KR102022662B1 - 식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 - Google Patents

식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 Download PDF

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Abstract

당화 도메인을 이용하여 식물 세포에서 목적 단백질을 고발현시키는 기술과 관련된 것으로, 당화 도메인과 목적 단백질의 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 세포, 형질전환 식물, 및 이들을 이용한 목적 단백질 생산 방법이 제공된다.

Description

식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터{Recombinant vector for expressing target protein}
본 발명은 당화 도메인을 이용하여 식물 세포에서 목적 단백질을 고발현시키는 기술과 관련된 것으로, 당화 도메인과 목적 단백질의 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 세포, 형질전환 식물, 및 이들을 이용한 목적 단백질 생산 방법을 제공한다.
분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 경우, 생산 단가를 파격적으로 줄일 수 있고, 종래의 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 분리 정제하는 방법에서 발생할 수 있는 바이러스, 암 유전자, 장 독소와 같은 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 장기 보관 및 관리가 가능하다는 이점을 갖는다. 또한, 해당 유용 물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템에 비해 절대적으로 유리하기 때문에 최단 기간에 높아진 수요에 따른 공급이 가능하다는 것도 장점이다.
하지만 이와 같은 장점에도 불구하고 식물세포에서 단백질을 생산함에 있어서 동물세포를 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 낮은 단백질 발현수준이 가장 큰 단점이 되고 있다. 이에 많은 연구들이 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질 발현량을 증가시키려는 시도가 있었다.
이전까지 식물세포에서 목적 단백질의 발현량을 증가시키기 위한 연구들은 대부분 단백질 발현과정 중 mRNA로부터 단백질이 만들어지는 번역(translation) 단계 이전인 전사(transcription) 단계에 집중되어 있었고, mRNA로부터 단백질이 번역될 때 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있는 방법에 관한 연구는 많이 이루어지지 않았다.
한편 종래 N-당화(N-glycosylation)가 단백질의 안정성(stability)에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있다. 이 경우에는 N-글리칸(N-glycan)들이 프로테아제(protease)로부터 단백질을 보호해 주기 때문에 안정성을 높인다고 생각되었다. 또한 다른 기작으로 단백질의 3차원 구조에 추가적인 결합력을 제공하여 안정성을 제공해 준다고 알려져 있다.
본 발명자들은 식물세포에서 목적 단백질을 생산함에 있어서 번역 단계에서 목적 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 예의 노력한 결과, 당화를 일으키는 작은 도메인을 목적 단백질에 융합하였을 때 단백질의 발현 수준이 높아지는 것을 확인하고, 이를 이용하여 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높일 수 있다는 점을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 N-당화 (N-glycosylation) 도메인의 목적 단백질 발현에 사용하기 용도와 관련된 것이다.
일 예는 N-당화 도메인을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 목적 단백질 발현용 조성물을 제공한다.
상기 목적 단백질 발현용 조성물은 목적 단백질 코딩 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 목적 단백질 코딩 유전자와 N-당화 도메인 코딩 유전자는 N-당화 도메인과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 포함될 수 있다.
상기 N-당화 도메인은 N-당화 가능한 잔기(N-glycosylation site)를 하나 이상, 또는 2개 이상 포함하는 N-당화 도메인 (예컨대, 다중 N-당화 도메인)일 수 있으며, 일 구체예에서, CD45 유래 M 도메인, 예컨대 인간 CD45 유래 M 도메인 또는 그 일부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 목적 단백질 발현은 진핵 세포 (예컨대, 식물 세포) 또는 진핵 유기체 (예컨대, 식물체) 내에서 수행되는 것일 수 있다.
다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 제공한다. 상기 세포는 진핵세포, 예컨대, 식물 세포일 수 있다.
상기 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및/또는 재조합 세포는 목적 단백질의 생산을 증진시키는 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및/또는 재조합 세포를 포함하는 목적 단백질 생산용 또는 목적 단백질 생산 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환 유기체를 제공한다. 상기 형질전환 유기체는 형질전환 진핵 유기체, 예컨대, 형질전환 식물체일 수 있다.
다른 예는 상기 목적 단백질 생산용 조성물 또는 생산 증가용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법 또는 목적 단백질 생산 증가 방법을 제공한다. 상기 방법은 목적 단백질 코딩 유전자를 세포에 단독 도입시킨 경우 (즉, N-당화 도메인을 포함하지 않은 재조합 벡터를 통하여 도입시킨 경우)와 비교하여, 목적 단백질의 발현량 또는 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, N-당화 (N-glycosylation) 도메인의 식물체 내 목적 단백질 발현에 사용하기 용도, 보다 구체적으로, 목적 단백질을 코딩하는 유전자, 및 상기 유전자의 C-말단 해당 부위 (3' 말단), 또는 N-말단 해당 부위 (5' 말단)에 N-당화(N-glycosylation) 도메인을 코딩하는 유전자를 융합하여 발현시킴으로써, 목적 단백질의 발현 수준을 증가시키는 기술을 제안한다.
일 예는 N-당화 도메인을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 목적 단백질 발현용 조성물을 제공한다.
상기 목적 단백질 발현용 조성물은 목적 단백질 코딩 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 목적 단백질 코딩 유전자와 N-당화 도메인 코딩 유전자는 N-당화 도메인과 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 포함될 수 있다.
상기 N-당화 도메인은 N-당화 가능한 잔기를 하나 이상, 또는 2개 이상 포함하는 N-당화 도메인일 수 있으며, 일 구체예에서, CD45 유래 M 도메인 또는 그 일부, 예컨대 인간 CD45 유래 M 도메인 또는 그 일부를 포함할 수 있다. 상기 목적 단백질 발현은 진핵 세포, (예컨대, 식물 세포) 또는 진핵 유기체, (예컨대, 식물체) 내에서 수행되는 것일 수 있다.
다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 진핵 세포, 예컨대, 식물 세포에서 발현을 위한 것일 수 있다.
다른 예는 상기 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 세포에 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 세포는 진핵 세포, 예컨대, 식물 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 유기체를 제공한다. 상기 형질 전환 유기체는 유기체에 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 상기 형질전환 유기체는 형질전환 진핵 유기체, 예컨대, 형질전환 식물체일 수 있다. 상기 형질전환 유기체는 앞서 설명한 재조합 세포를 포함하는 진핵 유기체 (예컨대, 식물체)일 수 있다.
상기 융합 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및/또는 재조합 세포 및/또는 형질전환 유기체는 목적 단백질의 생산용 또는 목적 단백질의 생산을 증진시키는 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 유기체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 목적 단백질 생산용 또는 목적 단백질 생산 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법 또는 목적 단백질 생산 증가 방법을 제공한다. 상기 재조합 세포는 세포에 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 세포는 진핵 세포, 예컨대, 식물세포일 수 있다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이전에, N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 상기 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 세포 (세포, 세포 파쇄물, 또는 세포 용해물) 및/또는 배양 배지로부터 목적 단백질을 분리 (또는 추출) 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 형질전환 유기체를 성장시키는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법 또는 목적 단백질 생산 증가 방법을 제공한다. 상기 유기체는 진핵 유기체, 예컨대, 식물일 수 있다. 상기 방법은 상기 성장시키는 단계 이전에, N-당화 도메인 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유기체에 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 상기 상기 성장시키는 단계 이후에, 상기 진핵 유기체 (예컨대, 식물), 또는 상기 진핵 유기체의 세포 (세포, 세포 파쇄물, 세포 용해물, 또는 상기 세포의 배양물)로부터 목적 단백질을 분리 (또는 추출) 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은, 목적 단백질 코딩 유전자를 세포 또는 유기체에 단독 도입시킨 경우 (즉, N-당화 도메인을 포함하지 않은 재조합 벡터를 통하여 도입시킨 경우), 목적 단백질을 O-당화 도메인와 융합시켜 사용하는 경우, 및/또는 별개의 N-당화 도메인이 융합되지 않고 목적 단백질이 내재적으로 N-당화 잔기를 포함하는 경우와 비교하여, 목적 단백질의 발현량 또는 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
일 실시예에 있어서, 상기 N-당화 도메인은 N-당화 잔기 (N-당화가 일어나는 아미노산; 아스파라긴(Asn))를 1개 이상 또는 2개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 포함하고, 총 아미노산 개수가 10 내지 100개 또는 20개 내지 80개인 폴리펩타이드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 N-당화 도메인은 사람 CD45 내의 적어도 사람 CD45 유래 M 도메인(M domain; 4개의 N-당화 잔기를 포함) 또는 그 일부를 포함하는 연속하는 10 내지 100개 또는 20개 내지 80개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 사람 CD45 단백질은 서열번호 5(UniProt no. P08575)의 아미노산 서열로 표현되는 것일 수 있다, 상기 사람 CD45 유래 M 도메인은 사람 CD45 단백질 (서열번호 5)의 231 번째 잔기인 Ala부터 290번째 잔기인 Asp까지의 총 60개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 (60aa; A N ITVDYLYN KETKLFTAKL NVNENVECG N NTCTNNEVH N LTECK N ASVS ISHNSCTAPD; 서열번호 2; 밑줄 및 굵은 글씨체는 N-당화 잔기를 나타냄)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 사람 CD45 유래 M 도메인을 암호화하는 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 사람 CD45 유래 M 도메인의 일부는 상기 CD45 유래 M 도메인 중 N-당화 잔기 (예컨대, 서열번호 2 중 2번째 위치의 N(Asn), 30번째 위치의 N(Asn), 40번째 위치의 N(Asn), 및 46번째 위치의 N(Asn) 중에서 선택됨)를 1개 이상 또는 2개 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 단편은, 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 적어도 40번째 위치의 N 및 46번째 위치의 N 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 예컨대 "LTECKNASVS ISHNSCTAPD (서열번호 6)" 또는 "NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVS ISHNSCTAPD (서열번호 7)") 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 N-당화 도메인은, 사람 CD45 단백질 (서열번호 5) 중의, M 도메인 (서열번호 2) 또는 상기 M 도메인 (서열번호 2) 중의 연속하는 10개 이상, 15개 이상 또는 20개의 아미노산을 포함하는 M 도메인 일부를 포함하는 연속하는 10 내지 100개 또는 20개 내지 80개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 (예컨대, 서열번호 6, 7, 또는 8)일 수 있다.