KR102029803B1 - 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 14 및 서열번호 16로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이를 이용한 부갑상선 호르몬 검출용 조성물, 키트, 칩 및 마이크로어레이에 관한 것이다. 또한 본 발명은 부갑상선 호르몬에 특이적 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법, 상기 DNA 앱타머를 포함하는 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물 및 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to Prathyroid Hormone and Uses Thereof}

본 발명은 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

부갑상선 호르몬(Parathyroid Hormone, PTH)은 주로 부갑상선에서 분비되는 호르몬으로 84개의 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. 부갑상선 호르몬은 위장관과 콩팥에서 칼슘 흡수를 증가시키고, 인의 재흡수를 억제하여 혈중 칼슘농도를 높이는 기능을 담당하며, 인산염의 농도를 감소시킨다. 또한, 비타민 D의 전환을 증가시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 칼슘은 뼈의 주요 구성성분이기도 하지만 심장을 포함한 전신의 근육을 수축시키거나 혈액응고 작용에도 중요한 역할을 하는 성분이다. 칼슘의 대부분은 뼈에 저장되어 있지만, 부갑상선호르몬은 비타민D와 함께 칼슘을 뼈에서 혈액으로 내보내는 작용을 통하여 혈액의 칼슘농도를 조절하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 부갑상선에 존재하는 칼슘 감지 수용체(calcium-sensing receptor)는 혈청 칼슘의 미세한 변화에도 민감하게 반응하여 상호작용을 하게 되는데, 혈액의 칼슘 농도가 저하되면 부갑상선호르몬 분비가 상승하게 되고 반대로 혈액 중의 칼슘농도가 상승되면 부갑상선호르몬 분비가 저하되어 칼슘의 농도를 낮추려고 하는 작용을 통하여 체내의 혈중 칼슘농도를 일정하게 유지하는 역할을 한다.

한편, 혈중 칼슘 농도를 조절하는 핵심 역할을 하는 부갑상선 호르몬의 분비에 이상이 생기면 다양한 질환이 유발되는데, 부갑상선 기능이 항진되어 부갑상선 호르몬이 부적절하게 과다 분비되는 경우, 뼈에서 혈액으로 이동하는 칼슘이 과도하게 많아지게 되며, 칼슘 및 인의 대사에 이상을 초래하게 되어 골다공증을 유발하게 되고 인산의 수치가 정상수치보다 높게 증가하는 경우 심혈관계 이상이나 골외성 석회화를 유발한다. 반면, 주로 수술에 의한 외적 요인에 의하여 부갑상선의 제거 및 축소가 되거나, 유전적 변이와 같은 내적인 요인으로 인하여 부갑상선기능감퇴증(hypoparathyroidism)이 유발되는 경우 분비되는 부갑상선 호르몬의 감소로 인하여 뼈에서 혈액으로 이동하는 칼슘이 감소하게 되어 저칼슘혈증과 고인산혈증이나 신경이나 근의 흥분성 증가에 의한 테타니(tetany), 골경화증, 외골증(exostosis)일어난다.

따라서 부갑상선 호르몬이 칼슘대사의 조절에 중추적인 기능을 담당하기 때문에, 칼슘대사 조절 문제로 인하여 발생되는 각종 질환의 진단에서 정확한 원인을 판단하기 위해 환자의 혈액으로부터 혈중 부갑상선 호르몬을 측정한다.

혈중 내 부갑상선 호르몬을 측정하는 방법은, 부갑상선 호르몬에 직접적으로 결합하는 항체를 활용하여 검체로부터 부갑상선 호르몬을 검출하는데, 부갑상선 호르몬의 존재 시 나타나는 발광반응의 확인방식으로 진행되고 있으며, 검사의 진행을 통해 나타나는 발광의 정도에 따라 검체내 존재하는 부갑상선 호르몬 농도로 연산하는 과정을 거치고 있다.

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 항체는 단순히 질환의 원인을 분석하는 검체로서 활용될 뿐만 아니라, 치료제의 기능을 평가하는 하나의 지시자로서의 기능도 담당할 수 있다. 내외부적인 요인으로 인하여 부갑상선에 문제가 발생하는 경우 부갑상선 호르몬의 분비에 이상이 발생할 수 있는데, 부갑상선 호르몬의 분비가 감소하는 문제가 발생하는 경우 인위적으로 부갑상선 호르몬을 처방받는 방식으로 치료를 진행할 수 있다. 이를 위하여 부갑상선 호르몬을 과발현하는 세포 치료제가 활용될 수 있는데, 이를 평가하는 방법에는 일반적으로 항체를 사용하여 나타나는 발광을 확인하여 부갑상선 호르몬이 적합하게 생산되는지를 확인하는 방식으로 기능성 평가 지표 중 하나로 작용하고 있다.

그러나 부갑상선 호르몬은 일반적으로 혈중 매우 적은 양으로 존재하며 반감기가 매우 짧고 혈중에서 여러 가지 형태로 변환되어 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 칼슘조절의 이상이 의심되는 환자를 검사하는 경우에도 혈액을 채취한 후, 바로 부갑상선 호르몬에 특이적인 항체를 활용하여 검사를 진행하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 부갑상선 호르몬의 분비량이 매우 적고 짧은 반감기를 가지고 있다는 점과 체내에서 다양한 형태로 존재한다는 특성을 감안하였을 때, 비특이적으로 결합하는 위양성 반응이 나타난다는 문제점을 가지고 있다. 또한, 부갑상선 호르몬을 과발현하는 세포 치료제의 기능 평가에 있어서 항체를 활용하여 발광을 확인하는 경우 비특이적으로 결합하는 결과가 존재하여 정확한 평가가 어려운 문제점이 존재한다.

