vector comprising the gene of claim 2. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.A host cell transformed with the recombinant vector of claim 4. 제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 OfPGRP2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 OfPGRP2 단백질의 생산방법.A method of producing an OfPGRP2 protein comprising overexpressing a gene encoding OfPGRP2 protein by transforming a host cell with the recombinant vector of claim 4. 제6항의 방법에 의해 생산된 OfPGRP2 단백질.OfPGRP2 protein produced by the method of claim 6. 제1항 또는 제7항의 OfPGRP2 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 항균 조성물.An antimicrobial composition for fish comprising the OfPGRP2 protein of claim 1 as an active ingredient. 제8항에 있어서, 아연(zinc) 이온을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 어류용 항균 조성물.The antimicrobial composition for fish according to claim 8, which further contains zinc ions. 제1항 또는 제7항의 OfPGRP2 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 사료첨가제.A feed additive for fish comprising the OfPGRP2 protein of claim 1 or 7 as an active ingredient.
KR1020180125757A 2018-10-22 2018-10-22 PGRP2 protein from rock bream and uses thereof KR102035802B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180125757A KR102035802B1 (en) 2018-10-22 2018-10-22 PGRP2 protein from rock bream and uses thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180125757A KR102035802B1 (en) 2018-10-22 2018-10-22 PGRP2 protein from rock bream and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102035802B1 true KR102035802B1 (en) 2019-10-23

Family

ID=68460869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180125757A KR102035802B1 (en) 2018-10-22 2018-10-22 PGRP2 protein from rock bream and uses thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102035802B1 (en)

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fish & Shellfish Immunology Vol.28 (2010) p.632-639 [doi:10.1016/j.fsi.2009.12.023] *
Fish and Shellfish Immunology VOl.77 (2018) p. 286-293 [[https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.04.006] *
GenBank: ADC93707.1 *
NCBI Reference Sequence: XM_022747937.1 *
NCBI Reference Sequence: XP_018554185.1 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Isolation, purification and the anti-hypertensive effect of a novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from Ruditapes philippinarum fermented with Bacillus natto
Yin et al. Structural characterization of the major extrapallial fluid protein of the mollusc Mytilus edulis: implications for function
KR101615551B1 (en) Antimicrobial peptide from Protaetia brevitarsis seulensis larva and uses thereof
Jemil et al. Peptidomic analysis of bioactive peptides in zebra blenny (Salaria basilisca) muscle protein hydrolysate exhibiting antimicrobial activity obtained by fermentation with Bacillus mojavensis A21
KR20070033956A (en) Novel Peptide Family Compositions, Methods and Uses
Go et al. Biochemical and molecular identification of a novel hepcidin type 2-like antimicrobial peptide in the skin mucus of the pufferfish Takifugu pardalis
KR101892072B1 (en) Novel piscidin peptide from Rock bream and uses thereof
Olson III et al. Pseudin-2: an antimicrobial peptide with low hemolytic activity from the skin of the paradoxical frog
EP1968623B1 (en) Bacteriocin inducer peptides
Mai et al. cDNA cloning, expression and antibacterial activity of lysozyme C in the blue shrimp (Litopenaeus stylirostris)
CN110564756A (en) method for prokaryotic expression of recombinant chicken angiopoietin-like protein 4 and application thereof
WO2020118427A1 (en) Antimicrobial peptides
KR102004153B1 (en) Novel theromacin peptide from Perinereis linea and uses thereof
KR102187479B1 (en) PGRP-SC2 protein from Rock bream and uses thereof
KR102035802B1 (en) PGRP2 protein from rock bream and uses thereof
Chu et al. Anti-diarrhea effects and identification of Musca domestica larvae low molecular weight peptides (LMWP)
KR102420699B1 (en) Novel antimicrobial peptide from starry flounder and uses thereof
KR101121077B1 (en) Novel genes encoding defensin of olive flounder and uses thereof
CN106967740B (en) Escherichia coli fusion expression plectasin, preparation method and application thereof
KR20080074332A (en) Proteins activating pro-phenoloxidase system and genes encoding the same
KR102569795B1 (en) Ubiquitin-related novel antimicrobial peptide derived from starry flounder and uses thereof
KR102569799B1 (en) Novel antimicrobial peptide from ubiquitin of starry flounder and uses thereof
KR101508693B1 (en) Novel antimicrobial peptide from Crassostrea gigas, and uses thereof
Wu et al. Identification and molecular cloning of novel antimicrobial peptides from skin secretions of the Chinese bamboo leaf odorous frog (Odorrana versabilis) and the North American pickerel frog (Rana palustris)
KR20180053169A (en) Lactobacillus johnsonii induced from rat and composition for enhancement of immunity using the same

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant