KR102021176B1

KR102021176B1 - 검사용 단일클론항체 및 이를 이용한 검사 키트

Info

Publication number: KR102021176B1
Application number: KR1020170034834A
Authority: KR
Inventors: 노부오 미야사키; 토모야 코다마; 임봉수
Original assignee: 주식회사 솔포투
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2019-11-05
Also published as: KR20170114247A

Abstract

넙치 등의 물고기로부터 직접 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로 검출할 수 있는 단일클론항체, 검사도구 및 검사 키트를 제공한다. 쿠도아속 점액포자충의 포자를 동결해 융해하는 것으로 해당 포자껍질 및 포자 내부의 세포를 파괴해, 해당 세포를 구성하는 단백질을 취득해, 이것을 항원으로서 제작한 단일클론항체는, 쿠도아 셉템푼타타등의 쿠도아속 점액포자충의 내부 구조를 구성하는 단백질과 결합하므로, 포자가 미형성의 쿠도아속 점액포자충도 존재하는 넙치 등의 어육으로부터, 직접 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로 검출할 수 있다. 해당 단일클론항체를 이용한 검사 키트는은, 나사 등의 원주방향의 홈 막대로 만들어지는 채취도구를 구비하고 있으므로, 대량의 넙치 등의 어류의 검사를 할 수 있다.

Description

검사용 단일클론항체 및 이를 이용한 검사 키트{Monoclonal antibody and inspection Kit.}

본 발명은, 어류의 기생충인 쿠도아속　점액포자충을 검출할 수 있는 단일클론항체, 해당 단일클론항체를 이용한 검사도구(면역크로마트 시험편, ELISA법검사도구) 및 해당 검사도구를 갖춘 검사 키트에 관한 것이다.

어육에 기생하는 쿠도아속 점액포자충 안에는 사람에게로의 병원성이 있어, 식중독의 원인이 되는 것이 있다. 예를 들면, 넙치 생식에 의해 일어나는 식중독은, 넙치에 기생하는 쿠도아속 점액 포자충의 일종인 쿠도아 셉템푼타타(Kudoa septempunctata)가 원인이라고 알려져 있다. 이러한 쿠도아속 점액포자충은 어육 속에서 포자를 형성하지만, 어육 속에는 포자를 형성하고 있지 않는 쿠도아속 점액 포자충도 존재한다. 또, 넙치육인 경우에는, 쿠도아 셉템푼타타 외에, 쿠도아속 점액포자충이며, 사람에게로의 병원성이 없는 쿠도아 티르시테스(Kudoa thyrsites), 쿠도아 라테오라브라시스(Kudoa lateolabracis)가 기생하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 이러한 쿠도아속 점액포자충의 검사에서는, 포자 미형성의 해당 포자충도 검출할 수 있고 더불어 넙치육의 경우에는, 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스를 구별하여, 쿠도아 셉템푼타타를, 식중독 방지를 위해 선택적으로 검출할 수 있도록 하는 것이 필요하다.

(종래 기술)

쿠도아속 점액포자충에 의한 식중독의 검사법으로서는, 넙치육에 기생하는 쿠도아 셉템푼타타의 검출을 하는 검사가 알려져 있고 컨벤션 PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 RNA를 이용한 정량적 RT(Reverse Transcription) - PCR에 의한 방법(비특허 문헌 1 참조), 리얼타임 PCR에 의한 방법(비특허 문헌 2 참조)이나 단일클론항체를 검사 시약으로 이용하는 방법(특허 문헌 1 참조)이 알려져 있다.

그러나, PCR법(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2)에 따른 방법은 DNA의 증폭기가 필요하고, 검사도 판정에는 수시간에 걸친 장시간을 필요로 한다.

면역 학문적 측정 방법을 이용하는 쿠도아 셉템푼타타의 검사법에 대해서는, 단일클론항체를 검사 시약으로 이용하는 방법이 특허 문헌 1에 개시되어 있다. 특허 문헌 1의 방법은 면역 학문적 측정 방법 중, 면역크로마트 그래프법을 채용하는 것으로, 단시간에 검사할 수 있고 장치도 면역크로마트 그래프용 검사도구(이하 「면역크로마트 시험편」이라고 한다. ) 를 사용하기 때문에 간편하다. 특허 문헌 1의 검사 방법은, 쿠도아 셉템푼타타 포자를 검출하는 방법이므로, 쿠도아 셉템푼타타 포자의 존재가 필요하다. 넙치에 감염된 쿠도아 셉템푼타타에서는, 앞서 기술한 바와 같이, 포자 상태 즉 포자의 껍질로 포자가 덮여 있는 상태 뿐만이 아니라, 포자껍질이 미형성 상태의 것도 다수 존재하고 있으므로, 넙치육에서 쿠도아 셉템푼타타를 검출하기 위해서는, 포자껍질이 미형성의 것도 검출해야만 한다 . 그러나, 특허 문헌 1과 관련되는 검사 방법 및 이것에 이용되는 단일클론항체는, 넙치육으로부터 쿠도아 셉템푼타타 포자를 추출해, 정제 한 후, 해당 포자 상태로 검사를 해야 한다. 따라서, 포자가 미형성인 쿠도아 셉템푼타타도 존재하는 넙치육에서는 직접 쿠도아 셉템푼타타를 검출할 수 없다. 또, 해당 단일클론항체는, 쿠도아 셉템푼타타에 반응할 뿐만 아니라, 넙치의 근육에 기생해 사람에게로의 병원성은 없는 쿠도아 티르시테스에도 반응성을 나타내므로, 넙치육에서, 쿠도아 티르시테스와 구별하여, 쿠도아 셉템푼타타를 선택적(이하 「특이적」이라고 한다. ) 으로 검출할 수 없다.

대량의 넙치에 대해 쿠도아 셉템푼타타의 검사를 단시간에 실시하는 경우에는, 넙치로부터 간단하고 쉽고 신속히 넙치육을 채취해, 해당 넙치육으로부터 직접, 간편하게 쿠도아 셉템푼타타를 검출할 필요가 있지만, 특허 문헌 1등에는 이것에 관한 검사도구 및 검사 키트에 대해서는 기재되어 있지 않고, 대량의 넙치의 검사를 하는 검사도구나 검사 키트의 제공을 과제로 하고 있다.

