KR102027816B1 - Epitope Antigens of TSA56 Antigens of Orientia tsutsugamushi and the Use Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포에 대한 에피톱 항원과 그것을 이용한 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석 방법 등의 용도를 개시한다.
The present invention discloses the use of an epitope antigen against TSA56 antigen-specific CD8 T cells of Orientia Tsutsugamu bacteria and a method for quantitative analysis of TSA56 antigen-specific CD8 T cells using the same.
Description
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 TSA56 항원의 에피톱 항원 및 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an epitope antigen of TSA56 antigen of Orientia Tsutsugamu strain and its use.
쯔쯔가무시병 (scrub typhus)은 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi, 이하 "쯔쯔가무시균")에 감염된 털진드기 유충이 사람을 물었을 때 발생하는 절지동물 매개 감염질환으로서, 러시아 연해주, 한국, 일본, 중국, 및 동남아시아 지역, 호주 북부 등, 주로 아시아-태평양 지역에서 매년 백만명 이상의 환자들이 발생하고 있는 것으로 추정되고 있다. 감염된 털진드기 유충에 물린 환자는 1-2주간의 잠복기를 거쳐 발열, 오한, 가피 생성, 발진, 근육통, 림프절 종대 등의 증상을 나타낸다. 감염 초기에 진단되면 적절한 항생제 처방을 통하여 치료가 가능하지만, 초기 임상증상이 다른 열성감염질환과 유사하여 감별진단이 어렵고, 임상현장에서 간편하고 빠르게 진단할 수 있는 방법이 없기 때문에 중증의 전신성 열성질환으로 발전하는 경우가 많으며, 매년 적지 않은 사망자가 발생하고 있다. 발병 지역 및 환자의 연령에 따라, 치료받지 않은 환자의 사망률은 6%가량으로 파악되고 있다(Taylor AJ et al., PLoS Negl Trop Dis 2015 Aug; 9(8): e0003971.).Tsutsugamus disease (scrub typhus) is an arthropod-borne infection caused by hair mite larvae infected with Orientia tsutsugamushi (hereinafter referred to as "Tsutsuga mucin"). It is estimated that more than one million cases occur annually in the Asia-Pacific region, such as Southeast Asia and Northern Australia. Patients with bites of infected hair mite larvae have symptoms of fever, chills, crust, rash, myalgia, and lymphadenopathy after 1-2 weeks of incubation. If the disease is diagnosed early, it can be treated with appropriate antibiotics. However, the initial clinical symptoms are similar to those of other febrile infections, which makes it difficult to differentiate between them. In many cases, many deaths occur every year. Depending on the area of incidence and the age of the patient, mortality of untreated patients is estimated to be about 6% (Taylor AJ et al., PLoS Negl Trop Dis 2015 Aug; 9 (8): e0003971.).
쯔쯔가무시병은 한번 앓고 나도 보호면역이 수년 내에 사라지기 때문에 유행지역에서의 재감염이 적지않게 발생하고 있는 것으로 알려져있다. 또한, 다양한 유전형의 쯔쯔가무시균에 대한 교차 반응성이 낮기 때문에 2차 세계대전 이후 지속된 백신개발 노력에도 불구하고, 아직까지 쯔쯔가무시병에 보편적으로 유효한 백신은 개발되어 있지 않다.Tsutsugamushi disease is known to cause re-infection in the epidemic area because even once I have suffered, protective immunity disappears within a few years. In addition, due to the low cross-reactivity with various genotypes of Tsutsugamu bacilli, despite the efforts to develop vaccines since World War II, no universally effective vaccines against Tsutsugamus disease have been developed.
초기 쯔쯔가무시병 백신은 포르말린 처리나 감마선 조사를 통한 사백신(Killed-vaccine)이었으나 사람에게서 효과적인 보호 면역을 제공하지 못하는 것으로 확인되었다. 또한, 재조합 단백질 백신(Subunit vaccine), DNA 백신 등이 연구되어 왔으나 이들 백신들은 일부 유전자형의 쯔쯔가무시 감염 환자에만 방어면역을 유도하는 것으로 보고되었다(Buckland and Dudgeon, 1945; Lancet 2, 734~737; Kawamura et al., 1940. Trop.Dis.Bull. 37, 269~270; Seong et al., 1997. Infect.Immun. 65, 1541~1545; Yu et al., 2005. Am.J.Trop.Med.Hyg. 72, 458~46). Early Tsutsugamus disease vaccine was killed-vaccine through formalin treatment or gamma irradiation, but was found to not provide effective protective immunity in humans. In addition, recombinant protein vaccines and DNA vaccines have been studied, but these vaccines have been reported to induce protective immunity only in patients with some genotypes of Tsutsugamushi infection (Buckland and Dudgeon, 1945; Lancet 2, 734-737; Kawamura). et al., 1940. Trop. Dis. Bull. 37, 269-270; Seong et al., 1997. Infect. Immun. 65, 1541-1545; Yu et al., 2005. Am. J. Trop. Med. Hyg. 72, 458-46).
현재 쯔쯔가무시균의 주요 막단백질인 56kDa Type specific antigen (TSA56)과 surface cell antigen A(ScaA)가 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 실험에서 숙주세포(host cell)의 면역 반응을 일으키는 것으로 알려졌다(Seong SY et al., Vaccine 1997 Nov; 15(16):1741-1747.; Ha NY et al., PLoS Negl Trop Dis 2015 Mar; 9(3): e0003585). 또한 최근 쯔쯔가무시균 감염 동물모델에서 CD8 T 세포가 치사율을 억제하는데 중요한 역할을 한다는 연구 결과들이 알려졌으나(Hauptmann M et al., PLoS Negl Trop Dis 2016 Sep; 10(9): e0004991; Xu G et al., PLoS Negl Trop Dis 2017 Jul; 11(7): e0005763), 아직까지 그 에피톱(항원결정기)에 대한 구체적인 연구는 수행되지 않았다.56kDa Type specific antigen (TSA56) and surface cell antigen A (ScaA), which are the major membrane proteins of Tsutsugamu bacteria, cause immune responses of host cells in in vitro and in vivo experiments. (Seong SY et al., Vaccine 1997 Nov; 15 (16): 1741-1747 .; Ha NY et al., PLoS Negl Trop Dis 2015 Mar; 9 (3): e0003585). In addition, recent studies have shown that CD8 T cells play an important role in suppressing mortality in Tsutsugamushi infection animal models (Hauptmann M et al., PLoS Negl Trop Dis 2016 Sep; 10 (9): e0004991; Xu G et al. , PLoS Negl Trop Dis 2017 Jul; 11 (7): e0005763), no specific studies have been conducted on the epitopes.
본 발명에서는 쯔쯔가무시균의 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포에 대한 에피톱 항원과 그것의 용도를 개시한다.The present invention discloses epitope antigens against TSA56 antigen-specific CD8 T cells of Tsutsugamu bacteria and their use.
본 발명의 목적은 쯔쯔가무시균의 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포에 대한 에피톱 항원을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide an epitope antigen against TSA56 antigen-specific CD8 T cells of Tsutsugamushi bacteria.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.Other and specific objects of the present invention will be presented below.