일 실시예에 있어서, 상기 M 도메인을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 전사조절인자, 번역조절인자, 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전사조절인자는, 세포, 예컨대, 식물 세포에서의 전사조절을 위하여 통상적으로 사용되는 모든 전사인자들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA(Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA) 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 19S RNA(Cauliflower Mosaic Virus 19S RNA) 프로모터, 피크워트 모자이크 바이러스(Figwort Mosaic Virus) 유래 전장 전사 프로모터 및 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus) 코트 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 번역조절인자는 세포, 예컨대, 식물 세포에서 번역조절을 위하여 통상적으로 사용되는 모든 번역조절인자들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, M17 인자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 M17 인자는 서열번호 3의 핵산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 특정 세포내 소기관으로의 타겟팅 (이동 및/또는 체류 (retention))을 위하여 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 재조합 벡터는 소포체 (ER)에 타겟팅되도록 설계된 것일 수 있으며, 이를 위하여 소포체 (예컨대, 세포체 막 표면) 이동 신호 (예컨대, BiP(chaperone binding protein) 코딩 유전자 등) 및/또는 소포체 체류 신호 (예컨대, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드 코딩 유전자)를 를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포내 소기관 (예컨대, 소포체) 타겟팅 신호 서열은 융합 단백질의 N-말단 (융합 단백질 코딩 유전자의 5' 말단) 또는 C-말단 (융합 단백질 코딩 유전자의 3' 말단), 예컨대, N-말단 (융합 단백질 코딩 유전자의 5' 말단)에 연결된 것일 수 있다. 이와 같이, 재조합 벡터가 세포내 소기관 중 소포체 (예컨대, 소포체 내부)에 타겟팅됨으로써, 단백질 발현 수준을 보다 증가시킬 수 있다 (도 3 참조). 일 예에서, 상기 융합 단백질의 N-당화는 소포체 내부에서 일어날 수 있다.
상기 BiP(chaperone binding protein)은 서열번호 4의 핵산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 목적 단백질 코딩 유전자, 사람 CD45 유래 M 도메인(M domain) 코딩 유전자, 전사조절인자, 상기 전사조절인자와 작동 가능하게 연결된 M17 인자, 및 BiP(chaperone binding protein) 및/또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 목적 단백질 발현 수준을 증가시키기 위한 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 웨스턴 블럿에서 발현 여부를 확인하기 위해 HA 에피토프 서열을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 진핵 세포는 진균, 동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 식물 세포일 수 있다. 진핵 유기체는 모든 진핵 단세포 생물 및 진핵 다세포 생물 (식물 또는 동물)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 식물일 수 있다. 본 명세서에 기재된 식물은 모든 조류, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물중에서 선택된 1종 이상의 식물, 또는 이들의 세포일 수 있으며, 예컨대, 는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군에서 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군에서 선택되는 단자엽 식물, 또는 이들의 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터를 진핵 유기체 (예컨대, 식물체) 또는 진핵 세포 (예컨대, 식물 세포)에 도입시키는 단계는
통상적인 형질도입 방법에 의하여 수행 가능하며, 예컨대, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이
본 명세서에서 사용된 바로서, "N-당화 (N-Glycosylation)은 단백질의 아미노산의 질소 원자에 당분자 올리고사카라이드인 글리칸을 결합시키는 일련의 과정을 의미하는 것으로, 단백질의 아미노산 잔기의 산소원자에 당분자를 결합시키는 O-당화 (O-glycosylation)과 구별된다. 본 명세서에서, N-당화는 소포체 (예컨대, 소포체 내부)에서 일어나는 것일 수 있다.
상기 "N-당화 도메인"은 N-당화되는 위치 (N-Glycosylation site; 아미노산 잔기)를 포함하는 폴리펩타이드로서, 인위적으로(non-naturally occurring) 화학적 또는 재조합적으로 합성되거나, 천연 유래의 것일 수 있다
일 실시예에서는 사람 CD45의 M 도메인을 목적 단백질의 카르복시 말단(C-terminal)에 융합시킨 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하여 실험하였으나, 이에 한정되지 않고, 목적 단백질의 아미노 말단(N-terminal)에 융합될 수도 있다.
상기 목적 단백질과 N-당화 도메인을 포함하는 융합 단백질은 상기 목적 단백질과 N-당화 도메인 사이에 적절한 링커 (예컨대, 1-50 aa, 1-30 aa, 1-20 aa, 2-50aa, 2-30 aa, 또는 2-20 aa의 펩타이드 링커)를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 글리신-세린(glycine-serine)이 반복되는 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 아미노산 서열 및 핵산 서열은 제공된 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열까지 확장되어 해석될 수 있다.
상기 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바로서, "재조합 벡터 또는 재조합 세포"은 세포가 이종의 핵산 (폴리뉴클레오타이드)을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나, 또는 펩타이드, 이종의 펩타이드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 벡터 또는 세포를 의미하는 것일 수 있다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 및/또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기 "재조합 벡터"는 유전자 서열 또는 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 모든 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 및 기타 매개체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 식물세포 또는 식물체 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 재조합 벡터는 식물체 또는 식물 세포의 형질전환에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 유전자 서열 또는 염기 서열은 발현 조절 인자에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된(operably linked) 유전자 서열과 발현 조절 인자는 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
공지된 벡터의 예는 pBI121, pHellsgate8, pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, 및 pGEM을 포함한다. 또한, CMV35s 프로모터를 포함하는, 식물체에서 발현되는 벡터는 예를 들어 pCAMBIA 시리즈 (pCAMBIA1200, 1201, 1281, 1291, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1380, 1381, 2200, 2201, 2300, 2301, 3200, 3201, 3300), pMDC32, 및 pC-TAPapYL436와 같은 것이 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "작동 가능하게 연결"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 인자에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 인자일 수 있다.
본 발명의 상기 용어 "발현 조절 인자"는 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 인자는 전사를 실시하기 위한 프로모터 및 임의의 오퍼레이터 서열을 포함하는 전사조절인자, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 단백질 합성을 조절하는 서열을 포함하는 번역조절인자, 전사 및 번역의 종결을 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서, 상기 전사조절인자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA(Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA) 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 19S RNA(Cauliflower Mosaic Virus 19S RNA) 프로모터, 피크워트 모자이크 바이러스(Figwort Mosaic Virus) 유래 전장 전사 프로모터 및 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus) 코트 단백질 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 번역조절인자는 M17 서열일 수 있으며, 이는 식물체 내에서 목적 단백질의 합성량을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명에서 바람직하게 상기 M17 서열은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 또는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있으며, 이는 상기 전사조절인자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 BiP는 루미날 결합 단백질(luminal binding protein)로서, 면역글로불린 중사슬 결합 단백질(immunoglobulin heavy chain binding protein)과 글루코스 조절 단백질(glucose regulated protein)로 동정되었으며, 소포체에 위치해 있는 HSP70 샤페론 패밀리의 한 종류로서 소포체에서 새로이 합성된 단백질에 일시적으로 결합한다. 또한, BiP 단백질의 N-말단에는 소포체로의 타겟팅을 결정하는 신호 서열을 함유하고 있어 목적 단백질들을 소포체로 타겟팅 시키는 역할을 한다. 예컨대, 상기 BiP 코딩 핵산은 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 식물형질전환용 재조합 벡터는 HDEL과 같은 소포체 저장 신호 펩타이드(ER retention signal peptide)를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으며, HDEL 신호 펩타이드의 경우 목적 단백질을 소포체 내에 머물도록 함으로써 분자 샤페론에 의한 폴딩(folding)과 조합(assembly)이 증가되어 결과적으로 단백질의 분해를 더욱 최소화하기 위함이다. 이러한 예로서, 목적 단백질을 분비 경로로 보냈을 때 보다 소포체에 유지(retention)시킨 경우, 목적 단백질의 수율이 10~100배 정도 증가된다고 알려진 바 있다.