(과제 1)

종래의 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충의 검사에 이용되는 단일클론항체는, 쿠도아속 점액포자충의 포자를 간편하고 특이적으로 검출할 수 있다. 그러나 해당 단일클론항체는, 포자가 미형성인 쿠도아속 점액포자충이 기생하는 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을 직접적으로 검출하는 것이 곤란했다. 또, 넙치의 경우에는, 해당 단일클론항체로는, 사람에게 병원성이 없는 쿠도아 티르시테스와 구별하여 식중독을 일으키는 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출하는 것도 곤란했다. 따라서, 종래 기술에서 해결해야 할 과제가 되는 문제는, (I) 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충의 검사에 이용되는 단일클론항체가, 포자가 미형성인 쿠도아속 점액 포자충에는 반응하지 않아 포자가 미형성의 쿠도아속 점액포자충을 포함한 쿠도아속 점액 포자충에 감염된 넙치 등의 어육으로부터 직접 쿠도아속 점액포자충을 검출할 수 없는 것, (II) 넙치의 경우에, 쿠도아 티르시테스에도 반응성을 나타내, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응하지 않는 것이다.

(과제 2)

종래의 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충의 검사에는, 앞서 기술한 종래의 단일클론항체를 이용한 검사도구나 검사 키트를을 사용하므로, 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충의 포자를 분리해 정제 하지 않으면 안되며, 어육을 직접적으로 검사에 사용을 할 수 없기 때문에, 대량의 물고기의 검사를 할 수 없었다. 또 검사의 채취도구도, 대량의 검사에 적절한 것이 없었다. 따라서, 종래 기술에서 해결해야 할 과제는, 쿠도아속 점액포자충의 검사에 사용되는 검사 키트가이 쿠도아속 점액포자충에 감염된 물고기로부터 간단하고 쉽고 신속히 어육을 채취할 수 없는 것 및 쿠도아속 점액포자충이 기생하고 있는 어육으로부터 직접, 특이적으로 검출할 수 없는 것으로 인해, 대량의 물고기로부터 단시간에 쿠도아속 점액포자충을 검출하는 검사를 할 수 없는 것이다.

본 발명자 등은, 이하의(1)~(5)의 공정을 포함해 이루어지는 방법을 통해 제작되는 단일클론항체가, 상기 과제 1을 해결할 수 있는 방법을 찾아냈다.

(1) (항원 단백질 조정 공정) 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을 분리해, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자를 포함한 포자현탁용액을 동결해 융해하는 처리를 실시함으로써 해당 포자껍질과 해당 포자 내부의 세포를 파괴하고, 해당 세포를 구성하고 있는 단백질을 용출시킨 해당 현탁용액을 조정하는 공정,

(2) (항체생성세포 취득 공정) 공정(1)로 얻어진 단백질을 포유류 또는 조류의 동물에 1회이상 접종 해, 해당 동물의 체내에서, 해당 단백질에 반응하는 항체를 생성하는 항체생성세포를 만들어 내어 해당 항체생성세포를 해당 동물로부터 적출하는 공정,

(3) (세포 융합 공정) 공정(2)에 의해 얻어진 항체생성세포와 해당 동물과 동일한 동물 종의 골수종세포를 융합하여, 불활화 항체생성세포 A를 제작하는 공정,

(4) (스크리닝 공정) 공정(3)으로 얻어진 불활화 항체생성세포 A 중, 해당 쿠도아속 점액포자충에 유래하는 단백질을 이용하여, 해당 단백질에 반응하는 불활화 항체생성세포 B를 선별하는 공정,

(5) (클로닝 공정) 공정(4)에서 선별한 불활화 항체생성세포 B를 단일의 세포로서 분리한(이하 「클론화」라고 한다. ) 후, 해당 세포에 단일클론항체를 생성시키는 공정.

공정(1)에서, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자(포자를 인산 완충 생리 식염수(이하 「PBS」라고 한다. )로 현탁시킨 포자현탁용액)를 동결해 융해함으로써 해당 포자껍질과 포자 내부의 세포를 파괴할 수 있다. 이 포자껍질의 파괴를 함으로써, 해당 포자껍질로 덮여 있던 쿠도아속 점액포자충의 내부 구조를 해당 현탁용액 중에 노출시켜, 다시 해당 동결과 융해에 의해, 해당 내부 구조에 포함되는 세포가 파괴되어 해당 세포를 구성하고 있는 단백질을 해당 현탁용액 속에 용출시켜, 공정(2)에서의 동물에 접종(면역)을 위한 항원이 되는 해당 단백질(이하 「항원 단백질」이라고 한다.) 을 포함한 현탁용액을 조정할 수 있다. 공정(1)으로 얻어지는 항원 단백질은, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자의 내부의 구조에 유래하는 단백질이다.

본 발명과 관련되는 단일클론항체는, 해당 단백질을 항원으로서 공정(2)에 있어서 해당 동물에 접종해 얻어진 항체생성세포를 불활화하고, 클론화하여 얻어진 불활화 항체생성세포가 생성하는 항체이므로, 해당 단일클론항체는 해당 항원 단백질에 반응한다. 따라서, 본 발명과 관련되는 단일클론항체는, 포자(껍질)가 미형성인 해당 쿠도아속 점액포자충, 즉 그 내부 구조가 노출하고 있는 해당 쿠도아속 점액포자충에 반응한다. 그 때문에, 해당 공정에 의해 제작된 단일클론항체는, 포자(껍질)가 미형성인 해당 쿠도아속 점액포자충 포함한 해당 쿠도아속 점액 포자충에 오염된 어육으로부터 포자의 추출이나 정제를 하는 일 없이, 직접, 해당 쿠도아속 점액포자충을 검출할 수 있다.

공정(1)에서, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자를 동결해 융해하는 처리를 한 후, 해당 현탁용액에 계면활성제를 더해 가용화 처리를 행하는 것으로, 해당 포자껍질과 세포 내부의 세포를 구성하고 있는 단백질과 계면활성제가 결합해, 해당 용액 속에서 미셀(meicelle)을 형성하고, 해당 미셀로부터 공정(2)에서의 동물에 접종(면역)을 위한 항원이 되는 해당 단백질을 얻을 수 있다.