따라서, 부갑상선 호르몬의 정확한 검출 및 진단을 위한 방법으로 항체 사용이 아닌 다른 검사방법의 개발이 요구되고 있다.

한편, 앱타머는 안정된 삼차구조를 가지는 짧은 길이의 단일가닥 핵산으로 표적 물질과 높은 친화성과 특이성으로 결합하는 특징을 가지고 있다. 앱타머는 일반적으로 항체와 비교되는데, 항체의 경우 분자 구조가 크기 때문에 생산의 어려움과 변형의 한계가 존재하는 반면, 앱타머는 짧은 길이의 핵산으로 구성되어 있어 비교적 작은 분자 구조를 갖게 되며, 화학적 합성 기법을 이용하여 단시간 및 저비용으로 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라 목적에 따라 다양한 변형이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 pH 및 온도와 같은 주변 환경에 대한 높은 안정성을 가지므로 표적물질의 탐지, 질환 진단 센서 개발 등 환경과 의료분야를 포함하여 다양한 산업분야에서 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0142446호

이에 본 발명자들은 기존에 항체를 활용하여 부갑상선 호르몬을 검출하던 방법보다 더 정확하고 신속하며 간편하게 부갑상선 호르몬을 검출할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 연구하던 중, 부갑상선 호르몬에 특이성을 갖는 DNA 앱타머들을 합성하고 선별하는데 성공하였고, 이들 앱타머가 항체 기반의 부갑상선 호르몬 검출 방법을 대체할 수 있으며, 부갑상선 호르몬에 의해 유발되는 질환의 검사 및 진단에 활용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 부갑상선 호르몬 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)가 기판 상에 고정되어 부갑상선 호르몬 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 칩 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 이용한 부갑상선 호르몬 단백질의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 부갑상선 호르몬에 특이적 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 이용한 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)로서, 서열번호 9, 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 사람 부갑상선 호르몬 단백질 또는 His 융합 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴, 티올기 및 디곡시게닌(digoxigenin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)가 기판 상에 고정되어 부갑상선 호르몬 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 칩 또는 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은, (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함하는, 부갑상선 호르몬 단백질의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 칼슘저혈증, 골감소증, 골다공증, 부갑상선기능항진증, 부갑상선기능감퇴증, 골절, 부갑상선기능항진증-관련 칼슘과혈발증, 악성 칼슘과혈증, 신부전증, 요로결석 및 고혈압증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계; (2) 상기 단일가닥 DNA 앱타머와 부갑상선 호르몬의 결합을 유도하는 단계; (3) 단일가닥 DNA 앱타머와 결합한 부갑상선 호르몬을 Ni-NTA 아가로오스 레진에 결합시키는 단계; (4) 부갑상선 호르몬에 결합하지 못한 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및 (5) SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 회수 및 선별하는 단계;를 포함하는, 부갑상선 호르몬에 특이적 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (5) 단계는 최적 친화력(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위한 실시간 PCR 단계; 최적 SELEX 라운드에서 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군의 부갑상선 호르몬에 대한 친화력을 측정하는 단계; 및 선별된 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열결정 단계;로 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함하는, 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 칼슘저혈증, 골감소증, 골다공증, 부갑상선기능항진증, 부갑상선기능감퇴증, 골절, 부갑상선기능항진증-관련 칼슘과혈발증, 악성 칼슘과혈증, 신부전증, 요로결석 및 고혈압증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 가지므로, 부갑상선 호르몬 단백질의 검출용도 뿐만 아니라, 혈액 내 부갑상선 호르몬 단백질의 수준을 측정함으로써, 부갑상선 호르몬에 의해 유발되는 질환의 진단 및 예후를 검사하는데 있어서 보다 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 부갑상선 호르몬 특이적 결합능을 갖는 DNA 앱타머는 세포치료제로서 부갑상선 호르몬을 과발현하는 경우 이를 확인할 수 있는 수단으로 사용할 수 있고 이는 기존에 사용하던 항체에 비해 보다 정확하고 효과적인 검출 및 진단이 가능하여 명확한 판단의 기준을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 및 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과를 나타낸 것으로, 레인 M : 100 bp DNA 마커, 레인 1 : 부갑상선 호르몬 특이결합 DNA 앱타머를 PCR을 이용하여 증폭한 후, PCR 정제 kit를 사용하여 부갑상선 호르몬 특이결합 DNA 앱타머 만을 회수한 결과. 레인 2 : 부갑상선 호르몬 특이결합 DNA 앱타머를 PCR을 이용하여 증폭한 후, PCR 정제 kit를 사용하여 부갑상선 호르몬 특이결합 DNA 앱타머 만을 회수한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정에서 각 라운드에서 회수된 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용해 정량적으로 측정한 양을 나타낸 것이다.
도 3은 부갑상선 호르몬에 최적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 확보한 앱타머 후보군의 친화도 테스트를 나노 드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 부갑상선 호르몬과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 총 3 개의 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 카르복실기가 결합된 dextran으로 코팅된 CM5 칩 표면에 부갑상선 호르몬을 결합시키는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 6은 부갑상선 호르몬 결합 앱타머와 Dig 결합 앱타머를 이용한 aptamer blotting 기법을 이용하여 부갑상선 호르몬을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과로서, A: 도 6A는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH9)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬을 탐지한 결과이이며, 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea), 레인 1: 재조합 부갑상선 호르몬 단백질, B: 도 6B는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH14)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬을 탐지한 결과이고, 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea), 레인 1: 재조합 부갑상선 호르몬 단백질, C: 도 6C는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH16)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬을 탐지한 결과이다. 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea)이고, 레인 1: 재조합 부갑상선 호르몬 단백질을 나타낸 것이다.
도 7은 부갑상선 호르몬 결합 앱타머와 Dig 결합 앱타머를 이용한 aptamer blotting 기법을 이용하여 부갑상선 호르몬 과발현 세포의 전체 세포 활성형 단백질로부터 부갑상선 호르몬을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과이며, 도 7에서 도 7A는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH9)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬 과발현 세포의 전체 세포 활성형 단백질로부터 부갑상선 호르몬을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과이며, 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea), 레인 1: 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 2: 7일 배양한 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 3: 7일간 부갑상선 호르몬 과발현을 유도한 세포의 활성형 단백질을 나타낸 것이다. 도 7B는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH14)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬 과발현 세포의 전체 세포 활성형 단백질로부터 부갑상선 호르몬을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과로서, 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea), 레인 1: 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 2: 7일 배양한 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 3: 7일간 부갑상선 호르몬 과발현을 유도한 세포의 활성형 단백질을 나타낸 것이다. 도 7C는 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머(PTH16)와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬 과발현 세포의 전체 세포 활성형 단백질로부터 부갑상선 호르몬을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과로서, 레인 M: western blotting 마커 (Elpis biotech, Korea), 레인 1: 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 2: 7일 배양한 부갑상선 호르몬 발현 세포의 활성형 단백질, 레인 3: 7일간 부갑상선 호르몬 과발현을 유도한 세포의 활성형 단백질을 나타낸 것이다.

