KR102025642B1 - 산화아연이 코팅된 복합 나노구조체를 이용하여 바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

산화아연이 코팅된 복합 나노구조체를 이용하여 바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(구체적으로 나노 필라 어레이)의 표면 상에 적어도 2개의 금속 층을 부착하되, 상층으로 산화아연층을 형성하여 박테리아와 같은 유해 바이오물질에 대한 화학적 상호작용을 증가시키고 표면에 주름 형상의 형태학적 특징(topology)을 발달시킴으로써 바이오물질에 대한 포집능이 개선된 복합 나노구조체를 제조하고, 더 나아가 이를 이용하여 박테리아, 바이러스 등의 바이오물질을 간편하면서도 고효율로 포집하고, 검출할 수 있는 진단 플랫폼을 제공할 수 있는 시스템 및 방법이 기재된다.

Description

산화아연이 코팅된 복합 나노구조체를 이용하여 바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법{System and Method for Capturing and Assaying Biomaterials Using Hybrid Nano-structures Coated with Zinc Oxide}
본 개시 내용은 산화아연이 코팅된 복합 나노구조체를 이용한 바이오물질의 포집/진단 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(구체적으로 나노 필라 어레이)의 표면 상에 적어도 2개의 금속 층을 부착하되, 상층으로 산화아연 층을 형성하여 박테리아와 같은 바이오물질에 대한 화학적 상호작용을 증가시키고 표면에 주름 형상의 형태학적 특징(topology)을 발달시킴으로써 바이오물질에 대한 포집능이 개선된 복합 나노구조체를 제조하고, 더 나아가 이를 이용하여 박테리아, 바이러스 등의 유해 바이오물질을 간편하면서도 고효율로 포집하고, 검출할 수 있는 진단 플랫폼을 제공하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 주방, 주방도구, 책상, 식기 등 일상생활 속의 물건등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.
특히, 병원성 대장균 E.coli O157:H7은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.
병원체는 오염된 토양, 수질 환경, 식자재, 그리고 조리환경 등을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체(특히, E.coli)의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다. 이처럼, 유전학적 분석을 기반으로 하는 임상 진단 기술은 통상적으로 박테리아(bacteria), 균류(fungus) 또는 바이러스(virus)로부터 핵산을 회수하여 증폭 반응을 수행한 다음, 다양한 검출 수단(예를 들면, 광학적, 전기화학적 또는 기계적 바이오센서 디바이스)을 이용하여 앰플리콘(amplicon)을 분석하는 방식을 이용한다.
한편, 자연발생적으로 입수되는 환경 시료는 식수, 음식물(예를 들면, 우유, , 음식물 등), 식수, 혈액 등과 같은 다양한 오염 가능원으로부터 채취될 수 있는 바, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스와 같은 바이오물질이 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 이와 같은 유해 바이오물질의 분석을 위하여는 해당 음식물 등을 물에 세척하고 배양한 후에 유해 바이오물질의 농도 또는 량을 측정하는 방식이 수행되고 있다. 그러나, 이러한 방식은 복잡한 과정을 수반하기 때문에 전문가만이 분석을 진행할 수 있고, 예를 들면, 약 3 내지 5일의 배양 과정을 거쳐 육안으로 분석하는 만큼, 검출에 소요되는 시간이 길고, 검출 정확도가 낮다.
또한, 최근 독감 바이러스로 문제시되는 H1N1 인플루엔자 바이러스 등은 공기 중에 함유되어 전파되고 있는 바, 이러한 기상 내 유해 바이오물질의 진단을 위하여 포집하기 위하여는 통상적으로 필터를 이용한 부착 방식이 이용되고 있다. 이와 관련하여, 박테리아 및 바이러스를 포집하기 위하여, 포토마스크 패턴 또는 디지털 마이크로 미러 소자 공정을 통하여 제작된 마이크로 구조물을 이용하는 기술이 개발된 바 있다(예를 들면, 국내특허번호 제1243631호 등). 또한,
박테리아 등의 포집을 위하여 소프트 리소그래피(soft lithography) 공정을 이용하고, 상단 부위에 특이적 반응 특성을 갖는 항체를 부착하여 오존 플라즈마 처리하거나(J. Nanosci. Nanotechnol. 2017, Vol. 17, No. 11), 또는 평면의 폴리아미드 역삼투압(PARO) 멤브레인을 mLbL 방식으로 제조한 후에 TiO2 필라를 제조하기 위하여 졸-겔법을 이용한 나노임프린팅 공정을 수행하는 기술도 알려져 있다(ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8, 31433??31441).
그러나, 전술한 기술의 경우, 미생물 또는 바이러스를 일정 수준으로 분리/포집할 수 있으나, 신속하게 유전자를 분석 또는 진단하는데 기술적 한계가 있다. 따라서, 포집 및 진단에 비교적 많은 시간을 요구하고, 또한 복잡한 절차를 수반하기 때문에 재현성 및 효율성 면에서 문제점이 있으며, 특히 진단에 소요되는 비용이 높은 수준이다.
이처럼, 다양한 상(phase)으로 입수되는 환경 시료와 같이 저 농도로 존재하는 유해 바이오물질(예를 들면, 병원체)을 함유하는 시료에 대하여 표적 바이오물질을 용이하면서도 효과적으로 포집하고, 또한 저비용으로 정확하게 진단할 수 있는 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.
본 개시 내용에 따른 구체예에서는 바이오물질(예를 들면, 각종 병원체 등)을간편하게 효과적으로 포집할 수 있는 방안을 제공하고자 한다.
또한, 현장 신속 검출이 요구되는 각종 식품, 식재료, 조리기구 등으로부터 식중독 균과 같은 바이오물질을 고효율로 포집할 수 있고, 또한 포집된 바이오물질을 저렴한 비용으로 정확하게 진단할 수 있는 포집 및 진단 플랫폼을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 제1 면에 따르면,
시료 내 함유된 바이오물질을 포집하는 방법으로서,
a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료 내 바이오물질을 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 복합 나노구조체는,
(i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 방법이 제공된다.
본 개시 내용의 제2 면에 따르면,
a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료 내 바이오물질을 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계;
b) 상기 포집된 바이오물질을 용해(lysis)시켜 핵산을 추출하는 단계; 및
c) 상기 추출된 핵산을 증폭하여 검출하는 단계;
를 포함하는 바이오물질의 진단 방법으로서,
여기서, 상기 복합 나노구조체는,
(i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 방법이 제공된다.
본 개시 내용의 제3 면에 따르면,
시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 시스템으로서,
(i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 복합 나노구조체;
상기 복합 나노구조체에 포집된 시료 내 바이오물질로부터 유래하는 핵산에 대한 증폭 수단; 및
상기 증폭된 핵산의 검출 수단;
을 포함하는 시스템이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 산화아연 층은 초음파 합성법에 의하여 형성될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 산화아연 층의 표면 조도는, 205 내지 260 nm의 Rq, 170 내지 220 nm의 Ra 및 970 내지 1100 nm의 Rz 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 초음파 합성법은,
아연 전구체-함유 용액을 제공하는 단계; 및
상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물을 상기 아연 전구체-함유 용액에 접촉시켜 초음파 조사 하에서 반응시키는 것에 의하여 상기 아연 전구체를 산화아연으로 전환시키는 단계;
를 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 아연 전구체-함유 용액은, 환원제로서 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 초음파 조사 하에서의 반응은 20 내지 200 W의 출력의 초음파를 3 내지 120 분 동안 조사하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법은, 고분자 재질의 나노구조체, 즉 나노 필라(pillar) 어레이의 표면 상에 적어도 2개의 금속 층을 부착하되, 상층(구체적으로 바이오물질과 접촉하는 층)으로 산화아연 층을 형성하여 양전하를 띄게 함으로써 박테리아와 같은 바이오물질에 대한 화학적 상호작용을 증가시키고, 또한 초음파 조사에 의한 산화아연 층을 합성하여 산화아연 층 표면에 주름 형상의 공간적 특성 또는 형태학적 특징을 발달시킴으로써 바이오 물질에 대한 포집능을 현저히 개선함과 동시에, 기저의(underlying) 고분자 재질의 나노구조체로부터 기인하는 물리화학적 안정성을 확보할 수 있다.
또한, 본 개시 내용의 다른 구체예에서는 짧은 반응 시간에 걸쳐 수용액 상(phase)에서 산화아연으로 전환되는 초음파 조사법(sonication)을 적용한 결과, 저비용으로 신속하게 나노패턴 구조물 상에 바이오물질의 포집에 효과적인 대면적의 산화아연 코팅 층을 형성할 수 있기 때문에 경제성, 친환경성 등에 있어서도 우수한 장점을 갖는다.
따라서, 복합 나노구조체를 이용한 병원체와 같은 바이오물질의 효과적인 포집 또는 고정을 통하여 각종 음식물 및 식수 내 유해 병원체의 진단은 물론, 인체의 피부 접촉, 기침, 공기 전파 등 다양한 직간접적 전파 또는 감염 경로에 대하여도 유연한 진단 방안을 제공할 수 있기 때문에 향후 임상 진단, 환경 모니터링, 약물 유전학 분석 등의 다양한 분야에서 광범위한 활용이 기대된다.
도 1a는 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 복합 나노구조체를 제조하는 일련의 공정을 보여주는 도면이고;
도 1b는 고분자 재질의 복수의 나노필라가 형성된 나노 패턴 구조물을 제작하는 일련의 과정을 도시하는 도면이고;
도 2a 내지 도 2c 각각은 실시예에서 초음파 조사 하에서 반응 시간(60분, 90분 및 120분)에 따른 ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물의 표면 상태를 보여주는 주사전자현미경(SEM) 사진이고,
도 3은 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(PUNO) 및 (b) Au 코팅된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(G-PUNO), 그리고 프로브 타입의 초음파 조사 장치를 이용하되, 시간(1 분, 2 분 및 5 분)을 달리하면서 산화아연 층이 코팅된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO)의 SEM 사진이고;
도 4는 실시예에서 형성된 산화아연 층의 제타전위 값을 나타내는 그래프이고;
도 5는 실시예에서 순차적으로 형성된 (a) 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(PUNO), (b) Au-코팅된 나노 패턴 구조물(G-PUNO) 및 (c) ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO) 각각에 대한 XRD 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 6은 ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO)에 대한 맵핑(mapping) 분석 결과를 나타내는 도면이고;
도 7은 실시예에서 순차적으로 형성된 (a) 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(PUNO), (b) Au-코팅된 나노 패턴 구조물(G-PUNO) 및 (c) ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO) 각각에 대한 FT-IR 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 8은 실시예에서 순차적으로 형성된 (a) 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(PUNO), (b) Au-코팅된 나노 패턴 구조물(G-PUNO), (c) ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO) 및 (d) ZG-PUNO 구조물을 이용하여 박테리아를 포집하는 일련의 과정을 보여주는 도면, 그리고 (e) PUNO 구조물, (f) ZG-PUNO 구조물 및 (g) 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물의 SEM 사진(107 CFU/ml)이고;
도 9는 ZG-PUNO 구조물에 대한 박테리아의 포집 상태를 보여주는 FIB(Focused ion beam) 사진이고;
도 10은 ZG-PUNO 구조물 상에 박테리아가 포집된 SEM 사진이고(10-106 CFU/ml)이고;
도 11은 (a) PUNO 구조물, (b) ZG-PUNO 구조물 및 (c) 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 FT-IR 스펙트럼이고;
도 12는 (a) PUNO 구조물, (b) ZG-PUNO 구조물 및 (c) 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 XRD 스펙트럼이고;
도 13은 (a) PUNO 구조물, (b) ZG-PUNO 구조물 및 (c) 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 AFM 분석 결과 및 이로부터 측정된 표면 조도를 나타내는 도면이고;
도 14a 내지 도 14d 각각은 초음파 조사 하에서의 반응 시간(10분, 30분, 40분 및 50분)을 변화시키면서 형성된 ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO)의 박테리아의 포집 상태를 보여주는 SEM 사진이고;
도 15는 ZG-PUNO 구조물 상에 식중독 균으로서 (a) S. enteritidis 및 (b) S. aureus가 포집된 상태를 보여주는 SEM 사진이고;
도 16은 시료 내 박테리아 농도에 따른 PCR 증폭 후 아가로오스 겔 전기영동 분석 결과를 나타내는 도면이고(Lane M: Molecular Weight Marker 50 bp(Amersham, USA). Lane N: Negative Control. Lane P: PUNO. Lane G: G-PUNO. Number: ZG-PUNO; 시료 내 박테리아 농도: 107-101 CFU/ml); 그리고
도 17은 106 CFU/ml 박테리아를 함유하는 시료를 투명 비닐장갑 및 고무장갑 각각에 분무한 후에 ZG-PUNO 구조물에 접촉시키고, PCR 증폭 후 아가로오스 겔 전기영동 분석 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"고분자"는 단일중합체 및 공중합체를 모두 포함하며, 공중합체는 랜덤 공중합체 및 블록 공중합체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
"나노구조물" 또는 "나노구조체"는 나노 스케일(예를 들면, 약 0.1 내지 1,000 nm, 구체적으로는 1 내지 100 nm)의 치수 또는 사이즈를 갖는 특징부(feature) 또는 텍스츄어(texture), 예를 들면 나노필라, 나노로드, 나노 벽(wall), 나노와이어, 나노 웹 등을 구비하는 임의의 나노 스케일의 객체를 의미할 수 있다.
"나노필라(nanopillar)"는 직경이 약 1,000nm 이하, 예를 들면 수 나노미터 내지 수백 나노미터 범위인 막대 형상을 의미할 수 있다.
"어레이(array)"는 지지체, 부재(member) 또는 백킹 부재(backing member)로부터 도출되거나 이에 부착(고정)된, 섬유, 컬럼, 필라, 루프, 튜브, 콘, 블록, 큐브, 헤미스페어, 스페어, 벽, 그리드, 홀 또는 이의 조합을 포함하는 형태학적 특징부, 텍스츄어 또는 표면을 의미하는 것으로 폭넓게 해석될 수 있다.
"부착(adhesion)" 또는 "고정(immobilization)"은 단백질, 세포 또는 기타 물질이 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.
"바이오물질"은 광의로는 임의 타입의 생물학적 유기체(biological organism)로부터 유래하는 물질을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 복수의 세포로 이루어질 수 있고 핵산일 필요는 없으며, 예를 들면 병원체(병원성 세포 또는 박테리아)일 수 있다.
"시료"는 검출하고자 하는 바이오물질를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.
"세포 용해(lysis)"는 세포의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전단계에서 DNA 또는 RNA를 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.
“핵산”은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.
"프로브"는 협의로는 표적 핵산 내에 함유된 특정 염기 서열과 상보적 염기 서열을 포함하고 있어, 적절한 조건 하에서 혼성화되는 성분 또는 바이오분자를 의미할 수 있으나, 광의로는 특정 성질 또는 량을 측정하기 위하여 표적 성분과 선택적이고 미리 정해진 방식으로 상호 작용하는 성분을 의미할 수 있다.
"용해 완충액 또는 세포용해 완충액(lysis buffer)"은, 예를 들면 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 이때, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화 가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다.
"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.
"증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.
"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.
"접촉한다"는 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
"형광(fluorescence)"이라는 용어는 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 즉, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미한다. 예시적으로, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들면 약 10-9 내지 10-8 초 수준일 수 있다.
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
전체적인 개시 내용
일 구체예에 따르면, 산화아연이 코팅된 복합 나노구조체에 바이오물질을 접촉시켜 포집하는 방법이 제공된다. 이때, 코팅된 복합 나노구조체는 (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함할 수 있다.
일반적으로, 박테리아와 같은 바이오물질과 고체 표면 간의 상호 작용에는 전하에 의한 상호작용(정전기적 결합), 수소 결합 및 소수성 결합(hydrophobic interaction)이 관여된다. 한편, 바이오물질 간의 상호 작용에 있어서도 이러한 3가지 힘이 작용한다.
고농도 시료에서는 바이오물질의 표면 전하에 관계없이 소수성 결합에 의하여 서로 용이하게 응집될 수 있다. 반면, 저농도 시료에 있어서는 바이오물질 간의 거리가 크기 때문에 수소 결합 및 소수성 상호작용이 감소하게 된다. 따라서, 저농도 시료에서는 고체 표면과 바이오물질 간의 상호 작용뿐만 아니라, 바이오물질들 간의 상호 작용과 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있다. 이와 관련하여, 바이오물질이 부착되는 고체 표면의 형태학적 특징 역시 바이오물질의 부착에 영향을 미치는 물리적 요인으로서 접촉 면적 등이 증가할 경우, 포집능은 강화될 수 있다. 이러한 점에서 후술하는 바와 같이 일 구체예에 따른 복합 나노구조체는 효과적인 포집 효과를 제공한다.
구체적으로, 바이오물질을 함유하는 시료를 산화아연이 코팅된 복합 나노구조체와 접촉시킬 경우, 시료 내 바이오물질은 이와 접촉하는 복합 나노구조체의 표면 층인 양전하의 산화아연 층과 정전기적 인력 또는 화학적 상호작용이 증가하여 용이하게 부착될 수 있다. 또한, 초음파 조사 하에서 하측의 표면개질 금속층과 상호 작용하면서 합성하는 방식으로 산화아연 층을 형성한 결과, 이의 표면에 주름 형상의 공간적 특성(topology) 또는 형태학적 특징이 발달하여 1차적으로 부착된 바이오물질이 보다 견고하게 부착될 수 있는 효과를 제공한다. 더 나아가, 복합 나노구조체의 기저 구조인 고분자 재질의 나노필라 어레이가 갖는 물성으로부터 기인하는 물리화학적 안정성을 동시에 확보할 수 있다. 이외에도, 복합 나노구조체의 제작 과정 중 나노필라의 길이, 직경 및 필라 사이의 간격을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에, 박테리아뿐만 아니라, 보다 작은 사이즈의 바이러스까지도 포집 및 검출하는데 적용 가능성이 있다.
본 명세서에서 적용 가능한 바이오물질은 전형적으로는 병원체 또는 병원성 세균을 포함할 수 있다. 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물을 포함할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 병원체와 같은 바이오물질은 다양한 방식으로 또는 다양한 매개체를 통하여, 예를 들면 인체(예를 들면, 피부) 접촉, 액상(예를 들면, 기침 중 타액) 및/또는 기상(예를 들면, 공기)를 통하여 복합 나노구조체와 접촉하여 포집될 수 있다. 특히, 피부 전염으로 전파는 병원체의 경우, 손 접촉만으로도 용이하게 포집할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 이와 같이 포집된 바이오물질, 구체적으로 병원체는 후속적으로 증폭 반응을 거쳐 검출될 수 있는 바, 이러한 증폭 방식으로서, 예를 들면, PCR 테크닉(DNA를 증폭), NASBA 테크닉(RNA 증폭) 등과 같이 당업계에서 공지된 증폭 기술을 이용할 수 있으며, 이를 통하여 보다 정확하게 검출될 수 있다.
