KR102028498B1 - Method for improving the resistance to drought stress using RING finger E3 ligase CaASRF1 in plants - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a novel capsicum annuum ABA sensitive RING Finger E3 ligase 1 (CaASRF1) gene/protein derived from red pepper, and a method for improving resistance to drought stress of plants using the same. The present invention has identified the CaASRF1 gene encoding a protein enhancing resistance to drought stress. The CaASRF1 protein functions as a positive regulator of ABA signaling and is confirmed with the effect of enhancing resistance to the drought stress in transformed plants overexpressed with the protein. The present invention can be utilized for the improvement of crops and the like which can be used by humans through the regulation of expression of the CaASRF1 gene, and is expected to be useful for improving the productivity of plants.

Description

고추 녹광품종 유래 E3 ligase인 CaASRF1 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 {Method for improving the resistance to drought stress using RING finger E3 ligase CaASRF1 in plants}CaASRF1, an E3 ligase derived from red pepper rust varieties, and a method for enhancing the dry stress resistance of plants using the same

본 발명은 고추 유래 신규 CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) gene, protein, and method for enhancing dry stress resistance of plants using the same.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화시킨다. Global warming causes extreme climate change, causing environmental stress that hinders the normal growth and development of plants, against which plants have evolved sophisticated defense mechanisms to survive in adverse environments such as cold, high salt and drought. Drought, for example, is caused by a poor water environment and severely affects the normal growth of plants, resulting in reduced yields of grains, which can be used to control pore closure, abscisic acid, Activate various defense mechanisms such as synthesis and accumulation of ABA).

ABA는 비 생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.ABA is a regulator for protecting plants against abiotic stress, particularly dry stress, and is known to play a very important role in plant growth and development. Reportedly, plants that pre-treated and stressed ABA are more resistant to stress than those that do not, whereas mutant plants that do not produce ABA or do not respond to ABA are weak to stress. Therefore, using proteins involved in the reaction of ABA, it is expected to develop plants with improved resistance to environmental stress.

ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절다고 알려져 있으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려져 있다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.ABA signaling is known to regulate the expression of various stress-related genes such as transcription factors and E3 ligase involved in osmotic adaptation and regulation of root hydraulic conductivity, but the complete ABA signaling pathway is still unknown. It wasn't. Initiation of ABA signaling in plant cells requires the presence of ABA receptors and signaling to downstream proteins. To date, it is known that PYR / PYL / RCARs play a role in recognizing ABA as an ABA receptor. Recognition of ABA by receptors promotes expression of specific genes and ion channel activation through phosphorylation of target proteins, which allows plants to adapt to adverse environments.

한편, 26S 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 (ubiquitination)는 진핵 세포에서 공통된 단백질 변형 메카니즘이다. 식물에서의 유비퀴틴화는 전사 인자, 호르몬 수용체 및 손상된 단백질과 같은 대상의 다양한 세포내 신호 프로세스에 필수적이다. 유비퀴틴화는 E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3 (ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다. E3 리가아제는 다수의 다중 이성체를 가지고 있으며, 표적 단백질의 특성을 결정한다. 상기 E3 리가아제는 구조적 도메인이 단일 혹은 다중 서브유닛이 포함되는지에 따라 두 종류의 슈퍼패밀리로 구분된다. 이 때, 슈퍼패밀리 중 하나는, Really Interesting New Gene (RING), Homology to E6-AP Carboxyl Terminus (HECT) 및 U-box E3 리가아제로 구성되고, 다른 하나는, CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1 (CUL4-DDB1), Anaphase Promoting Complex (APC) 및 Skp1-cullin-Fbox (SCF) E3 리가아제로 구성된다.Ubiquitination by the 26S proteasome, on the other hand, is a common protein modification mechanism in eukaryotic cells. Ubiquitination in plants is essential for various intracellular signaling processes of the subject, such as transcription factors, hormone receptors, and damaged proteins. Ubiquitinylation is an important post-translational regulatory process caused by the sequential action of three enzymes consisting of ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3). When ubiquitin is activated by E1, the activated ubiquitin is delivered to E2 and E3 ligase binds ubiquitin with the target protein. In this process, E3 ligase determines and binds to the target protein. E3 ligase has a number of multiple isomers and determines the properties of the target protein. The E3 ligase is divided into two types of superfamily depending on whether the structural domain contains a single or multiple subunits. At this time, one of the superfamily, Really Interesting New Gene (RING), Homology to E6-AP Carboxyl Terminus (HECT) and U-box E3 ligase, the other, CULLIN4-Damaged-specific DNA binding protein1 (CUL4-DDB1), Anaphase Promoting Complex (APC) and Skp1-cullin-Fbox (SCF) E3 ligase.

한편, 애기 장대의 게놈은 1,400개 이상의 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있으며, 상기 E3 유비퀴틴 리가아제는 RING 도메인의 유형에 따라 여덟 개의 서브 그룹으로 세분화된 E3 U-box 리가아제를 포함하는 약 477개의 RING finger 도메인을 포함한다. 하지만, 현재까지는 단지 몇 종류의 RING type E3 리가아제의 정확한 기능만이 밝혀져 있는 실정(한국 등록 특허 10-1335440)이다.On the other hand, the genome of the baby pole contains more than 1,400 E3 ubiquitin ligase, which contains about 477 E3 U-box ligase subdivided into eight subgroups according to the type of RING domain. Include the RING finger domain. However, to date, only the exact function of several types of RING type E3 ligase is known (Korean Patent Registration 10-1335440).

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.As desertification progresses today, water shortages cause great problems for agriculture and the environment. Therefore, it is necessary to develop plants that can withstand and live in a dry environment with less water. When these technologies are developed and applied to crops, agricultural production is expected to increase significantly, especially in arid regions, where plants with improved drying resistance, i.e. plants that can lower transpiration, are conducive to survival, thus contributing to increased agricultural productivity. In addition, it can be useful for environmental cleanup in very dry areas.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국등록특허 10-1291365), 아직 미비한 실정이다.Therefore, a method for improving the resistance to dry stress of plants has been the main research object, and in this regard, research on genes related to dry stress resistance and growth and related transgenic plants have been made (Korea Patent Registration) 10-1291365), it is still inadequate.

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추에서 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors identified CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) gene in red pepper, while studying to investigate the relationship between dry stress response through ABA signaling pathway regulation. The present invention has been completed by elucidating that it functions as a positive regulator of ABA signaling that enhances proliferation.

이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자, 상기 CaASRF1 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaASRF1 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to encode a protein that enhances resistance to dry stress, CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the sequence encoded by the CaASRF1 gene It is an object to provide a CaASRF1 protein consisting of the amino acid sequence of No. 2.

본 발명의 다른 목적은 신규의 CaASRF1 유전자/단백질, 및 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the invention is a novel CaASRF1 Gene / protein, and to provide a composition for enhancing the dry stress resistance of plants comprising the gene or protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 CaASRF1 유전자를 식물체에 형질 전환하여 과 발현시킴으로써 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention CaASRF1 It is to provide a method for enhancing the dry stress resistance of plants by transforming and overexpressing the gene in plants.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a transgenic plant having improved dry stress resistance by the above method.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자, 상기 CaASRF1 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaASRF1 단백질을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention encodes a protein that enhances resistance to dry stress, CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) gene, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, It provides a CaASRF1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoded by the CaASRF1 gene.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for enhancing the dry stress resistance of plants, comprising the gene or the protein as an active ingredient.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for enhancing dry stress resistance of a plant, comprising the following steps.

(a) CaASRF1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및(a) transforming a plant with a gene of SEQ ID NO: 1 encoding a CaASRF1 protein; And

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaASRF1 단백질을 과발현시키는 단계.(b) overexpressing CaASRF1 protein in the transformed plant.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.The present invention also provides a transgenic plant having improved dry stress resistance by the above method.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 신규 CaASRF1 유전자를 동정하였으며, CaASRF1 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과 발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaASRF1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다. The present invention provides a novel CaASRF1 encoding protein that enhances resistance to dry stress. Genes were identified, and CaASRF1 protein acts as a positive regulator of ABA signaling and has been found to enhance dry stress resistance in transgenic plants expressing the protein. Through expression control, it can be used to improve crops that can be used by human beings, and is expected to be particularly useful for improving plant productivity.