본 발명은 부갑상선 호르몬 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer) 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 기존의 항체를 기반으로 하는 표적 물질 검출 기법의 문제점들을 해결하기 위한 방법으로 부갑상선 호르몬에 특이적 결합능을 갖는 앱타머를 발굴하였다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 확인하여 생물학적 시료로부터 부갑상선 호르몬 단백질을 용이하게 검출할 수 있고, 부갑상선 호르몬 단백질과 관련된 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 목적 물질에 높은 특이성과 친화력을 가지고 결합할 수 있는 단일 가닥의 DNA를 가리키는 것으로, SELEX (Systematic Evolution of Ligand of Exponential enrichment) 기법을 통해 제작할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 "DNA 앱타머"는 "DNA 올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다. 앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조를 형성하여 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징을 가지고 있다. 또한, 앱타머는 DNA나 RNA인 핵산으로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질(단백질, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 서열번호 9, 서열번호 14 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖거나, 이러한 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성될 수도 있는데, 상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴, 티올기 및 디곡시게닌(digoxigenin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA가 포함될 수 있고, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenganand Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 9, 14 및 16의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명에서 규명한 부갑상선 호르몬 단백질 특이적 결합능을 갖는 이러한 DNA 앱타머는 본 명세서 도 4에 도시된 3차 구조를 형성한다.

또한, 본 발명의 부갑상선 호르몬단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 부갑상선 호르몬 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 9, 14 및 16의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％ 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

또한 본 발명의 DNA 앱타머가 결합할 수 있는 상기 부갑상선 호르몬 단백질은 바람직하게 인간 유래 부갑상선 호르몬 단백질 또는 His 융합 부갑상선 호르몬 단백질일 수 있고, 상기 인간 유래 부갑상선 호르몬 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 25 에 나타내었고, His가 융합된 재조합 부갑상선 호르몬 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 26에 나타내었다.

나아가 본 발명은 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 바람직하게, (1) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계; (2) 상기 단일가닥 DNA 앱타머와 부갑상선 호르몬의 결합을 유도하는 단계; (3) 단일가닥 DNA 앱타머와 결합한 부갑상선 호르몬을 Ni-NTA 아가로오스 레진에 결합시키는 단계; (4) 부갑상선 호르몬에 결합하지 못한 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및 (5) SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 회수 및 선별하는 단계;를 포함한다.

여기서 상기 (5) 단계는 구체적으로, 최적 친화력(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위한 실시간 PCR 단계; 최적 SELEX 라운드에서 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군의 부갑상선 호르몬에 대한 친화력을 측정하는 단계; 및 선별된 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열결정 단계;로 이루어진다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 DNA 앱타머 선별을 위해, PCR을 이용하여 증폭한 dsDNA (double strand DNA) 중에서 ssDNA (single strand DNA) 만을 증폭하기 위해 비대칭(asymmetric) PCR을 수행하였고, 이때 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10 : 2 비율, 예를 들면, 동일한 농도 (25 uM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 2 ㎕를 이용하여 PCR을 수행함으로써 ssDNA를 수득하였다. 또한, ssDNA 앱타머의 선별 방법은, PCR 수행 시 역방향 프라이머에 바이오틴을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물의 3’에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 바이오틴이 결합되지 않은 반대쪽의 ssDNA 앱타머 만을 수득할 수 있도록 하였다.

이후 선별된 ssDNA 앱타머를 대상으로 재조합된 인간 유래 부갑상선 호르몬 단백질을 이용한 SELEX 기법으로 부갑상선 호르몬 결합능을 갖는 DNA 앱타머를 선별하였는데, 본 발명의 일실시예에 의하면, 앱타머 서열을 증폭하여 확보한 후, 부갑상선 호르몬을 레진에 고정하는 단계; 고정된 부갑상선 호르몬과 DNA 앱타머를 결합시키는 단계; 부갑상선 호르몬과 반응성이 있는 부갑상선 특이 결합 DNA 앱타머만을 회수하는 단계를 한 라운드로 하여, 높은 친화성(affinity)과 특이성(specificity)을 갖는 최적의 SELEX 라운드를 선별하는 과정을 수행하였다.