이하에서는 복합 나노구조체의 제조 및 특성, 그리고 바이오물질의 포집(및 검출)에 대하여 상세히 기술한다.
나노 패턴 구조물의 제작
도 1a는 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 산화아연이 코팅된 복합 나노구조체의 제조 과정을 개념적으로 도시하는 도면이다.
도시된 구체예에 있어서, 복합 나노구조체는 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물 상에 표면 개질 금속층이 형성되고, 상기 표면 개질 금속층이 형성된 나노 패턴 구조물에 산화아연 층을 코팅하는 방식으로 제조된다.
상기 나노 패턴 구조물은 평면에 복수의 나노필라(나노 스케일을 갖는 필라 구조)가 돌출되어 있는 형태로서, 고분자 재질로 이루어질 수 있다. 이때, 고분자는 최종 목적물인 복합 나노구조체의 적용 분야를 고려하여 적절히 선택될 수 있다. 특히, 나노 패턴 구조물을 제작하는 과정 중 도포(코팅)가 용이하고, 주형 몰드로부터 비교적 쉽게 분리(탈착) 가능하고, 형성되는 나노필라의 치수 또는 배열을 용이하게 조절할 수 있는 등의 특성을 갖는 고분자를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 고분자는 유연성, 광 감광성, 기계적 안정성, 열적 안정성, 화학적 안정성 등의 물성이 양호한 종류를 선택하여 사용하는 것이 유리할 수 있다.
이를 위하여, 고분자는 나노 패턴 조절의 용이성을 위하여, 상온에서 비경화(유체) 상태의 점도가, 예를 들면 약 300 내지 5000 cps, 구체적으로 약 500 내지 3000 cps, 보다 구체적으로 약 800 내지 2000 cps 범위일 수 있다. 또한, 제1 고분자는 전형적으로 플라스틱 재질에 대한 접착력이 금속에 대한 접착력과 동일하거나, 또는 그 이상인 것이 유리할 수 있다. 이는 후술하는 바와 같이 금속 재질의 마스터 몰드를 사용할하여 나노 패턴을 형성할 경우, 몰딩 및 경화(예를 들면, UV 경화) 이후, 마스터 몰드로부터 나노패턴 구조물을 분리(이형)할 때, 플라스틱보다 금속에 대한 접착력이 강할 경우에는 고분자 층을 마스터 몰드로부터 분리하기 곤란할 수 있기 때문이다.
예시적 구체예에 따르면, 고분자는 폴리우레탄(Poly urethane, PU)계, 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)계, NOA(Noland Optical Adhesive)계 및 에폭시(Epoxy)계로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다. 이와 관련하여, NOA 계 고분자(예를 들면, Norland Products사에서 시판 중이며 상품명 NOA 61, NOA 63, NOA 65, NOA 68 등이 있음)는 다관능성 티올 및 다관능성 알릴(allyl) 모노머를 포함하는 액상 UV 경화성 모노머 혼합물이다.
특정 구체예에 따르면, 폴리우레탄 아크릴레이트(PU)와 상품명 NOA 68과 같은 NOA계 접착제의 블렌드를 사용할 수 있다. 이때, 블렌드 중 폴리우레탄 아크릴레이트(PU) 및 NOA계 접착제 각각의 함량은, 예를 들면 약 20 내지 80 중량%(구체적으로 약 30 내지 70 중량%, 보다 구체적으로 약 40 내지 60 중량%) 및 약 80 내지 20 중량%(구체적으로 약 70 내지 30 중량%, 보다 구체적으로 약 60 내지 40 중량%) 범위일 수 있다. 이하에서는 상기 PU 및 NOA계 접착제의 블렌드로부터 제조되는 고분자를 "PUNO"라고 지칭한다.
이와 관련하여, NOA 63은 NOA 61 약 70 내지 75 중량% 및 우레탄 성분 약 25 내지 30 중량%를 함유하며, NOA 61은 실질적으로 하기 화학식 I로 표시되는 테트라티올 약 55 내지 57 중량% 및 트리알릴 이소시아누레이트 약 43 내지 45 중량%로 이루어진다.
[화학식 1]
Figure 112018000813410-pat00001
상술한 나노 패턴 구조물은 특정 제조방법으로 한정됨이 없이 당업계에 공지된 방식을 이용할 수 있다.
도 1b는 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 고분자 재질의 복수의 나노필라가 형성된 나노 패턴 구조물을 제조하는 일련의 과정을 도시하는 도면이다.
먼저, 복수의 나노 스케일의 홀(12)이 형성된 마스터 몰드(11)를 제공한다. 상기 마스터 몰드는, 예를 들면 실리콘(Si) 웨이퍼, PDMS(Polydimethylsiloxane), 글래스(Glass), 석영(Quartz), PET(polyethylene terephthalate), PC(polycarbonate), PE(polyethylene), PU(polyurethene), COC(cyclic olefin copolymer) 등과 같이 다양한 재료로부터 선택하여 사용할 수 있다. 이때, 마스터 몰드(11)의 재질과 고분자는 전형적으로는 상이할 것이나, 경우에 따라서는 동종일 수도 있다.
이와 관련하여, 마스터 몰드(11) 내에 형성된 나노 스케일의 홀 또는 나노 홀(12)은 추후 형성되는 고분자 재질의 나노필라에 대응되는 형상 및 치수를 갖고 있는 바, 원형, 타원형, 사각형 등의 다양한 형태를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 원형일 수 있다. 이러한 나노 스케일의 홀(12)은 포토리소그래피법, 이온 밀링, e-beam 리소그래피법 등과 같이 당업계에 알려진 가공 기술에 의하여 형성될 수 있다. 본 발명이 특정 가공 기술로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 포토리소그래피법을 이용한 선택적 에칭 공정을 적용할 수 있다. 또한, 포토리소그래피법에서 이용 가능한 에칭 방법으로는 건식 에칭법, 예를 들면 반응성 이온 에칭법(reactive ion etching; RIE), 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭(inductively coupled plasma reactive ion etching; ICP-RIE), 화학적 이온 빔 에칭(chemically assisted ion beam etching; CAIBE) 등을 이용할 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적 구체예에 따르면, 나노 스케일의 홀(12)의 직경은 약 100 내지 1000 nm(구체적으로 약 300 내지 900 nm, 보다 구체적으로 약 400 내지 700 nm), 그리고 홀(12)의 깊이는 약 100 내지 1500 nm(구체적으로 약 300 내지 1000 nm, 보다 구체적으로 약 500 내지 900 nm) 범위일 수 있다. 또한, 복수의 홀(12) 사이의 간격은 약 100 내지 3500 nm, 구체적으로 약 300 내지 2500 nm 범위, 보다 구체적으로 약 500 내지 1500 nm 범위일 수 있다. 본 발명이 전술한 나노 스케일의 홀(12)의 수치 범위로 한정되는 것은 아니며, 고분자의 재질, 복합 나노구조체의 용도 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
마스터 몰드(11)가 제공되면, 선택적으로 이물질을 제거하기 위한 세정 단계가 수행될 수 있다. 이러한 세정을 위하여, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 이소프로판올 등이 사용 가능하며, 경우에 따라서는 표면에 잔류하는 유기 물질을 제거하기 위하여 플라즈마 처리가 수행될 수도 있다.
상기 마스터 몰드(11) 상에 고분자(또는 고분자 형성용) 용액을 도포하여 고분자 층(13)을 형성한다(일종의 나노 캐스팅 또는 나노 몰딩 방식일 수 있음). 이때 도포 방식은 당업계에서 알려진 도포 방법, 예를 들면 스핀 코팅, 회전 코팅, 스프레이 코팅 등을 적절히 선정하여 적용할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 고분자 층(13)을 도포한 후에 선택적으로 약 1 내지 500 μm(구체적으로 약 5 내지 300 μm, 보다 구체적으로 약 20 내지 200 μm) 두께의 고분자 재질의 연성 지지 필름층(14)을 부착하고 롤링함으로써 고분자가 마스터 몰드 내 나노 스케일의 홀에 충분히 주입되도록 하는 것이 유리할 수 있다. 이때, 지지 필름층의 재질로는 예를 들면, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 사이클로올레핀 고분자(cyclo olefin polymer; COC), 폴리에틸렌(PE), 폴리카보네이트(PC), 폴리에테르에틸케톤(PEEK), 폴리아미드(PA), 폴리우레탄(PU) 등을 예시할 수 있다. 이러한 지지 필름층(14)은 유연성이 양호한 것이 바람직하며, 또한 후속 단계에서 이루어질 수 있는 UV 조사를 원활히 수행할 수 있도록 투명성을 갖추는 것도 바람직할 수 있다.
또한, 지지 필름층(14)의 부착(도포) 이후에 수행되는 롤링 과정이, 전형적으로 상온 내지 90 oC의 온도 범위에서 수행될 수 있는 점을 고려할 때, 이러한 온도 범위에서 내구성을 유지할 수 있는 종류를 선정하는 것이 유리할 수 있다. 이외에도, 산화아연 층의 형성 과정에서 각종 화합물에 대한 내화학성을 나타내는 것이 유리할 수 있다.