오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 주요 막단백질인 TSA56은 백신 항원으로 사용되어 오고 있다. 이에 더불어 최근 CD8 T 세포가 오리엔티아 쯔쯔가무시 균 감염에 대한 방어능을 제공한다는 것이 보고되었다. 따라서 사람에서 면역방어능을 확인하는데 있어, 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 확인하는 것은 매우 중요하지만, 아직 구체적인 시험방법이 존재하지 않는다. TSA56, a major membrane protein of Orientia Tsutsugamu strain, has been used as a vaccine antigen. In addition, the recent CD8 T cells are Orientia Tsutsugamu bacteria It has been reported to provide protection against infection. Therefore, it is very important to identify the CD8 T cell response specific to Orientia Tsutsugamu in the identification of immune defense ability in humans, but no specific test method yet exists.
이에 본 발명자들은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 측정하기 위한 도구로, TSA56 항원 내 MHC class I 제한 에피톱을 확인하기 위하여 아래 [표 2]의 네 개의 인터넷 기반 프로그램을 사용하여, 쯔쯔가무시병이 유행하는 동아시아 지역에서 가장 흔한 HLA 대립유전자인 HLA-A*0201에 결합할 수 있는 CD8 T 세포의 에피톱 후보 17가지 펩티드를 선별하고, 이 17가지 에피톱 후보 펩티드에 대해서 ELISPOT 분석(Enzyme-Linked ImmunoSpot assay)을 실시한 결과, HLA-A2형을 가진 회복된 환자의 말초혈액 단핵세포(PBMCs, peripheral blood mononuclear cells;PBMCs)에서 세 가지 항원결정인자 펩티드(MLIASAMSA의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, YLRNISAEV의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, QLYKDLVKL의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드)가 HLA-A2형 대조군(쯔쯔가무시병을 앓은 적인 없는 군) 혹은 비 HLA-A2형을 가진 회복된 환자와 비교할 때 유의하게 많은 IFN-γ 양성 면역점(immunospot)들을 유도함을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 펩티드들이 HLA-A2형을 가진 사람들에서 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석을 가능하게 함으로써 TSA56 항원 백신 접종이 면역 방어능을 유도하였는가 등을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.In this regard, the present inventors As a tool for measuring specific CD8 T cell responses, the four Internet-based programs in Table 2 below were used to identify MHC class I restricted epitopes in the TSA56 antigen. 17 epitope candidate peptides of CD8 T cells capable of binding to the common HLA allele HLA-A * 0201 were selected, and ELISPOT assay (Enzyme-Linked ImmunoSpot assay) was performed on the 17 epitope candidate peptides. , Three epitope peptides (peptides consisting of the amino acid sequence of MLIASAMSA, peptides consisting of the amino acid sequence of YLRNISAEV) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of recovered patients with type HLA-A2, QLYKDLVKL Peptide consisting of the amino acid sequence of the HLA-A2 control group (never had Tsutsugamushi disease) or a non-HLA-A2 recovered patient In comparison, it was confirmed that induced a lot of IFN-γ positive immunospot (immunospot). These results indicate that the peptides can be useful for confirming whether TSA56 antigen vaccination induced immune defense by enabling quantitative analysis of TSA56 antigen specific CD8 T cells in people with HLA-A2 type. do.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서, YLRNISAEV의 서열로 이루어진 TSA56 항원의 에피톱 항원 또는 QLYKDLVKL의 서열로 이루어진 TSA56 항원의 에피톱 항원에 관한 것이다.In view of the foregoing, in one aspect, the present invention relates to an epitope antigen of a TSA56 antigen consisting of a sequence of YLRNISAEV or an epitope antigen of a TSA56 antigen consisting of a sequence of QLYKDLVKL.
본 발명의 에피톱 항원은 재조합 DNA 기술을 이용하여 유전공학적으로 제조되거나 화학적 합성 방법으로 제조될 수 있다. The epitope antigens of the present invention can be produced genetically using recombinant DNA technology or by chemical synthesis methods.
유전공학적인 제조 방법은 펩티드를 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 DNA를 숙주세포에 형질전환시켜 발현시키는 기술인데, 이러한 재조합 DNA는 숙주세포에서 발현될 수 있도록 프로모터, 활성인자(activator), 인핸서, 작동인자(operator), 리보솜 결합 부위, 개시 신호, 정지 신호, 캡 신호(cap signal), 폴리아데닐화 신호, 등을 포함하며, 숙주세포는 E. coli 등의 박테리아, 사카로미세스(Saccharomyces sp.) 속 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 등이 사용될 수 있다. 재조합 DNA의 제작 기술, 형질전환 기술, 숙주세포의 적절한 배양 기술은 등은 모두당업계에 공지되어 있다.Genetic engineering is a technique for transforming and expressing recombinant DNA containing a gene encoding a peptide in a host cell, such a recombinant DNA promoter, activator, enhancer, operation Factors include an operator, ribosomal binding site, initiation signal, stop signal, cap signal, polyadenylation signal, and the like, and host cells include bacteria such as E. coli , Saccharomyces sp. Genus yeast, insect cells, mammalian cells and the like can be used. Techniques for making recombinant DNA, transformation techniques, appropriate culture techniques for host cells, and the like are all known in the art.
화학적 합성 방법도 당업계에 잘 공지되어 있는데, 예컨대 고체상 합성 기술, 용액상 합성 기술, 효소 합성법 등을 사용할 수 있으며 구체적인 것은 문헌[Stewart J.M. and Young J.D. (1984) “Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition”], 문헌[Bodanzsky M. and Bodanzsky A. (1984) “The practice of Peptide Synthesis”], 문헌[Lloyd-Williams, P., Albericio, F. and Giralt, E. (1997) “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins”], 문헌[Kullmann W. (1980) “Proteases as catalysts for enzymic syntheses of opioid Peptides” J.Biol.Chem. 255, 8234-8238] 등을 참조할 수 있다. 이러한 화학적 합성 기술은 아미노산의 수가 적은 소형 펩티드인 본 발명의 에피톱 항원의 제조에 특히 유용할 것이다.Chemical synthesis methods are also well known in the art, such as, for example, solid phase synthesis techniques, solution phase synthesis techniques, enzyme synthesis techniques, and the like, and specific examples are described in Stewart J.M. and Young J.D. (1984) “Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition”, Bodanzsky M. and Bodanzsky A. (1984) “The practice of Peptide Synthesis”, Lloyd-Williams, P., Albericio, F. and Giralt , E. (1997) “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins”, Kullmann W. (1980) “Proteases as catalysts for enzymic syntheses of opioid Peptides” J. Biol. Chem. 255, 8234-8238, and the like. Such chemical synthesis techniques will be particularly useful for the preparation of the epitope antigens of the invention, which are small peptides with a low number of amino acids.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 에피톱 항원들을 이용한 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for quantitative analysis of TSA56 antigen specific CD8 T cells using the epitope antigens.
본 발명의 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석 방법은, 전술하였듯이 TSA56 항원 백신 접종이 면역 방어능을 유도하였는가를 확인하는데 사용될 수 있고, 나아가 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 후 회복한 개체(사람)가 면역 방어능을 획득하였는가를 확인하는데 사용될 수 있으며, 또한 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 여부 진단 등에도 유용하게 사용될 수 있다. 또한 상기 에피톱 항원들은 다양한 유전형(Boryong, Gilliam, Ikeda, Karp, Kato, Kawasaki, Saitama, Shimokoshi, 및 TA763)의 TSA56 단백질 내에서 비교적 그 아미노산 서열이 잘 보존되어 있는 구간에 위치하고 있기 때문에(도 6 및 도 7 참조), 본 발명의 방법은 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토, 길리엄 등을 포함한 보령, 카와사키 등 다양한 균주에 대해서도 적용될 수 있다.The method of quantitative analysis of TSA56 antigen-specific CD8 T cells of the present invention can be used to confirm whether TSA56 antigen vaccination induced immune defense as described above, and furthermore, an individual (human) who recovered after infection with Orientia Tsutsugamus bacteria. Can be used to confirm whether the immune defenses have been obtained, and can also be useful for diagnosing the infection of Orientia Tsutsugamu bacteria. In addition, the epitope antigens are located in a region where the amino acid sequence is relatively well conserved in the TSA56 protein of various genotypes (Boryong, Gilliam, Ikeda, Karp, Kato, Kawasaki, Saitama, Shimokoshi, and TA763) (FIG. 6). 7), the method of the present invention can be applied to various strains such as Boryeong, Kawasaki, and the like, including the original serotype of Tsutsuga mucosa, kato, and gilium.