도 1a는 RING zinc finger C3H2C3 유형 도메인의 정렬을 확인한 결과이다. 도 1b는 CaASRF1 단백질의 추정 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열의 비교를 관찰한 결과이다. 도 1c는 CaASRF1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위해 CaASRF1-GFP 융합 단백질의 GFP(Green fluorescent protein) 신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 1d는 상기 CaASRF1의 발현 양상을 확인하기 위해 고추식물에 후추 Actin1 유전자를 내부 통제한 채 NaCl(200mM), 건조, ABA(10μM) 각각 처리한 후 한 결과이다. 도 1e는 CaASRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인하기 위해, 유비퀴틴, E1(UbE1) 및 E2(UBHPCH5b)의 존재하에 MBP-CaASRF1 융합 단백질의 E3 유비퀴틴 리가제 활성(E3 ubiquitin ligase activity)을 나타낸 결과이다.
도 2a는 CaAsRF1-silenced 고추 식물 잎 (TRV : CaASRF1) 및 대조군(control plants) 인 빈 벡터 고추 식물(empty vector control pepper plants) 잎 (TRV : 00)에서 ABA 처리 후 CaASRF1 발현의 RT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 2b는 CaAsRF1-silenced 식물체 및 대조군에 건조스트레스를 주었을 때 표현형의 차이를 확인한 결과이다. 도 2c는 다시 물 준 후 1일이 지난 때 CaAsRF1-silenced 식물체와 대조군의 생존률을 확인한 결과이다. 도 2d는 대조군과 CaAsRF1-silenced 식물체로부터 잎을 제거한 후 매 시간 별로 증발하는 물손실량을 확인한 결과이다. 도 2e는 CaAsRF1-silenced 식물체에 ABA(50 μM) 처리 후의 잎 온도가 감소됨을 확인한 결과이다. 도 2f는 CaAsRF1-silenced 식물체에 다양한 농도의 ABA 처리 후 기공 구획을 관찰한 결과이다.
도 3a는 야생형 식물(wild-type plant , WT)과 CaASRF1-OX 형질 전환 계통에서 CaASRF1 발현의 RT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 3b는 CaASRF1-OX 형질전환 식물이 ABA에 감수성이 높은 표현형을 보여주기 위해 CaASRF1-OX 식물과 야생형에 ABA를 각각 다른 농도로 처리한 후, 5일 후의 대표이미지를 관찰한 결과이다. 도 3c는 다양한 농도의 ABA 처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 종자발아율을 나타낸 결과이다. 도 3d는 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 묘목성장을 알아보기 위해, ABA(0.5μM)처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물 자엽량을 관찰한 결과이다. 도 3e 및 3f는 ABA 처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 일차 뿌리 신장을 관찰한 결과이다.
도 4a는 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 가뭄저항성 표현형을 관찰한 결과이다. 도 4b는 재 급수 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 생존률을 관찰한 결과이다. 도 4c는 잎을 분리한 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물과 야생형의 수분손실을 관찰한 결과이다. 도 4d는 ABA(0μM) 및 ABA(10μM) 처리 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물 잎의 온도가 증가된다는 것을 관찰한 결과이다. 도 4e 및 4f는 3주된 각각 식물에서 잎 껍질을 수확하고 ABA(0μM) 및 ABA(10μM) 함유하는 SOS완충액에서 배양한 후에 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 기공구멍을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 4g는 CaASRF1-OX 형질전환 식물에 3시간동안 가뭄스트레스를 준 후에 가뭄 - 유도성 유전자의 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction , qRT-PCR) 분석을 관찰한 결과이다.
도 5a는 ClustalW2를 사용하여 CaAIBZ1 단백질과 그 상동성 bZIP 전사 인자의 아미노산 정렬을 나타낸 결과이다. 도 5b는 100 μM abscisic acid (ABA), 가뭄 또는 200 mM NaCl로 처리 한 후 고추잎에서 CaAIBZ1 발현의 qRT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 5c는 담배(Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질의 일시적인 발현에 의한 CaAIBZ1의 세포 내 위치를 확인한 결과이다. 도 5d는 효모단백질잡종분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)을 통한 CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용을 관찰한 결과이다. 도 5e는 CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용에 대한 풀다운 분석(pull-down assay)을 관찰한 결과이다. 도 5f는 이분자 형광 상보성 분석(Bimolecular fluorescence complementation , BiFC) 분석을 통해 CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 5g는 CaAIBZ1에 의한 CaASRF1의 시험관 내 유비퀴틴화(In vitro ubiquitination)를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 ABA 처리 후에 야생형(Wild-type , WT) , CaASRF1 과발현(CaASRF1-OX) 형질전환 식물, CaAIBZ1 과발현(CaASRF1-OX) 형질전환 식물 및 CaASRF1/CaAIBZ1 과발현(CaASRF1-OX/CaAIBZ1-OX) 형질전환 식물의 발아률을 관찰한 결과이다. 도 6b는 ABA 처리 후 WT과 상기 CaASRF1-OX 식물, CaAIBZ1-OX 식물 및 CaASRF1-OX/CaAIBZ1-OX 식물의 1차 뿌리 신장을 관찰한 결과이다.Figure 1a is the result of confirming the alignment of the RING zinc finger C3H2C3 type domain. 1B is a result of observing a comparison of the estimated amino acid sequence of CaASRF1 protein with another amino acid sequence. Figure 1c is a result of observing the GFP (Green fluorescent protein) signal of the CaASRF1-GFP fusion protein to confirm the position in the plant cell of the CaASRF1 protein by confocal microscopy. Figure 1d is a result after treatment with NaCl (200mM), dried, ABA (10μM) while internal control of pepper Actin1 gene in pepper plants to confirm the expression of the CaASRF1. Figure 1E shows the E3 ubiquitin ligase activity of MBP-CaASRF1 fusion protein in the presence of ubiquitin, E1 (UbE1) and E2 (UBHPCH5b) to confirm auto-ubiquitination of CaASRF1. Is the result.
2A shows RT-PCR analysis of CaASRF1 expression after ABA treatment in CaAsRF1-silenced pepper plant leaves (TRV: CaASRF1) and control vector empty vector control pepper plants leaves (TRV: 00). The result is confirmed. Figure 2b is a result of confirming the difference in phenotype when given dry stress to CaAsRF1-silenced plants and controls. Figure 2c is a result of confirming the survival rate of CaAsRF1-silenced plants and the control when 1 day after watering again. Figure 2d is the result of confirming the amount of water loss evaporated every hour after removing the leaves from the control group and CaAsRF1-silenced plants. Figure 2e is a result of confirming that the leaf temperature after ABA (50 μM) treatment on CaAsRF1-silenced plants is reduced. Figure 2f is a result of observing the pore compartment after various concentrations of ABA treatment on CaAsRF1-silenced plants.
Figure 3a is a result of confirming the RT-PCR analysis of CaASRF1 expression in wild-type plants (WT) and CaASRF1-OX transformation line. Figure 3b is a result of observing the representative image 5 days after the CaASRF1-OX transgenic plants treated with different concentrations of ABA in the CaASRF1-OX plants and wild type to show a highly sensitive phenotype to ABA. Figure 3c is a result showing the seed germination rate of wild-type and CaASRF1-OX transformed plants after various concentrations of ABA treatment. Figure 3d is a result of observing the wild-type and CaASRF1-OX transgenic cotyledon amount after ABA (0.5μM) treatment to determine the seedling growth of CaASRF1-OX transgenic plants. 3E and 3F show the results of primary root elongation of wild-type and CaASRF1-OX transformed plants after ABA treatment.
Figure 4a is a result of observing the drought resistance phenotype of CaASRF1-OX transformed plants. Figure 4b is the result of observing the survival rate of CaASRF1-OX transformed plants after refeeding. Figure 4c is the result of observing the water loss of the CaASRF1-OX transformed plants and wild type after separating the leaves. Figure 4d is the result of observing that the temperature of CaASRF1-OX transgenic plant leaves increased after ABA (0μM) and ABA (10μM) treatment. 4E and 4F show the results of observing the pore of wild-type and CaASRF1-OX transformed plants after harvesting leaf bark from each of the three-week-old plants and culturing in SOS buffer containing ABA (0 μM) and ABA (10 μM). . Figure 4g shows the results of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis of drought-inducible genes after 3 hours of drought stress on CaASRF1-OX transgenic plants.
Figure 5a shows the amino acid alignment of CaAIBZ1 protein and its homologous bZIP transcription factor using ClustalW2. 5b shows the results of qRT-PCR analysis of CaAIBZ1 expression in red pepper leaves after treatment with 100 μM abscisic acid (ABA), drought or 200 mM NaCl. Figure 5c is a result of confirming the intracellular location of CaAIBZ1 by transient expression of green fluorescent protein (GFP) fusion protein in tobacco (Nicotiana benthamiana) epidermal cells. Figure 5d is the result of observing the interaction between CaASRF1 and CaAIBZ1 through yeast protein hybrid (Yeast two-hybrid assay, Y2H). FIG. 5E shows the results of a pull-down assay of the interaction between CaASRF1 and CaAIBZ1. FIG. 5F shows the results of observing the interaction between CaASRF1 and CaAIBZ1 through bimolecular fluorescence complementation analysis (BiFC) analysis. Figure 5g shows the results of in vitro ubiquitination (In vitro ubiquitination) of CaASRF1 by CaAIBZ1.
6A shows wild-type (Wil-type, WT), CaASRF1 overexpressing (CaASRF1-OX) transgenic plants, CaAIBZ1 overexpressing (CaASRF1-OX) transgenic plants and CaASRF1 / CaAIBZ1 overexpressing (CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX) after ABA treatment. The germination rate of the transgenic plants was observed. Figure 6b is the result of observing the primary root elongation of WT and CaASRF1-OX plants, CaAIBZ1-OX plants and CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX plants after ABA treatment.