선택적으로, 후속 과정에서 마스터 몰드(11)로부터 고분자 층(13)이 보다 용이하게 분리될 수 있도록 고분자의 도포에 앞서 이형제(예를 들면, 플루오로알킬실란, 구체적으로 트리데카플루오로-(1,1,2,2)-테트라하이드로옥틸-트리클로로실란과 같은 저에너지 이형제)를 사용할 수도 있을 것이다.
이처럼, 형성된 고분자 층(13)은, 예를 들면 경화 과정을 통하여 일정한 탄성을 갖게 된다. 상기 경화 과정은 자외선(UV) 경화, 열 경화 등의 다양한 방식으로 이루어질 수 있는 바, 예를 들면 고분자로서 실리콘계 탄성 고분자인 PDMS를 사용할 경우, 고분자와 함께 경화제를 함께 사용하여 고분자 용액을 제조하는데, 이때 고분자(PDMS) : 경화제의 중량 비는 당업계에서 통상적으로 사용되는 범위, 예를 들면 약 10 : 1 내지 약 11 : 1 범위일 수 있다. 경화제로서, 대표적으로는 Dow Corning사에 의하여 시판 중인 2액형의 Sylgard 184 키트(Sylgard A : Sylgard B=10:1)가 바람직하게 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된 고분자 용액을 마스터 몰드 상에 도포한 후에 가열하여 경화시킴으로써 고분자 층(13)을 형성할 수 있다.
고분자로서 폴리우레탄 아크릴레이트(PU)와 NOA계 접착제(예를 들면, 상품명 NOA 68)의 블렌드를 사용할 경우, 예를 들면, 약 1000 내지 2000 rpm 조건 하에서 마스터 몰드에 스핀코팅하고, 이후 그 위에 지지 필름으로서 예를 들면, PET 필름을 부착한 다음, 롤러를 이용하여 롤링한다. 후속적으로, UV 조사에 의하여 PUNO 고분자를 경화시키는 바, 이때, 자외선의 강도는, 예를 들면 약 100 내지 600 mJ/ cm2, 구체적으로 약 200 내지 500 mJ/ cm2, 보다 구체적으로 약 400 내지 480 mJ/ cm2 범위일 수 있다.
상기와 같이 경화된 고분자 층(13)을 마스터 몰드(11)로부터 분리하여 나노 패턴 구조물(15)을 얻는다. 이러한 분리 방법으로, 예를 들면 용매 사용 방법, 습식 화학 에칭 방법, 박리(peeling) 방법 등 당업계에 알려진 다양한 방식이 채택될 수 있다.
예시적 구체예에 있어서, 나노 패턴 구조물 중 나노필라의 종횡비(aspect ratio)는 용도, 재질 등을 고려하여 적절한 범위로 조절될 수 있는 바, 예를 들면 약 1 내지 10, 구체적으로 약 2 내지 7, 보다 구체적으로 약 3 내지 5의 범위일 수 있다. 이와 관련하여, PDMS의 기계적 물성(E < 10 MPa; σult < 2.4 MPa)은 PUNO의 기계적 물성(E=24 MPa; σult = 11.5 MPa)에 비하여 낮기 때문에 마스터 몰드로부터 분리하는 과정에서 손상될 수 있기 때문에 PUNO 재질의 나노필라에 비하여 낮은 종횡비를 가질 수 있다.
택일적 구체예에 따르면, 본 출원인의 국내특허공개번호 제2015-0053303호에 기재되어 있는 바와 같이 고분자 몰드를 이용하여 나노 패턴 구조물을 제작할 수 있는 바, 상기 특허문헌은 본 명세서의 참고자료로 포함된다. 이외에도, 복수의 나노 스케일의 필라(또는 로드) 형상을 갖는 나노 패턴 구조물을 제공할 수 있는 한, 특정 방법으로 한정됨이 없이 다양한 방식이 채택 가능하다.
표면 개질 금속층의 부착
일 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 제작된 나노 패턴 구조물(15) 상에 표면 개질 금속층을 부착한다.
물론, 이러한 표면 개질 금속층의 부착 없이도 나노 패턴 구조물 상에 산화아연 층이 어느 정도 형성될 수는 있으나, 원하는 표면 특성을 형성하고 산화아연 층의 부착 강도 등에 있어서 표면 개질 금속층을 개재한 경우가 더욱 유리하다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이러한 표면 개질 금속층은 고분자와의 부착력을 향상시킬 뿐만 아니라, 후술하는 산화아연 층의 형성 과정(예를 들면, 초음파 조사법에 의한 산화아연의 합성 과정)에서 바이오물질의 부착에 유리한 공간적 특성 또는 형태학적 특성, 구체적으로 주름진 표면 특성을 부여하는데 유리하게 작용하는 것으로 판단된다.
예시적 구체예에 있어서, 상기 표면 개질 금속층의 예로서 Ni, Pd, Ag, Cd, Pt, Ga, In, Au 등, 보다 구체적으로는 Au, Ag 등을 들 수 있으며, 이들 금속을 단독으로 또는 조합하여(또는 합금 형태로) 형성할 수 있다.
특정 구체예에서는 표면 개질 금속층의 재질로서 Au를 사용할 수 있는데, Au는 양호한 내산화성 및 내부식성, 생물학적 실험에서 사용 시 비활성 표면을 제공할 수 있고, 전기전도성 및 열 전도성이 양호하며, 광 반사도(optical reflectivity)가 높고, 평활한 표면을 얻을 수 있는 등의 표면 특성을 갖고 있다. 이러한 특성을 이용하여, 예를 들면 생명과학 분야에서 유용한 기재로 사용되거나, 화학 및 생화학 센서에서 시그널 변환기(transducer)로 적용되고 있다. 또한, Au 박막은 비활성 특성을 이용하여 미세유체 디바이스에서 표면 강화 라만 산란(surface enhanced Raman scattering) 기재로도 사용될 수도 있다.
특정 구체예에 있어서, 표면 개질 금속층은 당업계에서 알려진 방법, 열 증착(thermal vapor deposition), 스퍼터링, E-beam 증착 등을 이용하여 나노 패턴 구조물 상에 형성될 수 있다. 표면 개질 금속층의 두께는, 예를 들면 약 1 내지 500 nm, 구체적으로 약 5 내지 300 nm, 보다 구체적으로 약 50 내지 200 nm 범위일 수 있다. 상기 나노 패턴 구조물에 대한 표면 개질 금속층의 피복율(coverage)은, 예를 들면 적어도 약 70%, 구체적으로 적어도 약 80%, 보다 구체적으로 적어도 약 90%, 더 나아가 실질적으로 100%일 수 있다.
전술한 표면 개질 금속층, 특히 Au 층은 양호한 물리화학적 특성에도 불구하고, 하측의 고분자 기반의 나노 패턴 구조물의 표면과의 부착성이 좋지 않을 수 있다. 이는 고분자 또는 고분자 기반의 표면이 낮은 표면 에너지, 비상용성, 화학적으로 비활성이거나 약한 경계층(boundary layer)의 존재로 인하여 젖음성 및 결합성(bonding)이 낮기 때문이다. 이와 같이 하측의 나노 패턴 구조물의 표면에 대한 부착 곤란성을 완화할 목적으로, 특정 구체예에서는 나노 패턴 구조물과 표면 개질 금속층 사이에 선택적으로 중간층(intermediate layer)을 개재할 수 있다(예를 들면, 표면 개질 금속층/중간층의 2층 구조). 이러한 중간층으로서, 접착성이 양호한 금속, 예를 들면 Ti, V, Cr, Sc, Nb, Mo, W 등, 보다 구체적으로 Ti, Cr 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 금속은 나노 패턴 구조물의 표면 상에서 극성 원자와 화학적 결합을 형성할 수 있기 때문에 상면의 표면 개질 금속층과 하면의 고분자 재질의 나노 패턴 구조물이 견고하게 부착될 수 있도록 하는 것으로 판단된다.
다만, 상기 나열된 중간층 형성용 금속 중 Cr은 Au 층의 접착성을 개선시킬 수는 있으나, Au 표면으로 확산하여 Au 층의 형태학적 특징 또는 전기적 물성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서는 중간층으로서 Ti, 그리고 표면 개질용 금속층으로서 Au를 사용한 Au/Ti의 2층(binary layer) 구조를 적용할 수 있다.
상술한 구체예에서, 중간층 역시 열 증착(thermal vapor deposition), 스퍼터링, E-beam 증착 등과 같은 공지의 방법을 이용하여 나노 패턴 구조물 상에 부착될 수 있다. 예를 들면 약 1 내지 500 nm, 구체적으로 약 5 내지 300 nm, 보다 구체적으로 약 10 내지 100 nm 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 표면 개질 금속층/중간층의 두께 비는 전형적으로 약 1 내지 50, 구체적으로 약 3 내지 20, 보다 구체적으로 5 내지 10의 범위로 조절될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 전술한 표면 개질 금속층(및 중간층)의 형성 단계는, 예를 들면 50 oC의 챔버 온도에서 수행될 수 있고, 예를 들면 타겟(Au 등)에만 특이적으로 레이저를 조사하여 타겟의 유리 전이 온도까지 가열, 증착 대상인 나노 패턴 구조물에 증착시킬 수 있고, 이때 증착 두께는 증착 시간에 따라 조절할 수 있을 것이다.
산화아연 층의 형성
일 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 나노 패턴 구조물 상에 표면 개질 금속층을 형성한 다음, 특히 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 산화아연 층을 형성(코팅)하여 바이오물질의 포집(고정) 표면을 제공한다.