본 발명의 방법은 (a) 상기 에피톱 항원을 준비하는 단계, (b) TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 준비하는 단계, 및 (c) 상기 에피톱 항원과 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 반응시켜 에피톱 항원과 결합한 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 계수하는 단계를 포함하여 구성된다.The method of the present invention comprises the steps of (a) preparing the epitope antigen, (b) preparing TSA56 antigen specific CD8 T cells, and (c) reacting the epitope antigen with TSA56 antigen specific CD8 T cells. To count TSA56 antigen specific CD8 T cells bound to the epitope antigen.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계는 전술한 바와 같이 유전공학적 제조 방법 또는 화학적 합성 방법에 의하여 이루어질 수 있다.In the method of the present invention, step (a) may be performed by a genetic engineering method or a chemical synthesis method as described above.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 여부가 의심되는 개체(사람)나 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 후 회복한 개체, 유효성분이 TSA56 항원인 백신이 면역 방어능을 유도하였는가의 확인이 필요한 개체 등에서 혈액 시료를 얻고 원심분리 등의 방법을 통하여 CD8 T 세포를 포함하는 PBMC 세포를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 상기 개체들은 상기 에피톱 항원이 HLA-A2형에 특이적인 것임으로 고려할 때 HLA-A2형을 가진 개체인 것이 바람직하며, TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포는 이를 포함하는 IFN-γ-양성 PBMC 세포인 것이 바람직하다.In addition, in the method of the present invention, the step (b) may be performed by an individual suspected of having an infection with orientia Tsutsugamu (or human), or an individual recovered after infection with an Orientia Tsutsugamu, or a vaccine whose active ingredient is a TSA56 antigen. It may be achieved by obtaining a blood sample from an individual in need of confirmation of induction and isolating PBMC cells including CD8 T cells by centrifugation or the like. The subjects are preferably individuals having HLA-A2 type, considering that the epitope antigen is specific for HLA-A2 type, and TSA56 antigen specific CD8 T cells are IFN-γ-positive PBMC cells comprising the same. It is preferable.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (c) 단계는 본 발명의 아래의 실시예에서처럼 ELISPOT 분석(Enzyme-Linked ImmunoSpot assay) 등 공지된 방법을 통하여 이루어질 수 있다.In addition, in the method of the present invention, step (c) may be performed through a known method such as ELISPOT assay (Enzyme-Linked ImmunoSpot assay) as in the following examples of the present invention.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 쯔쯔가무시균의 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포에 대한 에피톱 항원과 그것을 이용한 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석 방법 등의 용도를 제공할 수 있다. As described above, according to the present invention, it is possible to provide the use of an epitope antigen against TSA56 antigen-specific CD8 T cells of Tsutsugamushi bacteria and a method for quantitative analysis of TSA56 antigen-specific CD8 T cells using the same.
도 1은 쯔쯔가무시 항원에 대한 항체 반응을 ELISA와 IFA 방법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는 쯔쯔가무시 항원에 대한 IgG 서브클래스 반응을 ELISA 방법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 3은 쯔쯔가무시 항원 특이적인 세포면역 반응(IFN-γ 및 IL-4)을 ELISPOT assay를 이용하여 확인한 결과이다.
도 4는 쯔쯔가무시 항원에 특이적인 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 flow cytometry를 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 PBMC 세포에서 IFN-γ- 양성세포를 확인하기 위하여 ELISPOT assay를 수행한 결과이다.
도 6은 9가지 유전형(Boryong, Gilliam, Ikeda, Karp, Kato, Kawasaki, Saitama, Shimokoshi 및 TA763)의 TSA56 항원의 서열을 정렬하고 그 정렬된 서열에서 17가지 에피톱 후보 항원 위치(적색 박스)를 표시한 것이다(각 정렬된 서열 상단에 표시된 아미노산 서열은 9가지 유전형에서 가장 높은 빈도수로 나타난 아미노산 서열이다).
도 7서열 도 6에서 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포와 반응성이 높은 4번 및 14번 에피톱 항원의 정렬된 서열을 확대하여 나타낸 것이다.1 is a result of confirming the antibody response to the Tsutsugamushi antigen using ELISA and IFA method.
Figure 2 shows the results of confirming the IgG subclass response to the Tsutsugamushi antigen using the ELISA method.
Figure 3 shows the results of confirming the Tsutsugamushi antigen-specific cell immune response (IFN-γ and IL-4) using the ELISPOT assay.
4 is a result of confirming the CD4 and CD8 T cell response specific to the Tsutsugamu antigen using flow cytometry.
Figure 5 shows the results of the ELISPOT assay to identify IFN-γ-positive cells in PBMC cells.
6 aligns the sequences of the TSA56 antigens of the nine genotypes (Boryong, Gilliam, Ikeda, Karp, Kato, Kawasaki, Saitama, Shimokoshi and TA763) and shows 17 epitope candidate antigen positions (red boxes) in the aligned sequence. (The amino acid sequence shown on top of each aligned sequence is the amino acid sequence with the highest frequency of nine genotypes).
FIG. 7 shows an enlarged sequence of
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의해 제한되는 것을 아니다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples.
<실시예 1> 시료 준비Example 1 Sample Preparation
<실시예 1-1> 샘플 수집Example 1-1 Sample Collection
본 발명의 실험은 서울대학교병원(IRB No. 1308-058-513) 및 충남대학교병원(IRB No. 2014-12-006)의 생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인하에 이루어졌다. 본 발명 실시예의 환자 및 건강한 사람의 임상 샘플은 모두 사전에 서면으로 수집 동의되었다.The experiment of the present invention was conducted under the approval of the Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (IRB No. 1308-058-513) and Chungnam National University Hospital (IRB No. 2014-12-006). All clinical samples of the patients and healthy persons of the inventive examples were agreed to be collected in writing in advance.