공정(1)에서, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자를 동결해 융해하는 처리를 한 후, 해당 포자를 포함한 포자현탁용액에 초음파를 조사해 한층 더 해당 포자 내부의 세포를 파괴해, 해당 포자껍질과 세포를 구성해 있는 단백질을 해당 용액 속에 용출시켜, 항원이 되는 해당 항원 단백질을 얻을 수 있다. 공정(1)에 해당 가용화 처리 및 해당 초음파 조사를 추가함으로써, 해당 포자 내부의 세포에 잔존하고 있는 단백질을 더욱 해당 용액 속에 용출시키기 때문에, 해당 용액 속에 포함되는 항원 단백질의 양이 증가한다.

따라서, 공정(1)로 해당 처리 등을 더한 방법에 의해 얻어진 단백질을 동물에 접종하면, 해당 동결?융해 처리만의 경우보다, 쿠도아속 점액포자충의 포자의 내부 구조의 세포를 구성하는 단백질에 반응하는 항체를 생성하는 항체생성세포를 쉽게 얻을 수 있게 되고, 포자가 미형성인 쿠도아속 점액포자충에 반응하는 단일클론항체를 쉽게 얻을 수 있게 된다.

공정(1)에서, 어육이 넙치육의 경우는, 넙치육에 기생하는 쿠도아 셉템푼타타 포자를 동결하고 융해해, 해당 포자 내부의 세포를 파괴하여, 공정(2)의 항원 단백질을 얻는다.

공정(4)에서, 공정(2)로 얻어진 항체생성세포를 공정(3)에서의 불활화한 불활화생성세포 A 중, 해당쿠도아속 점액포자충에 유래하는 항원 단백질에 반응하는 불활화 항체생성세포 B를 선별하는 것으로, 해당 선별되어 공정(5)로 클론화 된 불활화생성세포 B가 산출하는 단일클론항체는, 식중독의 원인 물질인 특정의 쿠도아속 점액포자충과 특이적으로 반응하는 항체가 된다.

또, 넙치육의 경우에, 공정(4)에서, 공정(3)으로 얻어진 불활화 항체생성세포 A 중, 쿠도아 셉템푼타타에 유래하는 항원 단백질에 반응해, 쿠도아 티르시테스 및 쿠도아 라테오라브라시스에 유래하는 항원 단백질에 반응하지 않는 불활화 항체생성세포 C를 선별함으로써, 해당 선별되어 공정(5)로 클론화 된 불활화 항체생성세포 C가 산출하는 단일클론항체는, 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스와는 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에만 특이적으로 반응하기 때문에, 넙치육으로부터 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출하는 검사에 적절한 항체가 된다.

본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이용하는 검사도구는, 쿠도아 셉템푼타타 등의 해당 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로 또한 간편하게 검출할 수 있는 검사도구가 적합하다. 그러한 검사도구로서는, 공지의 면역크로마트법을 이용하는 면역크로마트 시험편 또는 공지의 ELISA법을 이용하는 ELISA법 검사도구를 들 수 있다. 어느 검사도구도 본 발명과 관련되는 2종류의 단일클론항체를 이용해 특별한 장치는 불필요하고, 해당 쿠도아속 점액포자충의 간편하고 특이적으로 검출하는 것에 적합하다.

본 발명과 관련되는 면역크로마트 시험편에서는, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 해당 쿠도아속 점액포자충에 대한 제1 및 제2의 단일클론항체로서 사용한다. 면역크로마트 시험편은, 시료가 적하되는 샘플 패드와 그 하류 측에 배치되어 표지된 제2의 단일클론항체(표지 항체)가 미리 도포되어 샘플 패드로부터 유출한 시료와 해당 표지 항체가 혼합한 복합체(conjugate)가 형성되어 전개되는 복합체 패드와 그 하류 측에 배치되어 제1의 단일클론항체(고상화 항체)가 고정된 검출부가 있는, 복합체 패드로부터 유출한 해당 복합체가 전개되는 멤브레인과 그 하류 측에 과잉인 시료나 복합체를 흡수하는 흡수 패드와 해당 샘플 패드, 멤브레인, 복합체 패드, 흡수 패드를 지지해 만들어진 벡킹 시트로 이루어진다. 해당 멤브레인의 검출부에서, 해당 고상화 항체가 해당 복합체를 구성하고 있는 시료 속에 해당 쿠도아속 점액포자충에 유래하는 항원 단백질을 반응시켜, 해당 쿠도아속 점액포자충을 검출한다.

또한 해당 면역크로마트 시험편은 전체 형상이 장방형의 시트형태이며, 시료의 공급측(샘플 패드측)과 하류 단부(흡수 패드 측)가 동일 형상이기 위해, 시료를 샘플 패드에 적하 할 경우에, 샘플 패드 측이 어느 쪽에 있는지 판별하기 어려운 경우가 있다. 그 경우에는, 샘플 패드 측과 흡수 패드 측의 단부의 형상을 다른 형상으로 변경할 수도 있다.

본 발명과 관련되는 ELISA법 검사도구는, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 사용해, 해당 단일클론항체가, 해당 쿠도아속 점액포자충에 대한 제1 및 제2의 단일클론항체며, 해당 제1의 단일클론항체가, 고정화된 플레이트와 효소에 의해 표지 된 해당 제2의 단일클론항체가 함유 된 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 ELISA법 검사도구이다.

상기의 과제2를 해결하기 위해, 본 발명과 관련되는 검사 키트는, 검체채취도구를 물고기에 삽입해, 뽑아 내는 것으로, 어육편을 물고기로부터 채취할 수 있는 검체채취도구와 채취한 해당 어육이 부착된 해당 검체채취도구를 완충액을 넣은 용기(이하 「튜브」라고 한다. ) 에 넣어 해당 튜브를 진동시켜 해당 어육을 해당 채취도구로부터 박리해, 소편화해 쿠도아속 점액포자충을 완충액에 용출시킨 샘플 용액을 균질화하는 샘플 용액 조정부와 샘플 용액을 검사도구에 공급하기 위한 샘플 용액 공급도구와 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이용해 해당 샘플 용액으로부터 쿠도아속 점액포자충을 검출하는 검사도구를 갖춘다.

해당 검체채취도구는, 검체의 어육부에 삽입해, 뽑아내는 것만으로, 어육(검체)을 물고기의 생체로부터 직접 채취할 수 있는 채취도구로 되므로, 물고기의 생체로부터 직접, 신속하고 간편하게 물고기의 육편을 채취할 수 있어 대량의 물고기의 검사를 할 수 있다.