본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 ABA 신호전달 기전에서 양성 조절인자 (positive regulator)로 기능하는 CaASRF1 유전자를 동정하였고, 상기 유전자가 과 발현된 형질전환 애기 장대 식물체에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명은 완성되었다. We have identified a CaASRF1 gene that functions as a positive regulator in ABA signaling mechanisms in dry stress in plants, and has found an increase in resistance to dry stress in transgenic baby plants that are overexpressed. The present invention was completed by confirming.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자 (pogitive regulator) 단백질을 암호화하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자를 제공한다.The present invention provides a CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) gene encoding a positive regulator protein for dry stress.

본 발명의 유전자인 CaASRF1은 바람직하게는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaASRF1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 바람직하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.CaASRF1, which is a gene of the present invention, preferably consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the protein encoded by the CaASRF1 gene may be preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. .

본 명세서에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaASRF1가 과 발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.As used herein, the term "positive regulator protein" refers to a protein that acts in an increasing direction in regulating life phenomena. That is, when CaASRF1, the gene of the present invention, is overexpressed, the ABA sensitivity may be increased, and the resistance to dry stress may be increased.

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 저항성에 대하여 연구하던 중, 앱시스산(ascisic avid; ABA)에 의해 유도된 ABA 감수성 E3 ligase 인 CaASRF1를 동정하여(실시예 2 참조), 상기 CaASRF1 유전자가 ABA 신호전달 및 비 생물적 스트레스 반응과 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다.The inventors of the present invention, while studying the dry stress resistance through the regulation of the ABA signaling pathway, by identifying the CaASRF1, ABA-sensitive E3 ligase induced by ascisic avid (ABA) (see Example 2), the CaASRF1 gene The purpose of this study was to determine whether is related to ABA signaling and abiotic stress response.

본 발명의 일실시예에서는, CaASRF1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위해 녹색 형광 단백질 ( green fluorescent protein; GFP ) 와 CaASRF1 융합 단백질을 제조하여 핵에서 GFP 형광이 발현되는 것을 확인하였고, 가뭄, ABA 및 염분과 같은 비 생물적 스트레스에 반응하는 CaASRF1 유전자의 발현수준을 확인하였으며, 유비퀴틴, E1(UbE1) 및 E2(UBHPCH5b)의 존재 하에 MBP -CaASRF1 융합 단백질의 E3 유비퀴틴 연결효소( ligase ) 가 활성 되는 것을 관찰하여 CaASRF1의 자가 유비퀴틴화( Auto-ubiquitination ) 를 확인하였다. (실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, the green fluorescent protein (GFP) and CaASRF1 fusion protein was prepared to confirm the position of the CaASRF1 protein in the plant cell, it was confirmed that GFP fluorescence is expressed in the nucleus, drought, ABA And the expression level of CaASRF1 gene in response to abiotic stress such as salinity was confirmed, E3 ubiquitin ligase of MBP -CaASRF1 fusion protein is activated in the presence of ubiquitin, E1 (UbE1) and E2 (UBHPCH5b) Observation confirmed the auto-ubiquitination of CaASRF1. (See Example 2).

본 발명의 다른 일실험예에서는, CaASRF1 유전자 침묵(CaASRF1-silenced) 식물체 및 대조군에 건조스트레스를 주었을 때 표현형의 차이를 확인하여, 생존률, 잎제거 후 물손실, ABA처리 후 온도변화, ABA 처리 후 기공구획을 관찰하여 CaASRF1-silenced 고추식물의 가뭄 내성이 감소한다는 사실을 확인하였다 (실험예 3 참조),In another experimental example of the present invention, CaASRF1 gene silencing (CaASRF1-silenced) plants and control groups to determine the difference in phenotype when dry stress is given, survival rate, water loss after leaf removal, temperature change after ABA treatment, after ABA treatment Pore block observation was observed to reduce the drought tolerance of CaASRF1-silenced pepper plants (see Experimental Example 3),

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, CaASRF1 과 발현 (CaASRF1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형 식물을 비교하여 CaASRF1-OX 형질전환 애기 장대 식물이 ABA 감수성이 증가한다는 사실을 확인하였다(실험예 4 참조) In another embodiment of the present invention, CaASRF1 and the expression (CaASRF1-OX) transgenic baby pole plants compared to wild type plants confirmed that the ABA susceptibility increased CaASRF1-OX transgenic baby pole plants (Experimental Example) 4)

본 발명의 또 다른 일실험예에서는, CaASRF1 과 발현 (CaASRF1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형 식물을 비교하여 CaASRF1-OX 형질전환 식물이 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가한다는 사실을 확인하였다 (실험예 5 참조).In another experimental example of the present invention, it was confirmed that CaASRF1-OX transgenic plants have increased resistance to drought stress by comparing CaASRF1 and expression (CaASRF1-OX) transgenic larvae and wild type plants (experimental) See Example 5).

효모 단백질 잡종법(Yeast two-hybrid assay)을 통해 CaASRF1와 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1)간의 상호작용을 확인하였고, CaASRF1 과 CaAIBZ1이 함께 과 발현 된 형질전환 애기 장대 식물이 ABA 감수성이 증가한다는 사실을 확인하였다. (실험예 6 및 7 참조)The yeast protein hybridization (Yeast two-hybrid assay) confirmed the interaction between CaASRF1 and CaAIBZ1 ( Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1). It was confirmed that the increase. (See Experimental Examples 6 and 7)

따라서, CaASRF1 단백질의 발현 또는 활성을 증진시킴으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성(내성)을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaASRF1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.Therefore, by enhancing the expression or activity of the CaASRF1 protein, it is possible to enhance the resistance (dry resistance) to the dry stress of the plant, and as another aspect of the present invention, the present invention provides a CaASRF1 protein or a gene encoding the same as an active ingredient It provides a composition for enhancing the drying resistance of the plant comprising a.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 된 식물체에서 CaASRF1 단백질을 과 발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법, 및 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다. As another embodiment of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) transforming a plant with a gene of SEQ ID NO: 1 encoding CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) protein; And (b) provides a method of improving the dry stress resistance of the plant comprising the step of over-expressing the CaASRF1 protein in the transformed plant, and provides a transformed plant enhanced dry stress resistance by the method.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the plant (sieve) is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, millet; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, peppers, strawberries, tomatoes, watermelons, cucumbers, cabbages, melons, pumpkins, green onions, onions, carrots; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut, rapeseed; Fruit trees including apple trees, pears, jujube trees, peaches, leeks, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots, bananas; Flowers, including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; And fodder crops including lysis, red clover, orchardgrass, alpha alpha, tolsque cue, perennial lyse, and the like, but most preferably, Arabidopsis or capsicum, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예 1. 실험준비 및 실험방법Example 1 Experiment Preparation and Experiment Method

1-1. 식물 재료 및 성장 조건1-1. Plant material and growing conditions

고추 (Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 고추 식물은 27±1℃ 조건의 생육실에서 16시간 빛/ 8시간 암주기로 백색 형광등(80 ㎛ol photons m^-2.S^-1) 빛 아래 성장시켰다. 담배 식물은 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 25±1℃ 조건의 성장 챔버에서 유지시켰다. 애기 장대(Arabidopsis thaliana, 생태형 Col-0) 식물 종자를 1 % sucrose와 Microagar (Duchefa 생화학)가 포함된 Murashige and Skoog (MS) 소금에서 발아시켰다. 모든 종자는 성장실에 넣기 전에, 4℃에서 2일간 개화결실을 맺게 하였고, 그 플레이트를 성장 챔버에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 24℃에서 배양하였다. 애기 장대 모종은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에 24℃에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 백색 형광등(130 ㎛ol photons m^-2.S^-1) 빛 아래 60% 상대습도로 유지시켰다.Pepper (Capsicum annuum L., cv. Nockwang), and Tobacco ( Nicotiana benthamiana ) seeds were steam sterilized (Peat moss: perlite: vermiculite = 5: 3: 2, v / v) / v), sand, and loam soil were mixed at 1: 1: 1 (v / v / v) and sown. The pepper plants were grown under the white fluorescent lamp (80 μm photons m ⁻² .S ⁻¹ ) at 16 ± 8 h dark cycle in a growth room at 27 ± 1 ° C. Tobacco plants were maintained in growth chambers at 25 ± 1 ° C. with a 16 hour light / 8 hour dark cycle. Arabidopsis thaliana (Eco-type Col-0) plant seeds were germinated in Murashige and Skoog (MS) salt containing 1% sucrose and Microagar (Duchefa biochemistry). All seeds were allowed to bloom for 2 days at 4 ° C. before being placed in the growth chamber, and the plates were incubated at 24 ° C. in a 16 hour light / 8 hour dark cycle in the growth chamber. Baby pole seedlings are white with steam for 8 hours at 8 ° C for 16 hours at 24 ° C on steam sterilized compound soil (peat moss: perlite: vermiculite = 9: 1: 1, v / v / v). It was maintained at 60% relative humidity under fluorescent (130 μm photons m ⁻² .S ⁻¹ ) light.