건강한 사람(n=29)과 쯔쯔가무시병에서 회복된 환자(n=64)의 말초 혈액은 충남대학교병원(대전, 한국)에서 수집되었다. 체액성 및 세포성 면역 반응을 분석하기 위하여 쯔쯔가무시병 환자들은 병에서 회복된 기간에 따라 4 그룹(Y0: 회복 후 2주 이내, Y1 ~ Y3: 회복 후 1 내지 3년)으로 분류되었다. 쯔쯔가무시병의 확진은 임상적인 증상 및 혈청학적 검사를 통하여 이루어졌다. 구체적으로 입원 중 쯔쯔가무시균 항원에 대한 간접면역형광항체법(indirect immunofluorescence antibody assay;IFA) 검사 또는 수동적혈구응집법(passive hemagglutination assay;PHA) 결과 IgM 항체에 대한 single titer cutoff가 1:160 이상이거나 또는 한 쌍의 플라즈마 값(titer of paired plasma)이 4배 이상인 경우 쯔쯔가무시병으로 확진하였다.Peripheral blood from healthy people (n = 29) and patients recovering from Tsutsugamus disease (n = 64) was collected at Chungnam National University Hospital (Daejeon, Korea). To analyze the humoral and cellular immune responses, Tsutsugamus disease patients were divided into 4 groups (Y0: within 2 weeks after recovery, Y1 to Y3: 1 to 3 years after recovery) according to the duration of recovery from the disease. Tsutsugamus disease was confirmed through clinical symptoms and serological examination. Specifically, the indirect immunofluorescence antibody assay (IFA) test or passive hemagglutination assay (PHA) test against the Tsutsugamus antigen during hospitalization resulted in a single titer cutoff of at least 1: 160 for IgM antibody or When the titer of paired plasma was more than four times, it was confirmed as Tsutsugamushi disease.
쯔쯔가무시 환자의 평균 연령은 60.1세(17~88세) 이었으며, 건강한 사람의 평균 연령은 60.5세(52-71세)였다. 검사에 참여한 쯔쯔가무시 환자의 성비는 남성대 여성의 비율이 45대 55 이었으며 건강한 사람의 경우 32대 68이었다.The average age of patients with Tsutsugashi was 60.1 years (17-88 years), and the average age of healthy people was 60.5 years (52-71 years). The sex ratio of Tsutsugamu patients who participated in the test was 45 to 55 for male to female and 32 for 68 for healthy people.
<실시예 1-2> 말초혈액 단핵세포 및 혈장 시료 준비Example 1-2 Peripheral Blood Mononuclear Cells and Plasma Sample Preparation
혈액 시료는 헤파린이 첨가된 튜브에 수집되었으며 800xg로 20분 동안 원심분리 하였다. 혈장을 포함하고 있는 튜브의 상층액은 쯔쯔가무시 항원에 대한 항체를 적정(titrate)하기 위하여 동결보관 되었다. 말초혈액 단핵세포(PBMCs, peripheral blood mononuclear cells;PBMCs)는 Histopaque(GE Healthcare)를 이용한 밀도기울기 원심분리(standard density centrifugation)를 통하여 분리하였다. 갓 채취한 PBMCs는 단일세포 수준에서 사이토카인 생성세포를 확인하고 측정하기 위한 Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) assay에 사용되었으며, 남은 PBMCs는 추후 유동 혈구 계산 분석(flow cytometric analysis)에 사용하기 위하여 동결보관 되었다.Blood samples were collected in heparinized tubes and centrifuged at 800xg for 20 minutes. The supernatant of the tube containing plasma was cryopreserved to titrate the antibody against the Tsutsugamus antigen. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by standard density centrifugation using Histopaque (GE Healthcare). Freshly harvested PBMCs were used for the Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) assay to identify and measure cytokine producing cells at the single cell level, and the remaining PBMCs were cryopreserved for later flow cytometric analysis. It became.
<실시예 1-3> 재조합 ScaA 및 TSA56 단백질 준비Example 1-3 Recombinant ScaA and TSA56 Protein Preparation
쯔쯔가무시 보령균주로부터 획득한 gDNA(GenBank accession no. AM494475.1)를 이용하여 ScaA 또는 TSA56의 유전자를 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 [표 1]에 기재하였다.The gene of ScaA or TSA56 was amplified using gDNA (GenBank accession no. AM494475.1) obtained from Tsutsugamushi Boryeong strain. The primer used at this time is described in [Table 1].
(amplified region in nt position)Product size (bp)
(amplified region in nt position)
ScaA
(88-3000)2,913
(88-3000)
Tsa56
(250-1230)981
(250-1230)
＊＊O. tsutsugamushi Boryong strain served as the templateRestriction enzyme sites are underlined
＊＊ O. tsutsugamushi Boryong strain served as the template
PCR 산물을 pET-28a에 삽입하였으며 서열확인을 위하여 시퀀싱을 수행하였다. 해당 재조합 플라스미드를 대장균(E.coli BL21 (DE3))에 도입하여 재조합 ScaA 또는 TSA56 단백질을 획득하였다. 구체적으로, 대장균 배양액에 isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG, 0.1 mM, Duchefa, Zwijndrecht, Netherlands)를 16℃에서 16시간 동안 처리하여 단백질 발현을 유도하였으며 Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) His-레진(Qiagen)을 이용하여 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 단백질은 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(Thermo scientific)와 인산완충 생리식염수(phosphate-buffered saline ; PBS)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 투석하였다. 획득한 재조합 단백질의 동정 및 순도 확인은 일반적인 웨스턴 블로팅과 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)법을 통하여 이루어졌다.PCR products were inserted into pET-28a and sequencing was performed for sequencing. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli ( E. coli BL21 (DE3)) to obtain recombinant ScaA or TSA56 protein. Specifically, E. coli cultures were treated with isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG, 0.1 mM, Duchefa, Zwijndrecht, Netherlands) at 16 ° C. for 16 hours to induce protein expression and Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) His-resin (Qiagen Purified according to protocol. The purified protein was dialyzed overnight at 4 ° C. using Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (Thermo scientific) and phosphate-buffered saline (PBS). Identification and purity confirmation of the obtained recombinant protein was carried out by general Western blotting and Coomassie blue staining method.
<실시예 1-4 > CD8Example 1-4 CD8 + + T 세포의 항원결정기 예측 및 HLA 타이핑(typing)Antigen Determinant Prediction and HLA Typing of T Cells
오리엔티아 쯔쯔가무시균의 TSA56 항원의 HLA-A*0201 하플로타입(haplotype) CD8+ T 세포 항원결정인자(epitope)를 예측하기 위하여 4가지 웹(Web)-기반 프로그램을 사용하였다[표 2].Four Web-based programs were used to predict HLA-A * 0201 haplotype CD8 + T cell epitopes of the TSA56 antigen of Orientia tsutsugamushi [Table 2].
상기 [표 2]에 기재된 4개 프로그램 중 최소 3개 이상에서 상위 1% 스코어 또는 백분위점수(percentile ranks)를 나타내는 17개의 잠재적 펩티드 항원결정인자를 선정하였다. 항원결정인자 펩티드의 서열 및 HLA-A*0201에 대한 친화도는 NetMHCpan 프로그램에 의하여 예측되었으며 [표 3]에 기재하였다. [표 3]의 TSA56 서열 아미노산 시작 위치는 GeneBank accession no. CAM79668에 기반하여 이루어졌으며 펩티드의 친화도(IC50)는 NetMHCpan 3.0 Server를 이용하여 예측하였다(Andreatta M and Nielsen M. Bioinformatics 2016; 32(4): 511- 517). [표 3]에 기재된 서열은 서열목록에서 그 일련번호 순서에 따라 서열번호 5 내지 21로 지정되어 있다.Seventeen potential peptide epitopes were selected that exhibited top 1% scores or percentile ranks in at least three of the four programs listed in Table 2 above. The sequence of the epitope peptides and the affinity for HLA-A * 0201 were predicted by the NetMHCpan program and described in Table 3. The amino acid starting position of the TSA56 sequence of Table 3 is according to GeneBank accession no. Based on CAM79668 and peptide affinity (IC 50 ) was predicted using NetMHCpan 3.0 Server (Andreatta M and Nielsen M. Bioinformatics 2016; 32 (4): 511-517). The sequences described in [Table 3] are designated by SEQ ID NOs: 5 to 21 according to their serial number order in the sequence listing.
