KR102026681B1

KR102026681B1 - 조 단백질 생산능을 갖는 신규의 클로렐라 속 균주 및 이를 이용한 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR102026681B1
Application number: KR1020180014954A
Authority: KR
Inventors: 이성필; 강순태; 박창병; 전진영
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2019-09-30
Also published as: KR20190095675A

Abstract

본 발명은 조 단백질 생산능을 갖는 신규의 클로렐라 속 균주, 즉 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 조 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

조 단백질 생산능을 갖는 신규의 클로렐라 속 균주 및 이를 이용한 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법{Novel microorganism of the Genus Chlorella having crude proteins-producing activity and process for producing Chlorella-derived crude proteins using the same}

본 발명은 조 단백질 생산능을 갖는 신규의 클로렐라 속 균주 및 이를 이용한 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

미세 담수 녹조류 중 하나인 클로렐라는 인체에 유익한 탄수화물, 단백질, 지방뿐 아니라 엽록소, 비타민, 미네랄 등의 영양소를 함유하고 있어, 우주 식품으로도 선정된 영양학적으로 가치가 뛰어난 식품의 원료로 알려져 있다. 이 외에도 건강 기능 식품의 원료로도 널리 이용되고 있는 클로렐라는 높은 항산화 효과뿐 아니라, 피부건강과 면역기능에도 도움을 줄 수 있다. 클로렐라는 독립영양배양, 종속영양배양, 또는 이들의 조합에 의해 배양되며, 탄소원, 질소원, 미량금속, 미량원소 등을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다.

한편, 클로렐라 유래의 조 단백질(crude proteins) 즉, 클로렐라 균주가 가지고 있는 조 단백질은 순수한 단백질과 핵산, 아미드 화합물, 요소(urea) 등으로 구성되어 있다. 단백질은 몸을 구성하는 대표적인 물질로, 이는 근육의 주성분이 단백질이기 때문이다. 생물체 내의 화학반응의 종류는 매우 다양하며 각각의 반응에는 그 반응에만 촉매작용을 하는 효소가 존재한다. 생물체 내에서의 화학반응의 속도를 조절하는 촉매를 효소라고 하는데, 대부분의 효소는 단백질로 이루어져 있다. 그리고 면역을 담당하는 항체의 주된 구성성분으로 외부로부터 들어오는 항원과 결합하여 면역반응을 일으키는 주요 생체 방어 기작의 구성요소이다

본 발명자들은 높은 조 단백질 생산능을 갖는 신규의 클로렐라 균주를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 전국 각지의 기수역으로부터 다양한 클로렐라 속 균주를 분리하여, 배양 패턴 및 조 단백질 함량 분석을 통하여 선별된 균주에 대하여 18s rRNA 서열 분석을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 서열분석을 통하여 얻어진 균주에 대하여 무작위 변이(random mutation)를 실시하여 높은 조 단백질 생산능을 갖는 신규의 균주를 얻었다.

따라서, 본 발명은 상기 조 단백질 생산능을 갖는 클로렐라 속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조 단백질 생산능을 갖는 클로렐라 속 균주를 배양하고, 조 단백질을 회수하는 것을 포함하는 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 조 단백질 생산능을 갖는 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)가 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 조 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 따라 얻어진 새로운 균주, 즉 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)는 높은 조 단백질 생산능을 갖는다. 따라서, 상기 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 배양함으로써 클로렐라 유래의 조 단백질을 효과적으로 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의해 한강 기수역의 담수로부터 1차 선별된 2종의 균주를 5ℓ jar fermenter에서 배양하여 균주의 성장 패턴을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명에 의해 선별된 균주의 종 확인을 위한 계통수(phylogeny tree)이다.
도 3은 본 발명에 의해 선별된 균주에 대하여 무작위 변이(random mutation)를 실시한 후, 시클로헥시미딘(cycloheximide, CHX) 농도에 따른 균체량 및 조 단백질 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 시클로헥시미딘(cycloheximide, CHX) 2ppm 조건에서 내성을 갖는 변이 균주를 5ℓ jar fermenter에서 배양하여 균주의 성장 패턴을 측정한 결과이다.

본 명세서에서 "조 단백질 생산능을 갖는" 균주라 함은 해당 균주의 배양액으로부터 회수한 균체 중 조 단백질의 함량이 예를 들어 60 중량% 이상, 바람직하게는 65 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 70 중량% 이상인 균주를 의미한다.