또한, 일 구체예는, 목적 단백질, 사람 CD45 유래 M 도메인(M domain) 또는 이의 일부를 코딩하는 유전자, 전사조절인자, 상기 전사조절인자와 작동 가능하게 연결된 M17, BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 목적 단백질 발현 수준을 증가시키기 위한 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에 기재된 재조합 벡터는 유전자 발현을 확인할 수 있는 마커를 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서는 웨스턴 블럿에서 발현 여부를 확인하기 위해 HA 에피토프 서열을 사용하였으나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "목적 단백질"은 생산하고자 하는 단백질 또는 그 단편을 의미하는 것으로서, 특정 단백질로 한정되지는 않는다. 구체적으로 목적 단백질은 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터 (예컨대, 티로신 키나아제 수용체 등), 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 리포터단백질 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에서는 상기 목적 단백질로 렙틴(leptin), GLP-1, Exendin-4, aprotinin, GFP (green fluorescent protein) 등을 예시적으로 사용하였으나, 이는 본 명세서에서 제공되는 단백질 생산 증가 효과를 예시적으로 보여주기 위한 것일 뿐이며, 목적 단백질이 상기 단백질들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다. 상기 형질전환 식물은 M 도메인 서열을 포함하고 이는 전사 및 번역조절인자와 작동 가능하게 연결되고 이의 의해 제어되도록 고안되어 있다. 본 발명에서 설명된 형질전환 식물은 식물 전체, 식물 세포 (예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 등의 세포), 또는 식물 조직 (예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 등)일 수 있다. 식물 조직은 식물 종자를 포함할 수 있다. 상기 식물은 초본 또는 교본 식물일 수 있고, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 구체적으로 상기 쌍자엽 식물로는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법 (sonication), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Polyethylenglycol))-매개성 형질전환 방법 중에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 형질전환된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환된 식물체는 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제조하는 단계, 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계, 상기 형질전환된 식물체를 배양하는 단계 및 상기 형질전환된 식물체 또는 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 식물 발현 벡터의 식물세포 또는 식물체로의 도입은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(silicon carbide whiskers), 초음파 처리법 (sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명 의 일실시예에서는 PEG-매개성 형질전환 방법을 사용하였다.
본 발명에 따른 식물 형질전환용 재조합 벡터는 식물 세포 내에서 목적 단백질의 발현 수준을 향상시킴으로써 기존의 식물 형질전환을 이용한 단백질 생산에서 가장 큰 문제였던 고발현 형질전환체 획득의 어려움을 극복하였으며, 이를 통해 식물을 이용한 유용 단백질 생산에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은 일 실시예에 따라 제작한 식물 형질전환용 재조합 벡터에서 p35S-M17:Bip:Leptin:M:HA:HDEL 부분을 포함하는 연결형태를 나타낸 모식도이다.
도 2a는 일 실시예에 따라 제작한 식물 형질전환용 재조합 벡터에서 p35S-M17:Bip:Leptin:HA:HDEL, p35S-M17:Bip:Leptin:M:HA:HDEL, 및 p35S-M17:Bip:Leptin:M1234:HA:HDEL 부분을 포함하는 연결형태를 나타낸 모식도이다 (M1234: M 도메인의 N-glycosylation site N1, N2, N3, 및 N4가 변형 (Asn→Gln)된 M 도메인 변이체).
도 2b는 M 도메인의 N-당화 여부 에 따른 단백질 발현량을 웨스턴 블럿 방법으로 확인한 전기영동 결과 (상단) 및 이의 정량 결과 (하단)를 보여준다.
도 3은 타겟팅되는 식물 세포 소기관에 따른 단백질 발현량 차이를 시험하기 위한 재조합 벡터의 모식도 (상단), 및 단백질 발현 수준을 웨스턴블럿으로 확인한 전기영동 결과 (중단) 및 이를 정량한 결과 (하단)을 보여준다.
도 4는 M 도메인과 융합된 융합 단백질의 시간에 따른 발현 양상을 웨스턴블럿을 통해 확인한 전기영동 결과 (상단) 및 이의 정량 결과 (하단)을 보여준다.
도 5은 M 도메인이 Exendin4 또는 GLP-1와 각각 융합된 융합 단백질의 발현 수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 6a는 일 실시예에 따른 M 도메인과 다양한 목적 단백질이 다양한 순서로 융합된 융합 단백질의 발현을 위하 재조합 벡터의 모식도이다.
도 6b는 M 도메인이 leptin (Lep), aprotinin (Apr), 또는 GFP (Gfp)와 다양한 순서로 융합된 융합 단백질의 발현 수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 M 도메인의 N-당화 위치가 다양한 조합으로 변이된 변이 M 도메인과 Leptin이 융합된 융합 단백질의 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 8은 ER-associated degradation 억제 여부에 따른 야생형 M 도메인 또는 변이형 M 도메인이 융합된 융합 단백질의 발현 수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 내재적으로 N-당화 위치를 갖는 목적 단백질의 M 도메인과 융합 여부에 따른 단백질 발현 수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 다양한 M 도메인 일부 또는 연장부와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질의 단백질 발현 수준을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 M 도메인 또는 다양한 M 도메인 변이체의 융합에 따른 전사 수준을 정량적 RT-PCR로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
참고예 1: 식물 재료 준비
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana ecotype, Col-0) 식물을 16 시간/8 시간 명암 주기 및 20℃ 내지 22℃ 온도 조건의 성장 챔버의 B5 플레이트 상에서 성장시켰다. 2주 성장시킨 식물의 잎 조직을 원형질체 분리에 사용했다.
참고예 2: 플라스미드 구축
마우스 leptin cDNA(NM_008493.3)의 mature peptide region을 사용하였다. M 도메인을 코딩하는 DNA 단편(서열번호 1)을 반복적인 PCR 수행에 의하여 합성하였으며, N-당화 부위의 돌연변이 (Asn-Gln 치환)은 PCR-기반 부위-특이적 돌연변이(PCR-based site-directed mutagenesis)에 의해 생성하였다. 화학 합성에 의해 aprotinin을 암호화하는 DNA 단편 (서열번호 11)을 제작하였다 (Bioneer, 대전, 한국). 엔테로 키나아제 및 푸린 (furin) 절단 부위를 렙틴 증폭에 사용된 프라이머에 포함시켰다 (5'-GGATCCAAGATGATGATGATAAGGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGGAT-3' (서열번호 18). HA 에피토프 및 ER retention signal HDEL은 상기 M 도메인 증폭에 사용된 프라이머를 사용하여 도입시켰다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ 5분, (94℃ 30초, 52℃ 1분, 72℃ 30초) 30회 반복, 72℃ 7분. 사용된 프라이머 서열을 하기의 표 1에 정리하였다:
Primer Name Sequence (5' to 3') 서열번호
BamHI-Ek-leptin-F GGATCCAAGATGATGATGATAAGGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGGAT 18
leptin-furin-SpeI-R ACTAGTTCGCCTGACACGGCATTCAGGGCTAACATCCAACTG 19
hspt-R GAATTCCTTATCTTTAATCATATT 20
M-3-HA-HDEL-F TCATAATTCATGTACTGCTCCTGATTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCCCACGATGAGCTCTAGCTCGAGATATGAAGATGAAGATGAAATATT 21
M-2-F AATGTGGAAACAATACTTGCACAAACAATGAGGTGCATAACCTTACAGAATGTAAAAATGCGTCTGTTTCCATATCTCATAATTCATGTACTGCTCCTGA 22
SpeI-M-1-F ACTAGTGCAAACATCACTGTGGATTACTTATATAACAAGGAAACTAAATTATTTACAGCAAAGCTAAATGTTAATGAGAATGTGGAATGTGGAAACAATACTTGCACAA 23
SpeI-HA-F ACTAGTTACCCATACGATGTTCCAGATTAC 24
XbaI-Cab-F TCTAGAATGGCGTCGAACTCGCTTATGAGC 25
Cab-BamHI-R GGATCCTCTCTGACTCTTTGTA 26
XbaI-F1-F TCTAGAATGGCAATGGCTGTTTTCCGTCGC 27
F1-BamHI-R GGATCCTCTGAACTGCTCTAAGCTTGGAAG 28
SpeI-M-F ACTAGTGCAAACATCACTGTGGAT 29
SpeI-M-N2Q-F ACTAGTGCACAAATCACTGTGGAT 30
M-N30Q-F GTGGAATGTGGACAAAATACTTGCACA 31
M-N30Q-R TGTGCAAGTATTTTGTCCACATTCCAC 32
M-N40Q-F AATGAGGTGCATCAACTTACAGAATGT 33
M-N40Q-R ACATTCTGTAAGTTGATGCACCTCATT 34
M-N46Q-F ACAGAATGTAAACAAGCGTCTGTTTCC 35
M-N46Q-R GGAAACAGACGCTTGTTTACATTCTGT 36
M-N40,46Q-F AACAATGAGGTGCATCAACTTACAGAATGTAAACAAGCGTCTGTTTCCATA 37
M-N40,46Q-R TATGGAAACAGACGCTTGTTTACATTCTGTAAGTTGATGCACCTCATTGTT 38
BamHI-M-F GGATCCCGATGGCAAACATCACTGTGGATTACTTA 39
M-GS2-SpeI-R ACTAGTTGATCCACCACCAGACCCACCTCCACCATCAGGAGCAGTACATGAATTAT 40
BamHI-Ek-Apro GGATCCCGGATGACGACGATAAGCGACCGGAC 41
BamHI-ek-Apr-F GGATCCAAGATGATGATGATAAGCGACCGGAC 42
Apr-fu-SpeI-R ACTAGTTCGCCTGACACGGGCACCGCCGCAGGTTCTCATACA 43
GFP-HDEL-stop-XhoI-R CTCGAGCTAGAGCTCATCGTGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 44
GFP-fu-SpeI-R ACTAGTTCGCCTGACACGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 45
SpeI-ek-GFP-F ACTAGTGATGACGACGATAGGTGAGCAAG 46
AtACT2-5' TATGAATTACCCGATGGGCAAG 47
AtACT2-3' TGGAACAAGACTTCTGGGCAT 48
leptin- F-qRT1-F TCGGTATCCGCCAAGCAGTGCCTATCCAGAAAGTCCA 49
leptin- R-qRT1-R GGTGAAGCCCAGGAATGAAGGCATTCAGGGCTAACATCCA 50
Leptin의 mature region과, M 도메인 혹은 Asn-to-Gln 치환 돌연변이 M 도메인을 벡터 BiP:HA:CBD:HDEL에 연속적으로 연결시켰다.