또한, 최적 SELEX 라운드의 선별과정은 나노드랍 (NanoDrop spectrophotometer, USA) 및 실시간 PCR을 이용한 정량화 분석을 통한 최적 라운드 선택 단계; 최적 SELEX 라운드에서 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 확보를 위한 PCR 및 클로닝 단계; 및 확보된 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열결정 단계;를 통해 수행하였다.

본 발명에서 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법 (Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566)을 말한다.

본 발명은 최적 SELEX 라운드 선별을 위하여 SELEX 과정을 10회까지 마친 후 SELEX의 계속적 진행 여부 및 최적 라운드 선별을 위해 각 라운드에서 회수한 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머를 나노드랍을 통하여 선별할 수 있다. 이후 선정된 최적 SELEX 라운드에서 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 서열확보를 위하여 PCR 및 클로닝을 수행한 후, 선별된 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열을 결정하였다.

이상의 방법으로 통해 발굴된 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)는 부갑상선 호르몬 단백질을 직접 검출하는데 사용되거나 환자의 생물학적 시료에서 부갑상선 호르몬 단백질을 검출하는데 사용될 수 있으며, 이를 활용하여 부갑상선 호르몬과 관련된 질환들을 진단하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 검출은 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 부갑상선 호르몬 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 형광물질(예를 들어, 플루오레세인(fulorescein), Cy3, Cy5 또는 HRP), 방사성물질, 또는 비오틴(biotin)과 같은 화학물질로 표지되거나 1차 아민으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 DNA 앱타머는 고정화된 기판(substrate)을 포함하는 바이오 센서, 키트 및 칩의 형태로 제작되어 부갑상선 호르몬 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “센서 및 칩”은 기판의 특정 영역에 특정 물질이 고밀도로 부착된 센서 및 칩을 의미한다. 본 명세서에서 용어 바이오 센서 및 센서칩의 “기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화될 수 있다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합방법 또는 UV와 같은 공유결합적 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커(예를 들어, 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는, 예를 들어, 비오티닐화(biotinylated)화 될 수 있고, 이를 스트랩트아비딘(streptavidin)이 코팅된 기판상에 성공적으로 고정시킬 수 있다. 기판상에 고정화된 본 발명의 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 부갑상선 호르몬 단백질과 결합하여 이를 포획할 수 있으며, 이와 같이 포획된 부갑상선 호르몬 단백질은 다시 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 부갑상선 호르몬 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열번호 9, 14 또는 16의 염기서열 또는 이 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 부갑상선 호르몬 단백질 검출에 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 부갑상선 호르몬 단백질의 특이적 검출을 통해 부갑상선 호르몬과 관련된 질환을 진단하거나 그 예후 판단을 위해 유용한 정보를 제공할 수 있다.

앞서 종래 기술에서도 기재한 바와 같이, 부갑상선 호르몬은 위장관과 콩팥에서 칼슘 흡수를 증가시키고, 인의 재흡수를 억제하여 혈중 칼슘농도를 높이는 기능을 담당하고 있고 인산염의 농도를 감소시키는 작용을 하며, 또한 비타민 D의 전환을 증가시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 부갑상성 호르몬의 비정상적인 조절로 인해 유발될 수 있는 질환중 하나인 부갑상선 기능 항진증은 고칼슘혈증의 가장 흔한 원인으로 발병하며, 한 개 이상의 부갑상선의 기능이 항진되어 부갑상선 호르몬이 부적절하게 과다 분비됨으로써 칼슘, 인 및 골대사의 이상을 초래하는 질환이다.

또한, 부갑상선 기능 저하증은 저칼슘혈증, 고인산혈증, 혈청 부갑상선 호르몬의 감소가 원인이 되어 발병하는 내분비 결핍 질환이다.

본 발명에서 상기 부갑상선 호르몬 관련 질환은 부갑상선 호르몬 조절 이상에 의해 유발될 수 있는 질환이라면 모두 포함하여, 이에 제한되지는 않으나, 칼슘저혈증, 골감소증, 골다공증, 부갑상선기능항진증, 부갑상선기능감퇴증, 골절, 부갑상선기능항진증-관련 칼슘과혈발증, 악성 칼슘과혈증, 신부전증, 요로결석 및 고혈압증일 수 있다. 따라서 본 발명은 (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함하는, 부갑상선 호르몬 단백질의 검출 방법을 제공할 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물 및 본 발명의 DNA 앱타머를 이용한 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.

상기 본 발명의 DNA 앱타머를 이용한 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보 제공 방법은, (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함한다.

여기서 상기 시료에 함유된 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질의 수준 또는 함량이 정상대조군(정상인의 시료)에 비해 높은 경우, 부갑상선 기능 항진증에 의한 질환이 발병된 것으로 예측 또는 진단할 수 있으며, 반면, 상기 시료에 함유된 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질의 수준 또는 함량이 정상대조군(정상인의 시료)에 비해 낮은 경우, 부갑상선 기능 저하증에 의한 질환이 발병된 것으로 예측 또는 진단할 수 있다.

나아가 본 발명의 DNA 앱타머는 부갑상선 호르몬 분비 저하로 유발되는 질환에 대한 치료제로서 세포 치료제를 사용할 경우, 해당 세포치료제로서의 세포가 부갑상선 호르몬을 발현 및 분비하는지를 확인하기 위한 수단으로도 활용 가능하다.

