KR102027693B1 - 벤젠환과 질소환을 포함하는 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 계면활성제 조성물 - Google Patents

벤젠환과 질소환을 포함하는 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 계면활성제 조성물 Download PDF

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KR102027693B1 KR1020180049541A KR20180049541A KR102027693B1 KR 102027693 B1 KR102027693 B1 KR 102027693B1 KR 1020180049541 A KR1020180049541 A KR 1020180049541A KR 20180049541 A KR20180049541 A KR 20180049541A KR 102027693 B1 KR102027693 B1 KR 102027693B1
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장수정
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윤형준
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Abstract

본 발명은 벤젠환과 질소환을 화학구조식 내에 포함하는 양친매성의 특성을 가지는 신규한 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규 화합물은 핵산분석이나 혈액분석 등에 있어서 시료의 형태를 장시간 동안 유지할 수 있는 계면활성제의 유효성분으로서 매우 효과적이다.

Description

벤젠환과 질소환을 포함하는 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 계면활성제 조성물{A amphiphatic compound containing heterocyclic structure with benzene and nitrogen-atom rings, the preparation method and a surfactant composition containing the compound}
본 발명은 벤젠환과 질소환을 화학구조식 내에 포함하는 양친매성의 특성을 가지는 신규한 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신규 화합물은 핵산분석이나 혈액분석 등에 있어서 시료의 형태를 장시간 동안 유지할 수 있는 계면활성제의 유효성분으로서 매우 효과적이다.
형광 프로브 등을 이용하여 혈액 등 유기체를 분석하기 위해서는 상기 혈액 등의 형태, 크기, 모양, 성숙정도 등이 장시간 동안 유지되어야 하고, 특히 분석대상이 되는 유기체를 선택적으로 분석할 수 있도록 노이즈를 최소화하기 위해 대상이 되는 유기체를 제외하고 다른 유기체는 용해시키거나 분해시킬 필요가 있다.
특히, Flow Cytometry 등을 이용하여 전혈을 분석할 때에는 분석 전에 혈액을 분구하여 각각의 분석 시약과 반응을 시키는 영역인 반응기 (reaction chamber)가 여러 개 배치되는데, 1개의 반응기 안에서 혈액 내 혈구들의 수십 개 정보를 한 번에 얻기는 어렵기 때문에, 각각의 반응기 내에서 적혈구 용혈, 백혈구 선택 손상 및 용혈을 선택적으로 유도할 수 있는 다양한 detergent와 동일 633nm 광원에 다른 형광 파장을 내도록 하는 핵산 염색용 근적외 형광 염료들을 사용하여, 각 반응기 내에서 얻어진 복잡다단한 혈구 내 성분을 측정하고 이를 비교 분석하여 보정하는 방식의 기법이 주로 활용되고 있다.
혈구 분석에 있어서는 제조사마다 차이는 있으나 혈액 샘플을 적정한 방법으로 분석하기 위해 전용시약을 사용하고 있으며, 이러한 시약의 종류로는 형광 염료를 이용한 DNA, RNA 및 백혈구 염색(fluorescence staining), 적혈구 용혈(hematolysis), 헤모글로빈 산화 시약, 혈액 샘플의 희석(dilution), 단백질 및 용혈성분 세정(cleaning), 고정(attaching) 및 측정 부위에 혈구를 일렬로 배열하기 위한 sheath reagent 등이 있다.
예를 들어 적혈구를 산성용혈형의 시약으로 용해하면 호염기구는 탈과립이 선택적으로 억제되면서 백혈구로부터 분리되며, 혈소판 응집 등의 영향을 받지 않는 상태에서 백혈구 수의 측정도 가능하며, 이렇게 처리된 혈액 시료를 레이져를 이용하여 분석할 경우에 전방 산란광과 측방산란광의 정보에 노이즈가 최소화되어 구체적으로 혈구를 검출 및 해석할 수 있다.
또한, 혈액의 과립구를 측정하는 경우에는 적혈구 용혈시약과 함께 백혈구 세포막 손상시약을 사용하여 DNA/RNA 등을 염색하기 위한 형광 시약의 형광 효율을 향상시켜 다양한 정보를 확인할 수 있어서, 최근에는 형광시약 등과 용이하게 상용이 가능한 계면활성제 시약 등을 개발하는 추세이다.
본 발명의 신규한 양친매성 화합물은 특히 전혈의 분석에 있어서 혈구의 용혈이 매우 우수하고 또한 형광 화합물을 동시에 적용하였을 경우에 형광 파장의 노이즈를 최소화하여 상기 파장분석을 통하여 다양한 정보를 측정 및 확인할 수 있는 전혈분석용 계면활성제로서 우수한 특성이 있다.
본 발명은 세포 및 유기체의 분석, 특히 전혈분석에 있어서 분석대상이 되는 목적물만을 안정적으로 유지하고, 시료 내에 존재하는 다른 유기체 및 세포는 용해 또는 용혈시킴으로써 형광염료 등을 이용하여 목적물을 분석할 때에 발생하는 오염 및 노이즈를 최소화할 수 있는 신규 화합물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 상기 신규 화합물의 제조방법 및 상기 신규 화합물을 포함하는 시료의 분석 등에 적용되는 계면활성제 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