엽록체 및 미토콘드리아로 융합단백질을 축적시키기 위하여, Cab transit peptide 또는 F1-ATPase gamma subunit presequence를 PCR로 증폭하고, EeLepf 및 EeLepfM 벡터 내의 BiP로 치환시켰다 (Lee, D. W. et al., Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell 20, 1603-1622 (2008); Lee, S. et al., Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell 24, 5037-5057 (2012) 참조).
상기 구조체들은 모두 동일한 벡터로부터 제작되었고, 따라서, 동일한 5'-UTRs을 갖는다. 모든 PCR 산물의 핵산 서열은 nucleotide sequencing에 의하여 확인하였다.
참고예 3: 발현, 화합물 처리, 및 웨스턴블랏 분석
상기 참고예 2에서 제작된 플라스미드는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-매개 형질전환에 의하여, 참고예 1에서 준비된 식물 세포의 원형질체 내로 도입시켰다. 형질 전환 후, 24 시간 또는 정해진 시점에서 단백질을 추출하여 단백질 추출물을 준비하였다. 형질 전환 직후, 원형질체에 투니카마이신 (tunicamycin, 10㎍/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 처리하고, 형질전환 12시간 후에 Cycloheximide (50㎍/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 처리하였다. 단백질 추출물에 대하여 항-HA 항체 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 항-actin 항체 (MP Biomedicals, Solon, OH), 항-GFP 항체 (Bio-Application, 포항, 대한민국) 또는 항 BiP 항체를 사용하여 Western blotting analysis를 수행하였다. 단백질 블롯을 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 전개하고 LAS4000 image analyzer (Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 이미지를 얻었다.
참고예 4: 전체 RNA 분리 및 전사 수준의 정량적 RT-PCR 분석
PEG-매개 형질전환 후의 식물세포 원형질체로부터 Ambion Phenol-free total RNA isolation kit를 이용하여 전체 RNA를 추출하고, TURBO DNase (Ambion)를 처리하였다. high-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems)를 사용하여 상기 추출된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 전사 수준(transcript level)을 검출하였다. ACTIN2는 내재적 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. PCR 혼합물 (20㎕)은 template 50ng, forward 및 reverse primer 0.5 mM, 및 1xSYBR Mix를 포함하였다.
PCR 조건은 다음과 같다: initial denaturation at 95℃ for 10 min, followed by 40 cycles of 95℃ for 15 s and 60℃ for 1 min.
특이적인 증폭을 확인하기 위하여, 95℃에서 15초간 가열 한 후, 60℃에서 1분간 가열 한 다음, 95℃까지 매 15초마다 0.3℃씩 온도를 상승시키면서 융해곡선을 얻었다.
실시예 1. M 도메인(M domain) 융합용 재조합 벡터의 제작
식물체에서 목적 단백질을 고발현 시킬 수 있도록, 목적 단백질에 사람 CD45의 M 도메인(M domain)이 융합된 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제작하였다. 목적 단백질로 엔테로키나아제 절단 부위(enterokinase cleavage site)와 퓨린 절단 부위 (furin cleavage site)가 각각 아미노 말단과 카르복시 말단에 융합된 렙틴 (Leptin)(이하 "eLepf"이라 함)을 사용하였다. 상기 재조합 벡터는 통상적으로 사용하는 벡터인 pCAMBIA1300 벡터에 CaMV 35S 프로모터를 사용하고, 단백질 합성량의 증가를 위하여 M17 서열(서열번호 3)을 추가하였으며, BiP(chaperone binding protein) 단백질의 신호 펩타이드(signal peptide)에 해당하는 게놈 DNA 서열(서열번호 4)을 이용하여 목적 단백질을 소포체로 이동시킬 수 있도록 하였고, 최종 목적 단백질이 소포체에 축적될 수 있도록 카르복실 말단에 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 부여하여 소포체에 보존(retention)시켰다. 또한 웨스턴 블럿을 통해 융합 단백질의 발현 여부를 확인하기 위해 HA 에피토프를 사용하였다. 본 실시예에서 제작한 재조합 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다 (M: M 도메인).
도 1에 보여진 재조합 벡터의 핵산 서열 (서열번호 10)을 다음의 표 2에 정리하였다:
Leptin-M domain 융합 단백질 발현용 재조합 벡터의 핵산 서열 (서열번호 10)
핵산 서열 (5'→3')
XbaI (Restriction enzyme site) tctaga
M17 ggcgtgtgtgtgtgttaaaga (서열번호 3)
BiP atggctcgctcgtttggagctaacagtaccgttgtgttggcgatcatcttcttcggtgagtgattttccgatcttcttctccgatttagatctcctctacattgttgcttaatctcagaaccttttttcgttgttcctggatctgaatgtgtttgtttgcaatttcacgatcttaaaaggttagatctcgattggtattgacgattggaatctttacgatttcaggatgtttatttgcgttgtcctctgcaatagaagaggctacgaagttaa (서열번호 4)
Enk (Enterokinase cleavge site) ggatccaagatgatgatgataag
Leptin Gtgcctatccagaaagtccaggatggcaccaaagccctcatcaagaccattgtcaccaggatcaatgacatttcacacacgcagtcggtatccgccaagcagagggtcactggcttggacttcattcctgggcttcaccccattctgagtttgtccaagatggaccagactctggcagtctatcaacaggtcctcaccagcctgccttcccaaaatgtgctgcagatagccaatgacctggagaatctccgagacctcctccatctgctggccttctccaagagctgctccctgcctcagaccagtggcctgcagaagccagagagcctggatggcgtcctggaagcctcactctactccacagaggtggtggctttgagcaggctgcagggctctctgcaggacattcttcaacagttggatgttagccctgaatgc (서열번호 53)
furin cleavage site cgtgtcaggcgaactagt
M gcaaacatcactgtggattacttatataacaaggaaactaaattatttacagcaaagctaaatgttaatgagaatgtggaatgtggaaacaatacttgcacaaacaatgaggtgcataaccttacagaatgtaaaaatgcgtctgtttccatatctcataattcatgtactgctcctgat (서열번호 1)
HA tacccatacgatgttccagattacgct
linker tcc
HDEL cacgatgagctc (서열번호 9)
stop codon-XhoI tagctcgag
서열번호 2의 M 도메인의 N-당화 잔기는 다음과 같다:
Figure 112018005641087-pat00001
실시예 2. M 도메인의 N-당화에 의한 단백질 발현 증가 확인
상기 실시예 1에서 제작한 M 도메인이 포함된 재조합 벡터에 의해 만들어진 융합 단백질 eLepfM의 발현량을 비교하기 위하여, 아래와 같이 재조합 벡터를 제작하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터(EeLepfM; 도 1)에서 M 도메인을 제거한 벡터(EeLepf) 및 M 도메인 중 4개 (실시예 1의 그림 참조)의 N-당화 부위(Asn)가 돌연변이 (mutation; Asn을 Gln로 치환)된 벡터(EeLepfM1234)를 제작하였다 (참고예 1 참조). 이 세 가지 벡터 (도 2a 참조)를 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 잎으로부터 분리한 식물세포 (참고예 1 참조)에 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG)을 통해 형질전환시켰고, N-당화의 효과를 확인하기 위해 형질전환 후 N-당화를 저해하는 튜니카마이신 (tunicamycin)을 처리하였다. 24시간 후 웨스턴블럿을 통해 단백질의 발현량을 확인하였다. 상기 얻어진 단백질 발현량 결과를 도 2b에 나타내었다 (상단: 웨스턴블럿 결과; 하단: 웨스턴블럿 결과 얻어진 단백질 발현량을 LAS4000 image analyzer로 정량하여 나타낸 그래프(Error bars, standard deviation (n = 3); *, p < 0.05 (Student's t-test))).
도 2b에 나타낸 것과 같이, N-당화가 일어나지 않아도 M 도메인이 융합되었을 때 단백질 발현량이 증가하기는 하지만(EeLepfM + tunicamycin), M 도메인이 있는 재조합 벡터에서 튜니카마이신을 첨가하지 않았을 때(EeLepfM - tunicamycin) N-당화가 일어나면서 목적 단백질의 발현량이 최대로 증가하였다.