전술한 바와 같이, 복합 나노구조체의 시료 내 바이오물질에 대한 포집능은 바이오물질과 접촉하는 표면에 영향을 받는 바, 일 구체예에서는 바이오물질과 접촉하는 표면이 주름진 형태학적 특성(일종의 텍스츄어 특성)을 갖도록 산화아연 층을 형성할 수 있다. 이를 위하여, 일 구체예에서는 초음파 조사 하에서 아연 전구체-함유 용액(액상 매질)을 상기 표면 개질 금속층이 형성된 나노 패턴 구조물과 접촉하여 산화아연으로 전환시키는 방식으로 산화아연 층(또는 코팅층)을 형성한다. 이때, 접촉 방법으로 딥핑(dipping), 초음파처리공정, 침전법, 수열합성법 등을 예시할 수 있으나, 액상 매질과 구조물 간에 충분한 접촉을 제공하는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적 구체예에 따르면, 아연 전구체 용액은 액상 매질(용매) 내에 아연 전구체 및 환원제를 함유할 수 있다.
이때, 액상 매질은 수계 매질일 수 있는 바, 예를 들면 물, 탄소수 1 내지 3의 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 구체적으로 액상 매질로 물을 사용할 수 있는 바, 물은 아연 전구체의 분산 매질인 동시에 합성을 통하여 생성되는 산화아연 결정 입자가 성장하는 모액의 역할을 하기 때문에 결정 성장에 영향을 미칠 수 있는 불순물이 최대한 제거된 정제수, 보다 구체적으로 탈이온수를 사용할 수 있다.
아연 전구체의 경우, 수계 매질 내에 용해 가능한 전구체, 즉 수용성 아연 화합물(또는 염)일 수 있으며, 구체적으로 질산아연, 황산아연, 아세트산아연, 포름산아연, 염화(II) 아연, 요오드화아연, 아연아세틸아세토네이트, 이의 수화물 등일 수 있는 바, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 아세트산아연 2수화물(zinc acetate dihydrate), 질산아연 6수화물(zinc nitrate hexahydrate) 또는 이의 조합일 수 있다. 액상 매질 내 아연 전구체의 농도는 산화아연 층의 밀도에 영향을 줄 수 있는 인자로서, 예를 들면 아연 이온의 농도가 증가함에 따라 표면개질 금속-코팅된 나노패턴 구조물의 표면에 생성되는 핵 생성점이 증가할 것이다. 상기의 점을 고려하여, 예시적 구체예에 따르면, 액상 매질 내 아연 전구체의 농도는, 예를 들면 약 0.0005 내지 1 M, 구체적으로 약 0.0025 내지 0.1 M, 보다 구체적으로 약 0.005 내지 0.01 M 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.
또한, 환원제로서, 예를 들면 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 수산화나트륨 또는 이의 조합을 사용할 수 있는 바, 보다 구체적으로는 헥사메틸렌테트라아민, 암모니아 또는 이의 조합을 사용할 수 있다. 예시적으로, 액상 매질 내 환원제의 농도는, 예를 들면 약 0.5 내지 5 M, 구체적으로 약 1 내지 3 M, 보다 구체적으로 약 1.5 내지 2.5 M 범위일 수 있다.
이와 관련하여, 아연전구체-함유 용액 중 환원제/아연 전구체의 몰 비는, 예를 들면 약 1000 내지 3000, 구체적으로 약 1200 내지 2000, 보다 구체적으로 약 1500 내지 1800의 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 아연전구체-함유 용액을 적용할 경우, 산화아연의 합성 반응 과정에서 매질의 pH는, 예를 들면 약 9 내지 12, 전형적으로 약 9 내지 11, 보다 전형적으로 약 9.5 내지 10.5 범위일 수 있으나, 아연전구체 및 환원제의 종류, 이들 간의 상대적인 비율에 따라 변화 가능하다.
이와 관련하여, 초음파 조사 하에서의 산화아연의 합성 반응 메커니즘은 복수의 단계를 거쳐 수행될 수 있는 바, 환원제로 암모니아를 사용할 경우에는 하기 반응식 1에서와 같이 암모늄착체를 형성한 후에 산화아연으로 전환될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112018000813410-pat00002
한편, 환원제로 헥사메틸렌테트라아민(HMTA)을 사용할 경우에는 하기 반응식 2에서와 같이 수산화아연을 거쳐 산화아연으로 전환될 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112018000813410-pat00003
다른 예시적 구체예에 따르면, 경우에 따라 염기 성분을 선택적으로 첨가할 수 있는 바, 초음파 조사 하에서의 반응 중 촉매(특히, 가수분해 촉매)로 작용할 수 있다. 선택적으로 첨가 가능한 염기 성분은, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨 등일 수 있다.
초음파 조사 방식의 산화아연 합성 반응에 있어서, 반응 온도는, 예를 들면 약 20 내지 50℃, 구체적으로 약 25 내지 45℃, 보다 구체적으로 약 30 내지 35℃ 범위일 수 있는 바, 특히 상온 조건일 수 있다. 이는 종래의 수열합성법에서 고온으로 가열하는 점과 구별된다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 전구체-함유 용액에 초음파를 조사함에 따라 초음파 에너지에 의하여 캐비테이션 효과가 유도되며, 결과로서 생성된 캐비테이션 열점에 의한 미세열적(microthermal) 가열에 의하여 산화아연으로 전환될 수 있는 것으로 판단된다. 구체적으로, 캐비테이션은 초음파가 액상을 통과할 때 액상의 압축 및 팽창의 반복 과정에 의하여 형성되는데, 팽창 시 음의 압력의 영향으로 성장하다 압축 과정에서 임계값에 도달하게 되면 붕괴하게 된다. 이와 같은 초음파에 의한 캐비테이션의 형성, 성장 및 붕괴 과정을 통하여 마이크로-버블(micro-bubble)이 붕괴될 때 순간적으로 고온 및 고압이 형성됨에 따라 종래의 수열합성법 등에 비하여 낮은 온도에서도 아연 전구체가 산화아연으로 전환될 수 있는 것으로 판단된다. 이처럼, 초음파 조사 방식을 이용함으로써 온화한 시스템 반응 조건(특히, 상온 및 상압 조건) 하에서 산화아연 층을 형성할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 아연 전구체 용액으로 조사되는 초음파는 출력이 약 20 내지 200 W, 구체적으로 약 30 내지 170 W, 보다 구체적으로 약 50 내지 150 W 범위일 수 있다. 조사되는 초음파의 특성은 합성되는 산화아연 층의 형성에 영향을 미치는 바, 예를 들면 주파수 또는 이의 출력이 지나치게 낮은 경우에는 핵 생성이 불충분하여 반응 시간이 증가하는 한편, 주파수 또는 이의 출력이 지나치게 높은 경우에는 핵 생성이 표면 개질 금속 코팅된 나노구조체의 표면 상이 아닌 액상 매질 내에서 일어나는 경향을 나타낼 수 있는 만큼, 전술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 예시적 구체예에 있어서, 초음파 조사 하에서의 반응 시간은, 예를 들면 약 3 내지 120 분, 구체적으로 약 4 내지 60분, 보다 구체적으로 약 5 내지 40분 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 반응 시간이 지나치게 긴 경우에는 기재 표면에 손상을 유발할 수 있는 만큼, 적절하게 조절하는 것이 유리할 수 있다.
다만, 전술한 반응 조건은 예시적 목적으로 기재된 것으로, 나노패턴 구조물 상에 코팅되는 표면개질 금속의 종류, 초음파 조사 장치의 타입, 반응물(예를 들면, 아연전구체, 환원제 등)의 종류 및 이의 농도 등에 따라 변경 가능하다.
한편, 초음파 에너지를 액상 시스템으로 전달하는데 요구되는 장치는 크게 하기의 3가지 부재로 이루어진다: (i) 전기 에너지를 고주파수의 교류 전류로 전환하여 트랜스듀서 어셈블리를 구동하는 발전기, (ii) 고주파수 교류 전류를 기계적 진동(vibration)으로 전환하는 트랜스듀서, 및 (iii) 진동을 액체로 전달하는 전달 시스템.
이와 관련하여, 초음파 조사는 용기(vessel) 타입(배스 타입) 또는 프로브 타입(소노트로드 타입)일 수 있다.
용기 타입의 초음파 조사의 경우, 예를 들면 초음파 조사 장치가 용기의 일 측면 부, 예를 들면 하측 면에 고정 배치될 수 있으며, 이로부터 조사된 초음파가 용기 내 액상 매질에 직접 전달될 수 있다.
용기 타입의 초음파 조사 장치의 경우, 초음파 조사 장치와 표면개질 금속-코팅된 나노패턴 구조물의 표면에 가해지는 초음파 세기가 상대적으로 약하기 때문에 과도한 초음파 조사 시 유발되는 표면 손상을 억제할 수 있는 반면, 상대적으로 긴 반응 시간을 필요로 할 것이다.
한편, 프로브 타입의 경우, 에미터(emitter) 표면이 액상 매질과 직접 접촉함에 따라 비교적 높은 출력을 생성할 수 있기 때문에 상대적으로 짧은 반응 시간을 요하는 반면, 조사 시간이 지나치게 긴 경우에는 표면개질 금속-코팅된 나노패턴 구조물의 표면을 손상시킬 수 있다.