본 발명은 조 단백질 생산능을 갖는 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 제공한다.

본 발명자들은 전국 각지의 기수역(brackish water zone, 汽水域)으로부터 클로렐라 균주와 유사한 성격을 가진 노란색 콜로니를 분리한 후, 암배양(heterotrophic culture) 가능성을 확인하고, 클로렐라 균주와 유사한 형태를 나타내는 균주들을 선별하였다. 선별된 균주들을 진탕배양 및 5 ℓ Jar fetmenter 배양을 수행하여 배양 패턴 및 조 단백질 함량을 분석하였으며, 이로부터 조 단백질 함량이 높은 균주를 선별하였다. 선별된 균주에 대하여 18s rRNA 서열 분석 및 염기서열 분석을 수행한 결과, 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 속하는 종으로 확인되었다. 본 발명자들은 선별된 균주를 시클로헥시미딘(cycloheximide, CHX)를 이용하여 NTG((N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)로 처리하여 무작위 변이(random mutation)를 실시하였으며, 그 결과 CHX 2ppm 조건에서 내성을 갖는 균주가 균체량 및 조 단백질 함량이 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 CHX 2ppm 조건에서 내성을 갖는 변이 균주를 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)로 명명하였으며, 이를 2017년 11월 14일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 18633P의 수탁번호를 부여받았다.

본 발명의 또한 상기 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 조 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법이 제공된다.

상기 배양은 통상의 클로렐라 배양방법(예를 들어, 대한민국 특허등록 제10-0193748호)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 물(예를 들어, 정제수 등) 중에 당원으로서 포도당(Glucose), 인산염(KH₂PO₄, K₂HPO₄ 등), 금속염(MgSO₄, ZnSO₄, CuSO₄, FeSO₄, NaMoO₄, MnCl₂ 등), 붕산 등을 포함하는 배지 중에서 수행될 수 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 배지는 소포제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 배지 중에서의 균주의 배양은 통상의 배양방법, 예를 들어 무균 탱크에서 무균적, 유기종속적(예를 들어, 당원으로서 포도당을 사용하여)으로 수행될 수 있으며, 공기를 0.3∼1.0vvm, 교반을 200∼500rpm, pH는 6.5∼7.5로 조절하여 유가식으로 수행될 수 있다.

상기 조 단백질의 회수는 배양액을 예를 들어 원심분리 등에 의해 균체를 회수한 후, 필요에 따라 통상의 방법으로 건조한 다음, 클로렐라 세포벽을 파쇄하여 조 단백질을 회수할 수 있다. 상기 클로렐라 세포벽의 파쇄는 예를 들어 효소처리에 의한 세포벽 용해방법 및 물리적인 세포벽 파쇄방법 등의 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 배양액을 원심분리한 후 균체를 증류수로 수세하여 클로렐라 현탁액의 형태로 얻은 다음, 이를 공지의 방법에 따라 마쇄함으로써 클로렐라 세포벽을 파쇄하여, 조 단백질을 회수할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

(1) 균주 분리

2016년 6월경 한강 기수역(brackish water zone, 汽水域)에서 담수를 채취해 필터를 이용해 담수를 통과시켜 샘플링을 진행하였다. 멸균된 0.9% 생리식염수로 수세를 진행한 후 희석하여 한천 플레이트 배지에 도말한 후 28℃에서 2-5일간 정치 배양을 실시하였다. 생성된 단일 콜로니들을 새로운 한천 플레이트 배지에서 계대배양한 후 액상배지(enrichment broth medium)를 이용해 플라스크에서 증균배양을 실시하였다. 자란 콜로니 중 노란색 콜로니를 선별한 후, 암배양(heterotrophic culture) 가능성을 확인하기 위해 탄소원으로서 포도당(Glucose)을 첨가한 한천 플레이트 배지에서 28℃에서 2-5일 동안 암배양하여 성장시켰다. 선별된 콜로니들 중 현미경 관찰을 통하여 클로렐라 균주와 유사한 형태(단일 세포 녹조류로서 구 형태, 크기는 약 5∼10 um, 편모 없음, 단일 세포로도 존재하고 세포분열시 뭉쳐있는 상태로도 존재)를 갖는 5종의 미세조류 균주들을 1차 선별하였다.