M 도메인의 융합으로 단백질 발현량이 증가되는 것이 N-당화에 의한 것인지를 좀 더 명확하게 하기 위해, M 도메인이 없는 목적 단백질(eLepf) 및 M 도메인이 융합된 단백질(eLepfM)이 각각 소포체, 엽록체, 미토콘드리아로 타겟팅되도록 하는 재조합 벡터를 제작하였다. 융합 단백질을 소포체, 엽록체, 미토콘드리아로 타겟팅 시키기 위해 각각, BiP (서열번호 4), Cab transit peptide (서열번호 12), 또는 F1-ATPase gamma subunit presequence (서열번호 13)를 목적 단백질의 아미노 말단에 융합하고, M 도메인 코딩 핵산서열 (서열번호 1)을 목적 단백질의 카복시 말단에 융합하여 재조합 벡터를 제작하였다. 각각의 재조합 벡터를 상기와 같은 방법으로 식물세포에 도입한 후 배양하여 융합 단백질을 발현시켰다. 웨스턴블럿을 통해 단백질 발현량을 확인하였다.
상기 얻어진 단백질 발현량 결과를 도 3에 나타내었다 (상단: 발현벡터 모식도; 중간: 웨스턴블럿 결과; 하단: 웨스턴블럿 결과 얻어진 단백질 발현량을 LAS4000 image analyzer로 정량하여 나타낸 그래프 (Error bars, standard deviation (n = 3); *, p < 0.05 (Student's t-test))).
도 3에 나타낸 것과 같이, M 도메인이 없는 eLepf은 세포 내 소기관별 단백질 양에 차이가 없는 반면, M 도메인이 융합된 eLepfM의 경우 N-당화가 일어나는 소포체(ER)로 타겟팅 시킨 EeLepfM만이 단백질 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 2b와 도 3의 결과를 종합하였을 때, M 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 발현 증가는 N-당화에 의한 것이라는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. M 도메인 융합 단백질의 발현 속도
상기 실시예 2에서 확인한 바와 같이 N-당화에 의한 단백질 발현 증가의 기작을 이해하기 위해 M 도메인 융합 단백질의 발현 속도를 확인하였다. 상기 M 도메인이 융합된 재조합 벡터 EeLepfM과 M 도메인의 N-당화 부위가 돌연변이화 된 EeLepfM1234를 각각 식물세포에 형질전환 시키고, 12시간 후에 단백질의 합성을 막는 시클로헥사미드(cycloheximide) 또는 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 처리한 후 12시간 간격으로 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿으로 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다 (상단: 웨스턴블럿 결과; 하단: 웨스턴블럿 결과 얻어진 단백질 발현량을 LAS4000 image analyzer로 정량하여 나타낸 그래프 (x축, 시간; Error bars, SD (n = 3); *, p < 0.05; ***, p < 0.001))).
그 결과, 도 4에 나타낸 것과 같이 초기(12 시간)에는 EeLepfM과 EeLepfM1234의 발현량 차이가 거의 없으나, 시간이 지날수록 그 차이가 점점 커지는 것을 알 수 있었고, 이로부터 EeLepfM의 발현 속도가 EeLepfM1234에 비해 월등히 빠르다는 것을 알 수 있었다. 하지만 시클로헥사미드(cycloheximide)를 처리하여 단백질 합성을 막았을 때 식물 세포 내에서 EeLepfM은 조금씩 사라지지만, EeLepfM1234는 48시간까지 그대로 유지된 것을 확인함으로써 만들어진 단백질의 소포체 내 안정성은 EeLepfM1234가 더 높은 것을 알 수 있었다. 이 결과는 N-당화가 일어나는 단백질의 번역 속도가 N-당화가 일어나지 않는 단백질에 비해 빠르다는 것을 의미한다.
실시예 4. 다양한 단백질과 M 도메인 융합
M 도메인에 의한 발현 증가 효과가 위의 실시예에서 사용한 목적 단백질(eLepf) 이외의 단백질에도 적용이 되는지 확인하기 위해,
또 다른 목적 단백질로서 Exendin4 (서열번호 51) 코딩 유전자 또는 GLP-1 (서열번호 52) 코딩 유전자에 M 도메인 코딩 유전자(서열번호 1)을 융합하고, 번역 증폭 도메인(translation enhancer domain)으로서 G 도메인을 융합하여 재조합 벡터를 제조하고 (도 1 참조), 각각의 재조합 벡터를 식물세포(참고예 1)에 형질전환 시킨 후, 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, N-당화를 막는 튜니카마이신(tunicamycin)을 처리하였을 때 보다 튜니마마이신을 처리하지 않아 N-당화가 일어났을 때 단백질 발현 정도가 월등히 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 다양한 단백질과 M 도메인의 다양한 순서로의 융합
또한, 도 6a에 모식적으로 나타낸 재조합 벡터의 Xxx 위치에 leptin (Lep), aprotinin (Apr; 서열번호 11), 또는 GFP (Gfp; 서열번호 15)를 포함하는 재조합 벡터를 준비하고 ("(G4S)2": 링커 (GGGGSGGGGS)), 이를 식물세포에 형질전환한 후, 단백질 발현량을 웨스턴블럿으로 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6b에 나타난 바와 같이, 목적 단백질과 M 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킨 경우, 목적 단백질 종류, M 도메인과의 연결 순서, 및 링커의 유무와 무관하게, M 도메인과 융합되지 않은 경우와 비교하여, 목적 단백질의 발현량이 현저하게 증가함을 확인할 수 있다.
실시예 6: M 도메인의 N- glycosylation site의 조합에 따른 목적 단백질 발현 시험
M 도메인의 4개의 N-glycosylation site (실시예 1의 그림 참조)의 다양한 조합에 Asn-Gln 치환 돌연변이를 도입한 돌연변이체(4개의 N-glycosylation site 중 하나씩 변이, 2개씩 변이, 3개씩 변이, 및 4개 모두 변이)를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여, 목적 단백질(Leptin)의 발현 수준을 측정하였다 (도 7). 상기 재조합 벡터를 식물세포 원형질체에 형질전환시킨 후, 단백질을 추출하고, 상기 얻어진 단백질 추출물을 항-HA 항체를 이용한 웨스턴블랏팅으로 분석하였다. 상기 웨스턴블랏팅 결과 얻어진 밴드의 신호 강도를 LAS4000 이미지 분석기와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 정량화하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다 (x축의 EeLepfM 뒤에 기재된 숫자는 Asn-to-Gln 변이된 N-glycosylation site를 의미함). 도 7에서, 각 돌연변이체를 사용한 경우의 목적 단백질 발현 수준을 ER-표적화된 야생형 단백질 (야생형 M 도메인과 목적 단백질 융합)인 EeLepfM의 발현수준(1)에 대한 상대값으로 나타내었다. 도 7에서, (a)는 단일 Asn-Gln 돌연변이체를 사용한 경우의 목적 단백질이 상대적 발현 수준을, (b)는 이중 Asn-Gln 돌연변이체를 사용하는 경우의 목적 단백질이 상대적 발현 수준을, (c)는 트리플 Asn-Gln 돌연변이체를 사용한 경우의 목적 단백질이 상대적 발현 수준을 각각 나타낸다 (Error bars, SD (n = 4)).
도 7에 나타난 바와 같이, M 도메인의 N-glycosylation site 중 1-3개의 위치에 돌연변이가 발생하는 경우에 야생형보다 목적 단백질의 발현 수준이 낮아지지만, N-glycosylation site 4개가 모두 돌연변이된 경우보다는 모두 높은 수준의 목적 단백질 발현을 보였다. M 도메인의 4개의 N-glycosylation site가 모두 돌연변이된 돌연변이체를 사용한 경우라도, 목적 단백질을 단독 발현시키는 경우와 비교하여, 목적 단백질의 발현 수준이 증가하는 것을 고려할 때 (도 2b 참조), 야생형 M 도메인뿐 아니라, 4개의 N-glycosylation site 중 1-4개의 위치에 돌연변이가 발생한 변이 M 도메인을 사용한 경우라도, 융합 발현된 목적 단백질의 발현 수준을 증가시키는데 기여한다고 볼 수 있다.
실시예 7: 비당화 단백질 ( unglycosylated protein)의 낮은 발현수준과 ER-관련 분해와의 관련성 시험
비당화 단백질 (unglycosylated protein)의 발현수준이 낮은 것이 ER-associated degradation과 관련 있는지 여부를 시험하였다. 결론적으로 비당화 단백질의 낮은 발현 수준은 ER-associated degradation에 기인하는 것이 아님을 확인하였다.
보다 구체적으로, EeLepfM 벡터 (Leptin과 야생형 M 도메인의 융합 단백질 발현) 및 EeLepfM1234 벡터 (Leptin과 4개의 당화 위치가 모두 변이 (Gln으로 치환)된 변이 M 도메인의 융합 단백질 발현)을 각각 식물 원형질체에 형질전환 후, 18시간 또는 21 시간에 26S proteasome-mediated degradation의 억제제인 MG132 (IUPAC name: Benzyl N-[(2S)-4-methyl-1-[[(2S)-4-methyl-1-[[(2S)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]carbamate) 20μM을 원형질 배양 배지에 첨가하고, 원형질체를 각각 6 또는 3 시간 더 배양하였다.