1-2. CaASRF1 유전자가 과 발현된 형질전환 애기 장대의 제조1-2. Preparation of Transgenic Baby Pole Overexpressed with CaASRF1 Gene

전장 CaASRF1의 cDNA를 pENTR / D-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합하고, CaASRF1 유전자의 구성적 발현을 위해 LR 반응을 사용하여 pK2GW7 이원매개체( binary vector )를 애기 장대의 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 제어 하에 삽입 하였다. 35S : CaASRF1 구조를 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens )균주 GV3101 로 형질 전환시켰다. 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens ) 매개한 형질전환은 꽃가루 딥 방법(floral dip method) (Clough and Bent, 1998)을 통해 수행되었다. 형질 전환된 계통을 선택하기 위해, 형질 전환된 식물체로부터 수확한 종자를 카나마이신(kanamycin) 5050 ㎍·mL^-1을 함유 한 MS 한천 평판에 뿌렸다.The full-length CaASRF1 cDNA was bound to the pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and the pK2GW7 binary vector was transformed into the cauliflower mosaic using the LR response for constitutive expression of the CaASRF1 gene. virus (CaMV) was inserted under 35S promoter control. 35S: CaASRF1 structure was transformed with Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was carried out via the floral dip method (Clough and Bent, 1998). To select transformed lines, seeds harvested from the transformed plants were sown in MS agar plates containing 5050 μg · mL ⁻¹ of kanamycin.

1-3. 효모 단백질 잡종 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)1-3. Yeast two-hybrid assay (Y2H)

CaAIBZ1 또는 CaASRF1의 전장 cDNA를 pGBKT7벡터에 서브 클로닝 하였다. 상기 방법으로 얻은 구조를 리튬 아세테이트 - 매개 형질 전환 방법(lithium acetate-mediated transformation method (Ito 등, 1983)에 따라 효모 AH109 균주에 도입 하였다. 합성이 완료된 (SC) - 류신 - 트립토판 배지에서 선별 한 후, 형질 전환체는 생장 평가를 위해 SC- 아데닌 - 히스티딘 - 류신 - 트립토판 배지로 옮겼다; 이 평가는 단백질 - 단백질 상호 작용의 지표를 제공했다. 다음으로 각 효모 세포 배양액(OD600 = 0.5) 에서 10 배 단계 희석액을 준비하고 각 시료 5 μL를 SC- 류신 - 트립토판 배지 또는 SC- 아데닌 - 히스티딘 - 류신 - 트립토판 배지에 스포팅(spotted) 시켰다.Full-length cDNA of CaAIBZ1 or CaASRF1 was subcloned into the pGBKT7 vector. The structure obtained by the above method was introduced into the yeast AH109 strain according to the lithium acetate-mediated transformation method (Ito et al., 1983.) After selection was carried out on the synthesized (SC) -leucine-tryptophan medium. The transformants were transferred to SC-adenine-histidine-leucine-tryptophan medium for growth evaluation; this assessment provided an indication of protein-protein interactions, followed by 10-fold in each yeast cell culture (OD600 = 0.5). Step dilutions were prepared and 5 μL of each sample was spotted in SC-Leucine-Tryptophan medium or SC-Adenine-Histidine-Leucine-Tryptophan medium.

1-4. 이분자 형광 상보성 분석 (Bimolecular fluorescence complementation assay , BiFC)1-4. Bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC)

종결 코돈이 없는 CaAIBZ1 또는 CaASRF1의 전장 cDNA는 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 구조체 (Waadt et al., 2008)의 생성을 위해 35S-VYNE 벡터에 서브 클로닝되었다. 일과성 발현을 위해서, 상기 구조을 보유하고 있는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 유전자 침묵을 피하기 위해 p19 균주와 혼합 한 후, 1mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 5 주된 담배(N. benthamiana) 식물 (OD₆₀₀ = 0.5)의 잎의 배축면에 침투시켰다. 침윤 3 일 후, 잎 디스크를 절단하고 LSM Image Browser 소프트웨어가 장착 된 공 촛점 현미경 (510 UV / Vis Meta; Zeiss) 하에서 하측 표피 세포를 검사 하였다.Full length cDNA of CaAIBZ1 or CaASRF1 without a stop codon was subcloned into a 35S-VYNE vector for generation of a bimolecular fluorescence complementation (BiFC) construct (Waadt et al., 2008). For transient expression, the Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 containing the structure was mixed with the p19 strain to avoid gene silencing, followed by a 5 mL N. benthamiana plant (OD) using a 1 mL needleless syringe. Permeate into the axial plane of the leaves ( ₆₀₀ = 0.5). After 3 days of infiltration, the leaf discs were cut and the lower epidermal cells examined under confocal microscopy (510 UV / Vis Meta; Zeiss) equipped with LSM Image Browser software.

1-5. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)1-5. Subcellular localization analysis

정지 코돈이 없는 CaASRF1 코딩 영역을 GFP- 융합 이진 벡터 p326GFP에 삽입 하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 p19 균주 (1 : 1 비율, OD600 = 0.5)와 혼합하고, 5 주된 완전히 팽창 된 담배 식물 잎에 공침시켰다. 침투 2 일 후, 현미경 분석을 전술 한 바와 같이 수행 하였다. A stop codon-free CaASRF1 coding region was inserted into the GFP-fused binary vector p326GFP. Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 was mixed with p19 strain (1: 1 ratio, OD600 = 0.5) and co-precipitated to 5 weeks fully expanded tobacco plant leaves. After 2 days of infiltration, microscopic analysis was performed as described above.

1-6. 시험관 내 유비퀴틴 분석 (1-6. In Vitro Ubiquitin Analysis in vitroin vitro ubiquitination assay) ubiquitination assay

Park et al.(2016)에 말토오스 결합 단백질 (MBP) - CaASRF1 재조합 단백질의 발현 및 정제 과정이 나타나 있다. 시험관내 자가 유비퀴틴 분석(in vitro self-ubiquitination assay)을 위해, 정제된 MBP-CaASRF1(500 ng)을 재조합 인간 UBE1 (E1) (Boston Biochemicals, Cambridge, MA), 그 E1에 태그된 인간 h5b 효소 (E2) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) 및 10 ㎍의 소(bovine)의 유비퀴틴(Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT)과 30 ℃에서 3 시간 동안 배양시켰다. CaASRF1이 CaAIBZ1 유비퀴틴화를 매개하는지 여부를 결정하기 위해서, 50 ng의 GST-CaAIBZ1 융합 단백질을 유비퀴틴 혼합물에 첨가하고 혼합물을 3 시간 동안 배양 하였다. 반응된 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 항-Ub (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA) 및 항-GST 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 면역 블로팅 (immunoblotting)을 사용하여 분석 하였다.Park et al. (2016) show the process for the expression and purification of maltose binding protein (MBP)-CaASRF1 recombinant protein. For in vitro self-ubiquitination assay, purified MBP-CaASRF1 (500 ng) was purified by recombinant human UBE1 (E1) (Boston Biochemicals, Cambridge, MA), a human h5b enzyme tagged with E1 ( E2) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) and ubiquitination reaction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2) and 10 μg bovine ubiquitin (Sigma-Aldrich) , 2 mM DTT) and incubated at 30 ° C. for 3 hours. To determine whether CaASRF1 mediates CaAIBZ1 ubiquitination, 50 ng of GST-CaAIBZ1 fusion protein was added to the ubiquitin mixture and the mixture was incubated for 3 hours. Reacted proteins were isolated using SDS-PAGE and analyzed using immunoblotting with anti-Ub (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA) and anti-GST antibodies (Santa Cruz Biotechnology).

1-7. RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)1-7. RNA extraction and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR)

RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 각기 ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 준 고추 및 애기장대 식물의 잎을 수확하였다. 상기 식물체의 잎으로부터 추출한 모든 RNA 샘플에 대하여 RNA가 없는 DNase(RNA-free DNase)로 분해하여 genomic DNA를 제거하고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1과 같은 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 45싸이클의 프로그램으로 수행되었다. 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8 (Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자 및 고추 액틴 1(CaACT1) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.Total RNA was extracted using the RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). The leaves of pepper and Arabidopsis plants, each treated with ABA or subjected to dry stress, were harvested. All RNA samples extracted from the leaves of the plant were digested with RNA-free DNase (RNA-free DNase) to remove genomic DNA and synthesized cDNA using Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA). It was. For qRT-PCR analysis, cDNA synthesized by the above method was combined with a CQ96 Touch ™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) with iQ ™ SYBR Green Supermix and specific primers as shown in Table 1 below. Amplified using. All reactions were repeated three times. PCR was performed with a program of 45 cycles for 5 minutes at 95 ° C., 20 seconds at 95 ° C., 20 seconds at 60 ° C., 20 seconds at 72 ° C. Relative expression of each gene was calculated by the ΔΔCt method, Arabidopsis actin8 ( Atact8 ) gene and pepper actin 1 ( CaACT1) gene was used for normalization.