해당 샘플 용액 조정부는, 해당 검체채취도구로 채취한 해당 어육이 부착된 해당 채취도구를 완충액을 넣은 용기에 넣고, 샘플 용액을 조정한다. 즉 해당 용기마다 상하로 흔들어, 완충액 속에서 해당 검체채취도구에 부착된 어육을 박리해, 박리한 어육은 해당 상하 진동으로 해당 검사체채취도구나 튜브의 벽과 충돌해 파쇄 되어 소편화해, 소편화된 어육은 다시 진동으로 완충액 속에서 균일하게 분산해, 샘플 용액을 균질화한다. 이것으로 어육 속의 쿠도아속 점액포자충(항원)의 완충액에 용출이 촉진된 샘플 용액을 얻을 수 있다. 그 결과, 해당 샘플 용액이 적하된 검사도구에서, 해당 검사에 이용되는 단일클론항체가, 해당 항원을 인식하기 쉬워진다.

해당 검사도구는, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이용하여, 해당 샘플 용액으로부터 쿠도아속 점액포자충을 검출할 수 있다. 본 발명과 관련되는 단일클론항체는, 포자가 미형성인 쿠도아속 점액포자충을 포함한 쿠도아속 점액포자충에 오염된 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을, 포자를 추출, 정제 하는 일 없이, 직접 및 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이것을 이용한 해당 검사도구는 쿠도아속 점액포자충을 어육으로부터 직접 및 특이적으로 검출하는 검사를 할 수 있다.

이상에 의해, 해당 검체채취도구, 샘플 용액 조정부 및 검사도구를 포함한 본 발명과 관련되는 검사 키트는, 쿠도아속 점액포자충에 감염된 물고기로부터 쿠도아속 점액포자충을 직접적, 특이적, 또한 간편하게 검출할 수 있어 대량의 물고기 검사를 할 수 있다.

본 발명과 관련되는 검사 키트에 포함되는 해당 검사도구로서는, 면역크로마트 시험편이나 ELISA법검사도구를 사용할 수 있다. 모두 공지의 검사도구로, 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명과 관련되는 검사 키트에 포함되는 해당 검체채취도구로서 원주방향의 홈 막대 모양 채취도구이면, 어육부에 삽입, 뽑아 내는 것만으로 해당 채취도구의 홈 부분에 검사에 필요한 양의 검체(어육)를 채취할 수 있으므로, 어육을 직접, 신속하고 간편하게 채취할 수 있어 그 때문에 대량의 물고기 검사를 하는 경우에도 단시간에 검체를 채취할 수 있다.

본 발명과 관련되는 검사 키트에 포함되는 해당 샘플 용액 조정부에는, 어육을 파쇄해, 더욱 소편화를 촉진하는 경우에는, 튜브로 바꾸어 호모지나이저를 사용할 수도 있다. 해당 호모지나이저를 사용하는 것으로, 검체채취도구로 채취한 어육을 더욱 소편화할 수도 있다.

상기 (1)~(5)의 공정을 포함해 만들어지는 방법에 의해 제작되는 단일클론항체가, 포자와 포자껍질이 미형성인 쿠도아속 점액포자충에 반응하는 것으로, 포자가 미형성인 쿠도아속 점액포자충을 포함한 쿠도아속 점액포자충에 감염된 넙치 등의 어육으로부터 포자를 추출해, 정제하는 일 없이, 직접, 쿠도아속 점액포자충을 검출하는 검사에 적절하며, 또한 어육에 기생해 사람에게 병원성이 없는 쿠도아속 점액포자충(넙치육의 경우는 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스)에 반응하지 않고, 사람에게 병원성이 있는 쿠도아속 점액포자충(넙치육의 경우는 쿠도아 셉템푼타타)에 특이적으로 반응하여, 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로 검출하는 검사할 수 있다.

본 발명과 관련되는 검사 키트를을 사용함으로써, 물고기의 생체로부터 직접, 특이적이고 간편하게 어육을 채취해, 채취한 어육으로부터 면역크로마트 시험편 등의 검사의 사용에 적절한 샘플 용액을 조정할 수 있어, 해당 용액을 사용한 검사도구로, 쿠도아속 점액포자충을 특이적으로, 간편하게 검출로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 어종이 넙치의 경우에는, 넙치육에 기생하는 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스와 구별하여, 쿠도아 셉템푼타타에만 특이적으로 반응해, 넙치육으로부터 쿠도아 셉템푼타타를 신속, 간편하고 직접적으로 검출할 수 있어 특히 대량의 넙치 등의 물고기의 생체를 신속히 검사할 수 있는 검사 키트를을 제공할 수 있다.

도1은, 본 발명과 관련되는 단일클론항체가, 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 세포를 구성하는 단백질과 결합하고 있는 사진(위상차 현미경상과 fluorescein isothiocyanate, FITC) 형광 염색상)를 나타낸다.
도2는, 본 발명과 관련되는 단일클론항체(2종류)가, 분자량 25,000~37,000 부근의 단백질을 인식하는 웨스턴 블랏의 결과를 나타내는 화상이다.
도3은, 본 발명과 관련되는 면역크로마트 시험편의 구성과 관련되는 개략도이다.
도4는, 본 발명과 관련되어, 검사도구로서 면역크로마트 시험편을 사용한 검사 키트의 구성과 관련되는 개략도이다.
도5는, 본 발명과 관련되어, 검사도구로서 ELISA법검사도구를 사용한 검사 키트의 구성과 관련되는 개략도이다.

(공정(1)~(5)의 설명)

본 발명과 관련되는 단일클론항체는, 공정(1)~(5)의 공정을 포함해서 만들어지는 방법을 통해 제작된다. 공정(1)은 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을 분리해, 해당 쿠도아속 점액포자충의 포자를 포함한 포자현탁용액을 동결해 융해하는 처리를 실시하는 것으로 해당 포자껍질과 해당 포자 내부의 세포를 파괴하고, 해당 세포를 구성해 있는 단백질을 용출시킨 해당 현탁용액을 조정하는 공정이며, 공정(2)은 공정(1)에서 얻어진 항원 단백질을 포유류 또는 조류의 동물에 1회이상 접종 해, 해당 동물의 체내에서, 해당 단백질에 반응하는 항체를 생성하는 항체생성세포를 만들어 내, 해당 항체생성세포를 해당 동물로부터 적출하는 공정이며, 공정(3)은 공정(2)에 의해 얻어진 항체생성세포와 앞서 기술한 동물과 동일한 동물종의 골수종 세포를 융합하여, 불활화 항체생성세포 A를 제작하는 공정이며, 공정(4)은 공정(3)에서 얻어진 불활화 항체생성세포 A 속에서, 해당 쿠도아속 점액포자충에 유래하는 항원 단백질을 이용해 해당 단백질에 반응하는 불활화 항체생성세포 B를 선별하는 공정이다. 공정(5)은 공정(4)에서 선별된 불활화 항체생성세포 B를 단일의 세포로서 분리한 후, 해당 세포에 단일클론항체를 생성시키는 공정이다.