[시험 디자인 개략도]
Figure 112018005641087-pat00002
(HAT: hours after transformation)
비교를 위하여 (양성 대조군), 원형질체를 Rbcs[T4,7A]:GFP로 형질전환킨 후, 18 시간에 MG132로 처리하고 추가로 6 시간동안 배양하였다. Rbcs[T4,7A]:GFP는 GFP 융합체로서, 엽록체로의 단백질 도입에 결함이 있는 RbcS 전달 펩타이드의 돌연변이 형태를 발현하고, 세포질 내 26S 프로테아좀에 의해 유비퀴틴화되고 분해된다.
형질전환 후 24시간째에 형질전환된 원형질체로부터 단백질을 추출하고, 항-HA 항체 또는 항-GFP 항체를 이용한 Western blotting을 수행하여 상기 단백질 추출물을 분석하였다.
상기 얻어진 Western blotting 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, RbcS[T4,7A]:GFP의 발현 수준은, MG132의 미처리시와 비교하여, 처리시에 더 높았으며, 이러한 결과는 본 실시예의 시험 조건 하에서 MG132가 26S 프로테아좀-의존성 단백질 분해를 억제함을 보여준다. 그러나 EeLepfM과 EeLepfM1234 단백질 발현 수준은 MG132 처리에 관계없이 차이가 없었으며, 이는 ER-associated degradation이 N-당화된 EeLepfM과 비당화된 EeLepfM1234의 단백질 발현에 역할을 하지 않음을 보여준다.
실시예 8: 목적 단백질 자체의 N- glycosylation과 M 도메인의 N-glycosylation이 목적 단백질 발현에 미치는 효과 시험
목적 단백질이 N-glycosylation site을 내재적으로 포함하여 그 자체로 N-glycosylation 가능한 경우, M 도메인과 융합되지 않고 목적 단백질 자체의 N-glycosylation되는 경우에도 목적 단백질의 발현 수준이 증가되는지 확인하였다.
이를 위하여, 앞선 실시예들을 참조하여, Leptin 단백질을 대신하여 LIF (Leukemia inhibitory factor; 서열번호 17; 코딩 핵산 서열: 서열번호 16; EeLiff; 내재적으로 6개의 N-glycosylation site가 있음)를 사용하여, M domain이 융합되거나 융합되지 않은 LIF (EeLiff)을 발현하는 재조합 벡터를 구축하고, 식물 원형질체에 형질전환시키고, 24시간 후에 단백질을 추출하여 웨스턴블랏팅을 수행하여 단백질 발현 수준을 측정하였다.
상기 얻어진 단백질 발현 수준을 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난바와 같이, M domain이 융합되지 않은 EeLiff와 비교하여, M domain이 융합된 EeLiffM의 발현 수준이 월등히 높은 것을 알 수 있다 (RbcL: loading control). 이러한 결과는 목적 단백질에 내재하는 N-glycosylation 위치에서의 N-glycosylation은 목적 단백질의 발현 수준에 영향을 미치지 않는 반면, 목적 단백질과 융합되는 융합 파트너인 M domain의 N-glycosylation이 목적 단백질의 발현수준에 중요한 역할을 하는 것임을 보여준다.
실시예 9: M 도메인의 일부 또는 M 도메인의 연장부와 융합된 융합 단백질의 발현 수준
목적 단백질(Leptin)이 M 도메인의 일부 또는 연장부와 융합된 융합 단백질의 발현 수준을 시험하였다. 이를 위하여, 실시예 2의 방법을 참조하여, 목적단백질과 M 도메인 (서열번호 2; 총 60aa)의 41-60 위치의 20개 아미노산 길이의 단편 (서열번호 6)이 융합된 융합 단백질 (EeLepfM20; N-당화 위치 1개 (N4: 46번째 위치의 Asn) 포함), 21-60 위치의 40개 아미노산 길이의 단편 (서열번호 7)이 융합된 융합 단백질 (EeLepfM40; M 도메인의 N-당화 위치 3개 (N2: 30번째 위치의 Asn; N3: 40번째 위치의 Asn; 및 N4: 46번째 위치의 Asn) 포함), M 도메인 (서열번호 2)과 융합된 융합 단백질(EeLepfM60), 및 CD45 (서열번호 5)에 있어서, 서열번호 2의 M 도메인의 N 말단쪽 및 C 말단쪽으로 각각 10개 아미노산만큼 연장된 총 80개 아미노산 길이의 단편 (서열번호 8)이 융합된 융합 단백질 (EeLepfM80)을 식물 세포의 원형질체에 도입하여 각각 발현시킨 후, 단백질을 추출하여 웨스턴블랏팅으로 발현량을 측정하였다. 비교를 위하여, M domain이 융합되지 않은 EeLepf의 발현 수준도 하게 측정하였다.
상기 얻어진 단백질 발현 수준을 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, EeLepfM20, EeLepfM40, EeLepfM60, 및 EeLepfM80는 모두 EeLepf보다 높은 발현 수준을 나타내었다 (EeLepf << EeLepfM20 < EeLepfM40 ≒ EeLepfM ≒ EeLepfM80).
실시예 10: M 도메인 또는 다양한 M 도메인 변이체의 융합에 따른 전사수준 시험
식물 세포 (참조예 1)를 야생형 (변이되지 않은) M 도메인 또는 N-당화부위가 각각 변이된 다양한 M 도메인 변이체와 leptin이 각각 융합된 융합 단백질의 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 각각 형질전환시키고, 1일 후에 전체 RNA를 추출하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 구체적 방법은 참고예 4에 기재하였다.
상기와 같이 얻어진 RNA 수준을 도 11에 나타내었다. 도 11은 야생형 (변이되지 않은) M 도메인 (i.e., fully glycosylated)과 leptin 융합된 경우의 mRNA 양 (=1)에 대한 각각의 M 도메인 변이체가 융합된 경우의 mRNA양의 상대치의 평균을 나타낸 것이다 (Error bar, SD (n=3 for M to 14; n=2 for 23 to 1234)). Student's t-test 결과, p 값이 0.05이상으로 M 도메인 융합된 leptin과 변이된 M 도메인이 융합된 leptin들간의 mRNA양의 차이는 없었다. 이 결과는 M 도메인의 융합에 의한 발현증가가 전사 (transcription) 증가에 의한 mRNA 양의 증가에 기인하는 것이 아님을 의미하며, mRNA로부터 단백질로의 번역 (translation)의 촉진에 기인하는 것임을 제안한다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Recombinant vector for expressing target protein <130> DPP20174426KR <150> 10-2017-0008160 <151> 2017-01-17 <160> 53 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M domain coding nucleic acid sequence <400> 1 gcaaacatca ctgtggatta cttatataac aaggaaacta aattatttac agcaaagcta 60 aatgttaatg agaatgtgga atgtggaaac aatacttgca caaacaatga ggtgcataac 120 cttacagaat gtaaaaatgc gtctgtttcc atatctcata attcatgtac tgctcctgat 180 180 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M domain <400> 2 Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr 20 25 30 Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser 35 40 45 Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala Pro Asp 50 55 60 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M17 <400> 3 ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21 <210> 4 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP(chaperone binding protein) coding nucleic acid sequecne <400> 4 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273 <210> 5 <211> 1304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD45 <400> 5 Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp 1 5 10 15 Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu 35 40 45 Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu 50 55 60 Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser 65 70 75 80 Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr 85 90 95 Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp 100 105 110 Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser 115 120 125 Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser 130 135 140 Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro 145 150 155 160 Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala 165 170 175 Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser 180 185 190 Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly 195 200 205 Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro 210 215 220 Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val 245 250 255 Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr 260 265 270 Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala 275 280 285 Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe 290 295 300 Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys 305 310 315 320 Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile 325 330 335 Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile 340 345 350 Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu 355 360 365 Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys 370 375 380 Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser 385 390 395 400 Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser 405 410 415 Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys 420 425 430 Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys 435 440 445 Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 450 455 460 Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser 465 470 475 480 Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp 485 490 495 Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro 500 505 510 His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg 515 520 525 Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr 530 535 540 Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro 545 550 555 560 Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala 565 570 575 Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu 580 585 590 Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys 595 600 605 Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln 610 615 620 Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr 625 630 635 640 Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln 645 650 655 Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys 660 665 670 Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp 675 680 685 Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn 690 695 700 Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr 705 710 715 720 Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg 725 730 735 Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys 740 745 750 Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu 755 760 765 Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His 770 775 780 Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys 785 790 795 800 Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser 805 810 815 Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu 820 825 830 Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val 835 840 845 Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile 850 855 860 Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr 865 870 875 880 Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val 885 890 895 Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln 900 905 910 Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His 915 920 925 Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala 930 935 940 Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile 945 950 955 960 Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile 965 970 975 Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser 980 985 990 Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp 995 1000 1005 Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser Tyr 1010 1015 1020 Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Glu Thr 1025 1030 1035 1040 Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys Val Ile 1045 1050 1055 Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln 1060 1065 1070 Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu 1075 1080 1085 Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu 1090 1095 1100 Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr 1105 1110 1115 1120 Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile 1125 1130 1135 Ser Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser 1140 1145 1150 Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg 1155 1160 1165 Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu 1170 1175 1180 Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys 1185 1190 1195 1200 Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr 1205 1210 1215 Gln Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly 1220 1225 1230 Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn 1235 1240 1245 Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly 1250 1255 1260 Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser Glu 1265 1270 1275 1280 Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala 1285 1290 1295 Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser 1300 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of M domain <400> 6 Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys 1 5 10 15 Thr Ala Pro Asp 20 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of M domain <400> 7 Asn Val Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn 1 5 10 15 Glu Val His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser 20 25 30 His Asn Ser Cys Thr Ala Pro Asp 35 40 <210> 8 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended M domain <400> 8 Pro Ser Lys Pro Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val 20 25 30 Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val 35 40 45 His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn 50 55 60 Ser Cys Thr Ala Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly 65 70 75 80 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDEL coding nucleic acid sequecne <400> 9 cacgatgagc tc 12 <210> 10 <211> 1010 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant vector BiP:Leptin:M <400> 10 tctagaggcg tgtgtgtgtg ttaaagaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300 ggatccaaga tgatgatgat aaggtgccta tccagaaagt ccaggatggc accaaagccc 360 tcatcaagac cattgtcacc aggatcaatg acatttcaca cacgcagtcg gtatccgcca 420 agcagagggt cactggcttg gacttcattc ctgggcttca ccccattctg agtttgtcca 480 agatggacca gactctggca gtctatcaac aggtcctcac cagcctgcct tcccaaaatg 540 tgctgcagat agccaatgac ctggagaatc tccgagacct cctccatctg ctggccttct 600 ccaagagctg ctccctgcct cagaccagtg gcctgcagaa gccagagagc ctggatggcg 660 tcctggaagc ctcactctac tccacagagg tggtggcttt gagcaggctg cagggctctc 720 tgcaggacat tcttcaacag ttggatgtta gccctgaatg ccgtgtcagg cgaactagtg 780 caaacatcac tgtggattac ttatataaca aggaaactaa attatttaca gcaaagctaa 840 atgttaatga gaatgtggaa tgtggaaaca atacttgcac aaacaatgag gtgcataacc 900 ttacagaatg taaaaatgcg tctgtttcca tatctcataa ttcatgtact gctcctgatt 960 acccatacga tgttccagat tacgcttccc acgatgagct ctagctcgag 1010 <210> 11 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aprotinin coding nucleic acid sequecne <400> 11 cgaccggact tctgtcttga acctccttac acaggtcctt gcaaagctag aattatcagg 60 tatttttaca atgctaaggc aggactttgt caaacttttg tttacggggg atgtagagcg 120 aaacgtaaca atttcaagtc tgcagaggat tgtatgagaa cctgcggcgg tgcc 174 <210> 12 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cab transit peptide coding nucleic acid sequecne <400> 12 atggcgtcga actcgcttat gagctgtggc atagccgccg tgtacccttc gcttctctct 60 tcttccaagt ctaaattcgt atccgccgga gttccactcc caaacgccgg gaatgttggt 120 cgtatcagaa tggctgctca ctggatgcct ggcgagccac gaccagctta ccttgacggt 180 tctgctcctg gtgactttgg gtttgaccca cttggacttg gagaagttcc agcgaacctt 240 gagagataca aagagtcaga g 261 <210> 13 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1-ATPase gamma subunit presequence coding nucleic acid sequecne <400> 13 atggcaatgg ctgttttccg tcgcgaaggg aggcgtctcc tcccttcaat cgccgctcgc 60 ccaatcgctg ctatccgatc tcctctctct tctgaccagg aggaaggact tcttggagtt 120 cgatctatct caactcaagt ggtgcgtaac cgcatgaaga gtgttaagaa catccaaaag 180 atcacaaagg caatgaagat ggttgctgct tccaagctta gagcagttca g 231 <210> 14 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-domain coding nucleic acid sequecne <400> 14 gggggcaact ggacatgtgt gaaaggtgaa ccagtggtct acacgggggg gctagtaaaa 60 caatgcagat ggtgtggctt tgacttcaat gagcctgacg gactcccaca ctaccccata 120 ggtaagtgca ttttggcaaa tgagacaggt tacagaatag tggattcaac agactgtaac 180 agagatggtg ttgtaatcag cacagagggg agtcatgagt gcttgatcgg taacacgact 240 gtcaaggtgc atgcatcaga tgaaagactg ggccccatgc catgcagacc taaagagatc 300 gtctctagtg caggacctgt aaggaaaact tcctgtacat tcaactacgc aaaaactttg 360 aagaacaagt actatgagcc cagggacagc tacttccagc aatatatgct taagggcgag 420 tatcagtact ggtttgacct ggacgtgact gaccgccact cagattactt cgcagaagga 480 480 <210> 15 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP coding nucleic acid sequecne <400> 15 gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180 gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420 ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600 ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714 <210> 16 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIF coding nucleic acid sequecne <400> 16 atgagccccc tccccatcac ccctgtcaac gccacctgtg ccatacgcca cccatgtcac 60 aacaacctca tgaaccagat caggagccaa ctggcacagc tcaatggcag tgccaatgcc 120 ctctttattc tctattacac agcccagggg gagccgttcc ccaacaacct ggacaagcta 180 tgtggcccca acgtgacgga cttcccgccc ttccacgcca acggcacgga gaaggccaag 240 ctggtggagc tgtaccgcat agtcgtgtac cttggcacct ccctgggcaa catcacccgc 300 gaccagaaga tcctcaaccc cagtgccctc agcctccaca gcaagctcaa cgccaccgcc 360 gacatcctgc gaggcctcct tagcaacgtg ctgtgccgcc tgtgcagcaa gtaccacgtg 420 ggccatgtgg acgtgaccta cggccctgac acctcgggta aggatgtctt ccagaagaag 480 aagctgggct gtcaactcct ggggaagtat aagcagatca tcgccgtgtt ggcccaggcc 540 ttc 543 <210> 17 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LIF <400> 17 Met Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile Arg 1 5 10 15 His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile Arg Ser Gln Leu Ala 20 25 30 Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Tyr Thr Ala 35 40 45 Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys Leu Cys Gly Pro Asn 50 55 60 Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly Thr Glu Lys Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu Gly Thr Ser Leu Gly 85 90 95 Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro Ser Ala Leu Ser Leu 100 105 110 His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu Arg Gly Leu Leu Ser 115 120 125 Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His Val Gly His Val Asp 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp Val Phe Gln Lys Lys 145 150 155 160 Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Val 165 170 175 Leu Ala Gln Ala Phe 180 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-Ek-leptin-F primer <400> 18 ggatccaaga tgatgatgat aaggtgccta tccagaaagt ccaggat 47 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin-furin-SpeI-R primer <400> 19 actagttcgc ctgacacggc attcagggct aacatccaac tg 42 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspt-R primer <400> 20 gaattcctta tctttaatca tatt 24 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-3-HA-HDEL-F primer <400> 21 tcataattca tgtactgctc ctgattaccc atacgatgtt ccagattacg cttcccacga 60 tgagctctag ctcgagatat gaagatgaag atgaaatatt 100 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-2-F primer <400> 22 aatgtggaaa caatacttgc acaaacaatg aggtgcataa ccttacagaa tgtaaaaatg 60 cgtctgtttc catatctcat aattcatgta ctgctcctga 100 <210> 23 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI-M-1-F primer <400> 23 actagtgcaa acatcactgt ggattactta tataacaagg aaactaaatt atttacagca 60 aagctaaatg ttaatgagaa tgtggaatgt ggaaacaata cttgcacaa 109 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI-HA-F primer <400> 24 actagttacc catacgatgt tccagattac 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-Cab-F primer <400> 25 tctagaatgg cgtcgaactc gcttatgagc 30 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cab-BamHI-R primer <400> 26 ggatcctctc tgactctttg ta 22 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-F1-F primer <400> 27 tctagaatgg caatggctgt tttccgtcgc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1-BamHI-R primer <400> 28 ggatcctctg aactgctcta agcttggaag 30 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI-M-F primer <400> 29 actagtgcaa acatcactgt ggat 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI-M-N2Q-F primer <400> 30 actagtgcac aaatcactgt ggat 24 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N30Q-F primer <400> 31 gtggaatgtg gacaaaatac ttgcaca 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N30Q-R primer <400> 32 tgtgcaagta ttttgtccac attccac 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N40Q-F primer <400> 