HLA 타이핑은, HLA-A2 타입을 스크리닝하기 위하여 PE-labelled HLA-A2 항체(MBL, Nagoya, Japan)을 이용한 유동혈구 계산분석법(flow cytometric analysis)으로 이루어졌다.HLA typing consisted of flow cytometric analysis using PE-labelled HLA-A2 antibodies (MBL, Nagoya, Japan) to screen HLA-A2 types.
<실시예 2> 실험방법Example 2 Experimental Method
<실시예 2-1> 면역형광검사법(Immunofluorescence assay;IFA)Example 2-1 Immunofluorescence Assay (IFA)
면역형광검사법은 쯔쯔가무시균에 대한 전체 IgG 항체 역가를 측정하기 위하여 사용되었다. 세 가지 쯔쯔가무시 균주(Boryong, Karp, Gilliam strain)를 감염한 L929 세포를 수집하였으며 동량을 혼합한 후 면역형광검사법을 위한 항원으로 사용하였다(Ha NY et al., Clin Vaccine Immunol 2012 19(9):1442-1451). 구체적으로, 쯔쯔가무시병에 감염된 L929 세포를 모은 후 PBS를 이용하여 세척하고 테플론(teflon) 코팅된 슬라이드에 스폿 형태로 올렸다. 이후 차가운 아세톤 용액을 이용하여 10분간 고정화 작업을 수행하였으며 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. 2배씩 순차적으로 PBS에 희석한(1:40 에서 1:5,120까지) 환자의 혈청을 항체가 고정된 슬라이드의 스폿에 올리고 상온의 습실(moist chamber)에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 2차 항체로 Alexa Fluor 488이 부착된 goat anti-human IgG 항체(Molecular Probes)를 사용하였으며 PBS에 1:1,000의 비율로 희석하였다. 염색된 슬라이드는 올림푸스 FV1000 공초점 레이저주사현미경(Olympus)을 이용하여 관찰하였다. 면역형광검사법의 종말점 역가는 배경(background) 상에서 형광 신호를 나타내는 가장 높은 역가로 정의되었다.Immunofluorescence was used to determine the total IgG antibody titer against Tsutsugamu bacteria. L929 cells infected with three Tsutsugamushi strains (Boryong, Karp, Gilliam strain) were collected and used as antigens for immunofluorescence after mixing the same amount (Ha NY et al., Clin Vaccine Immunol 2012 19 (9): 1442-1451). Specifically, L929 cells infected with Tsutsugamus disease were collected, washed with PBS, and placed in spot form on a teflon-coated slide. After the immobilization was performed for 10 minutes using a cold acetone solution and stored at -70 ℃ until use. The serum of patients diluted twice in sequential order (1:40 to 1: 5,120) was raised to the spots of the slides on which the antibodies were fixed and incubated for 30 minutes in a room temperature moist chamber. Alexa Fluor 488-attached goat anti-human IgG antibody (Molecular Probes) was used as a secondary antibody and diluted 1: 1000 in PBS. Stained slides were observed using an Olympus FV1000 confocal laser scanning microscope (Olympus). The endpoint titer of immunofluorescence was defined as the highest titer that represents the fluorescence signal on the background.
<실시예 2-2> 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunospecific assay; ELISA)Example 2-2 Enzyme-linked immunospecific assay (ELISA)
ScaA 또는 TSA56 특이적 항체 반응이 나타나는지 확인하기 위하여, 96 웰 immunoassay 플레이트(Nunc)에 1㎕/ml의 농도의 정제된 항체 100㎕를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그 후 5% skim milk(탈지유) 첨가 PBS 용액을 이용하여 상온에서 2시간 동안 플레이트를 블로킹하였다. 0.05% Tween20가 포함된 PSB(0.05% PBST)를 이용하여 플레이트를 세척하였으며 horseradish peroxidase (HRP)가 부착된 마우스 anti-human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgG 항체 (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)를 첨가하여 한시간 동안 상온에서 인큐베이션 하였다. 그 다음으로 0.05% PBST를 이용하여 세척하였으며 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) peroxidase 기질용액(KPL, Gaithersburg, MD, USA)을 첨가한 후 10분 동안 인큐베이션 하였다. 해당 반응은 1M의 인산용액(phosphoric acid solution)을 이용하여 종료하였다. 450nm의 파장을 이용하여 microplate reader(Beckman Coulter Inc)로 흡광도를 측정하였으며 ELISA의 종말점 역가는 19개 대조군 혈청(1:100배로 희석)에서 획득한 평균 OD와 3x 표준편차(standard deviation; SD)를 포함하는 optical density (OD)의 가장 낮은 역가로 결정하였다.To determine if ScaA or TSA56 specific antibody reactions were present, 100 μl of purified antibody at a concentration of 1 μl / ml was coated in a 96 well immunoassay plate (Nunc) overnight at 4 ° C. Thereafter, the plate was blocked for 2 hours at room temperature using a PBS solution containing 5% skim milk. Plates were washed with PSB with 0.05% Tween20 (0.05% PBST) and mouse anti-human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or IgG antibodies (Southern Biotech, Birmingham, AL, attached to horseradish peroxidase (HRP)) USA) was added and incubated at room temperature for one hour. Next, the resultant was washed with 0.05% PBST and incubated for 10 minutes after adding 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) peroxidase substrate solution (KPL, Gaithersburg, MD, USA). The reaction was terminated using 1M phosphoric acid solution. Absorbance was measured with a microplate reader (Beckman Coulter Inc) using a wavelength of 450 nm, and the endpoint titer of the ELISA was calculated from the mean OD and 3x standard deviation (SD) obtained from 19 control sera (diluted 1: 100-fold). The lowest titer of the containing optical density (OD) was determined.