1-8. ABA, 건조스트레스, NaCl 처리 및 형태 분석1-8. ABA, dry stress, NaCl treatment and morphology analysis

ABA에 반응한 CaASRF1의 발현 양상을 조사하기 위해, 6 엽 단계(six-leaf stage) 고추 식물에 100 μM ABA 또는 대조액을 뿌렸다. NaCl 처리를 위해 고추 식물을 200 mM NaCl 용액으로 관개 하였다. 건조스트레스 처리를 위해서, 고추 식물을 손상을 피하기 위해 토양에서 조심스럽게 제거 한 다음 3mm 용지 (Whatman)에 두었다. 각 처리 후 0 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간에 잎을 수확하고 상기 실시예 1-7 에 따른 RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 수행 하였다.To investigate the expression patterns of CaASRF1 in response to ABA, six-leaf stage pepper plants were sprayed with 100 μM ABA or control. Pepper plants were irrigated with 200 mM NaCl solution for NaCl treatment. For dry stress treatment, pepper plants were carefully removed from the soil to avoid damage and then placed on 3 mm paper (Whatman). Leaves were harvested at 0 hours, 2 hours, 6 hours, 12 hours and 24 hours after each treatment and RNA isolation and RT-PCR analysis according to Example 1-7 were performed.

1-9. 표현형 분석 (Phenotypic analyses)1-9. Phenotypic analyses

묘목 성장을 시험하기 위해, 다양한 ABA 농도를 가진 MS 한천 배지를 함유하는 플레이트 상에 유전자형 당 36 개의 씨앗을 뿌렸다. 야생형 애기 장대와 CaASRF1 과 발현(CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대에서 얻은 1 주일 된 묘목을 토양 혼합물을 담고 있는 그릇에 무작위로 심어 물기가 있는 조건에서 2 주 동안 재배했다. 가뭄 스트레스를 주기 위해 급수를 9-10 일 동안 보류하고 다시 물을 준 후 1-2 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율을 계산했다. 고추의 경우, 10-11 일 동안 급수를 보류하여 4 엽 단계(four-leaf stage) 식물에 가뭄 스트레스가 가해졌으며 다시 물을 준 날로 부터 1 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율이 계산되었다. 가뭄 저항성은 증발 수분 손실을 측정하여 정량적으로 결정되었다. 네 엽 단계(four-leaf stage)고추와 3 주 된 애기 장대 식물에서 잎을 분리하여 페트리 접시에 넣었다. 접시를 성장 챔버에서 40 %의 상대 습도로 유지하고, 지시된 시점에서 생중량의 손실을 측정 하였다. 모든 실험은 생물학적 시료에서 독립적으로 최소 3회 반복되었다.To test seedling growth, 36 seeds per genotype were sown on plates containing MS agar medium with varying ABA concentrations. One week old seedlings from wild-type baby poles and CaASRF1 and expression (CaASRF1-OX) transgenic baby poles were randomly planted in bowls containing soil mixture and grown for 2 weeks in wet conditions. To give drought stress, the watering was withheld for 9-10 days, and after re-watering, after 1-2 days, the survival rate of plants with rehydrated leaves was calculated. In the case of red pepper, drought stress was applied to four-leaf stage plants with water holding for 10-11 days, and survival rates of plants with rehydrated leaves were calculated 1 day after the watering again. . Drought resistance was determined quantitatively by measuring evaporative moisture loss. The leaves were separated from the four-leaf stage pepper and three week old baby pole plants and placed in a Petri dish. The dish was kept at 40% relative humidity in the growth chamber and the loss of raw weight was measured at the indicated time points. All experiments were repeated at least three times independently in biological samples.

1-10. 열 영상법(Thermal imaging)1-10. Thermal imaging

열 화상 분석(thermal imaging analysis)을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 4 주된 고추 식물과 3 주 또는 4 주된 애기 장대 식물을 50μM ABA로 처리했다. 열 화상 이미지는 적외선 카메라 (FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며 잎 온도는 FLIR Tools + ver 5.2 소프트웨어로 측정했다. For thermal imaging analysis, the 4 week pepper plants, where both the first and second leaves grew, and the 3 or 4 week baby pole plants were treated with 50 μM ABA. Thermal images were obtained using infrared cameras (FLIR systems; T420) and leaf temperatures were measured with FLIR Tools + ver 5.2 software.

1-11. Virus-induced gene silencing (VIGS)1-11. Virus-induced gene silencing (VIGS)

CaASRF1의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV1 및 pTRV2:CaAIEF1 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.For loss-of function analysis of CaASRF1, virus-induced gene silencing (VIGS) was performed in pepper plants. Briefly, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 carrying pTRV1 and pTRV2: CaAIEF1 or pTRV2: 00 as negative controls was infiltrated into fully expanded cotyledons of pepper (OD ₆₀₀ = 0.2 for each strain). Plants were placed in a growth room at 24 ° C. with a photoperiod of 16 hours day and 8 hours night for growth and virus propagation.

1-12. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정1-12. Biological Assay of Stallal Aperture

기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량은 이전에 설명한대로 수행되었다(Lim and Lee, 2016). 간단하게는, 3 주된 장미 잎에서 잎 껍질을 채취하고 기공 개방 용액 (SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 μM CaCl2, pH 6.15)에 부유시켰다. 껍질을 애기 장대 식물 및 고추 식물에서 80 %초과 하는 기공 개구를 얻기 위해 3 시간 동안 배양 하였다. 완충액을 다양한 ABA 농도를 함유한 신선한 SOS로 대체하였다. 잎 껍질은 그 후 2 시간 더 배양되었다. 각각의 개별 샘플에서, 100 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경하에 무작위로 관찰 하였다. 각 실험은 3 배로 수행되었다.Biological quantification of stomatal aperture was performed as previously described (Lim and Lee, 2016). Briefly, leaf husks were taken from three main rose leaves and suspended in pore open solution (SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 μM CaCl 2, pH 6.15). The shells were incubated for 3 hours to obtain pore openings greater than 80% in the baby pole plants and the pepper plants. The buffer was replaced with fresh SOS containing various ABA concentrations. The leaf husks were then incubated for 2 more hours. In each individual sample, 100 pores were randomly observed under a Nikon Eclipse 80i microscope. Each experiment was performed three times.

실시예 2. CaASRF1 유전자의 동정과 CaASRF1 분자 특성 규명Example 2 Identification of CaASRF1 Gene and Characterization of CaASRF1 Molecules

ABA 처리한 고추 잎에서 ABA-유도 유전자(ABA-induced genes)를 분리하기 위해 RNA-seq 분석을 수행했다. CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger type E3 ligase 1) 유전자 (accession no. KU557245)를 확인할 수 있었다.RNA-seq analysis was performed to isolate ABA-induced genes from ABA-treated pepper leaves. CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger type E3 ligase 1) gene (accession no. KU557245) was identified.

그 결과, 도 1a 및 도1b에 나타 낸 바와 같이, CaASRF1 cDNA는 152 아미노산 잔기를 암호화하는 459 bp의 전사 해석틀(Open Reading Frame; ORF)이다.As a result, as shown in Figs. 1A and 1B, CaASRF1 cDNA is a 459 bp Open Reading Frame (ORF) encoding 152 amino acid residues.

보다 구체적으로, 도 1a에 나타 낸 바와 같이, CaASRF1 단백질은 유비퀴틴 -26S 프로테아좀 시스템 (ubiquitin-26S proteasome system)에서 E3리가제 활성(E3 ligase activity) 에 필수적인 C3H2C3 유형의 RING finger motif를 포함한다. More specifically, as shown in FIG. 1A, the CaASRF1 protein comprises a C3H2C3 type RING finger motif, which is essential for E3 ligase activity in the ubiquitin-26S proteasome system. .

또한 도 1b에 나타 낸 바와 같이, 다중 서열 정렬 분석(Multiple sequence alignment)을 통해, CaASRF1이 다른 RING유형 E3 리가제(RING type E3 ligases)와 비교적 높은 아미노산 서열 동일성 (75-97 %)을 갖는다는 것을 밝혀냈다. 몇몇 E3 리가제(E3 ligase)는 핵과 세포질에 위치하여 기능한다. CaASRF1의 세포 내 위치를 확인하기 위해, 우리는 35S 프로모터의 제어 하에 CaASRF1과 녹색 형광 단백질(GFP)의 융합 단백질(CaASRF1-GFP fusion protein)을 만들었다.In addition, as shown in FIG. 1B, through multiple sequence alignment, CaASRF1 has relatively high amino acid sequence identity (75-97%) with other RING type E3 ligases. Found out. Some E3 ligases function in the nucleus and cytoplasm. To identify the intracellular location of CaASRF1, we created a CaASRF1-GFP fusion protein (CaASRF1-GFP fusion protein) under the control of the 35S promoter.

그 결과 도 1c에 나타낸 바와 같이, 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 표피세포에서 CaASRF1-GFP 융합 단백질이 일시적으로 발현됨을 관찰하므로서, CaASRF1-GFP 융합 단백질은 핵과 세포질에 위치됨을 알 수 있었다. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)에 대한 청색 형광 신호가 핵에서 검출되었다. 이러한 결과는 CaASRF1이 핵과 세포질에서 기능한다는 것을 나타낸다.As a result, as shown in Figure 1c, CaASRF1-GFP fusion protein was observed in the epidermal cells of tobacco plants (Nicotiana benthamiana) temporarily, CaASRF1-GFP fusion protein was found to be located in the nucleus and cytoplasm. A blue fluorescence signal for 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) was detected in the nucleus. These results indicate that CaASRF1 functions in the nucleus and cytoplasm.