상기 용어“생물학적 시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

His 융합 인간 유래 재조합 부갑상선 호르몬 단백질 준비

인간 유래 부갑상선 호르몬에 대한 앱타머 제작을 위해 NCBI로부터 사람 유래 부갑상선 호르몬 서열정보(NP_001303281.1)를 획득하였고, 획득한 서열정보를 바탕으로 말단에 His-tag가 부착된 재조합 부갑상선 호르몬 단백질을 확보하고자 하였다. 최종적으로 말단에 His-tag가 부착된 재조합 부갑상선 호르몬(Cloud-clone corp, USA)을 선별하였으며, 이를 본 발명의 DNA 앱타머에 대한 표적물질로서 활용하였다.

<실시예 2>

부갑상선 호르몬에 특이적인 DNA 앱타머 제작

<2-1> PCR 기법을 이용한 DNA 랜덤 라이브러리 증폭

부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH)에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 76 bp의 주형 DNA (5’-ATACCAGCTTATTCAATT N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')(서열번호 20)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 Bioneer (Korea)에 주문 제작하였다(정방향 프라이머 : 5‘-ATACCAGCTTATTCAATT-3’(서열번호 21), 바이오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머 : 5’-바이오틴-AGATAGTAAGTGCAA TCT-3‘(서열번호 22).) 임의의 DNA 라이브러리는 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. PCR에 의한 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.25 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.75 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20 주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다.

PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인하였으며(도 1 참조), PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.

<2-2> 비대칭(Asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭

PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR를 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 상기<2-1>을 통하여 획득한 주형 DNA 7 ㎕, 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 2.5 mM dNTP 혼합물 8 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 10 ㎕, 25 uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 62.5 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. 비대칭 PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15 주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가 신장시키는 반응을 수행하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였고, 나머지 DNA는 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 통상적으로 사용하는 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 활용하였다. 반응액을 동일 부피의 PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액 만을 회수하였고, 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 DNA만을 회수하였다. 회수한 DNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 DNA 중 4 ㎕를 취하여 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다.

<2-3> 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작 및 회수

비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 바이오틴이 붙어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, <2-2> 에서 획득한 DNA 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(Denaturation) 하였다. dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 수득하였다.

이후, 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10 분간 원심분리한 후, 상층액 만을 회수하여 ssDNA를 확보하였다. 반응액에서 순수한 ssDNA를 확보하기 위하여 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행하였는데, 즉, 반응액을 동일 부피의 PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액 만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다.

<실시예 3>

SELEX 기법을 활용한 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머의 선별

<3-1> SELEX에 이용되는 각 용액의 조성

SELEX에 사용되는 용액의 조성은 다음과 같다.

1X his binding buffer : 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.9)

1X his washing buffer : 60 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.9)

1X 앱타머 선별 용액: 10 mM PBS (pH 7.4)

2X 앱타머 선별 용액: 20 mM PBS (pH 7.4)

<3-2> SELEX에 이용될 ssDNA의 앱타머 구조 제작 및 부갑상선 호르몬과 ssDNA 앱타머의 결합유도

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여, 상기 실시예어서 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 60 ㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 100 ㎕을 첨가한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.

안정적으로 3차원 구조가 완성된 ssDNA 앱타머에 상기 실시예 1에서 준비한 부갑상선 호르몬 10 ㎕를 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 ssDNA 앱타머와 부갑상선 호르몬 간의 결합을 유도하였다.

<3-3> 부갑상선 호르몬에 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 부갑상선 호르몬 결합 Ni - NTA 아가로즈 레진(agarose resin) 활성화 및 SELEX 방법을 이용한 ssDNA 앱타머의 선별

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 재조합 단백질의 his-tag와 특이적으로 결합하는 Ni-NTA agaroes resin(QIAGEN, German)을 사용하였다. 우선, Ni-NTA agarose resin 200 ㎕에 1X his binding buffer 500 ㎕를 첨가한 후, 교반을 실시하였다. 이후, 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10 분)를 통하여 상층액을 제거한 후, 활성화된 Ni-NTA agarose resin에 상기 <3-2>에서 준비한 ssDNA 앱타머와 결합된 부갑상선 호르몬을 첨가하여 Ni-NTA agarose resin의 결합을 4℃에서 1시간 동안 유도하였다. Ni-NTA agarose resin과 결합하지 않은 재조합 부갑상선 호르몬을 제거하기 위하여 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10 분)를 통하여 상층액을 제거하였다. 이후, 1X his washing buffer를 이용하여 3회 세척함으로써 부갑상선 호르몬에 비특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머를 모두 제거하였다. 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머는 1X DNA 앱타머 용출 용액 200 ㎕를 첨가하여 85℃에서 5분간 반응시켜 변성시킨 뒤, 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10 분)를 통해 회수하였다. 회수과정은 총 2회 실시되었으며, 부갑상선 호르몬 특이 결합 DNA 앱타머 용출 용액으로부터 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 회수하였다.

<3-4> Negative SELEX을 통한 비특이적 ssDNA 앱타머 제거

부갑상선 호르몬에 결합하지 않고 Ni-NTA agarose resin에 비특이적으로 흡착하는 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 6회와 7회 사이에는 부갑상선 호르몬이 고정되어 있지 않은 Ni-NTA resin을 활용하여 negative SELEX을 수행하였다. 1X PBS 버퍼를 이용하여 활성화된 Ni-NTA resin 컬럼에 상온에서 식힌 ssDNA 앱타머를 1시간 동안 반응시킨 후 컬럼에 결합하지 않고 나온 ssDNA 앱타머 용액을 7회 SELEX에 이용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 양과 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 거칠게 하여 목표 물질인 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 앱타머만을 수득하였다.