이와 관련하여, 용기 타입의 초음파 조사 방식의 경우에 초음파 출력은, 예를 들면 약 20 내지 100 W, 구체적으로 약 30 내지 60 W 범위이고, 산화아연 합성 반응 시간은, 예를 들면 약 20 내지 120분, 구체적으로 약 25 내지 60분 범위일 수 있다. 한편, 프로브 타입의 초음파 조사 방식의 경우에 초음파 출력은, 예를 들면 약 100 내지 200 W, 구체적으로 약 120 내지 170 W 범위이고, 산화아연 합성 반응 시간은, 예를 들면 약 3 내지 20분, 구체적으로 약 4 내지 10분 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 초음파 조사 장치는 초음파 전달 효과를 높이기 위하여 티타늄 또는 알루미늄 합금과 같은 유연한 재질로 구성할 수 있으며, 전형적으로 도입된 에너지의 약 65 내지 80%, 구체적으로 약 70 내지 75%를 액체로 전달하게 되며, 초음파 생성기의 평균 효율은 약 80 내지 90% 수준일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 형성된 산화아연 층의 두께는 예를 들면 약 10 내지 100 nm, 구체적으로 약 15 내지 50 nm, 보다 구체적으로 약 20 내지 30 nm 범위일 수 있다. 이때, 산화아연 층은 하기 표 1과 같은 표면조도 범위를 나타낼 수 있다:
구분 표면 조도 값
Rq (nm) 예를 들면 약 205-260, 구체적으로 약 210-250,
보다 구체적으로 약 220 내지 240
Ra (nm) 예를 들면 약 170-220, 구체적으로 약 180-215,
보다 구체적으로 약 190 내지 210
Rz (nm) 예를 들면 약 970-1100, 구체적으로 약 980-1070,
보다 구체적으로 약 990 내지 1050
상술한 표면 조도는 표면개질 금속 층 형성 전(고분자 재질의 나노패턴 구조체) 및 표면개질 금속-코팅된 나노패턴 구조체 각각에 비하여 현저히 증가된 수준이다. 이는 표면 개질 층의 표면 상에서 초음파 조사 방식으로 산화아연이 합성되면서 주름진 형태학적 특징을 갖는 층이 형성되기 때문이다.
시료 내 바이오물질의 포집
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 상기와 같이 제작된 산화아연-코팅된 복합 나노구조체를 이용하여 바이오물질(박테리아 등)을 포집할 수 있다.
이러한 바이오물질은 그람-양성균 및 그람-음성균을 포함할 수 있는 바, 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytognes 등일 수 있다.
바이러스 종류로서 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 단순 포진 1형 및 2형 바이러스, 보다 전형적으로 알파바이러스, 아데노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스, 오쏘부냐바이러스(orthobunyavirus), 폴리오바이러스, 인간 파보바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 1, 2 및 3형의 파라인플루엔재 바이러스, 또는 임의의 확인된 바이러스를 포함할 수 있다. 상기 나열된 종류는 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 구체예에서는 항원-항체의 생화학적 방식을 이용하는 대신에, 바이오물질과 산화아연 층 간의 정전기적 인력 및/또는 복합 나노구조체 표면(즉, 산화아연 층의 표면)의 주름진 형태학적 특성을 이용하여 병원체 등의 바이오물질 표면의 섬모 구조와의 상호 작용을 이용하여 물리적으로 바이오물질을 고정하는 원리를 이용할 수 있다. 더 나아가, 복합 나노구조체의 제작 과정 중 나노필라의 길이, 직경 및 이들 간의 간격을 조절할 수 있기 때문에, 박테리아뿐만 아니라, 보다 작은 사이즈의 바이러스까지도 포집 및 검출할 수 있다.
포집된 바이오물질의 진단
이와 같이 복합 나노구조체 상에 포집된 바이오물질(구체적으로 박테리아)의 핵산 추출을 위하여 용해(lysis) 단계가 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 당업계에서 알려진 다양한 용해법을 적용할 수 있는 바, 조절된 온도 조건 하에서 포집된 바이오물질을 약 70 내지 95 ℃(구체적으로 약 80 내지 90 ℃)에서 가열하는 방법. 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 펄스 온(pulse on) 및 펄스 오프(pulse off)를 교대로 실시하는 방법, 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하는 방법 등이 적용 가능하다.
특정 구체예에 따르면, 용해 완충액을 이용한 핵산 추출 방식을 이용할 수 있다. 이러한 용해 완충액에 첨가 가능한 버퍼(buffer) 성분의 예로서, HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, 및/또는 NaH2PO4), 또는 이의 조합 등을 들 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 3 내지 30 mM, 구체적으로 약 5 내지 20 mM, 보다 구체적으로 약 6 내지 10 mM 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 반드시 상기 수치 범위에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 스트렙토그리신 등과 같이 당업계에서 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 함유할 수도 있다. 예시적 구체예에 따르면, 핵산 추출을 위하여, 시판 중인 G-spin™ 핵산 추출 키트, easy-spin™ 핵산 추출 키트, Pathogen-spin™ 핵산 추출 키트 등을 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 포집된 바이오물질의 용해 온도는 사용되는 효소의 종류 등을 고려하여 적절한 범위로 조절할 수 있는데, 예를 들면 약 30 내지 95 ℃(전형적으로 약 40 내지 80 ℃, 보다 전형적으로 약 55 내지 72 ℃) 범위 내에서 정하여질 수 있다. 상기 온도 범위는 예시 목적으로 기술되는 바, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이, 포집된 바이오물질의 용해 과정 이후에는 당업계에서 알려진 방법에 따라 추출된 핵산에 대한 증폭 반응을 수행한다. 증폭 반응을 위하여, PCR(DNA 증폭 방식), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; RNA를 이용한 등온 조건 하에서의 증폭 방식) 등과 같이 당업계에서 공지된 임의의 증폭 기술을 활용할 수 있다.
예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제593687호 등에 기재되어 있고, NASBA 방식은 EP 0 329 822 B1, 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. 예시적인 PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR 등을 예시할 수 있다.
상술한 바와 같이 증폭된 생성물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 검출(detection)될 수 있는 바, 예를 들면 겔 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent) 등을 이용할 수 있다. 다만, 상기 방식은 증폭 반응의 결과를 확인하기 위하여 각 샘플에 대하여 검출 단계를 별도로 수행해야 하는 불편한 점이 있기 때문에 택일적으로 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수도 있다.
예시적 구체예에 따르면, 증폭된 생성물은 라벨화된 프로브, 구체적으로는 형광 라벨화된 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 형광 라벨화된 프로브의 대표적인 예로서, 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알 렉사플로어계 (alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광 물질 등을 들 수 있으며, 이중 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 다만, 본 발명이 상기 예시된 형광 물질로 한정되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 형광 물질은 특정 파장의 광에 의하여 여기된 후, 또 다른 파장의 광을 방출하여 잉여 에너지를 배출하는 바, FITC와 같은 형광 물질은 550 nm 파장의 광을 방출한다
또 다른 구체예에서는 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브의 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 칩을 사용할 경우에는 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브를 이용한 형광 검출 방식이 특히 유리한 바, 이는 단일 바이오 칩 내에서 샘플의 농축, 증폭 및 검출을 모두 수행할 수 있기 때문이다.
분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3' 말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(Self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다.
TaqMan 프로브의 경우, 5' 말단을 형광체(FAM 등)로, 3' 말단을 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 다만, 검출 특이성 면에서 분자 비콘을 사용하는 것이 보다 바람직할 수 있다.
전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성할 수 있다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.
다른 예시적 구체예에 따르면, 증폭 단계에 앞서 또는 증폭 과정 중 삽입 염료가 증폭 혼합물에 첨가될 수 있다. 이때, 핵산으로서 DNA를 증폭할 경우, 삽입 염료는 이중 스트랜드 DNA(dsDNA) 사이에 삽입되어, 추후 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 염료는 증폭 과정에서 이중 스트랜드 내로 삽입 가능한 염료로서, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등을 포함할 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 전형적으로는, SYBR Green, TOTO 시리즈 중 TOTO-3, POPO 시리즈 중 POPO-3, BOBO 시리즈 중 BOBO-3 등을 사용할 수 있다. 본 발명이 상술한 종류로 반드시 한정되는 것은 아니며, 증폭 반응 중 이중 스트랜드에 삽입되어 이로부터 유래하는 형광 특성을 검출할 수 있는 한, 다양한 종류를 사용할 수도 있다. 또한, 첨가되는 삽입 염료의 량은, 삽입 염료의 특성 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.1 내지 20 μM 중량%(구체적으로, 약 1 내지 5 μM) 범위일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 증폭 생성물로부터 유래된 형광은, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같이 당업계에 알려진 검출 수단(또는 장치)를 통하여 확인할 수 있는데, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 타겟 핵산의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 형광 검출을 위하여, 예를 들면 레이저-유도 공초점 형광 현미경을 이용할 수 있다. 이외에도, 핵산(표적 핵산)의 존재에 따른 형광 유무 및 형광 세기의 변화를 확인할 수 있는 장비라면 특별한 제한 없이 사용 가능한 바, 예를 들면 QuantaMaster PTI spectrofluorimeter (PTI), SPEX Fluorolog 3 (ISA) 등을 예시할 수 있다.