도 1d에 나타낸 바와 같이, CaASRF1의 발현 양상을 알아보기 위해 고추 잎을 ABA 및 비 생물성 스트레스로 처리하고 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석을 수행 하였다. 처리 전엔 CaASRF1 발현은 약하게 유도되었다. ABA, 가뭄 및 NaCl 처리 후에 CaASRF1 전사체가 더 강하게 축적되었다. E3 ligases와 공통적으로, CaASRF1은 유비퀴틴 활성(ubiquitination activity)을 나타내는 RING finger motif를 포함하고 있다.As shown in FIG. 1D, pepper leaves were treated with ABA and abiotic stress and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis to determine the expression pattern of CaASRF1. Prior to treatment, CaASRF1 expression was weakly induced. CaASRF1 transcripts accumulated more strongly after ABA, drought and NaCl treatment. In common with E3 ligases, CaASRF1 contains a RING finger motif that exhibits ubiquitination activity.

도 1e에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 E3 리가아제 활성(E3 ligase activity)을 가지고 있는지 확인하기 위해 정제 된 CaASRF1 단백질을 사용하여 상기 실시예 1-6에 따라 시험관 내 유비퀴틴 분석(in vitro ubiquitination assay)를 수행했다. 정제 된 CaASRF1 단백질을 유비퀴틴(ubiquitin), E1, E2와 함께 1 시간 동안 항온 처리한 결과, 유비퀴틴화 된 CaASRF1 단백질을 항-MBP 또는 항-유비퀴틴 항체로 면역 블롯 분석(immunoblot analysis)을 사용하여 검출되었다. 몇 가지 더 높은 분자량 단백질 밴드(molecular-weight protein bands)를 검출한 결과, CaASRF1 단백질이 자동-유비퀴틴화되었음(auto-ubiquitinated)을 알 수 있었다.As shown in Figure 1e, in vitro ubiquitination assay (in vitro ubiquitination assay) according to Examples 1-6 using the purified CaASRF1 protein to confirm whether CaASRF1 has E3 ligase activity (E3 ligase activity) Performed. Purified CaASRF1 protein was incubated with ubiquitin, E1, E2 for 1 hour, and then ubiquitinated CaASRF1 protein was detected using immunoblot analysis with anti-MBP or anti-ubiquitin antibody. . Several higher molecular weight protein bands were detected and the CaASRF1 protein was auto-ubiquitinated.

실험예 3. CaASRF1가 침묵된(CaASRF1-silenced) 고추 식물의 가뭄 내성 감소Experimental Example 3 Reduction of Drought Tolerance in CaASRF1-silenced Pepper Plants

고추 식물에서 CaASRF1의 생물학적 기능을 연구하기 위해 실시예 1-11에 따라 바이러스-유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing ;VIGS) 기반 유전자 기능 분석을 사용했다.Virus-induced gene silencing (VIGS) based gene function analysis was used according to Examples 1-11 to study the biological function of CaASRF1 in pepper plants.

먼저, 도 2a에 나타낸 바와 같이 실시예 1-7에 따른 반-정량적 RT-PCR 분석(semi-quantitative RT-PCR analysis)을 사용하여 CaASRF1의 발현 수준을 측정 하였다. CaASRF1 전사체는, 대조식물(TRV : 00) 보다 CaASRF1가 침묵된 (CaASRF1-silenced) 고추식물(TRV : CaASRF1)에서 덜 강하게 발현되었다. 따라서, 우리는 우리의 표현형 분석에서 이들 CaASRF1-silenced 고추 식물을 사용했다. 우리의 이전 연구는 비 생물적 스트레스에 의해 유도 된 여러 고추 RING finger type E3 ligases의 기능이 스트레스 반응의 조절과 관련이 있음을 밝혀냈다.First, the expression level of CaASRF1 was measured using a semi-quantitative RT-PCR analysis according to Examples 1-7 as shown in FIG. 2A. CaASRF1 transcript was less strongly expressed in CaASRF1-silenced pepper plants (TRV: CaASRF1) than control plants (TRV: 00). Therefore, we used these CaASRF1-silenced pepper plants in our phenotype analysis. Our previous study revealed that the function of several pepper RING finger type E3 ligases induced by abiotic stress is associated with the regulation of stress response.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 가뭄 스트레스에 대한 CaASRF1의 기능을 조사하기 위해, 우리는 대조 식물 및 CaASRF1-silenced 고추식물을 가뭄 스트레스를 10 일 동안 물을 주지 않고, 그 후 1 일 동안 다시 물을 주어 처리했다. 도 2b의 왼쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 물을 잘 준 조건 하에서는, CaASRF1-silenced 식물과 대조 식물 사이에 표현형상의 차이점을 관찰하지 못했다. 그러나, 도 2b의 가운데 및 오른쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 가뭄 스트레스 조건과 그 후 다시 물을 준 조건에서는, CaASRF1-silenced 식물은 대조 식물보다 더 시들어 진 표현형을 보였다. As shown in FIG. 2B, to investigate the function of CaASRF1 against drought stress, we watered the control plants and CaASRF1-silenced pepper plants without watering drought stress for 10 days, and then watered again for 1 day. Processed. As shown in the left panel of FIG. 2B, under well-watered conditions, no morphological differences were observed between CaASRF1-silenced plants and control plants. However, as shown in the middle and right panels of FIG. 2B, under drought stress conditions and then watered again, CaASRF1-silenced plants showed a more wilted phenotype than control plants.

더 나아가 도 2c에 나타낸 바와 같이, 다시 물을 준 후에 CaASRF1-silenced 식물의 생존율 33 % 였고, 대조식물은 약 99 %였다.Furthermore, as shown in FIG. 2C, the survival rate of the CaASRF1-silenced plants was 33% after the watering again, and the control plants were about 99%.

도 2d에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-silenced 식물에 의해 나타나는, 가뭄에 민감한 표현형(drought-sensitive phenotype)이 변경된 수분보습력(water retention capacity)에서 파생되었는지 여부를 평가하기 위해 분리 된 장미 잎의 생중량을 측정했다. 잎의 생중량은 대조 식물에서보다 CaASRF1-silenced 식물에서 현저히 낮았다. As shown in FIG. 2D, the raw weight of the rose leaves was isolated to assess whether the drought-sensitive phenotype, represented by CaASRF1-silenced plants, was derived from altered water retention capacity. Measured. The fresh weight of leaves was significantly lower in CaASRF1-silenced plants than in control plants.

이전 연구는 ABA 민감도가 변경된 수분 유지에 영향을 준다는 것을 보여주었다. 그래서 ABA 처리 후 잎 온도와 기공 구멍을 측정해보았다. (도 2e와 2f). 도 2e에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-silenced 식물의 잎 온도는 대조 식물의 잎 온도보다 낮았다. 변경된 잎 온도는 기공 운동의 변화로 인해 야기되며, 이는 증발 냉각의 증가 또는 감소를 초래한다. 그러므로 우리는 ABA 처리 전후에 기공의 크기를 측정 하였다. ABA가 없는 경우, 기공 구경은 대조 식물과 CaASRF1-silenced 식물 간에 차이가 없었다. 그러나 도 2f에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 후, CaASRF1-silenced 식물의 기공 구경은 대조 식물의 기공 구경보다 컸다.Previous studies have shown that ABA sensitivity affects altered moisture retention. So, after ABA treatment, leaf temperature and pore hole were measured. (FIGS. 2E and 2F). As shown in FIG. 2E, the leaf temperature of the CaASRF1-silenced plant was lower than that of the control plant. The altered leaf temperature is caused by a change in pore movement, which results in an increase or decrease in evaporative cooling. Therefore, we measured the pore size before and after ABA treatment. In the absence of ABA, the pore size did not differ between control and CaASRF1-silenced plants. However, as shown in FIG. 2F, after ABA treatment, the pore diameter of the CaASRF1-silenced plant was larger than that of the control plant.

실험예 4. CaASRF1가 과발현된 (CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 향상된 ABA 감수성 Experimental Example 4. Improved ABA sensitivity of (CaASRF1-OX) transgenic baby pole plants overexpressed CaASRF1

CaASRF1-silenced 고추 식물은 가뭄에 민감하고 ABA에 민감하지 않은 표현형을 나타냈다. 따라서 우리는 ABA와 가뭄 스트레스에 대한 CaASRF1의 생물학적 기능을 평가하기 위해 추가 유전 분석을 수행했다. 우리는 CaASRF1가 과발현된(CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물을 생성한 후 유전적 분석에 사용했다. 먼저, 우리는 상기 실시예 1-7에 따른 반 정량적 RT-PCR 분석(semi-quantitative RT-PCR assay)을 사용하여 CaASRF1 과 발현을 검사했다. CaASRF1-silenced pepper plants exhibited a phenotype that was drought sensitive and not ABA sensitive. Therefore, we performed additional genetic analysis to evaluate the biological function of CaASRF1 against ABA and drought stress. We generated transgenic baby pole plants overexpressed CaASRF1 (CaASRF1-OX) and used them for genetic analysis. First, we tested CaASRF1 and expression using a semi-quantitative RT-PCR assay according to Examples 1-7 above.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 우리는 두 개의 독립적인 T3 homozygous 형질 전환 계통에서 CaASRF1 전사체의 발현을 검출 하였지만 야생형(Wild-type , WT) 식물에서는 그렇지 않았다. As shown in Figure 3a, we detected the expression of CaASRF1 transcripts in two independent T3 homozygous transgenic lines, but not in wild-type (WT) plants.