선행기술문헌
-특허문헌
(특허문헌1)한국공개특허공보 KR 10-1996-0042056호
(특허문헌2)한국공개특허공보 KR 10-2006-0103902호
상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 신규한 화합물 및 이의 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018042458208-pat00001
상기 화학식 1에서
m은 1 내지 20의 정수이고, n 은 1 내지 25의 정수이고, R1은 탄소 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알킬, 탄소 1 내지 20의 치환 또는 비치환된 아민, 탄소 1 내지 6의 카르복실산, 설폰산, 이미도에스테르, 말레이미드, 숙신아미딜옥실, 에텐설포닐, 탄소 1 내지 6의 알킬아미닐 중에서 선택된다. 상기 화학식 1의 화합물은 할로겐 또는 황산과 염을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 화합물은 생체분자 등의 분석시 이용되는 계면활성제의 유효성분으로 사용될 수 있으며, 단백질 또는 항체와 같은 생체분자를 관측할 때에 목적물의 형태를 오랫동안 유지시킬 수 있고, 목적물 이외의 유기물에서 발생되는 노이즈를 최소화할 수 있다는 효과가 있다.
본 기술은 전혈 종합 분석을 위한 혈액 분석 장비용 형광, 용혈, 희석, 세정 및 고정 시약 개발에 관한 것으로서, 구체적으로는 전혈 종합 분석을 위한 혈액 분석 장비용 형광, 용혈, 희석, 세정 및 고정 시약 기술은 혈액 검사 시 일상적으로 측정되는 호중구 (neutrophil, NEUT), 호산구 (eosinphil, EO), 호염기구 (basophil, BASO), 림프구 (lymphocyte, LYMPH), 단핵구 (monocyte, MONO)의 5가지의 백혈구, 망상적혈구 (Reticulocyte, RET), 유핵적혈구 (nucleated red blood cell, NRBC), 헤모글로빈 (hemoglobin, HGB) 등의 적혈구 및 혈소판 분석을 위한 장비에 최적화된 분석용 신규 화합물 및 이를 포함하는 계면활성제 조성물에 관한 것이다.
혈구 분석 등을 위한 계면활성제 조성물의 목표시장은 전혈구 검사 시장으로 혈액질환의 진단이나 경과 관찰, 혈구 수의 증감이나 형태적 이상을 감별해 감염상태, 혈액응고 능력, 빈혈 유무 및 원인, 비뇨기 계통의 이상과 혈액성분이나 순환기 계통의 이상 등을 알아보기 위한 목적으로 실시되는 다양한 건강검진이나 의사가 처방하는 가장 흔한 병증진단검사 등이 될 수 있다.
혈액분석시장의 경우 대부분의 수요자가 중대형 병원에 집중되어 있으며 이의 공략을 위해서는 장비의 공급뿐만 아니라 수익의 대부분을 창출하고 지속적인 매출원이 될 수 있는 혈액/혈구 분석용 전용 시약의 개발이 필수적인 과제이며, 특히, 기 특허가 만료되었거나 혈구 분석 개발 방법이 공개되어 접근이 쉬운 세정, 세척 시약에 반해 직접적으로 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 분석에 효과적으로 사용될 수 있는 계면활성제의 확보가 절실한 상황이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018042458208-pat00002
상기 화학식 1에서
m은 1 내지 20의 정수이고, n 은 1 내지 25의 정수이고, R1은 수소, 탄소 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알킬, 탄소 1 내지 20의 치환 또는 비치환된 아민, 탄소 1 내지 6의 카르복실산, 설폰산, 이미도에스테르, 말레이미드, 숙신아미딜옥실, 에텐설포닐, 탄소 1 내지 6의 알킬아미닐 중에서 선택된다. 상기 화합물은 할로겐 또는 황산과 염을 형성할 수 있다.
본 발명에 속하는 구체적인 화합물로는 아래의 화학식 2 및 화학식 3의 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112018042458208-pat00003
상기 화학식 2에서 n은 8 또는 9이다.
[화학식 3]
Figure 112018042458208-pat00004
상기 화학식 3에서 n은 8 또는 9이다.
혈액 분석을 위한 본 발명의 화합물을 포함하는 혈액 분석용 시약 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 사용하고 또한 브롬화미리스틸트리메틸암모늄(Myristyltrimethylammonium bromide, Sigma aldrich)과 시트르산(Citric acid, Sigma aldrich)을 더 포함하여 제조될 수 있다. 본 발명의 혈액 분석용 시약 조성물은 상기의 화합물을 혼합한 후에 1M 수산화나트륨(NaOH, Sigma aldrich)을 이용하여 pH 3.0 내지 4.0까지 적정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 혈액 분석 시약 조성물은 혈액 중의 적혈구를 용혈시키는 데에 우수한 효능을 발휘하는 것으로 나타났다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.
먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다.
FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 500을 사용하였고, LC/MS에는 Agilent사의 LC/MSD (G-1956B) 을 사용하여 측정되었다.