<실시예 4>

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 최적 SELEX 라운드 선별을 위한 친화성 테스트

SELEX를 10 라운드까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머에 대한 부갑상선 호르몬 친화성을 정량적으로 확인하기 위해, 각 라운드에서 회수된 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합한 ssDNA의 농도를 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 측정하였다.

나노드랍(Nano-drop)을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 9 라운드의 농도는 802.3 ng/㎕ 이고, 10 라운드의 농도는 706.3 ng/㎕인 것으로 나타나, 9 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 부갑상선 호르몬에 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9 라운드 풀임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

<실시예 5>

부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 선별 및 클로닝

나노드랍(Nano-drop)을 통하여 부갑상선 호르몬과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 9 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머 : 5‘-ATACCAGCTTATTCAATT-3’(서열번호 23), 역방향 프라이머 : 5’-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’(서열번호 24)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 Solgent의 T-블런트 클로닝 키트를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4㎕, 6× T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5 분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격(heat shock)을 가하여 형질 전환시킨 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 이후 여기에 900 ㎕의 SOC 배지 (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose)를 첨가한 후, 37℃에서 40 분 동안 배양한다. 배양 후, 200㎕의 용액을 취하여 앰피실린(ampicillin, 50㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖), X-gal(50㎍/㎖), IPTG (5㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트 (Solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다. 서열 분석을 통하여 중복되지 않은 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 서열 19개를 확보할 수 있었고, 하기 표 1에 부갑상선 호르몬의 결합 DNA 앱타머 19개의 서열을 나타내었다.

< 실시예 6>

나노드랍을 이용한 부갑상선 호르몬에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 친화도 테스트 및 구조 결정

부갑상선 호르몬에 최적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 5를 통해 확보한 앱타머 서열을 가지는 클론을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하였다. 각각의 서열을 가지는 앱타머는 동일한 농도로 제작하여 SELEX를 재진행하여 회수된 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 서열번호 9, 14 및 16의 DNA 앱타머들이 다른 DNA 앱타머에 비해 더 높은 농도인 것을 확인할 수 있었고(도 3 참조), 이들 선택된 앱타머들에 대한 구조를 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 함으로써 구조를 확인하였다(도 4 참조).

<실시예 7>

SPR을 통한 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머의 검출능 테스트

<7-1> 부갑상선 호르몬과 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 각 친화도 테스트를 위한 부갑상선 호르몬 단백질 코팅 센서 칩 CM5 제작 실험

부갑상선 호르몬과 상기 실시예 6에서 확인한 3개의 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore X100(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다.

부갑상선 호르몬 단백질과 3개의 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도 확인은, 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare)을 이용하였다. 센서 칩 CM5는 0.1M N-hydroxysuccinimide(NHS)와 0.4M N-ethyl-N'-(dimethyl aminopropyl)carbodiimide(EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 칩에 흘려 활성화시켜 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-hydroxysuccinimide ester로 전환하였으며, NHS-ester로 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에 부갑상선 호르몬 단백질로 코팅하기 위하여 10 mM NaOAc (pH4.0)에 녹아있는 0.5 ㎍/㎕ 농도의 부갑상선 호르몬 단백질을 35 ㎕/min의 속도로 7분 동안 처리하여 칩 표면에 부갑상선 호르몬 단백질을 고정하였다. 부갑상선 호르몬 단백질이 고정되어 있는 센서 칩은 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)로 불활성화시켜 다른 시약 및 ssDNA 앱타머가 칩에 직접 붙는 것을 방지하였으며, 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득하였다. 부갑상선 호르몬 단백질로 코팅된 센서 칩 CM5 모식도는 도 5에 나타내었다.

<7-2> 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머의 표적 단백질과의 친화력 평가

부갑상선 호르몬 결합 앱타머인 PTH9(서열번호 9), PTH14(서열번호 14), PTH16(서열번호 16)과의 정략적 친화도 평가를 위하여, 각 후보군의 ssDNA 앱타머를 HBS-EP 버퍼(GE Healthcare)에 녹여 다양한 농도(300nM, 200nM, 100nM, 50nM, 10nM, 0nM)로 기 제작하여 확보한 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머군을 부갑상선 호르몬 단백질을 붙이지 않은 센서 칩 (채널 1)과 부갑상선 호르몬 단백질이 고정된 (채널 2) 센서 칩에 순차적으로 주입함으로써, 본 발명자들은 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA　앱타머 후보군과 부갑상선 호르몬 단백질 간의 해리상수 (K _D, dissociation), 즉 친화도를 분석하였다. 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K _D, dissociation) 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

DNA 앱타머	해리상수(KD)M
PTH9	1.435 × 10-9
PTH14	3.622 × 10-11
PTH16	8.895 × 10-10

<실시예 8>

최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머의 digoxigenin 변형(dig modification) 및 HRP (Horseradish peroxidase)가 부착된 digoxigenin 결합 DNA 앱타머의 제작

<8-1> 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머의 digoxigenin modification

상기 실시예 7에서 선별한 3개의 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머의 부갑상선 호르몬 단백질 탐지능을 확인하기 위하여, IDT(Integrated DNA Technologies, America)에 합성 의뢰하여 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머의 5‘ 말단에 digoxigenin (Dig)을 부착하였다. 합성된 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머는 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 현탁시켜 동일한 농도(190 ng/㎕)로 맞춰주었다.

동일한 농도로 준비된 dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머를 50 ㎕씩 분주한 후, 이를 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.