<실시예 2-3> 유동 혈구 계산 분석법(Flow cytometric analysis)Example 2-3 Flow cytometric analysis
10% 열처리된 비활성화 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 nM의 베타-메르캅토에탄올, 100units/ml의 페니실린/스트렙토마이신 및 2mM 글루타민(Welgene, South Korea)이 포함된 RPMI 1640 배양액(Gibco)에 정제된 ScaA 또는 TSA56 항체를 첨가(10㎍/ml)하여 flat-bottomed 배양 플레이트 24 웰에서 18-20시간 동안 인간 PBMCs를 배양(5×106 cells/well)하였다. 세포 내부의 사이토카인 염색을 위하여, GolgiPlug (BD Biosciences)를 세포 배양액에 첨가하였으며 추가적으로 6시간 동안 배양하였다. 그 후 얼음에서 냉각시킨 FACS 완충액 (1% 우혈청 알부민 및 1 mM EDTA이 포함된 PBS)로 3회 세포를 세척하였으며 ultra-block용액(10% 래트 혈청, 10% 햄스터 혈청, 10% 마우스 혈청 및 2.4G2 단일클론항체 10μg/ml)을 이용하여 얼음 위에서 30분간 블로킹을 수행하였다. 이후 PBMC 세포에 Pacific blue-접합된 CD4와 FITC-접합된 CD8 항체(BD Pharmingen)를 4℃에서 30분간 처리하였다. 세포 표면의 CD4 또는 CD8을 염색한 후 얼음으로 냉각한 FACS 완충액으로 3회 세척하였으며, 세포 내부의 사이토카인을 분석하기 위하여 제조사의 프로토콜에 따라 Cytofix/Cyxtoperm kit(BD Biosciences)를 이용한 염색을 진행하였다. 또한 APC 접합된 IFN-γ 항체(BD Pharmingen)를 이용하여 30분 동안 4℃에서 염색을 수행하였으며 염색된 세포를 FACS LSRII flow cytometer(BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. 확보한 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 이용하여 분석하였다.RPMI 1640 culture (Gibco) containing 10% heat treated inactivated fetal bovine serum (FBS), 50 nM beta-mercaptoethanol, 100 units / ml penicillin / streptomycin and 2 mM glutamine (Welgene, South Korea) Human PBMCs were cultured (5 × 10 6 cells / well) in 24 wells of flat-bottomed culture plates by adding purified ScaA or TSA56 antibody (10 μg / ml). For cytokine staining inside cells, GolgiPlug (BD Biosciences) was added to the cell culture and incubated for an additional 6 hours. The cells were then washed three times with ice-cold FACS buffer (PBS with 1% bovine serum albumin and 1 mM EDTA) and ultra-block solution (10% rat serum, 10% hamster serum, 10% mouse serum and Blocking was performed for 30 minutes on ice using 2.4 G2 monoclonal antibody (10 μg / ml). Then, Pacific blue-conjugated CD4 and FITC-conjugated CD8 antibodies (BD Pharmingen) were treated with PBMC cells at 4 ° C. for 30 minutes. After staining CD4 or CD8 on the cell surface was washed three times with ice-cold FACS buffer, staining using Cytofix / Cyxtoperm kit (BD Biosciences) according to the manufacturer's protocol to analyze the cytokine in the cell . In addition, staining was performed at 4 ° C. for 30 minutes using APC conjugated IFN-γ antibody (BD Pharmingen), and the stained cells were analyzed by FACS LSRII flow cytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). The obtained data was analyzed using FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR, USA).
<실시예 2-4> 효소결합 면역점 방법(Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay)Example 2-4 Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay
인간 IFN-γ/IL-4 dual color ELISPOT 방법(Abcam, Cambridge, UK)은 해당 키트의 제조사 프로토콜에 따라서 이루어졌다. 구체적으로, polyvinylidene difluoride backed microtiter 플레이트(MSIP, Millipore)에 25㎕의 35% 메탄올을 30초간 처리하고 살균한 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 플레이트를 IFN-γ/IL-4 포착 항체로 4℃로 하룻밤 동안 코팅하였다. 공동자극분자(co-stimulatory moleculs)인 anti-CD28 및 anti-CD49d 단일클론 항체(BD Pharmingen)가 있는 가운데 ScaA, TSA56 또는 본 발명의 9-mer의 항원결정기 펩티드들(1μM)를 첨가하여 37℃에서 8시간 동안 인간 PBMCs(5×105cell/well)를 자극하였다. anti-IL-4 항체를 1시간 30분 동안 상온에서 반응시켰으며 그 후 anti-FITC HRP와 스트렙토피딘-알칼리성 인산가수분해 효소(alkaline phosphatase; AP) 접합체를 한시간 동안 반응시켰다. 면역점(immunospot)은 AEC 또는 BCIP/NBT 기질과 순차적으로 인큐베이션 한 후 디벨롭하였으며 CTL ImmunoSpot 리더기(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH, USA)을 이용하여 결과를 측정하였다. 해당 결과는 맨눈을 이용하여 재확인하였다.Human IFN-γ / IL-4 dual color ELISPOT method (Abcam, Cambridge, UK) was performed according to the manufacturer's protocol of the kit. Specifically, 25 μl of 35% methanol was treated with polyvinylidene difluoride backed microtiter plates (MSIP, Millipore) for 30 seconds and washed three times with sterile PBS. Plates were then coated overnight at 4 ° C. with IFN-γ / IL-4 capture antibody. 37 ° C. by adding ScaA, TSA56 or 9-mer epitope peptides (1 μM) in the presence of co-stimulatory molecules anti-CD28 and anti-CD49d monoclonal antibodies (BD Pharmingen) Human PBMCs (5 × 10 5 cell / well) were stimulated for 8 hours at. The anti-IL-4 antibody was reacted for 1 hour and 30 minutes at room temperature, and then the anti-FITC HRP and the streptopidine-alkaline phosphatase (AP) conjugate were reacted for 1 hour. Immunospots were sequentially incubated with AEC or BCIP / NBT substrates and then developed and measured using a CTL ImmunoSpot reader (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH, USA). The results were reconfirmed using the naked eye.
<실시예 2-5> 통계처리Example 2-5 Statistical Processing
데이터는 GraphPad Prism 5.01 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., LaJolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 통계분석은 95% confidence interval 또는 one-way analysis of variance (ANOVA)과 two-tailed 스튜던트 t 검정법을 통하여 수행하였다. 또한, 각각 다른 그룹간의 비교를 위하여 뉴먼-쿨스 t 검정(Newman-Keuls t-test)을 수행하였다. p < 0.05일 경우 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.Data was analyzed using GraphPad Prism 5.01 software (GraphPad Software, Inc., LaJolla, CA, USA). Statistical analysis was performed using a 95% confidence interval or one-way analysis of variance (ANOVA) and a two-tailed Student's t test. In addition, Newman-Keuls t-test was performed for comparison between different groups. It was considered statistically significant when p <0.05.
<실시예 3> 실험 결과Example 3 Experimental Results
<실시예 3-1> 쯔쯔가무시병 환자에 대한 anti-ScaA 및 anti-TSA56 항체의 반응성Example 3-1 Reactivity of anti-ScaA and anti-TSA56 Antibodies in Patients with Tsutsugamushi Disease
IFA 방법을 수행한 결과, 회복 후 2주 내의 21명 환자(Y0)의 혈청에서 쯔쯔가무시균 특이적 IgG 반응의 평균 역가(titer)는 2,194이었으며, 그 범위는 320에서 5120(S.D.:±1,825)이었다[도 1a]. 항체의 역가는 회복 1년 후 환자에서 유의미하게 감소하였으며 유사한 기준선 수준을 3년까지 유지하였다(평균 역가: Y1=204, Y2=272, Y3=120).As a result of performing the IFA method, the average titer of Tsutsugamus specific IgG response in serum of 21 patients (Y0) within 2 weeks after recovery ranged from 2,194, ranging from 320 to 5120 (SD: ± 1,825). 1A. The titer of the antibody decreased significantly in patients after one year of recovery and maintained similar baseline levels for up to three years (mean titers: Y1 = 204, Y2 = 272, Y3 = 120).
특정 단백질 항원(ScaA, TSA56)에 대한 항체 반응은 박테리아 항원을 이용하여 ELISA 방법으로 측정되었으며 IgG와 같이, 순차적으로 감소하는 경향을 나타내었다[도 1b]. 각 항원에 대한 항체의 역가는 감염 이후 2년 이후에 유의미하게 감소하였다. 특히 anti-ScaA 반응(평균 역가: Y0=14,421; Y1=1,460; Y2=473; 및 Y3=325)은 anti-TSA56(평균 역가:Y0=12,011; Y1=4,500; Y2=1,000; 및 Y3=642)에 비하여 매우 급격하게 감소하였으며 이를 통하여 anti-TSA56 항체의 반응이 anti-ScaA 반응보다 지속된다는 것을 알 수 있다. ELISA를 이용하여 측정한 ScaA와 TSA56 항체 반응의 결과는 전체 박테리아에 대하여 IFA를 수행한 결과와 유사한 양상을 나타내었다[도 1C]. Antibody responses to specific protein antigens (ScaA, TSA56) were measured by ELISA method using bacterial antigens and showed a tendency to decrease sequentially, like IgG [FIG. 1B]. The titer of antibody to each antigen was significantly reduced after 2 years after infection. In particular, the anti-ScaA response (average titers: Y0 = 14,421; Y1 = 1,460; Y2 = 473; and Y3 = 325) is anti-TSA56 (average titers: Y0 = 12,011; Y1 = 4,500; Y2 = 1,000; and Y3 = 642 ), It is shown that the anti-TSA56 antibody response is longer than the anti-ScaA response. The results of ScaA and TSA56 antibody reactions measured by ELISA showed a similar pattern to that of IFA on whole bacteria [FIG. 1C].