33 aatgaggtgc atcaacttac agaatgt 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N40Q-R primer <400> 34 acattctgta agttgatgca cctcatt 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N46Q-F <400> 35 acagaatgta aacaagcgtc tgtttcc 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N46Q-R primer <400> 36 ggaaacagac gcttgtttac attctgt 27 <210> 37 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N40,46Q-F primer <400> 37 aacaatgagg tgcatcaact tacagaatgt aaacaagcgt ctgtttccat a 51 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-N40,46Q-R primer <400> 38 tatggaaaca gacgcttgtt tacattctgt aagttgatgc acctcattgt t 51 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-M-F primer <400> 39 ggatcccgat ggcaaacatc actgtggatt actta 35 <210> 40 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-GS2-SpeI-R primer <400> 40 actagttgat ccaccaccag acccacctcc accatcagga gcagtacatg aattat 56 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-Ek-Apro primer <400> 41 ggatcccgga tgacgacgat aagcgaccgg ac 32 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-ek-Apr-F primer <400> 42 ggatccaaga tgatgatgat aagcgaccgg ac 32 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Apr-fu-SpeI-R primer <400> 43 actagttcgc ctgacacggg caccgccgca ggttctcata ca 42 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-HDEL-stop-XhoI-R primer <400> 44 ctcgagctag agctcatcgt gcttgtacag ctcgtccatg ccgag 45 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-fu-SpeI-R primer <400> 45 actagttcgc ctgacacgct tgtacagctc gtccatgccg ag 42 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeI-ek-GFP-F primer <400> 46 actagtgatg acgacgatag gtgagcaag 29 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtACT2-5 primer <400> 47 tatgaattac ccgatgggca ag 22 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtACT2-3 primer <400> 48 tggaacaaga cttctgggca t 21 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin- F-qRT1-F primer <400> 49 tcggtatccg ccaagcagtg cctatccaga aagtcca 37 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin- R-qRT1-R primer <400> 50 ggtgaagccc aggaatgaag gcattcaggg ctaacatcca 40 <210> 51 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 <400> 51 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 <400> 52 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 53 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin coding nucleic acid sequence <400> 53 gtgcctatcc agaaagtcca ggatggcacc aaagccctca tcaagaccat tgtcaccagg 60 atcaatgaca tttcacacac gcagtcggta tccgccaagc agagggtcac tggcttggac 120 ttcattcctg ggcttcaccc cattctgagt ttgtccaaga tggaccagac tctggcagtc 180 tatcaacagg tcctcaccag cctgccttcc caaaatgtgc tgcagatagc caatgacctg 240 gagaatctcc gagacctcct ccatctgctg gccttctcca agagctgctc cctgcctcag 300 accagtggcc tgcagaagcc agagagcctg gatggcgtcc tggaagcctc actctactcc 360 acagaggtgg tggctttgag caggctgcag ggctctctgc aggacattct tcaacagttg 420 gatgttagcc ctgaatgc 438

Claims (18)

  1. 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 N-당화 (N-glycosylation) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터,
    상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및
    상기 재조합 세포를 포함하는 형질전환 유기체
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 목적 단백질 생산용 조성물로서,
    상기 N-당화 도메인은 서열번호 2의 인간 CD45 유래 M 도메인(M domain) 또는 상기 M 도메인의 일부를 포함하는, 서열번호 1의 인간 CD45 단백질 내의 연속하는 10 내지 100개 아미노산 길이의 폴리펩타이드이고,
    상기 M 도메인의 일부는 서열번호 2의 2번째 위치의 Asn, 30번째 위치의 Asn, 40번째 위치의 Asn, 및 46번째 위치의 Asn 중에서 선택된 하나 이상의 N-당화 위치를 포함하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편인
    목적 단백질 생산용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 M 도메인의 일부는 "LTECKNASVS ISHNSCTAPD (서열번호 6)" 또는 "NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVS ISHNSCTAPD (서열번호 7)")를 포함하는, 서열번호 2 내의 연속하는 20개 내지 60개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드 단편인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 M 도메인의 일부는 "NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVS ISHNSCTAPD (서열번호 7)")를 포함하는, 서열번호 2 내의 연속하는 40개 내지 60개의 아미노산 길이의 폴리펩타이드 단편인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  5. 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 목적 단백질과 N-당화 도메인 사이에 펩타이드 링커를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  6. 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 소포체로 표적화되는 것인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  7. 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 코딩 유전자, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드 코딩 유전자, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  8. 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 식물 세포이고, 상기 유기체는 식물인, 목적 단백질 생산용 조성물.
  9. 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 N-당화(N-glycosylation) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현용 재조합 벡터로서,
    상기 N-당화 도메인은 서열번호 2의 인간 CD45 유래 M 도메인(M domain) 또는 상기 M 도메인의 일부를 포함하는, 서열번호 1의 인간 CD45 단백질 내의 연속하는 10 내지 100개 아미노산 길이의 폴리펩타이드이고,
    상기 M 도메인의 일부는 서열번호 2의 2번째 위치의 Asn, 30번째 위치의 Asn, 40번째 위치의 Asn, 및 46번째 위치의 Asn 중에서 선택된 하나 이상의 N-당화 위치를 포함하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편인
    목적 단백질 발현용 재조합 벡터.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 목적 단백질과 N-당화 도메인 사이에 펩타이드 링커를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질 발현용 재조합 벡터.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 소포체로 표적화되는 것인, 목적 단백질 발현용 재조합 벡터.
  12. 제9항에 있어서,
    BiP(chaperone binding protein) 코딩 유전자, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드 코딩 유전자, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는, 목적 단백질 발현용 재조합 벡터.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    식물 세포에서의 발현에 사용하기 위한 것인, 목적 단백질 발현용 재조합 벡터.
  14. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
  15. 제14항의 재조합 세포를 포함하는 형질전환 유기체.
  16. 제14항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    목적 단백질의 생산방법.
  17. 제15항의 형질전환 유기체를 성장시키는 단계를 포함하는, 목적 단백질의생산 방법.
  18. N-당화 도메인을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하고,
    상기 N-당화 도메인은 서열번호 2의 인간 CD45 유래 M 도메인(M domain) 또는 상기 M 도메인의 일부를 포함하는, 서열번호 1의 인간 CD45 단백질 내의 연속하는 10 내지 100개 아미노산 길이의 폴리펩타이드이고,
    상기 M 도메인의 일부는 서열번호 2의 2번째 위치의 Asn, 30번째 위치의 Asn, 40번째 위치의 Asn, 및 46번째 위치의 Asn 중에서 선택된 하나 이상의 N-당화 위치를 포함하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편인,
    단백질 발현용 조성물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210123235A (ko) * 2020-04-02 2021-10-13 조선대학교산학협력단 코로나바이러스 감염증­１９의 치료제로서 ａｃｅ２의 용도
WO2023085582A1 (ko) * 2021-11-09 2023-05-19 포항공과대학교 산학협력단 식물에서 재조합 단백질 발현의 증진에 있어서 gb1 도메인 융합의 효과

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102138272B1 (ko) * 2018-09-19 2020-07-28 주식회사 바이오앱 BiP 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법
KR102250576B1 (ko) 2018-11-15 2021-05-12 주식회사 바이오앱 식물 발현 시스템에서 캡시드 단백질의 발현을 증가시키는 재조합 벡터 및 이를 이용한 바이러스-유사 입자의 제조방법
KR102288367B1 (ko) 2018-11-15 2021-08-11 주식회사 바이오앱 식물체에서 바이러스-유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 써코바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법
WO2020101187A1 (ko) 2018-11-15 2020-05-22 주식회사 바이오앱 식물체에서 바이러스-유사 입자를 발현하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 써코바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법
KR102077772B1 (ko) * 2018-11-29 2020-02-17 주식회사 바이오앱 광견병 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법
US20200354726A1 (en) * 2019-03-22 2020-11-12 Biocompanion Inc. Method of mass-producing carbonic anhydrase in plant
KR102209198B1 (ko) * 2019-04-02 2021-02-02 주식회사 바이오앱 식물에서의 발현이 최적화된 재조합 이리신 유전자 및 이를 이용한 재조합 이리신 단백질의 생산 방법
KR102213745B1 (ko) * 2019-04-16 2021-02-09 주식회사 바이오앱 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법
WO2020256374A1 (ko) * 2019-06-17 2020-12-24 주식회사 바이오앱 아프리카 돼지열병의 예방을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도
KR102643810B1 (ko) 2020-03-20 2024-03-06 포항공과대학교 산학협력단 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101449155B1 (ko) * 2012-12-06 2014-10-13 주식회사 바이오앱 식물체에서 목적 단백질의 번역 효율을 증진시키기 위한 염기서열

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070161087A1 (en) * 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
JP4872327B2 (ja) * 2004-11-26 2012-02-08 東レ株式会社 改質されたインターロイキン−１１とその製造方法
JP2009515520A (ja) * 2005-11-10 2009-04-16 レセプター バイオロジックス， インコーポレイテッド 肝細胞成長因子イントロン融合蛋白
US20200354726A1 (en) * 2019-03-22 2020-11-12 Biocompanion Inc. Method of mass-producing carbonic anhydrase in plant

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101449155B1 (ko) * 2012-12-06 2014-10-13 주식회사 바이오앱 식물체에서 목적 단백질의 번역 효율을 증진시키기 위한 염기서열

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Glycobiology. Vol. 21, No. 6, 페이지 813-823 (2011.02.11.)*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210123235A (ko) * 2020-04-02 2021-10-13 조선대학교산학협력단 코로나바이러스 감염증­１９의 치료제로서 ａｃｅ２의 용도
KR102508238B1 (ko) * 2020-04-02 2023-03-09 조선대학교산학협력단 코로나바이러스 감염증­１９의 치료제로서 ａｃｅ２의 용도
WO2023085582A1 (ko) * 2021-11-09 2023-05-19 포항공과대학교 산학협력단 식물에서 재조합 단백질 발현의 증진에 있어서 gb1 도메인 융합의 효과

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