유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상 (normal phase)의 경우, 실리카겔 (silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60 (230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피 (TLC)에는 실리카겔 60 GF254 (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산 (phosphomolybdic acid) (PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4를 사용하였다.
실시예 1: 화합물 2-1의 제조
(1) 화합물 a의 합성
Figure 112018042458208-pat00005
노나에틸렌글리콜 (Nonaethylene glycol) (1 g, 2.4 mmol, 1 eq, Leap Labchem)과 5N 수산화나트륨 (0.72 ml, 3.6 mmol, 0.75 eq)을 둥근 플라스크에 넣고, 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran) 12 ml 에 녹인 후 p-톨루엔설포닐클로라이드 (p-Toluenesulfonyl chloride) (0.342 mg, 1.8 mmol, 0.75 eq, TCI)을 상온에서 천천히 첨가하여 12 시간동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 투명한 액체 입자를 얻었다(0.941 g, 69 %).
Rf = 0.43 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 568.26, 측정치 591.3 (+Na+)
(2) 화합물 b의 합성
Figure 112018042458208-pat00006
화합물 a (0.941 g, 1.66 mmol, 1 eq)과 탄산칼륨 (275 mg, 1.99 mmol, 1.2 eq, 덕산)을 둥근 플라스크에 넣고, 아세토니트릴 (Acetonitrile) 8 ml 에 녹인 후 4-Iodophenol (4-아이오도페놀) (383 mg, 1.74 mmol, 1.05 eq, TCI)을 상온에서 천천히 첨가하여 1 시간동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 b를 얻었다. (0.707 g, 69.2%)
Rf = 0.6 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 616.17, 측정치 639.8 (+Na+)
(3) 화합물 c의 합성
Figure 112018042458208-pat00007
화합물 b (0.409 g, 0.664 mmol, 1 eq)와 트리메틸실릴아세틸렌 (Trimethylsilylacetylene) (0130 g, 1.33 mmol, 2 eq, TCI), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드 (Bis(triphenylphosphine)palladium(Ⅱ) Dichloride) (2.3 mg, 0.003 mmol, 0.005eq), 트리페닐포스핀 (Triphenylphosphine) (3.5 mg, 0.013 mmol, 0.02eq), 요오드화제일구리 (copper iodide) (4 mg, 0.02 mmol, 0.03eq)을 트리에틸아민 (Triethylamine) 4 ml에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20 분동안 교반했다. 그 후 수산화칼륨 (75 mg, 1.33 mmol, 2 eq)을 에탄올 8 ml에 녹인 뒤 초음파분해기(Sonicator)에 20 분 동안 교반했다. 이후, 에틸 에테르와 증류수로 추출한 후, 에틸에테르층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 투명한 액체 입자를 얻었다(0.562 g, 91.1 %).
Rf = 0.46 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 514.28, 측정치 553.4 (+K+)
(4) 화합물 d의 합성
Figure 112018042458208-pat00008
둥근 플라스크에 1-아이오도옥탄 (1-Iodooctane) (5 g, 20 mmol, 1 eq, TCI)과 아지드화나트륨 (Sodium azide) (2.7 g, 41 mmol, 2 eq, TCI)를 가한 후 다이메틸폼아마이드 (Dimethylformamide) 5 ml를 넣고 12-24 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이후, 디클로로메탄과 포화 염화암모늄 용액으로 추출한 후, 디클로로메탄 층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 노란색의 액체 입자를 얻었다(2.7 g, 84.3%).
Rf = 0.2 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 10:1 v/v)
(5) 화합물 2-1의 합성
Figure 112018042458208-pat00009
화합물 c(0.259 g, 0.504 mmol, 1 eq)와 화합물 d(0.156 g, 1 mmol, 2 eq) 및 아세트산구리 소량을 둥근 플라스크에 넣고, 메탄올 5 ml 에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20분동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2-1을 얻었다(0.120 g, 35.5%).
Rf = 0.32 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 671.44, 측정치 695.2 (+Na+)
실시예 2: 화합물 2-2의 제조
(1) 화합물 e의 합성