<실시예 3-2> ScaA 및 TSA56에 대한 IgG isotype의 반응성Example 3-2 Reactivity of IgG Isotypes to ScaA and TSA56
ScaA와 TSA56에 대한 IgG 서브클래스 반응을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. [도 2]에 나타낸 바와 같이, TSA56 특이적 IgG1과 IgG3 서브클래스는 Y0 환자에게서 우세한 경향을 나타내었으며 이 후 두 서브클래스는 환자(Y1~Y3) 환자에서 순차적으로 감소하였다. 반면에, ScaA 항원 특이적인 IgG3 반응은 회복된 환자에서 거의 검출되지 않았으며 IgG1의 isotype만 막 회복된 환자군(Y0)에서 다소 우세한 경향을 나타내었다. 그러나 ScaA 특이적인 IgG1 반응은 회복 후 1년 환자군(Y1)에서는 급격하게 감소하였다. 박테리아 항원에 특이적인 IgG2와 IgG4 서브클래스는 쯔쯔가무시병에서 회복된 환자에서 유의미하게 검출되지 않았다. 결론적으로 TSA56 항원에 특이적인 IgG isotype은 IgG1 및 IgG3 서브클래스이며 이들의 반응은 회복 후 점차적으로 감소하였다. 또한 Sca1 항원에 대한 IgG1 isotype의 반응은 감염 후 1년 이내에 기저 수준까지 감소하였다.ELISA was performed to confirm IgG subclass response to ScaA and TSA56. As shown in FIG. 2, TSA56 specific IgG1 and IgG3 subclasses showed a predominant trend in Y0 patients, after which both subclasses decreased sequentially in patients (Y1 ~ Y3) patients. On the other hand, ScaA antigen-specific IgG3 responses were rarely detected in the recovered patients, and only the isotype of IgG1 tended to be more dominant in the recovered group (Y0). However, ScaA-specific IgG1 responses were drastically decreased in the patients group (Y1) 1 year after recovery. IgG2 and IgG4 subclasses specific for bacterial antigens were not significantly detected in patients recovering from Tsutsugamushi disease. In conclusion, IgG isotype specific for TSA56 antigen was subclass IgG1 and IgG3 and their response gradually decreased after recovery. In addition, the response of IgG1 isotype to Sca1 antigen decreased to baseline level within 1 year after infection.
<실시예 3-3> 항원 특이적인 T 세포의 반응성 확인Example 3-3 Confirmation of Reactivity of Antigen-Specific T Cells
항원 특이적인 세포성 면역 반응을 확인하기 위하여, TSA56 또는 ScaA 항원 자극 처리한 PBMCs 세포를 이용하여 ELISPOT과 유동혈구 계산 분석법을 수행하였다.To identify antigen specific cellular immune responses, ELISPOT and flow cytometry assays were performed using TSA56 or ScaA antigen stimulated PBMCs cells.
두 종류의 항원으로 자극된 IFN-γ-양성 반응의 PBMCs의 세포 숫자는 대조군(평균 숫자:98 for ScaA and 71 for TSA56 / 5 × 105 PBMCs)에 비하여 Y0 환자(평균 숫자:196 for ScaA and 145 for TSA56 / 5 × 105 PBMCs)와 Y1 환자(평균 숫자: 167 for ScaA and 102 for TSA56 / 5 × 105 PBMCs) 에서 급격하게 증가되었다[도 3].The cell number of PBMCs of IFN-γ-positive responses stimulated with both antigens was Y0 patients (mean number: 196 for ScaA and compared to control group (98 for ScaA and 71 for TSA56 / 5 × 10 5 PBMCs)). 145 for TSA56 / 5 x 10 5 PBMCs) and Y1 patients (mean number: 167 for ScaA and 102 for TSA56 / 5 x 10 5 PBMCs) increased dramatically (FIG. 3).
Y0 환자 그룹에서 ScaA와 TSA56로 자극되었을 경우 각각 53%(3 out of 15)와 67%(10 out of 15)의 회복된 환자가 ELISPOT 양성 반응을 나타내었다(counts over the mean plus 3 × SD of 19 control samples). 항원으로 자극된 IFN-γ-양성반응의 PBMCs의 숫자는 이후 점차적으로 감소하였으며 Y2 그룹에서는 통계적으로 유의한 숫자를 나타내지 않았다. 추가적으로, 항원으로 자극시켰을 경우 IL-4 양성반응의 PBMCs 세포 숫자는 환자 및 대조군에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 상기 사실들로부터 쯔쯔가무시병 환자는 Th1에 기반한 세포 반응이 우세하다는 것을 알 수 있다.In the Y0 patient group, 53% (3 out of 15) and 67% (10 out of 15) of recovered patients were positive for ELISPOT when stimulated with ScaA and TSA56 (counts over the mean plus 3 × SD of 19 control samples). The number of PBMCs of antigen-stimulated IFN- [gamma] -positive reactions then gradually declined and was not statistically significant in the Y2 group. In addition, PBMCs cell numbers of IL-4 positives did not show significant differences in patients and controls when stimulated with antigen. From the above facts, it can be seen that the T1-based cellular response is predominant in Tsutsugamus disease patients.
항원 특이적인 T 세포 반응을 보다 자세하게 살펴보기 위하여, 항원 자극 시에 IFN-γ를 분비하는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포를 유동혈구 계산 분석법을 사용하여 살펴보았으며 그 결과를 [도 4]에 나타내었다.To examine antigen-specific T cell responses in more detail, CD4 T cells and CD8 T cells secreting IFN-γ upon antigen stimulation were examined using flow cytometry and the results are shown in FIG. 4. It was.
ScaA 또는 TSA56 자극에 의해서, PBMCs 중 IFN-γ 양성반응의 CD4 T 세포는 Y0 환자 그룹의 샘플에서 대조군(쯔쯔가무시병을 앓지 않은 군)보다 급격하게 증가하였다. 그러나 Y1 및 Y2 환자 그룹의 샘플에서 증가되었던 IFN-γ 양성반응의 CD4 T 세포가 다시 급격하게 감소하는 경향을 나타내었다. CD8 T 세포의 경우, IFN-γ을 분비하는 비율이 항원을 처리한 Y0 그룹에서 급격하게 증가하였다. ScaA 항원에 특이적인, IFN-γ 양성반응의 CD8 T 세포는 Y1과 Y2 그룹에서 순차적으로 감소하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며 TSA56 항원에 특이적인 IFN-γ 양성반응의 CD8 T 세포는 감염 1년 이후 유의하게 감소하였다.By ScaA or TSA56 stimulation, CD4 T cells of IFN-γ positive in PBMCs increased more rapidly than the control (group without Tsutsumi's disease) in samples of the Y0 patient group. However, there was a tendency for the IFN-γ positive CD4 T cells to increase again in the samples of the Y1 and Y2 patient groups. For CD8 T cells, the rate of IFN-γ secretion increased dramatically in the Y0 group treated with antigen. IFN-γ-positive CD8 T cells specific for ScaA antigen decreased sequentially in the Y1 and Y2 groups but were not statistically significant and IFN-γ-positive CD8 T cells specific for TSA56 antigen were 1 year after infection. Significantly decreased.