공정(1)(항원 단백질 조정 공정)에서는, 어육으로부터 퍼콜(percholl) 밀도구배원심 등의 방법으로 쿠도아속 점액포자충을 분리해 정제 후, PBS에 현탁시켜, 해당 포자의 현탁용액 상태로,-80℃에서 냉동 보존한다. 이하의 3종류의 방법을 통해, 해당 보존한 현탁액 속의 쿠도아속 점액포자충의 포자(포자껍질 및 포자 내부)의 세포를 파괴하고, 해당 세포를 구성하는 단백질을 해당 현탁용액에 용출시켜, 공정(2)의 동물에 접종(면역)하기 위한 항원인 단백질을 포함한 현탁용액을 조정할 수 있다.

(a) 동결ㆍ융해 처리

보존중의 포자현탁용액을 실온에 되돌려, PBS로 희석해, 1 또는 2회 이상 반복해서 동결한후 융해한다. 동결하는 온도는 -5℃이하로-196℃이며, 융해하는 온도는 100℃이하로 0℃이상이 바람직하다. 해당 포자의 세포는 본 처리에 의해 물리적으로 손상되어 파괴되므로, 포자(및 그 내부)의 세포를 구성하는 단백질을 해당 현탁용액에 용출시켜, 공정(2)에서의 동물에의 접종(면역)을 위한 항원이 되는 해당 단백질을 포함한 해당 현탁용액을 조정할 수 있다.

(b) 동결ㆍ융해 처리 및 가용화 처리

포자현탁용액을 PBS로 희석해, 2회 이상 동결 융해를 실시한 후, 해당 용액에 계면활성제를 더해 실온으로 하루 둔다. 계면활성제로서는, 도데실 황산나트륨(SDS), 옥틸 페녹시 폴리 에톡시 에탄올 또는 모노라우린산 폴리옥시 에틸렌 소르비탄이 매우 적합하게 이용된다. 이 가용화 처리로, 해당 포자 내부의 세포를 구성하고 있는 단백질에 계면활성제가 결합하여, 해당 용액 속에서 미셀을 형성하고, 해당 미셀로부터 공정(2)에서의 동물에의 접종(면역)을 위한 항원이 되는 해당 단백질을 얻을 수 있다.

(c) 동결 융해 및 초음파 처리

포자현탁용액을 PBS로 희석해, 2회 이상 동결 융해를 실시한 후, 얼음으로 냉각하면서 해당 포자를 포함한 포자현탁용액에 초음파를 조사하고, 더욱 해당 포자 내부의 세포를 파괴해, 해당 세포를 구성하고 있는 단백질을 해당 용액 속에서 용출시켜, 공정(2)에서의 동물에의 접종(면역)을 위한 항원이 되는 해당 단백질을 얻을 수 있다.

공정(2)(항체생성세포 취득 공정)에서, 공정(1)에서 얻어진 단백질을 항원으로서 포유류 또는 조류의 동물에 1회 이상 접종(면역) 한다. 해당 동물로서는, mouse, rat, 토끼 또는 닭이 바람직하고, 취급의 좋은 점이나 과거의 면역 관련의 데이터의 축적으로 mouse가 더욱 바람직하다. 접종 하는 부위는 복강내, 피내, 피하, 근육 또는 정맥이 바람직하다. 해당 동물에의 면역 과정에서, 해당 동물의 혈청중의 항체력가를 ELISA법에서 측정해, 혈청의 항체력가가 높은 해당 동물을 선택한다. 선택한 동물에 해당 항원 단백질을 접종 하고, 해당 동물의 체내에서, 해당 단백질에 반응하는 항체를 생성하는 항체생성세포를 만들어 내어, 해당 항체생성세포(비장)를 해당 동물로부터 적출할 수 있다.

공정(3)(세포 융합 공정)에서, 공정(2)에 의해 얻어진 항체생성세포를 포함한 세포 현탁액과 해당 동물과 동일한 동물종의 골수종 세포(骨髓腫 세포)를 하나의 용기에 넣고, 폴리에틸렌 글리콜(이하「PEG」라고 한다.) 등의 세포 융합제를 더해 항체생성세포와 비장 세포를 세포융합하고, 불활화 항체생성세포 A를 제작한다.

공정(4)(스크리닝 공정)에서, 공정(3)으로 얻어진 불활화 항체생성세포 A중에서, 해당 쿠도아속 점액포자충에 특이적으로 반응하는 항체를 생성하는 불활화 항체생성세포 B를 선별(이하 「스크리닝」이라고 한다. ) 하기 위해, 해당 쿠도아속 점액포자충에 유래하는 단백질을 항원으로서 이용하고, ELISA법에 의해 선별한다. 즉 항체력가가 높은 불활화 항체생성세포 B를 선별한다. 어종이 넙치의 경우는, 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스에 유래하는 단백질에 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 유래하는 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 생성하는 불활화 항체생성세포 C의 선별을 실시한다. 이상의 스크리닝은 ELISA법으로, 불활화 항체생성세포의 항체력가를 측정해, 항체력가의 높은 해당 세포 즉 항원에 대한 반응성이 높은 해당 세포를 선별하면서 실시한다.

공정(5)(클로닝 공정)에서, 공정(4)로 선별된 불활화 항체생성세포 B 또는 C를 클론화 후, 해당 세포에 단일클론항체를 생성시킨다. 공정(4) 및 (5)에서는, 해당 불활화 항체생성세포 B 또는 C의 스크리닝 및 클로닝의 공정을 2회 이상 반복한다.

공정(5)에서, 어종이 넙치에 대해서는, 쿠도아 셉템푼타타에 유래하는 단백질에 반응성을 나타낸 양성 웰(불활화 항체생성세포 B)을 클론화하고, 불활화 항체생성세포 B의 클론을 제작한다. 해당 클론이 생성하는 단일클론항체는 쿠도아 셉템푼타타에 유래하는 단백질에 높은 반응성을 나타낸다.