Figure 112018042458208-pat00010
데카에틸렌글리콜 (Decaethylene glycol) (1 g, 2.1 mmol, 1 eq, Leap Labchem)과 5N 수산화나트륨 (0.87 ml, 1.6 mmol, 0.75 eq)을 둥근 플라스크에 넣고, 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran) 10 ml 에 녹인 후 p-톨루엔설포닐클로라이드 (p-Toluenesulfonyl chloride) (0.311 mg, 1.6 mmol, 1.5 eq, TCI)을 상온에서 천천히 첨가하여 12 시간동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 투명한 액체 입자를 얻었다(0.821 g, 63.8 %).
Rf = 0.43 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 612.28, 측정치 635.6 (+Na+)
(2) 화합물 f의 합성
Figure 112018042458208-pat00011
화합물 e (0.235 g, 1 mmol, 1 eq)과 탄산칼륨 (63 mg, 1.6 mmol, 1.2 eq, 덕산)을 둥근 플라스크에 넣고, 아세토니트릴 (Acetonitrile) 5 ml 에 녹인 후 4-Iodophenol (4-아이오도페놀) (88 mg, 0.8 mmol, 1.05 eq, TCI)을 상온에서 천천히 첨가하여 1 시간동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 f를 얻었다(0.353 g, 53.4 %).
Rf = 0.59 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 660.20, 측정치 699.6 (+K+)
(3) 화합물 g의 합성
Figure 112018042458208-pat00012
화합물 f (0.353 g, 0.535 mmol, 1 eq)와 트리메틸실릴아세틸렌 (Trimethylsilylacetylene) (0.105 g, 1.07 mmol, 2 eq, TCI), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드 (Bis(triphenylphosphine)palladium(Ⅱ) Dichloride) (187 mg, 0.267 mmol, 0.5eq), 트리페닐포스핀 (Triphenylphosphine) (7 mg, 0.267 mmol, 0.5eq), 요오드화제일구리 (Copper iodide) (5 mg, 0.267 mmol, 0.5eq)을 트리에틸아민 (Triethylamine) 4 ml에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20 분동안 교반했다. 그 후 수산화칼륨 (60 mg, 1.07 mmol, 2 eq)을 에탄올 8 ml에 녹인 뒤 초음파분해기(Sonicator)에 20 분 동안 교반했다. 이후, 에틸에테르와 증류수로 추출한 후, 에틸에테르층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 투명한 액체 입자를 얻었다(0.301 g, 78.8 %).
Rf = 0.48 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 558.67, 측정치 597.3(+K+)
(4) 화합물 2-2의 합성
Figure 112018042458208-pat00013
화합물 g(0.301 g, 0.538 mmol, 1 eq)와 화합물 d (0.159 g, 1.1 mmol, 2 eq) 및 아세트산구리 소량을 둥근 플라스크에 넣고, 메탄올 5 ml 에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20 분동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 2-2을 얻었다. (0.102 g, 26.5%)
Rf = 0.32 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 715.46, 측정치 736.9 (+Na+)
실시예 3: 화합물 3-1의 제조
(1) 화합물 h의 합성
Figure 112018042458208-pat00014
둥근 플라스크에 2,2,4-트리메틸-2-펜타논 (2,2,4-Trimethyl-2-pentanone) (2 g, 15.3 mmol, 1 eq, TCI)과 트리메틸브로모실란 (Trimethylsilyl bromide) (2.22 ml, 16.8 mmol, 1.1 eq, TCI)를 가한 후 1-2 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이후, 감압증류를 통해 투명한 액체 입자를 얻었다(2.96 g, 100%).
Rf = 0.09 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 10:1 v/v)
(2) 화합물 i의 합성
Figure 112018042458208-pat00015
둥근 플라스크에 화합물 d(2.96 g, 15.3 mmol, 1 eq, TCI)와 아지드화나트륨 (Sodium azide) (2.99 g, 46.0 mmol, 3 eq, TCI)를 가한 후 다이메틸폼아마이드 (Dimethylformamide) 3 ml를 넣고 12 시간 동안 120℃에서 환류시켰다. 이후, 디클로로메탄과 포화 염화암모늄 용액으로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 노란색의 액체 입자를 얻었다(1.75 g, 73.8%).
Rf = 0.67 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 10:1 v/v)
(3) 화합물 3-1의 합성
Figure 112018042458208-pat00016