<실시예 3-4> CD8 T 세포에 대한 TSA56항원의 항원결정기(epitope) 결정Example 3-4 Epitope Determination of TSA56 Antigen on CD8 T Cells
TSA56은, 쯔쯔가무시균의 주요한 외막 단백질 중 하나로 백신 개발에 있어서 주요한 타겟으로 여겨졌다. 또한 최근에는 CD8 T 세포가 쯔쯔가무시균 감염에 대한 주요 면역 방어 작용과 연관되어 있다는 보고가 있다(Hauptmann M et al. PLoS Negl Trop Dis 2016 Sep; 10(9): e0004991; Xu G et al., PLoS Negl Trop Dis 2017 Jul; 11(7): e0005763). 이에 따라 항체반응 뿐 아니라, 쯔쯔가무시균 특이적인 CD8 T 세포의 반응을 추적하는 것은 사람의 보호 면역능을 확인하는데 있어서 중요하다.TSA56 is one of the major outer membrane proteins of Tsutsugamu bacteria and was considered a major target in vaccine development. In addition, it has recently been reported that CD8 T cells are associated with a major immune defense against Tsutsugamu infection (Hauptmann M et al. PLoS Negl Trop Dis 2016 Sep; 10 (9): e0004991; Xu G et al., PLoS Negl Trop Dis 2017 Jul; 11 (7): e0005763). Accordingly, tracking not only the antibody response but also the response of Tsutsugamumini specific CD8 T cells is important in confirming the protective immune ability of humans.
CD8 T 세포 반응 측정을 위하여, TSA56 항원 중 MHC class I에 제한된 항원결정기를 스크리닝 하였다. 특히 TSA56의, HLA-A*0201형에 국한된 CD8 T 세포에 대한 항원결정기를 확보하기 위하여 4개의 웹 기반 프로그램(표 2)을 사용하여 스크리닝하였다. HLA-A*0201형은 쯔쯔가무시병이 유행하는 동아시아 지역에서 가장 흔한 HLA 대립 유전자로 알려져 있다.To determine CD8 T cell response, epitopes restricted to MHC class I of TSA56 antigen were screened. In particular, four web-based programs (Table 2) were screened to secure epitopes for CD8 T cells confined to HLA-A * 0201 type of TSA56. HLA-A * 0201 is known to be the most common HLA allele in East Asia, where Tsutsugamus disease is prevalent.
17개의 후보군 가운데 ELISPOT 방법을 이용하여 확인한 결과, 2개의 항원결정기 펩티드(YLRNISAEV(일련번호 4) 및 QLYKDLVKL(일련번호 14))가 대조군에 비하여 많은 수의 IFN-γ-양성 PBMCs 세포 spot을 유도하였다. 이러한 결과는 HLA-A2형의 회복된 환자에서 나타났으며, HLA-A2형의 대조군(쯔쯔가무시병을 앓지 않은 군)이나 HLA-A2형이 아닌 회복된 환자보다 우수하게 나타났다[도 5]. T 세포 항원결정기의 예측 서열들은 다양한 유전형의 TSA56 단백질 내에서 비교적 그 아미노산 서열이 잘 보존되어 있는 구간에 위치하고 있다([도 6] 및 [도 7] 참조).Among the 17 candidates, two epitope peptides (YLRNISAEV (serial number 4) and QLYKDLVKL (serial number 14)) induced a greater number of IFN-γ-positive PBMCs cell spots than the control group. . These results were seen in recovered patients of type HLA-A2, and were superior to those of non-HLA-A2 control groups (HZA-A2 control group) or non-HLA-A2 type recovered patients [FIG. 5]. Predictive sequences of T cell epitopes are located in sections where the amino acid sequences are well conserved within the various genotype TSA56 proteins (see [FIG. 6] and [FIG. 7]).
상기 결과를 통하여 확보한 항원결정기는, 쯔쯔가무시병에서 회복된 환자의 항원 특이적인 CD8 세포 면역 반응 모니터링을 위하여 유용하게 사용될 수 있으며 향후 다양한 유전형의 쯔쯔가무시균에 대한 공통 백신 개발에도 이용될 수 있다. The epitope obtained through the above results can be usefully used for monitoring the antigen-specific CD8 cell immune response of a patient recovered from Tsutsugamushi disease, and can be used in the development of a common vaccine against various genotypes of Tsutsugamushi bacteria in the future.
<110> TW, patent <120> Epitope Antigens of TSA56 Antigens of Orientia tsutsugamushi and the Use Thereof <130> PP17-467 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScaA-F <400> 1 cgggatccga tccatcagct tcatca 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScaA-R <400> 2 cggtcgacta tatcttcgtc tttgcc 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tsa56-F <400> 3 cggaatccgc accaggattt agagca 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tsa56-R <400> 4 cggtcgactt taccttgatt ctttgc 26 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide-1 <400> 5 Met Leu Ile Ala Ser Ala Met Ser Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide-2 <400> 6 Leu Ile Ala Ser Ala Met Ser Ala Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide-3 <400> 7 Val Met Tyr Leu Arg Asn Ile Ser Ala 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> 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Claims (6)
Epitope antigen of TSA56 antigen, consisting of the amino acid sequence of QLYKDLVKL.
(b) TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 준비하는 단계, 및
(c) 상기 에피톱 항원과 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 반응시켜 에피톱 항원과 결합한 TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포를 계수하는 단계를 포함하는
TSA56 항원 특이적 CD8 T 세포의 정량 분석 방법.
(a) preparing the epitope antigen of claim 1,
(b) preparing TSA56 antigen specific CD8 T cells, and
(c) reacting said epitope antigen with TSA56 antigen specific CD8 T cells to count TSA56 antigen specific CD8 T cells bound to epitope antigens;
Method for quantitative analysis of TSA56 antigen specific CD8 T cells.
상기 (a) 단계의 에피톱 항원은 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 3,
The epitope antigen of step (a) is characterized in that chemically synthesized.
상기 (b) 단계는 HLA-A2형을 가진 사람으로부터 혈액 시료를 얻고 그 혈액 시료에서 말초혈액 단핵세포를 분리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 3,
The step (b) is performed by obtaining a blood sample from a person with HLA-A2 type and separating peripheral blood mononuclear cells from the blood sample.
상기 방법은
(i) TSA56 항원 백신 접종이 면역 방어능을 유도하였는가를 확인하는데 사용되거나,
(ii) 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 후 회복한 사람이 면역 방어능을 획득하였는가를 확인하는데 사용되거나,
(iii) 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 여부 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 3,
The method is
(i) is used to confirm that TSA56 antigen vaccination induced immune defense, or
(ii) is used to confirm that a person who has recovered after infection with Orientia Tsutsugamu bacteria has acquired immune defenses,
(iii) A method characterized in that it is used for diagnosing the infection of Orientia Tsutsugamu bacteria.
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| PLOS: neglected tropical disease, (2015.03.13.), DOI:10.1371/journal.pntd.0003585. 1부.* |
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