<8-2> Dig 결합 Dig-1 앱타머의 HRP 부착 실험

Dig가 결합된 Dig-1 앱타머의 HRP 부착을 진행하기 위하여, IDT(Integrated DNA Technologies, America)에 합성을 의뢰하여 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 확보하였다. 이후, Dig가 결합된 Dig-1 앱타머의 HRP 변형은 Alpha diagnostic (USA)에서 판매하고 있는 Horseradish peroxidase (HRP) conjugation kit (Micro)를 이용하여 진행하였다. Dig-1 앱타머는 1X conjugation buffer (0.1M NaHCO3, pH 9.5)를 이용하여 앱타머를 HRP로 변형하기 위한 환경을 조성하였으며, 이후 preactivate된 HRP solution을 첨가한 후 4℃에서 3시간 반응하였다. 이후 반응이 끝난 샘플에는 blocking buffer를 샘플 1ml당 200 ul를 첨가한 후, 실온에서 1시간 이상 반응 시켜, HRP 변형 과정을 마무리 하였다. 이후 4℃에서 PBS로 투석하고, stabilizing buffer를 샘플 500 ul 당 1 ml를 첨가하여 샘플 안정성을 확보하였다.

<실시예 9>

부갑상선 호르몬 특이적 결합 DNA 앱타머 및 Dig 결합 앱타머를 활용한 재조합 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 과발현 세포에서의 탐지 실험

<9-1> Dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머와 HRP가 부착된 Dig 결합 DNA 앱타머를 활용한 부갑상선 호르몬 검출

실시예 1에서 준비한 부갑상선 호르몬 단백질을 SDS-PAGE (15%)에 3개로 나누어 로딩한 후, Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인(GE Healthcare, Sweden)으로 옮겼다. 부갑상선 호르몬 단백질이 결합된 멤브레인을 1X TBS-T buffer(50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 0.1%(v/v) Tween 20)를 이용하여 10분씩 3회에 걸쳐 세척하였으며, 이후 멤브레인은 블록킹 버퍼 (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 반응을 진행하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후, TBS-T buffer를 이용하여 10분씩 3회에 걸쳐 세척하였고, 실시예 <8-1>에서 안정한 3차 구조를 형성한 dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 26 ㎕를 4 ㎖의 blocking buffer (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))에 첨가한 후, 부갑상선 호르몬이 결합된 멤브레인과 4℃에서 3시간 동안 반응을 진행하여 Dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머와 멤브레인에 부착된 부갑상선 호르몬의 결합을 유도하였다. 이후, TBS-T buffer를 이용하여 20분씩 6회에 걸쳐 세척을 진행하였으며, 실시예 <8-2>에서 제작된 HRP가 부착된 Dig결합 dig-1 앱타머를 4 ㎖의 blocking buffer (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))에 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 반응을 진행하여 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 말단의 dig와 HRP가 부착된 dig결합 dig-1 앱타머의 결합을 유도하였다. 마지막으로 TBS-T buffer를 이용하여 20분씩 12회에 걸쳐 세척을 진행하였고 각 반응에 대한 시그널을 확인하기 위하여 Western blotting detection kit (Advansta, USA)을 사용하였다. 확인을 통하여 부갑상선 호르몬의 표적 size에서 신호를 확보할 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).

<9-2> Dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 단백질 결합 DNA 앱타머와 HRP가 부착된 Dig 결합 DNA 앱타머를 활용한 부갑상선 호르몬 검출