화합물 c(0.250 g, 0.486 mmol, 1 eq)와 화합물 i(0.151 g, 0.972 mmol, 2 eq) 및 아세트산구리 소량을 둥근 플라스크에 넣고, 메탄올 5 ml 에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20 분동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 3-1을 얻었다(0.0583 g, 17.9 %).
Rf = 0.33 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 669.86, 측정치 692.7 (+Na+)
실시예 4: 화합물 3-2의 제조
(1) 화합물 3-2의 합성
Figure 112018042458208-pat00017
화합물 g(0.250 g, 0.447 mmol, 1 eq)와 화합물 i(0.138 g, 0.894 mmol, 2 eq) 및 아세트산구리 소량을 둥근 플라스크에 넣고, 메탄올 5 ml 에 녹인 후 초음파분해기(Sonicator)에 20 분동안 교반했다. 이후, 디클로로메탄과 증류수로 추출한 후, 디클로로메탄층을 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 여과하여 감압증류를 통해 건조하였고, 디클로로메탄/메탄올 9:1을 전개액으로 실리카겔 정상 크로마토그래피로 정제하여 순수한 화합물 3-2를 얻었다(0.031 g, 9.7 %).
Rf = 0.32 (Silicagel, 디클로로메탄/메탄올 9:1 v/v)
LC/MS, 계산치 713.91, 측정치 736.6 (+Na+)
실시예 5: 상기 화학식 2 및 3의 화합물을 이용한 혈액분석 시약의 제조
화합물 2-1과 브롬화미리스트릴트리메틸암모늄(Myristyltrimethylammonium bromide(Sigma aldrich)), 시트르산(Citric acid(Sigma aldrich))을 혼합하여 혈액 분석 시약을 제조하였다. 상기 3 종류의 화합물을 혼합 후 1M NaOH(Sigma aldrich)를 이용하여 pH 3.3까지 적정하였다.
화합물 2-2, 3-1의 화합물을 이용하여 위와 동일한 방법으로 혈액 분석 시약을 제조하였다. 상기 화합물 2-1, 2-2 및 3-1을 이용하여 제조된 혈액분석 시약을 아래의 그림으로 도시하였다.
Figure 112018042458208-pat00018
시험예 1 : 본 발명의 계면활성제의 혈액 용혈 효능 검증
현미경 분석
계면활성제의 용혈 효과를 추가적으로 검증하기 위해 현미경을 이용하여 분석을 진행하였다. 혈액은 점도관리시약인 E-check(저농도)을 사용하였고, 화합물 3-1을 증류수에 0.4%으로 녹여 사용하였다. 분석은 Nikon ECLIPSE Ti-U 현미경으로 진행하였으며, X200 DIC filter 조건하에 측정하였다. 대조군으로 E-check 시약에 PBS를 처리한 샘플을 사용하였다. 아래의 그림에 표시한 분석결과로부터 대조군에 비해 화합물 3-1 계면활성제를 처리하였을 때 적혈구의 용혈이 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112018042458208-pat00019
시험예 2 : 혈액분석 시약을 이용한 계면활성제의 효능 검증
(1) FACS 분석
화합물 2-1, 화합물 2-2, 화합물 3-1을 이용하여 제조된 혈액 분석 시약을 검증하기 위해 Fluorescence Activated Cell Sorting(이하 FACS)을 사용하여 분석을 진행하였다. 분석을 위한 혈액 샘플은 Sysmex사의 점도관리시약인 E-check (저농도)를 사용하였고, E-check 시약에 제조된 혈액 분석 시약을 분주한 뒤 3초 후 FACS 분석을 진행하였다. 대조군으로 E-check 시약에 PBS를 처리한 샘플을 사용하였다. 분석은 Thermofisher 사의 Attune NxT 장비를 사용하였고 FSC 200, SSC 330, BL1 150, RL1 150, YL1 400의 조건하에 측정하였다. 아래의 데이터에 표시된 바와 같이 대조군으로 사용된 PBS를 처리한 샘플의 경우 적혈구 용혈이 이루어지지 않아 전체적으로 퍼져서 측정이 되는 것을 확인하였다. 이에 반해 화합물 2-1, 화합물 2-2, 화합물 3-1로 제조된 혈액분석시약을 처리하였을 때 적혈구의 용혈이 어느 정도 이루어지는 것을 확인하였다. 이 중 화합물 2-1이 계면활성제로서의 성능이 가장 좋은 것으로 확인되었다.
Figure 112018042458208-pat00020
(2) 현미경 분석
화합물 2-1, 화합물 2-2, 화합물 3-1로 제조된 혈액분석 시약의 혈액용혈 효과를 눈으로 확인하기 위해 현미경 분석을 진행하였다. 점도관리시약인 E-check(저농도)에 제조된 혈액분석시약을 처리하고 현미경 분석을 진행하였다. 분석은 Nikon ECLIPSE Ti-U 현미경으로 진행하였으며, X200 DIC filter 조건하에 측정하였다. 대조군으로 E-check 시약에 PBS를 처리한 샘플을 사용하였다. 아래의 그림에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 화합물 2-1, 화합물 2-2, 화합물 3-1을 이용한 계면활성제를 처리하였을 때 적혈구의 용혈이 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있었고, 앞서 FACS 결과와 유사하게 화합물2-1의 용혈 효과가 가장 큰 것으로 확인되었다.
Figure 112018042458208-pat00021
이상의 본 발명은 상기에서 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그 외에 다양한 생물학적, 화학적 분야에서 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