(2) 균주의 배양 패턴 및 조 단백질 함량 비교 (플라스크 배양)

1차 선별된 균주의 단백질 함량 및 성장을 확인하기 위해, 정제수 중에 하기 표 1의 조성을 갖는 배지를 사용하여 250㎖ 배플 플라스크에서 진탕배앙하였다. 상기 진탕배양은 시작 액량 100 ㎖, 배양 온도 28℃, 교반 속도 180 rpm의 조건으로 48시간 동안 수행하였다.

성분	농도 (%)
포도당(Glucose)	1.0
일인산 칼륨(KH₂PO₄)	0.07
이인산 칼륨(K₂HPO₄)	0.03
황산마그네슘(MgSO₄ 7H₂O)	0.03
효모 추출물(Yeast extract)	1.0
황산철(FeSO₄ 7H₂O)	0.003
붕산(H₃BO₃)	0.00286
염화망간(MnCl₂ 4H₂O)	0.0025
황산아연(ZnSO₄ 7H₂O)	0.00022
황산구리(CuSO₄ 5H₂O)	0.00008
몰리브덴산소다 (NaMoO₄ 2H₂O)	0.000021
소포제(LG126)	미량

상기와 같이 48시간 동안 진탕배양을 수행한 후, 각각의 배양 플라스크에서 얻어진 균체량 및 조 단백질 함량을 측정하였다. 균체량은 원심분리하여 배지를 제거한 후 증류수로 2회 수세한 현탁액을 105℃에서 24시간 건조한 후 무게를 측정하여 얻었다. 조 단백질 함량은 원심분리하여 배지를 제거한 후 증류수로 2회 수세한 현탁액을 황산(H₂SO₄)과 촉매제를 가하여 가열 분해한 후, 단백질 분석 기기(Kjeldahl 질소정량분석법)를 이용하여 측정하여 얻었다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.

플라스크	균체량(g/L)	조 단백질(%)
#1	6.3	42.33
#2	4.3	8.08
#3	7.4	38.36
#4	6.8	45.52
#5	4.7	1.08

표 2의 결과로부터 높은 조 단백질 함량을 나타낸 #1 및 #4의 2종의 균주를 선별하였다.

(3) 균주의 배양 패턴 및 조 단백질 함량 비교 (5 ℓ Jar fetmenter)

정제수 중에 하기 표 3의 조성을 갖는 배지를 사용하여 5ℓ jar fermenter에서 상기 (2)에서 선별된 균주 2종(#1, #4)을 배양하여 단백질 함량 및 성장패턴을 비교하였다. 상기 배양은 시작 액량 2.5 ℓ, 배양온도 28℃, 교반속도 550 rpm, Air 1.0 vvm의 조건으로 수행하였다. 배지 중 당의 농도를 모니터링하여 당의 농도가 0.5-1.0%로 감소하면 포도당을 가하여 1% 이상 되도록(약 2.0%) 조절하였다. 또한, 배지의 pH를 모니터링하여 pH가 6.8 이하로 감소하면, 암모니아를 가하여 약 pH 6.8로 유지하도록 조절하였다.

성분	농도(%)
포도당(Glucose)	3.0
일인산 칼륨(KH₂PO₄)	0.07
황산마그네슘(MgSO₄ 7H₂O)	0.03
비타민 B1	0.00001
황산제일철(FeSO₄ 7H₂O)	0.003
염화칼슘(CaCl₂ H₂O)	0.0025
몰리브덴산소다 (Na₂MoO₄ 2H₂O)	0.000021
이인산 칼륨 (K₂HPO₄)	0.03
염화나트륨 (NaCl)	0.0025
붕산 (H₃BO₃)	0.00286
황산망간(MnSO₄ 4H₂O)	0.0025
황산아연(ZnSO₄ 7H₂O)	0.00022
황산구리(CuSO₄ 5H₂O)	0.00008
효모추출물 (Yeast extract)	0.4
소포제(LG126)	미량

상기와 같이 배양을 수행하였을 때 얻어진 각각의 균주의 성장 패턴은 도 1과 같다. 또한, 각각의 배양액으로부터 얻어진 균체량 및 조 단백질 함량을 상기 (2)와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.

5L JF	균체량(g/L)	조 단백질(%)	배양시간(hr)
#1	38.6	43.4	53
#4	40.2	45.0	65

상기 표 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, #4 균주가 배양시간은 약간 길지만 성장패턴이 우수하고 조 단백질 함량이 45.0%로 #1 균주보다 높게 분석되어, #4 균주를 최종 선별하였으며, 이를 NCRC-4 균주로 명명하였다.