DNA 앱타머 및 HRP 변형 Dig 결합 앱타머를 이용하여 부갑상선 호르몬 과발현 세포로부터 부갑상선 호르몬 확인 실험을 진행하기 위하여 전체 세포 활성형 단백질을 획득하였다. 이때 전체 세포 활성형 단백질은 부갑상선 호르몬 과발현 세포를 용해버퍼를 이용하여 용해시킨 세포 용해물에 함유된 전체 세포의 단백질을 의미한다. 상기에서 획득한 부갑상선 호르몬 과발현 세포의 전체 세포 활성형 단백질을 SDS-PAGE (15%)를 통하여 확인하였고, SDS-PAGE를 통하여 확인된 단백질은 Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; GE Healthcare, Sweden)으로 옮겼다. 부갑상선 호르몬 단백질이 결합된 멤브레인을 1X TBS-T buffer(50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 0.1%(v/v) Tween 20)를 이용하여 10분씩 3회에 걸쳐 세척하였으며, 이후 멤브레인은 블록킹 버퍼 (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 반응을 진행하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후, TBS-T buffer를 이용하여 10분씩 3회에 걸쳐 세척을 진행하였으며, 실시예 <8-1>에서 안정한 3차 구조를 형성한 dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 26 ㎕를 4 ㎖의 blocking buffer (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))에 첨가한 후, 부갑상선 호르몬이 결합된 멤브레인과 4℃에서 3시간 동안 반응을 진행하여 Dig가 부착된 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머와 멤브레인에 부착된 부갑상선 호르몬의 결합을 유도하였다. 이후, TBS-T buffer를 이용하여 20분씩 6회에 걸쳐 세척을 진행하였으며, 실시예<8-2>에서 제작된 HRP가 부착된 Dig결합 dig-1 앱타머를 4 ㎖의 blocking buffer (5% bovine serum albumin, 1X TBS-T(pH 7.2))에 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 반응을 진행하여 최적 부갑상선 호르몬 결합 DNA 앱타머 말단의 dig와 HRP가 부착된 dig결합 dig-1 앱타머의 결합을 유도하였다. 마지막으로 TBS-T buffer를 이용하여 20분씩 12회에 걸쳐 세척을 진행하였고 이후 각 Western blotting detection kit (Advansta, USA)을 사용하여 시각화하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 앱타머를 기반으로 하는 앱타머 블롯팅 기법을 이용하여 10~15 kDa에서 부갑상선 호르몬의 시그널을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 본 발명에서 제작한 부갑상선 호르몬 특이적 겹합능을 갖는 DNA 앱타머를 이용할 경우, 부갑상선 호르몬 단백질을 용이하고 정확하게 검출할 수 있는 용도 뿐만 아니라, 혈액 내 부갑상선 호르몬 단백질의 정량을 정확하게 측정하여 부갑상선 호르몬에 의해 유발되는 질환을 진단 및 검사하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University and Ewha Womans University <120> DNA Aptamer Specifically Binding to Prathyroid Hormone and Uses Thereof <130> NPDC68492 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH1 DNA aptamer sequence <400> 1 cactcgtcga agctttactt tccatagcac tcggtttatg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH2 DNA aptamer sequence <400> 2 ccctgcctta tccattaata aacctatatt acatctacgg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH3 DNA aptamer sequence <400> 3 cgaagtgagc atgttggctg tattttacgc gttttacccg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH4 DNA aptamer sequence <400> 4 ccgttaaatc tacatgttca ttatcctgtt aagagcgtgg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH5 DNA aptamer sequence <400> 5 gcccgtcact attaacttga tatttattaa ccgccctacg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH6 DNA aptamer sequence <400> 6 ccaccacgtc tacttattac tagtccgttt cgctcttgta 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH7 DNA aptamer sequence <400> 7 cactctagtg tattattcat tacttcctca atatgtgtcg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH8 DNA aptamer sequence <400> 8 ccctgttaat acacgccatt ataatccatc acttattttg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH9 DNA aptamer sequence <400> 9 ccactataac tagcttctat tattaactag agtagtatgg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH10 DNA aptamer sequence <400> 10 ccacacggct caattatcct ttatttactt gattttacgg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH11 DNA aptamer sequence <400> 11 ccacgatcat atcaacgatt acttgccagc agatttatgg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH12 DNA aptamer sequence <400> 12 ccacgtccca ttggtgccag ttaattcaat acgtttttgg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH13 DNA aptamer sequence <400> 13 ccacttatac gtcttattat cacgcttatg tttattatgg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH14 DNA aptamer sequence <400> 14 cacgaaagat caattacatg cttatcattt tattcattgg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH15 DNA aptamer sequence <400> 15 gcacattcct gactctattt agttatatcc cttgttgaca 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH16 DNA aptamer sequence <400> 16 ccgtgatcac gttttaatct tccactcgct agctgcctcg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH17 DNA aptamer sequence <400> 17 ccaatactac tcttacttgt tctaccgtgt tagcttcgtg 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH18 DNA aptamer sequence <400> 18 ccacagagct catattactt gattctcgac ttcctgcttg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH19 DNA aptamer sequence <400> 19 acctgagtag aggataacat taccccgaat ttacatggta 40 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA sequence(N40) <400> 20 ataccagctt attcaattna gatagtaagt gcaatct 37 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer <400> 21 ataccagctt attcaatt 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer(5' biotinylation) <400> 22 agatagtaag tgcaatct 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 round ssDNA aptamer F primer <400> 23 ataccagctt attcaatt 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 round ssDNA aptamer R primer <400> 24 agatagtaag tgcaatct 18 <210> 25 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH amino acid sequence <400> 25 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln <210> 26 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged PTH amino acid sequence <400> 26 Met Gly His His His His His His Ser Gly Ser Glu Phe Arg Ser Val 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met 20 25 30 Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe 35 40 45 Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg 50 55 60 Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser 65 70 75 80 Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys 85 90 95 Ser Gln

Claims (15)

1. 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질에 특이적으로 결합하는, 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머(aptamer).
2. 제1항에 있어서,
   상기 DNA 앱타머는 사람 부갑상선 호르몬 단백질 또는 His 융합 부갑상선 호르몬 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, DNA 앱타머(aptamer).
3. 제1항에 있어서,
   상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, DNA 앱타머(aptamer).
4. 제3항에 있어서,
   상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴, 티올기 및 디곡시게닌(digoxigenin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지된 것을 특징으로 하는, DNA 앱타머(aptamer).
5. 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 조성물.
6. 제5항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 키트.
7. 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)가 기판 상에 고정되어 부갑상선 호르몬 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 칩.
8. (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및
   (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함하는,
   부갑상선 호르몬 단백질의 검출 방법.
9. 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)를 유효성분으로 포함하는 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 질환은 칼슘저혈증, 부갑상선기능항진증, 부갑상선기능감퇴증, 부갑상선기능항진증-관련 칼슘과혈발증, 악성 칼슘과혈증, 신부전증, 요로결석 및 고혈압증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단용 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. (1) 생체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)와 접촉시키는 단계; 및
    (2) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 단백질 특이적 결합반응을 통해 상기 생물학적 시료 내의 부갑상선 호르몬의 존부 또는 함량을 측정하는 단계;를 포함하는,
    부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 질환은 칼슘저혈증, 부갑상선기능항진증, 부갑상선기능감퇴증, 부갑상선기능항진증-관련 칼슘과혈발증, 악성 칼슘과혈증, 신부전증, 요로결석 및 고혈압증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 부갑상선 호르몬 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
15. 제1항의 DNA 앱타머(aptamer)가 기판 상에 고정되어 부갑상선 호르몬 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH) 검출용 마이크로어레이.

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