또한 해당 스크리닝 공정에서, 쿠도아 셉템푼타타 만이 아니고, 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스를 대상으로 해 교차 반응 시험을 실시한다. 이 스크리닝(공정(4)) 과 클로닝(공정(5)) 을 여러 차례 실시해, 불활화 항체생성세포 C의 클론을 제작한다. 해당 클론이 생성하는 단일클론항체는, 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스에는 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응한다.

공정(1)에서 (5)를 포함해 만들어지는 방법에 의해 제작된, 본 발명과 관련되는 단일클론항체중에서, 면역크로마트법을 이용하는 검사도구(면역크로마트 시험편)에 사용하는 항체를 선택한다. 면역크로마트법을 이용하는 면역크로마트 시험편에 대해서, 넙치육에 감염된 쿠도아 셉템푼타타를 검출하기 위해서 이용되는 단일클론항체는, 공정(1)~(5)를 포함해서 만들어지는 방법에 의해 제작된 단일클론항체로부터, 단락 0039에 기재한 공정을 반복해 선택한 3 종류(Ks-3 C5, Ks-6 F9, Ks-1 B11)의 항체를 사용한다.

면역크로마트법을 구축하기 위해서는, 2 종류의 단일클론항체로 항원 단백질을 샌드위치할 필요가 있기 때문에, 항원 단백질을 샌드위치 하는데 적합한 항체의 편성을 샌드위치 ELISA법에 의해 선택한다. 샌드위치 ELISA법에 따른 선택의 결과, Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성과 Ks-1 B11와 Ks-1 B11의 편성으로 좁혀진다. 다음에 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스와의 교차 반응성을 검토한다. 그 결과, Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성이, 교차성이 낮았기 때문에, 면역크로마트법에 이용하는 항체를 이 편성으로 결정한다.

도 1에 Ks-3 C5항체와 Ks-6 F9항체가 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 단백질과 결합하고 있는 사진(위상차 현미경상과 FITC 형광 염색상)을 나타낸다. Ks-3 C5항체와 Ks-6 F9항체는, 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스에 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응해, 서브 클래스가 IgG1로, 경쇄가 κ사슬이며, 쿠도아 셉템푼타타의 내부 구조의 분자량 25,000에서 37,000의 범위에 있는 단백질을 인식한다.

도 2에, 해당 항체가 인식하는 항원(쿠도아 셉템푼타타)의 웨스턴 블랏법의 결과의 화상을 나타낸다. 화상중의 M는 단백질 분자량 마커이며, 레인 1으로 레인2는 각각 2종류의 해당 항체가 인식하고 있는 해당 항원을 나타내, 레인1은 Ks-6 F9항체를 사용하고 있어, 레인2는 Ks-3 C5항체를 사용하고 있다. 도2는, 해당 항체가 쿠도아 셉템푼타타의 내부 구조의 분자량 25,000에서 37,000의 범위에 있는 단백질을 인식하는 것을 나타낸다.

해당 2종류의 단일클론항체는, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 2016년 1월 15일부로 수탁 번호 「NITEP-02181」으로 기탁된 불활화 항체생성세포 C의 클론(이하 「하이브리드마」라고 한다. ) 으로부터 생성되는 항체(Ks-3 C5항체) 및 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 2016년 1월 15일부로 수탁 번호 「NITEP-02182」로 기탁된 하이브리드마로부터 생성되는 항체(Ks-6 F9항체)이다.

Ks-3 C5항체 및 Ks-6 F9항체는, 공지의 방법으로 만들어진 수탁 번호 「NITEP-02181」으로 기탁된 하이브리드마 및 「NITEP-02182」로 기탁된 하이브리드마로부터 생성된다. 본 발명에서의 단일클론항체는, 쿠도아 셉템푼타타 포자에 특이적으로 반응한다.

(검사도구에 사용되는 면역크로마트 시험편)

면역크로마트 시험편은, 해당 단일클론항체 제작 공정으로 취득한 2종류의 항체(본 발명과 관련되는 단일클론항체)를 사용하고, 제1의 항체가 고정되는 멤브레인과 표지 된 제2의 항체가 고정되는 복합체패드와 시료(넙치 등의 어육편이 들어간 검체 현탁액의 공급부인 샘플 패드와 과잉의 시료를 흡수하는 흡수 패드 및 이러한 지지체가 되는 벡킹 시트를 적층해서 제작할 수 있다. 해당 샘플 패드, 멤브레인, 복합체 패드 및 흡수 패드를 구성하는 재료는, 해당 시료나 복합체를 전개해, 보관 유지하는 기능을 갖기 위해서, 바람직하게는 섬유 재료, 다공질 재료 또는 그 외의 해당 기능을 가지는 재료로 구성된다.

본 시험편의 성능은, 항원이 넙치육에 기생하는 쿠도아 셉템푼타타의 경우의 검출 감도는 포자수 5000개 정도이며, 넙치육의 경우의 교차성은 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스에는 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응한다. 또한 본 시험편의 사용은 넙치육에만 제한되는 것이 아니고, 다른 어육에 기생하는 쿠도아속 점액포자충의 검출에도 사용할 수 있다.

(검사도구에 사용되는 ELISA법검사도구)

ELISA법 검사도구는, 본 발명과 관련되는 2종류의 단일클론항체를 이용해 공지의 ELISA법을 이용하는 검사도구이며, 96 웹 마이크로 타이타프레이트, 마이크로 플레이트 고상화 항체(Ks-6 F9항체 사용), 페르오키시타제 표지 항체(Ks-3 C5항체 사용), 세정 용액, 블로킹 용액, 기질, 반응 정지액으로 구성된다.

본 검사도구의 성능은, 항원이 넙치육에 기생하는 쿠도아 셉템푼타타의 경우 검출 감도는 포자수 40개 정도이며, 넙치육의 경우의 교차성은 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스에는 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응한다. 또한 본 ELISA법검사도구의 사용은 넙치육에만 제한되는 것이 아니고, 다른 어육에 기생하는 쿠도아속 점액포자충에도 사용할 수 있다.

(검사 키트)

검사 키트는, 검체의 어육에 삽입해, 뽑아 내는 것으로, 검사에 필요한 양의 어육편(검체)을 얻을 수 있는 검체채취도구와, 해당어의 생체로부터 채취한 어육이 부착된 검체채취도구를 완충액을 넣은 튜브에 넣어, 쿠도아속 점액포자충을 완충액에 용출시켜 샘플 용액을 조정하는 샘플 용액 조정부와, 샘플 용액을 검사도구에 공급하기 위한 샘플 용액 공급도구와, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이용해 해당 샘플 용액으로 쿠도아속 점액포자충을 검출하는 검사도구로 이루어진다.