ABA 신호 전달과 CaASRF1의 관련성을 밝히기 위해, 우리는 ABA에 반응한 CaASRF1-OX 식물의 표현형 분석을 수행했다. ABA가 매개하는 분자 반응은 종자휴면(seed dormancy)에 있어서 중요하다. To elucidate the association between ABA signaling and CaASRF1, we performed phenotypic analysis of CaASRF1-OX plants in response to ABA. ABA-mediated molecular reactions are important for seed dormancy.

따라서 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 발아 단계에서 야생형과 형질 전환 식물을 비교했다. ABA가 없는 경우 야생형과 CaASRF1-OX 종자간에 발아율에 다른 현저한 차이가 없다는 결론을 얻었다. 그러나, 점차 증가하는 ABA 농도의 존재 하에서, 야생형 및 형질 전환 식물의 발아율은 점차 감소되었다. 또한, CaASRF1-OX 종자의 발아율은 야생 종자의 발아율보다 상당히 낮았다.Thus, as shown in Figures 3b and 3c, wild type and transformed plants were compared in the germination stage. Without ABA, it was concluded that there was no significant difference in germination rate between wild type and CaASRF1-OX seeds. However, in the presence of increasing ABA concentrations, germination rates of wild-type and transgenic plants gradually decreased. In addition, the germination rate of CaASRF1-OX seeds was significantly lower than that of wild seeds.

도 3d, 3e 및 3f에 나타낸 바와 같이, ABA에 반응하는 야생형과 CaASRF1-OX 식물의 입모와 뿌리 성장을 조사했다. 발아율과 비슷하게, CaASRF1-OX 식물의 입모와 뿌리의 성장률은 야생 식물보다 현저히 낮았다. 이에 따른 결과는 CaASRF1 발현이 발아 및 발아 발달 단계에서 ABA 반응에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.As shown in FIGS. 3D, 3E, and 3F, the hair growth and root growth of wild-type and CaASRF1-OX plants in response to ABA were examined. Similar to the germination rate, the growth rate of the hairs and roots of CaASRF1-OX plants was significantly lower than that of wild plants. The results show that CaASRF1 expression affects the ABA response at germination and germination stages.

실험예 5. CaASRF1가 과발현된 (CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 향상된 가뭄 내성Experimental Example 5 Improved Drought Resistance of (CaASRF1-OX) Transgenic Baby Pole Plant Overexpressed with CaASRF1

가뭄 저항성에 대한 CaASRF1 과 발현의 영향을 조사하기 위해, 우리는 가뭄 스트레스 조건 하에서 야생형(Wild-type , WT) 및 CaASRF1-OX 식물을 사용하여 더 많은 표현형 분석을 수행했다.To investigate the effects of CaASRF1 and expression on drought resistance, we performed more phenotypic analyzes using wild-type (WT) and CaASRF1-OX plants under drought stress conditions.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 물을 잘 준 조건 하에서 CaASRF1-OX 식물과 야생형 식물사이에 표현형의 차이를 관찰하지 못했다(도 4a, 왼쪽 패널). 그러나 상기 식물들에게 10 일 동안 물을 주지 않은 후 2 일 동안 다시 물을 주어 가뭄 스트레스를 주었을 때, CaASRF1-OX 식물은 야생형 식물보다 시든 표현형이 적었다 (도 4a, 중간 및 오른쪽 패널). 또한 도 4b에 나타낸 바와 같이, 다시 물을 준 후에는 CaASRF1-OX 식물은 62-98 %가 생존하였으나 야생형 식물은 1 %만이 성장을 재개했다.As shown in FIG. 4A, no difference in phenotype was observed between CaASRF1-OX plants and wild type plants under well-watered conditions (FIG. 4A, left panel). However, when the plants were not watered for 10 days and then watered again for 2 days to give drought stress, CaASRF1-OX plants had less withered phenotypes than wild type plants (FIG. 4A, middle and right panels). As shown in FIG. 4B, after watering again, CaASRF1-OX plants survived 62-98%, but only 1% of wild-type plants resumed growth.

도 4c에 나타낸 바와 같이, 변경된 수분보습력(water retention capacity)을 통해 CaASRF1-OX 식물에 의해 나타나는 가뭄에 견디는 표현형이 유도되는 지 여부를 알아보기 위해, 분리 된 장미 잎의 생중량을 측정했다. 잎의 생중량은 야생형 식물에서보다 CaASRF1-OX 식물에서 현저히 높았다. As shown in Figure 4c, to determine whether the drought-tolerant phenotypes represented by CaASRF1-OX plants are induced through altered water retention capacity, the weight of the separated rose leaves was measured. The fresh weight of leaves was significantly higher in CaASRF1-OX plants than in wild type plants.

도 4d, 4e 및 4f에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-OX 식물체의 ABA 민감도를 조사하기 위해 잎 온도 (도 4d)와 기공 구멍 (도 4e 및 4f)을 측정했다. 그 결과, CaASRF1-OX 식물이 ABA에 과민성임을 알아냈다. 데이터는 CaASRF1-OX 식물에 의해 표현된 수분보습력의 향상된 능력은 ABA 과민성으로부터 유도되었으며, 이는 가뭄 저항성 표현형을 유도한다는 것을 시사한다.As shown in Figures 4d, 4e and 4f, leaf temperature (Figure 4d) and pore pore (Figures 4e and 4f) were measured to investigate the ABA sensitivity of CaASRF1-OX plants. As a result, it was found that CaASRF1-OX plants are hypersensitive to ABA. The data suggest that the enhanced ability of moisturizing power expressed by CaASRF1-OX plants was derived from ABA hypersensitivity, which induces a drought resistant phenotype.

도 4g에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 향상된 가뭄 저항성에서 기능하는 메커니즘을 밝히기 위해, 잎 분리를 통해 가뭄 스트레스를 받은 야생형 및 CaASRF1-OX 잎을 사용하여 여러 가지 스트레스 관련 유전자에 대한 상기 실시예 1-7에 따른 qRT-PCR 분석을 수행했다. 가뭄 저항성 표현형과 일치하여 RD29B, RD20, RD22 및 NCED3을 비롯한 스트레스 관련 유전자의 발현 수준은 야생형 식물보다 CaASRF1-OX 식물에서 현저히 높았다. 이를 통해, CaASRF1이 ABA 매개성 기공 폐쇄의 조절을 통해 가뭄 내성을 적극적으로 조절한다는 것을 알 수 있었다.As shown in FIG. 4G, Example 1-7 for various stress related genes using wild-type and CaASRF1-OX leaves subjected to drought stress through leaf separation to reveal the mechanism by which CaASRF1 functions in improved drought resistance. QRT-PCR analysis was performed. Consistent with the drought resistant phenotype, the expression levels of stress-related genes including RD29B, RD20, RD22 and NCED3 were significantly higher in CaASRF1-OX plants than in wild type plants. This suggests that CaASRF1 actively regulates drought tolerance through the regulation of ABA-mediated pore closure.

실험예 6. CaASRF1 유전자와 고추 bZIP 전사 인자 (bZIP transcription factor) CaAIBZ1 유전자의 물리적 상호 작용Experimental Example 6 Physical Interaction between CaASRF1 Gene and CaiBZ1 Gene of Red Pepper bZIP Transcription Factor

CaASRF1 표적을 확인하기 위해, CaASRF1과 고추 cDNA 라이브러리를 각각 미끼와 먹이로 사용하여 상기 실시예 1-3 에 따른 효모 단백질 잡종 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)을 수행했다. To confirm the CaASRF1 target, a yeast protein hybrid assay (Y2H) according to Examples 1-3 was performed using CaASRF1 and capsicum cDNA libraries as bait and prey, respectively.

도 5a에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1)을 포함하여 여러 상호 작용 파트너 단백질(interacting partner proteins)을 분리했다.As shown in FIG. 5A, several interacting partner proteins were isolated, including CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1).

도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, CaASRF1과 대조적으로, CaAIBZ1 전사체의 발현 수준은 가뭄이나 NaCl에 의해 상승 또는 하향 조절되지 않았다(도 5b). 또한, 일시적 담배 식물(N. benthamiana) 의 상피 세포에서 35S : CaAIBZ1-GFP 융합 단백질의 발현은 핵에서만 GFP 신호를 생성 하였다 (도 5c).As shown in FIGS. 5B and 5C, in contrast to CaASRF1, expression levels of CaAIBZ1 transcripts were not elevated or down regulated by drought or NaCl (FIG. 5B). In addition, expression of 35S: CaAIBZ1-GFP fusion protein in epithelial cells of transient tobacco plants (N. benthamiana) produced GFP signals only in the nucleus (FIG. 5C).