(4) 균주 동정

NCRC-4 균주의 종 확인을 위하여 하기 표 5의 프라이머쌍을 사용하여 18s rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.

	서열번호	염기서열
ITS_S	1	AAG GAT CAT TGA AT
ITS_A	2	TTA AGT TCA GCG GGT A
CR_18S_S	3	ATG CTT GTC TCA AAG ATT AAG CCA
CR_18S_A	4	ACC TTG TTA CGA CTT CTC CTT CCT
qRT_CR18S_S	5	ATT GAC GGA AGG GCA CCA C
qRT_CR18S_A	6	CAA GGC AAC CCA CCA ACT AAG

즉, 18s rRNA 서열을 가지는 ITS_S 및 ITS_A 프라이머 쌍, CR_18S_S 및 CR_18S_A 프라이머 쌍, qRT_CR18S_S 및 qRT_CR18S_A 프라이머 쌍을 각각 이용하여 PCR 반응(총 부피 50㎕, 94℃ 5분 1사이클 후, 94℃에서 30초, 36℃에서 45초, 72℃에서 2분, 총 30 사이클 이후 72℃에서 5분 및 12℃에서 10분)을 수행하여 증폭된 단편을 얻은 다음, 18s rRNA 염기서열 분석을 실시하였다. 상기 PCR 단편 및 NCRC-4 균주의 염기서열 분석을 마크로젠에 의뢰하였으며, 도 2의 계통수(phylogeny tree)를 분석한 결과, 상기 NCRC-4 균주는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 속하는 종으로 확인되었다.

실시예 2. 무작위 변이를 통한 균주 개량

실시예 1에서 선별된 NCRC-4 균주를 NTG((N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘)로 처리하여 무작위 변이(random mutation)를 실시하여 조 단백질 함량이 높은 균주 개량을 시도하였다. 미세조류의 단백질 합성 저해를 일으키는 항생제인 시클로헥시미딘(cycloheximide, CHX)를 이용하여 NTG를 처리한 후 단백질 합성 저해에 내성이 있는 균주를 선별하였다. 균주 선별을 위하여, 정제수 중에 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 조건하에서, 250㎖ 배플 플라스크 진탕배양을 실시예 1의 (2)와 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 진탕배양 결과, CHX 농도에 따른 균체량 및 조 단백질 함량은 하기 표 6 및 도 3과 같다.

	균체량(g/L) 평균	조 단백질(%) 평균
Control (NCRC-4)	7.33	43.56
CHX 1ppm	7.52	45.25
CHX 2ppm	8.87	58.59

상기 표 6 및 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, CHX 2ppm 조건에서 내성을 갖는 균주가 모주인 NCRC-4 균주에 비하여 균체량 및 조 단백질 함량이 약 15% (43% → 58%) 증가하였다. 따라서, 상기 CHX 2ppm 조건에서 내성을 갖는 변이 균주를 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)로 명명하였으며, 이를 2017년 11월 14일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 18633P의 수탁번호를 부여받았다.

실시예 3. 조 단백질 생산성 비교(5ℓ Jar fetmenter )

실시예 2에서 선별된 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 정제수 중에 상기 표 3의 조성을 갖는 배지 조건하에서 5ℓ Jar fermenter 배양을 실시예 1의 (3)과 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 배양 결과, 균체량 및 조 단백질 함량은 하기 표 7 및 도 4와 같다.

	균체량(g/L)	조 단백질(%)	배양시간(hr)
Control (NCR-4)	40.8	45.0	58
DS-NCRC7	42.4	71.9	57

상기 표 7 및 도 4의 결과로부터, 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7) 및 NCRC-4 균주는 배양 패턴 및 시간은 유사하지만, 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)는 NCRC-4 균주에 비하여 조 단백질 함량이 약 26%(45% → 71%) 증가하였음을 알 수 있다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Novel microorganism of the Genus Chlorella having crude proteins-producing activity and process for producing Chlorella-derived crude proteins using the same <130> PN0846 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aaggatcatt gaat 14 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ttaagttcag cgggta 16 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 atgcttgtct caaagattaa gcca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 accttgttac gacttctcct tcct 24 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 attgacggaa gggcaccac 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 caaggcaacc caccaactaa g 21

Claims

조 단백질 생산능을 갖는 클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P).
클로렐라 프로토데코이데스 DS-NCRC7(Chlorella protothecoides DS-NCRC7)(KCTC 18633P)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 조 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 클로렐라 유래의 조 단백질의 제조방법.