검체채취도구를 검체의 어육에 삽입해, 뽑아 내는 것으로 검사에 필요한 양(바람직하게는 10 mg~20 mg이지만, 이 범위 외의 양에서도 좋다. ) 의 어육을 물고기로부터 채취할 수 있는 검체채취도구로서는, 원주방향의 홈이 파인 막대 모양 채취도구를 사용한다. 해당 막대 모양 채취도구로서는, 해당 홈이 나사모양인 시판의 나사(피스 또는 미니 피스)를 사용한 나사식 채취도구나 해당 홈이 봉의 원주방향으로 비나선모양에 1이상 이루어지 막대 모양 채취도구 등을 들 수 있다.

특히 시판의 피스 등을 사용하는 나사식 검체채취도구는, 어육에 삽입해, 뽑아 내는 것만으로 해당 나선모양의 홈에 상기 검사에 필요한 양의 어육을 채취할 수 있어 채취한 어육이 나사에 부착된 상태로, 샘플 용액 조정부의 튜브에 투입해, 진동을 더하는 것으로 균질화 된 샘플 용액을 조정할 수 있다. 또, 나사식 검체채취도구는, 염가로 입수도 용이하고, 대량 검체(물고기의 생체)로부터 직접, 간단하고 쉽게 어육을 채취해, 해당 어육으로부터 쿠도아속 점액포자충을 검출하는 검사가 가능해진다.

해당 나사는, 피스(십자 나사;JISB11121995) 또는 미니 피스 등이 매우 적합하게 사용할 수 있지만, 홈이 나선모양이면 제한은 없다. 재질은 바람직하게는 강철, 스테인리스 등의 철계 재료, 동, 구리합금, 알루미늄, 알루미늄 합금 등의 비철금속, 세라믹 등의 무기 재료, 넙치 등의 어류의 생체에 삽입, 빼내기를 반복해 사용할 수 있는 강도가 있는 것이면, 플라스틱이나 나무계 재료 등의 유기계 재료나 유기 재료와 무기 재료의 복합재료여도 된다. 나사의 치수는, 바람직하게는 호칭 지름(나사의 바깥지름)이 1~5 mm, 길이가 20~80 mm의 것을 들 수 있다.

검체의 어육에 삽입해, 뽑아 내는 것만으로 검사에 필요한 양을 채취할 수 있어 나사 강도도 해당 삽입과 빼내기에 견딜 수 있는 것이면, 특히 제한은 없다.

해당 샘플 용액 조정부의 튜브(도4, 도5 참조)에서도, 상기대로 어육 등의 검체를 파쇄해, 소편화하고, 균질화된 샘플 용액을 조정할 수 있지만, 더욱 확실히 어육을 파쇄해 소편화하는 것을 촉진하기 위해서, 해당 샘플 용액의 조정은, 해당 튜브로 바꾸어 바이오마셔(biomasher), 핑거매셔(finger masher) 또는 그 외의 호모지나이저를 사용할 수 있다.

해당 샘플 용액 조정부에서 조정된 샘플 용액은, 해당 튜브로부터 채취해 검사도구에 공급된다. 이 샘플 용액 공급도구로서는, 적당량의 샘플 용액(시료)을 검사도구에 공급할 수 있는 것으로 간단하고 쉬운 것이 바람직하고, 예를 들면, 스포이드, 피펫 등을 들 수 있지만, 특히 제한은 없다.

해당 검사도구에는, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 사용한 면역크로마트 시험편과 ELISA법 검사도구를 사용할 수 있다. 해당 검사도구는, 해당 항체를 이용하는 것으로, 쿠도아 셉템푼타타 등의 쿠도아속 점액포자충을 넙치육 등의 어육으로부터 직접, 특이적으로 한편 간편하게 검출할 수 있다.

(면역크로마트 시험편을 사용하는 해당 검사 키트의 성능)

검체채취도구로서 나사를 이용했다. 해당 나사를 넙치에게 직접 찌르고, 뽑아 내 넙치육을 채취해, 샘플 용액 조정도구로 PBS로 넙치육의 현탁액(샘플 용액)을 조정해, 스포이드로 면역크로마트 시험편의 샘플 패드에 샘플 용액을 적하하여, 검사했다. 그 결과 해당 시험편에 의하면 쿠도아 셉템푼타타에 감염된 넙치육에만 반응한다. 또한 본 시험편을 사용하는 검사 키트는, 넙치의 검사에만 한정되는 것이 아니고, 다른 어종의 검사에도 사용할 수 있다.

(ELISA법검사도구를 사용하는 해당 검사 키트의 성능)

검체채취도구로서 나사를 이용했다. 해당 나사를 넙치에게 직접 찔러, 넙치육을 채취해, 샘플 용액 조정부에서 PBS로 넙치육의 현탁액을 조정하고, 스포이드에로 해당 현탁액을 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입했다. 그 결과, 해당 검사도구에 의하면 쿠도아 셉템푼타타에 감염된 넙치육의 흡광도는 높은 수치가 되고, 본 검사 키트는 넙치육으로부터 특이적으로 쿠도아 셉템푼타타를 검출할 수 있다. 또한 본 검사도구를 사용한 검사 키트는은, 넙치의 검사에만 한정되는 것이 아니고, 다른 어종의 검사에도 사용할 수 있다.

본 발명을 실시한 예를 실시예 1~6에 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(단일클론항체의 제작)

본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이하와 같은 방법으로 제작했다.

공정(1)(항원 단백질의 조정)

쿠도아 셉템푼타타가 감염된 넙치육보다 퍼콜 밀도구배원심에서 쿠도아 셉템푼타타 포자를 분리해 정제한 후, 해당 포자를 PBS에 넣어 현탁시켜, 포자현탁용액을 제작한 후, 해당 용액을 -80℃으로 동결 보존 했다. 이하의 3종류의 방법을 통해 mouse에 접종하기 위한 항원인 단백질(항원 단백질)을 얻었다.

(a) 동결 융해 처리 항원

해당 용액을 PBS로 희석해, 해당 희석 후의 용액을 -80℃으로 동결한 후, 25℃로 융해를 하는 처리를 2회 반복했다.