도 5d , 5e 및 5f에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1이 CaASRF1의 표적인지를 결정하기 위해, 우리는 효모에서 CaASRF1과 함께 CaAIBZ1을 발현시켰다 (도 5d). 선택 배지에서 성장 분석을 통해 CaASRF1이 CaAIBZ1과 상호 작용 함을 나타내었다. 풀다운 분석(pull-down assay) (도 5e)과 상기 실시예 1-4 에 따른 이분자 형광 상보성 분석 (Bimolecular fluorescence complementation assay , BiFC) 분석 (도 5f)을 통해 이 상호 작용을 확인했다. CaASRF1 : VYNE와 CaAIBZ1: CYCE의 동시 발현 은 핵에서 주로 황색 형광 (yellow fluorescence , YFP)을 나타내며 이는 DAPI 염색과 일치한다.As shown in FIGS. 5D, 5E and 5F, to determine whether CaAIBZ1 is the target of CaASRF1, we expressed CaAIBZ1 with CaASRF1 in yeast (FIG. 5D). Growth analysis in selection media showed that CaASRF1 interacted with CaAIBZ1. Pull-down assay (FIG. 5E) and bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) according to Examples 1-4 Analysis (FIG. 5F) confirmed this interaction. Simultaneous expression of CaASRF1: VYNE and CaAIBZ1: CYCE shows mainly yellow fluorescence (YFP) in the nucleus, which is consistent with DAPI staining.

도 5g에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 CaAIBZ1와 유비퀴틴화하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 정제된 MBP-CaASRF1 및 글루타티온 S- 트랜스퍼라제 (glutathione S-transferase , GST)-CaAIBZ1 융합 단백질을 사용하여 상기 실시예1-6 에 따른 시험관 내 유비퀴틴 분석(in vitro ubiquitination assay)을 수행 하였다. E1과 E2의 존재 하에서, CaASRF1은 CaAIBZ1을 폴리유비퀴틴화(polyubiquitinated)시켰다.As shown in FIG. 5G, to determine whether CaASRF1 is ubiquitized with CaAIBZ1, we used the purified MBP-CaASRF1 and glutathione S-transferase (GST) -CaAIBZ1 fusion proteins above. An in vitro ubiquitination assay according to Example 1-6 was performed. In the presence of E1 and E2, CaASRF1 polyubiquitinated CaAIBZ1.

실험예 7. CaASRF1 와 CaAIBZ1이 함께 과발현된 유전자 변형 애기 장대 식물 (CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX transgenic Arabidopsis plants) 의 향상된 ABA 감수성Experimental Example 7. Improved ABA sensitivity of CaASRF1 and CaAIBZ1 coexpressed transgenic baby pole plants (CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX transgenic Arabidopsis plants)

CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 기능적으로 상관관계가 있는지 조사하기 위해, 우리는 CaASRF1 / CaAIBZ1 이중 과발현(CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX) 형질 전환 식물 (CaASRF1/CaAIBZ1 double overexpressing transgenic plants)을 생성시켰다.To investigate the functional correlation between CaASRF1 and CaAIBZ1, we generated CaASRF1 / CaAIBZ1 double overexpressing transgenic plants.

도 6a에 나타난 바와 같이, 이상적인 성장 조건에서는 야생형, CaASRF1-OX, CaAIBZ1-OX 및 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물간에 표현형 차이를 관찰하지 못했다. 그러나 ABA 처리 후 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물의 발아율은 야생형 식물의 발아율보다 현저히 낮았으며, 이를 통해 CaASRF1이 발아 단계에서 CaAIBZ1의 전사 활성을 저해한다는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 6A, no phenotypic differences were observed between wild type, CaASRF1-OX, CaAIBZ1-OX and CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX plants under ideal growth conditions. However, the germination rate of CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX plants after ABA treatment was significantly lower than that of wild-type plants, indicating that CaASRF1 inhibits CaAIBZ1 transcriptional activity in the germination stage.

도 6b에 나타난 바와 같이, 발아 단계에서 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물체의 ABA 과민성이 육묘 단계에서 유지되는지 여부를 확인하기 위해, 일차 뿌리 길이를 측정 하였다. 발아 분석과 일치하여, 1 차 뿌리 길이는 야생형 식물에서보다 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물에서 현저히 낮았다.As shown in Figure 6b, to determine whether ABA hypersensitivity of CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX plants in the germination stage is maintained in the seedling stage, the primary root length was measured. Consistent with the germination analysis, the primary root length was significantly lower in CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX plants than in wild type plants.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The description of the present invention set forth above is for illustrative purposes, and one of ordinary skill in the art may understand that the present invention may be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using RING finger E3 ligase CaASRF1 in plants <130> MP18-057 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 459 <212> DNA <213> Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1 - CaASRF1 <400> 1 atgggcctct cacaatatcc aactccagca gatgcaggag tactaggtgt gattctagta 60 aacacagcca tatccatatc cattgtcaag gagatactac gatcgattct tcgcctgata 120 ggcatccgta tcgcatcatg ggaagactat tctattgaag gctcctcaga ctcacttgaa 180 tgccgtggaa gcccaccaga gtcatacatg gaggagttca gaagccgaac acctgcattt 240 cgttatgact cgctatgcat ctctaaccac cctgaacaag aatgttctgt gtgcctaaca 300 aaatttgagc ctgatgcagg ggtaaacagt ctctcatgtg gtcatgtttt ccataagctg 360 tgtctagaga agtggctcag gtattggcat gtaacttgtc ctctttgcag aaattacttg 420 atgcctcaac aagaagagga cgatacgtgt ccaatgtga 459 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1 - CaASRF1 <400> 2 Met Gly Leu Ser Gln Tyr Pro Thr Pro Ala Asp Ala Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Ile Leu Val Asn Thr Ala Ile Ser Ile Ser Ile Val Lys Glu Ile 20 25 30 Leu Arg Ser Ile Leu Arg Leu Ile Gly Ile Arg Ile Ala Ser Trp Glu 35 40 45 Asp Tyr Ser Ile Glu Gly Ser Ser Asp Ser Leu Glu Cys Arg Gly Ser 50 55 60 Pro Pro Glu Ser Tyr Met Glu Glu Phe Arg Ser Arg Thr Pro Ala Phe 65 70 75 80 Arg Tyr Asp Ser Leu Cys Ile Ser Asn His Pro Glu Gln Glu Cys Ser 85 90 95 Val Cys Leu Thr Lys Phe Glu Pro Asp Ala Gly Val Asn Ser Leu Ser 100 105 110 Cys Gly His Val Phe His Lys Leu Cys Leu Glu Lys Trp Leu Arg Tyr 115 120 125 Trp His Val Thr Cys Pro Leu Cys Arg Asn Tyr Leu Met Pro Gln Gln 130 135 140 Glu Glu Asp Asp Thr Cys Pro Met 145 150 <110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using RING          finger E3 ligase CaASRF1 in plants <130> MP18-057 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 459 <212> DNA <213> Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1-CaASRF1 <400> 1 atgggcctct cacaatatcc aactccagca gatgcaggag tactaggtgt gattctagta 60 aacacagcca tatccatatc cattgtcaag gagatactac gatcgattct tcgcctgata 120 ggcatccgta tcgcatcatg ggaagactat tctattgaag gctcctcaga ctcacttgaa 180 tgccgtggaa gcccaccaga gtcatacatg gaggagttca gaagccgaac acctgcattt 240 cgttatgact cgctatgcat ctctaaccac cctgaacaag aatgttctgt gtgcctaaca 300 aaatttgagc ctgatgcagg ggtaaacagt ctctcatgtg gtcatgtttt ccataagctg 360 tgtctagaga agtggctcag gtattggcat gtaacttgtc ctctttgcag aaattacttg 420 atgcctcaac aagaagagga cgatacgtgt ccaatgtga 459 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1-CaASRF1 <400> 2 Met Gly Leu Ser Gln Tyr Pro Thr Pro Ala Asp Ala Gly Val Leu Gly   1 5 10 15 Val Ile Leu Val Asn Thr Ala Ile Ser Ile Ser Ile Val Lys Glu Ile              20 25 30 Leu Arg Ser Ile Leu Arg Leu Ile Gly Ile Arg Ile Ala Ser Trp Glu          35 40 45 Asp Tyr Ser Ile Glu Gly Ser Ser Asp Ser Leu Glu Cys Arg Gly Ser      50 55 60 Pro Pro Glu Ser Tyr Met Glu Glu Phe Arg Ser Arg Thr Pro Ala Phe  65 70 75 80 Arg Tyr Asp Ser Leu Cys Ile Ser Asn His Pro Glu Gln Glu Cys Ser                  85 90 95 Val Cys Leu Thr Lys Phe Glu Pro Asp Ala Gly Val Asn Ser Leu Ser             100 105 110 Cys Gly His Val Phe His Lys Leu Cys Leu Glu Lys Trp Leu Arg Tyr         115 120 125 Trp His Val Thr Cys Pro Leu Cys Arg Asn Tyr Leu Met Pro Gln Gln     130 135 140 Glu Glu Asp Asp Thr Cys Pro Met 145 150

Claims (5)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaASRF1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaASRF1 단백질을 과발현시키는 단계.
A method for enhancing dry stress resistance of a plant, comprising the following steps:
(a) transforming a plant with a gene of SEQ ID NO: 1 encoding a CaASRF1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to a plant; And
(b) overexpressing CaASRF1 protein in the transformed plant.
제4항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

A transgenic plant having improved dry stress resistance by the method of claim 4.

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