Claims (12)

  1. 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염
    [화학식 1]
    Figure 112019052751521-pat00022

    상기 식에서
    m은 1 내지 20의 정수이고, n 은 1 내지 25의 정수이고, R1은 메틸이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 아래의 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물
    [화학식 2]
    Figure 112018042458208-pat00023

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  3. 아래의 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물
    [화학식 3]
    Figure 112019052751521-pat00024

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  4. 혈액 분석을 위한 시약 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 아래의 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 시약 조성물
    [화학식 1]
    Figure 112019052751521-pat00025

    상기 식에서
    m은 1 내지 20의 정수이고, n 은 1 내지 25의 정수이고, R1은 메틸이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 아래의 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 시약 조성물
    [화학식 2]
    Figure 112018042458208-pat00026

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  6. 아래의 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 시약 조성물
    [화학식 3]
    Figure 112019052751521-pat00027

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  7. 제4항 내지 제6항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적혈구를 용혈하기 위한 계면활성제로 사용되는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 시약 조성물
  8. 제4항 내지 제6항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 브롬화미리스틸트리메틸암모늄(Myristyltrimethylammonium bromide) 및 시트르산(Citric acid)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 시약 조성물
  9. 혈액 분석 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 아래의 화학식 1로 표현되는 화합물을 제조하여 수득하는 단계;
    화학식 1로 표현되는 화합물과 브롬화미리스틸트리메틸암모늄(Myristyltrimethylammonium bromide) 및 시트르산(Citric acid)을 혼합하는 단계;
    상기의 혼합물에 수산화나트륨을 적가하여 pH를 3.0 내지 4.0으로 적정하는 단계; 및 상기 단계에서 수득된 조성물에 혈액을 혼합하여 분석하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 방법
    [화학식 1]
    Figure 112019052751521-pat00028

    상기 식에서
    m은 1 내지 20의 정수이고, n 은 1 내지 25의 정수이고, R1은 메틸이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 아래의 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 방법
    [화학식 2]
    Figure 112018042458208-pat00029

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  11. 혈액 분석 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 아래의 화학식 3으로 표현되는 화합물을 제조하여 수득하는 단계;
    화학식 3으로 표현되는 화합물과 브롬화미리스틸트리메틸암모늄(Myristyltrimethylammonium bromide) 및 시트르산(Citric acid)을 혼합하는 단계;
    상기의 혼합물에 수산화나트륨을 적가하여 pH를 3.0 내지 4.0으로 적정하는 단계; 및 상기 단계에서 수득된 조성물에 혈액을 혼합하여 분석하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 방법
    [화학식 3]
    Figure 112019052751521-pat00030

    상기 식에서 n은 8 또는 9이다.
  12. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2018067615A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-12 Sigilon Therapeutics, Inc. Compounds, devices, and uses thereof

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