예시적 구체예에 따른 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 10 내지 106 CFU/ml 범위일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 하기의 절차에 따라 복합 나노구조체를 제작하였다(도 8 참조). 본 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다:
- UV-경화성 접착제: NOA 63(Norland Optical Adhesives)
- PET 필름: 일본 Mitsubishi사 (두께: 50 μm)
- 폴리우레탄 아크릴레이트(PU): 일본 Minuta Tech사의 제품명 MINS-311RM
- Si 웨이퍼: LG 실트론사의 제품명 8인치 웨이퍼 (두께: 0.7 mm)
- E-beam evaporator: Evatac Process System사의 제품명 BAK641
- 아세트산아연 2수화물: Sigma-Aldrich(99%)
- 스퍼터링 장치: Ultech사에서 주문 제작하여 사용하였음
- 주사전자현미경: Nova230(FEI company)
또한, 실시예에서 사용된 시료는 하기와 같이 제조되었다.
- 박테리아 함유 시료
E.coli O157:H7 ((ATCC 43895): American Type Culture Collection (Washington DC, USA))를 선택하였으며, 병원체를 튜브에 넣고 15mL의 Luria-Bertani (LB) 배지와 함께 250 rpm으로 37℃에서 교반하면서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, UV 흡광도 측정법(600 nm)에 의한 광학 밀도(optical density; OD) 값이 1이 되었을때 배양을 종료하여 배양물을 회수하였다.
A. 산화아연 코팅된 나노패턴 구조물의 제작
마스터 몰드의 제작
Si 웨이퍼를 퍼니스(Centrotherm사의 제품명 Furnace E1200)에 넣고 1500 nm 두께의 SiO2 층을 형성하였다. 이후, 0.7 ㎛ 두께에 상당하는 량의 포토레지스트로서 Dongjin Semichem사의 제품명 SKKA-8670을 Si 웨이퍼 상에 스핀코터(SEMES 사의 제품명 Kspin 8)로 3000 rpm에서 60 초 동안 도포하였다. 그 다음, 마스크(mask)를 사용하여 포토레지스트가 도포된 Si 웨이퍼 표면에 UV 광(세기: 30 mJ/cm2)을 조사하여 노광하였다. 이후, 현상액(developer)을 이용하여 포토레지스트를 제거하고, 그 다음 ICP(Lam Research사의 제품명 TCP9400 SE) 및 가스 혼합물(Cl2, HBr 및 O2)을 이용하여 에칭하였다. 그 결과, Si 웨이퍼에 복수의 나노 홀이 형성되었으며, 이때 나노 홀의 직경, 깊이 및 나노 홀 사이의 간격은 각각 500 nm, 1000 nm 및 500 nm이었다.
나노 패턴 구조물의 제작
복수의 나노홀이 형성된 Si 웨이퍼를 주형으로 하여 대면적 나노필라 어레이(나노 패턴 구조물)를 제작하였다. 구체적으로, 폴리우레탄 아크릴레이트(PU) 및 NOA 68 을 3 : 7(중량 기준)의 비율로 교반 하에서 혼합하여 액상의 고분자 블렌드(PUNO)를 제조하였다. 상기 고분자 블렌드를 앞서 제작된 마스터 몰드 상에 스핀 코팅(조건: 30초 간 1200 rpm)에 의하여 도포하여 마스터 몰드 상에 약 100 ㎛의 두께를 갖는 필름을 형성시켰고, 이에 진공을 가하여 기포를 충분히 제거하였다. 상기 스핀코팅된 PUNO 고분자 필름의 표면 상에 PET 필름을 덮어주고 롤러를 이용하여 충분히 롤링시킴으로써 PET 필름과 PUNO 필름 사이의 기포를 제거하였다. 상기 얻어진 필름 복합체(PET 필름/PUNO 필름/마스터 몰드)에 480 mJ/cm2 강도의 UV를 1분 동안 조사하여 PUNO 필름을 경화시켰다. 이후, 형성된 PUNO 고분자 층을 마스터 몰드로부터 박리하여 나노 패턴 구조물을 얻었으며, 추가적으로 자외선(UV)을 5분 동안 조사하였다.
분석 결과, 나노 패턴 구조물(즉, 나노 패턴이 형성된 필름 형상의 구조물)에 형성되어 있는 나노필라의 직경, 높이, 그리고 복수의 나노필라 사이의 간격은 각각 500 nm, 1000 nm 및 500 nm이었다.
표면 개질용 금속층의 부착
상술한 바와 같이 제작된 나노 패턴 구조물 상에 E-beam evaporator를 사용하여 Ti를 20 nm 두께로 증착하였고, 이후 Au를 200 nm 두께로 순차적으로 증착하여 나노 패턴 구조물 상에 Au/Ti 금속층을 형성하였다. E-beam evaporator는 50 oC로 조절된 챔버 내에서 작동되었으며, 각각의 타겟 금속(Ti 및 Au)에 특이적으로 레이저를 조사하여 해당 금속의 유리전이온도까지 가열하여 증착시켰다(증착 조건: 2000 Å, 10초 당 1 nm 두께로 증착). 이때, Ti는 200 초, 그리고 Au는 1000 초 동안 증착시켰다(G-PUNO 구조물).
산화아연 층의 형성(코팅)
- 용기 타입 초음파 조사 장치를 이용한 산화아연 층의 형성
Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물(G-PUNO)을 기재로 하여 전구체로서 아세트산아연 2수화물 0.01 M 및 환원제로서 암모니아 1.57 M을 함유하는 전구체 수용액에 용기 타입 초음파 조사 장치(Bandelin사)를 이용하여 50 W의 초음파 조건 하에서 디핑하여 반응을 수행하였다.
이때, 반응 시간을 하기 표 2와 같이 변화시키면서 산화아연(ZnO) 층을 형성하였고, 이후 탈이온수로 세척하여 산화아연이 코팅된 나노패턴 구조물을 얻었다(ZG-PUNO 구조물).
초음파 출력 반응 시간
50 W 10 분
50 W 30 분
50 W 40 분
50 W 50 분
50 W 60 분
50 W 90 분
50 W 120 분
광학 현미경으로 관찰한 결과 상기 표에 기재된 반응 시간 범위 내에서 기재 표면은 거의 손상되지 않았다. 또한, AFM(Atomic Force Microscope)을 이용한 분석 결과, 다양한 반응 시간(30분, 40분, 50분 및 60분)을 통하여 형성된 산화아연 층의 두께는 20 내지 30 nm 범위이었다.
이와 관련하여, 초음파 조사 하에서의 반응 시간(60분, 90분 및 120분)에 따른 ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물의 표면 상태를 보여주는 주사전자현미경(SEM) 사진을 도 2a 내지 도 2c 각각에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 초음파 조사 하에서의 반응에 의하여 기저 구조물의 표면에 걸쳐 주름지면서 완만한 곡면 형상의 산화아연 층이 형성되었고, 반응 시간이 길수록 산화아연 층의 주름진 특성이 증가함을 알 수 있다.
- 프로브 타입 초음파 조사 장치를 이용한 산화아연 층의 형성
상술한 바와 동일한 전구체 수용액을 이용하되, 프로브 타입 초음파 조사 장치(VC-750 ultrasonic processor(Sonics@materials, U.S.A.))를 이용하여 산화아연 층을 형성하였으며, 반응 시간을 변화시키면서 ZG-PUNO 구조물 각각 수득하였다. 고분자 재질의 나노패턴 구조물(PUNO), Au 코팅된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(G-PUNO) 및 반응 시간(1 분, 2 분 및 5 분)을 달리하면서 산화아연 층이 코팅된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO) 각각의 SEM 사진을 도 3에 나타내었다.
상기 도면에 나타난 바와 같이, 반응시간이 1분 및 2분인 경우, 나노패턴(나노필라) 최상면 전체에 걸쳐 산화아연 층이 형성되지 않았으나, 반응시간이 5분인 경우에는 전체적으로 산화아연 층이 형성되었다.
B. 산화아연 코팅된 나노패턴 구조물(ZG-PUNO)의 특성 평가
용기 타입 초음파 조사 장치를 이용하여 30분 동안 반응시켜 제조된 산화아연 코팅된 나노패턴 구조물(ZG-PUNO)에 대하여 하기와 같이 특성을 평가하였다.
- 제타전위 측정
용기 타입 초음파 조사 장치를 이용하여 30분 동안 반응시켜 제조된 산화아연 코팅된 나노패턴 구조물(ZG-PUNO)의 제타전위 값을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 산화아연 층의 표면이 양 전하를 나타냄을 알 수 있다.
- XRD 분석
순차적으로 형성된 (a) 고분자 재질의 나노 패턴 구조물(PUNO), (b) Au-코팅된 나노 패턴 구조물(G-PUNO) 및 (c) ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO) 각각에 대한 XRD 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, G-PUNO의 경우에는 PUNO와 함께 금(Au)에 대한 특성 피크가 관찰되었다. 또한, ZG-PUNO의 경우에는 PUNO, 금(Au) 및 아연(Zn)에 대한 특성 피크가 모두 관찰되었으며, 다만 금(Au)에 대한 피크 세기는 다소 감소하였는 바, 이는 금 표면에 산화아연 층이 코팅되어 있는 점으로부터 기인한 것이다.
- 맵핑 분석
ZG-PUNO 구조물에 대한 맵핑(mapping) 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, PUNO 구조물 중 나노필라의 표면 상에 금(Au) 및 아연(Zn) 성분이 균일하게 분포되어 있음을 확인할 수 있다.
- FT-IR 분석
PUNO 구조물, G-PUNO 구조물 및 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 FT-IR 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
- 표면 조도 측정
AFM(Atomic force microscopy)를 이용하여 PUNO 구조물, G-PUNO 구조물 및 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 표면 조도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 PUNO G-PUNO ZG-PUNO
Rq (nm) 182.3 203.7 227.1
Ra (nm) 157.6 170.5 194.4
Rz (nm) 384.4 967.3 1035
상기 표에 기재된 바에 따르면, ZG-PUNO 구조물의 표면 조도가 가장 높았는 바, 이는 산화아연이 나노패턴 구조물 상에서 주름진 형태로 코팅되어 텍스츄어 특성이 강화된 결과로부터 기인한다.
C. 박테리아의 포집
- E. Coli의 포집
ZG-PUNO 구조물에 대하여 5 cm 거리에서 앞서 제조된 박테리아-함유 시료를 각각 3초에 걸쳐 앞뒤로 분사하였고(총 6초), 이후 1 시간 동안 상온에서 건조시켜 시료 내 박테리아(E.coli)를 포집하였다(107 CFU/ml). 이와 관련하여, 도 8은 (a) PUNO 구조물, (b) G-PUNO 구조물 및 (c) ZG-PUNO 구조물, 그리고 (d) ZG-PUNO 구조물을 이용하여 박테리아를 포집하는 일련의 과정을 보여주는 도면, 그리고 (e) PUNO 구조물, (f) ZG-PUNO 구조물 및 (g) 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물의 SEM 사진이다.
박테리아의 포집 여부에 대하여 FIB 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 다양한 시료 내 다양한 박테리아의 농도(10-106 CFU/ml)에서 ZG-PUNO 구조물 상에 식중독균이 포집된 SEM 사진을 도 10에 나타내었다.
이외에도, PUNO 구조물, ZG-PUNO 구조물 및 박테리아가 포집된 ZG-PUNO 구조물 각각에 대한 FT-IR 스펙트럼, XRD 스펙트럼, 그리고 AFM 분석 결과 및 이로부터 측정된 표면 조도를 각각 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
상기 도면에 따른 결과를 고려하면, 시료 내 박테리아가 ZG-PUNO 구조물의 표면에 효과적으로 포집되어 있음을 확인할 수 있다. 특히, 도 13를 참조하면, 산화아연 층의 형성 후 증가된 표면 조도가 박테리아 포집 후에는 다소 감소하였다.
초음파 조사 하에서의 반응 시간(10분, 30분, 40분 및 50분)을 변화시키면서 형성된 ZnO/Au-코팅된 나노 패턴 구조물(ZG-PUNO)의 박테리아의 포집 상태를 SEM을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 14a 내지 도 14d에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 초음파 조사 하에서 30분 동안 반응시켜 형성된 ZG-PUNO 구조물의 경우에 나노필라의 형상 유지 및 박테리아 포집 면에서 상대적으로 유리함을 알 수 있다.
- S. enteritidis 및 S. aureus의 포집
식중독 균으로서 S. enteritidis 및 S. aureus을 대상으로 한 것을 제외하고는 E. Coli를 대상으로 한 경우와 동일한 방식으로 박테리아 포집 테스트를 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, ZG-PUNO 구조물은 포집 대상인 2종의 박테리아 모두에 대하여 포집능을 나타내었고, 특히 S. aureus에 대한 포집 효과가 보다 양호함을 알 수 있다.
D. 포집된 박테리아의 증폭 및 검출
박테리아 시료 내 박테리아 농도를 변화시키면서 ZG-PUNO 구조물 상에 박테리아를 포집하였다(시료 내 박테리아 농도: 107-101 CFU/ml). 포집된 박테리아에 대하여 G-spin™ 핵산 추출 키트를 이용하여 세포용해를 수행하여 핵산을 추출하였다. 이들 각각에 대하여 i-StarMAX™을 이용한 PCR에 의하여 증폭 반응시켰고, 증폭 생성물에 대한 전기영동 분석을 수행하였다. 이때, 전기영동 분석을 위한 아가로오스 겔(2%)을 제조하기 위하여, 1X TAE 버퍼 100 mL 및 Agarose LE(intron, Cat No. 32034) 2 g을 혼합한 후에 전자레인지 내에서 녹였고, 이에 형광 염료(red safe)를 첨가하여 혼합한 다음, 겔 플레이트에 부어 응고시켰다.
전기영동 겔 실험은 PCR에 의한 증폭 생성물 샘플 6 ul 및 6X 로딩 버퍼 1 ul를 혼합한 후, 앞서 제조된 2% 아가로오스 겔에 5 ul를 로딩시켰으며, 전기 영동 장치에서 20분 동안 겔을 내려준 후에 UV로 측정하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다(Lane M: Molecular Weight Marker 50 bp(Amersham, USA). Lane N: Negative Control. Lane P: PUNO. Lane G: G-PUNO. Number: ZG-PUNO).
상기 도면에 따르면, 본 실시예에 따른 검출 플랫폼을 적용할 경우, 낮은 농도의 박테리아 함유 시료(10 CFU/ml)에 대하여도 유효하게 박테리아를 검출할 수 있었다.
한편, 박테리아-함유 시료(박테리아 농도: 106 CFU/mL)를 투명 비닐장갑 및 고무장갑 각각에 분무한 후에 ZG-PUNO 구조물에 접촉시키고, PCR 증폭 후 아가로오스 겔 전기영동 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, 2종의 장갑을 이용한 직접 접촉을 수반하는 경우에도 ZG-PUNO 구조물은 유효하게 박테리아를 검출할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (20)

  1. 시료 내 함유된 바이오물질을 포집하는 방법으로서,
    a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료 내 바이오물질을 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 복합 나노구조체는,
    (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 방법.
  2. a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료 내 바이오물질을 복합 나노구조체 상에 포집하는 단계;
    b) 상기 포집된 바이오물질을 용해(lysis)시켜 핵산을 추출하는 단계; 및
    c) 상기 추출된 핵산을 증폭하여 검출하는 단계;
    를 포함하는 바이오물질의 진단 방법으로서,
    여기서, 상기 복합 나노구조체는,
    (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화아연 층의 표면 조도는, 205 내지 260 nm의 Rq, 170 내지 220 nm의 Ra 및 970 내지 1100 nm의 Rz 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화아연 층은 초음파 합성법에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 초음파 합성법은,
    아연 전구체-함유 용액을 제공하는 단계; 및
    상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물을 상기 아연 전구체-함유 용액에 접촉시켜 초음파 조사 하에서 반응시키는 것에 의하여 상기 아연 전구체를 산화아연으로 전환시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 아연 전구체-함유 용액은,
    용매로서 물, 탄소수 1 내지 3의 알코올 또는 이의 혼합물,
    아연 전구체로서 질산아연, 황산아연, 아세트산아연, 포름산아연, 염화(II) 아연, 요오드화아연, 아연아세틸아세토네이트, 이의 수화물 또는 이의 조합, 그리고
    환원제로서 헥사메틸렌테트라아민, 에틸렌디아민, 암모니아, 폴리에틸렌이민, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아연 전구체-함유 용액 중 아연 전구체의 농도는 0.0005 내지 1 M, 그리고 환원제의 농도는 0.5 내지 5 M의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아연전구체-함유 용액 중 환원제/아연 전구체의 몰 비는 1000 내지 3000 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 초음파 조사 하에서의 반응은 20 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 초음파 조사 하에서의 반응은 20 내지 200 W의 출력의 초음파를 3 내지 120 분 동안 조사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 초음파 조사 하에서의 반응은,
    용기 타입의 초음파 조사 장치를 이용하여 20 내지 100 W 출력의 초음파 조사 하에서 20 내지 120분 동안 수행되거나, 또는
    프로브 타입의 초음파 조사 장치를 이용하여 100 내지 200 W 출력의 초음파 조사 하에서 3 내지 20분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화아연 층의 두께는 10 내지 100 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 고분자는 폴리우레탄(Poly urethane, PU)계, 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)계, NOA(Noland Optical Adhesive)계 및 에폭시(Epoxy)계로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 복수의 나노필라의 직경 및 높이는 각각 100 내지 1000 nm 및 100 내지 1500 nm 범위이고, 상기 복수의 나노필라 사이의 간격은 100 내지 3500 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 표면 개질 금속층은 Ni, Pd, Ag, Cd, Pt, Ga, In 및 Au로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표면 개질 금속층과 상기 나노 패턴 구조물 사이에 Ti, V, Cr, Sc, Nb, Mo 및 W으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 중간층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 시료 내 바이오물질을 포집하여 진단하기 위한 시스템으로서,
    (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및 (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층을 포함하는 복합 나노구조체;
    상기 복합 나노구조체에 포집된 시료 내 바이오물질로부터 유래하는 핵산에 대한 증폭 수단; 및
    상기 증폭된 핵산의 검출 수단;
    을 포함하는 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 시료 내 바이오물질을 포집하여 진단하기 위한 시스템의 검출 한계(LOD)는 10 내지 106 CFU/ml인 것을 특징으로 하는 포집 및 진단 시스템.
  19. (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물,
    (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질 금속층, 및
    (iii) 상기 표면 개질 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된, 양전하를 띄면서 주름진 형태학적 특성의 산화아연 층;
    을 포함하는 복합 나노구조체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 산화아연 층의 표면 조도는, 205 내지 260 nm의 Rq, 170 내지 220 nm의 Ra 및 970 내지 1100 nm의 Rz 범위인 것을 특징으로 하는 복합 나노구조체.
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