(b) 동결 융해 및 가용화제처리

해당 용액을 PBS로 희석해, 해당 희석 후의 용액을 상기 조건으로 동결과 융해를 하는 처리를 2회 반복한 후, 계면활성제(가용화제)로서 옥틸 페녹시 폴리 에톡시 에탄올(0.1%TritonX-100), 0.5%도데실 황산나트륨(SDS) 또는 모노 라우린산 폴리옥시 에틸렌 솔 부탄(0.1%Tween20)을 더해 실온에서 하루 두고 가용화했다.

(c) 동결 융해 및 초음파 처리

해당 용액을 PBS로 희석해, 해당 희석 후의 용액을 상기 조건으로 동결과 융해를 하는 처리를 2회 반복한 후, 얼음으로 냉각하면서 초음파 처리를 실시했다.

공정(2)(항체생성세포의 취득)

공정(1)에 의해 얻어진 항원 단백질을 mouse에 접종했다. 1무리당, 3마리의 BALB/cmouse를 준비해, 첫 회 접종(면역)은, 1회의 접종으로, mouse 1마리당, １×１０^６개의 쿠도아 셉템푼타타 포자로부터 얻을 수 있는 양의 해당 단백질(항원 단백질)을, 프로인트 완전 아쥬반트(DifcoLaboratories)에서 유화해, 2번째 면역 이후는, 프로인트 불완전 아쥬반트(DifcoLaboratories)에서 유화해, 합계 3회 피하, 피내, 근육, 복강 또는 정맥에 접종했다. 3번째 면역 1주일 후에 mouse의 꼬리의 정맥에서 채혈한 혈청을 취득해, 혈청중의 항체력가를 ELISA법(혈청 항체력가측정, 자세한 것은 단락 0056에 기재)에서 측정해, 해당 항체력가가 높은 mouse를 선택했다(하기 표1 참조). 선택한 mouse의 복강내에 아쥬반트를 사용하지 않고 １×１０^６개의 쿠도아 셉템푼타타 포자로부터 얻을 수 있는 양의 해당 단백질을 접종 해, 그 3일 후에 비장(항체생성세포)을 적출한다. 해당 항체생성세포를 RPMI1640 배양지가 들어가 있는 샬레 위에서 스테인리스 메쉬를 이용해 으깨어, 항체생성세포가 포함된 세포 현탁액을 얻었다.

(ELISA법에 따르는 혈청중의 항체력가의 측정)

퍼콜 밀도구배원심으로 정제해,　-80℃에서 동결 보존 한 쿠도아 셉템푼타타를 준비한다. 1×１×１０^６개(쿠도아 셉템푼타타의 포자수)/mL의 농도에 조정한 포자현탁용액을 공정(1)과 동일 조건으로 동결해 융해하는 처리를 2회 실시해, 해당 용액을 공정(1)과 동일한 가용화 처리를 실시한 가용화 포자액을 １×１０^３개/웹이 되도록 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입하고, 4℃에서 하룻밤 두었다. 그 후 가용화 포자액을 제거하고 나서, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 블로킹액으로서 0.5%젤라틴 함유 PBS를 300μL 각 웹에 나누어 주입하여, 실온에서 1시간 두었다. 해당 정치 후 블로킹액을 제거하고, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 쿠도아 셉템푼타타를 접종 한 mouse로부터 얻어진 혈청을 500배 희석해, 거기에서 5배 단계 희석을 실시해, mouse 혈청 희석액 100μL를 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 실온에 둔 후 mouse 혈청 희석액을 제거하고 나서, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 페르오키시다제 표지항 mouse IgG 항체(Kirkegaard & PerryLaboratories)를 0.5%젤라틴 함유 PBS로 2500배 희석해, 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지항 mouse IgG 항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 o-페닐렌 디아민 이염기산염(OPD) 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 웹에 더해 실온에서 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해서 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치로 490 nm의 흡광도를 측정했다. 해당 흡광도를 통해 공정(1)의 3종류의 처리에 의한 항원 단백질의 항체력가의 비교를 실시했다.

쿠도아 셉템푼타타 0.5%SDS 가용화 항원에 대한 3종류의 처리에 따른 항원 단백질을 면역한 mouse로부터 채취한 혈청중의 항체생성세포가 생성하는 항체의 항체력가(혈청 희석 배율 500배 때만의 데이터)를 표1에 나타낸다.

	K. septempunctata 0.5% SDS 가용화항원	0.5% 젤라틴 (백그라운드)
(a) 동결 융해 처리 항원 접종 mouse	0.756	0.044
(b) 동결 융해 및 0.5% SDS 가용화제처리 접종 mouse	1.598	0.059
(c) 동결 융해 및 초음파 처리 항원 접종 mouse	1.146	0.047

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 표 1에 의하면, (a) 동결 융해 처리 항원 접종 mouse, (b) 동결 융해 및 0.5%SDS 가용화 처리 항원 접종 mouse, (c) 동결 융해 및 초음파 처리 항원 접종 mouse 모두 백그라운드인 0.5%젤라틴의 흡광도에 비해 쿠도아 셉템푼타타 항원의 흡광도가 크게 상승하고 있어, 해당 항원에 강하게 반응하고 있어, 3종류의 항원((a) 동결 융해 처리 항원, (b) 동결 융해 및 0.5%SDS 가용화 처리 항원, (c) 동결 융해 및 초음파 처리 항원)를 접종 한 mouse에 대해서, 항체력가가 상승해, 3종류의 항원을 기본으로 제작되는 항체가, 쿠도아 셉템푼타타의 0.5%SDS 가용화 항원(포자 내부의 세포에 유래하는 단백질을 포함한다. ) 에 반응했다. 이것으로 공정(1)의 동결?융해 처리 등에 의해 얻어진 항원 단백질로부터 제작되는 단일클론항체 안에는, 포자 내부의 세포에 유래하는 항원 단백질에 반응하는 항체가 존재한다.

따라서, 본 발명과 관련되는 단일클론항체는, 목적인 포자를 형성하고 있지 않는 쿠도아속 점액포자충을 검출할 수 있다. 특히 동결해 융해하는 처리에 더해 가용화 처리를 한 항원(표 1의(b)) 는 항체력가의 상승이 가장 크고, 그 다음에 동결?융해 처리 후에 초음파에 의한 처리를 한 항원(표 1의(c)), 그 다음에 동결 E융해 처리만의 항원(표 1의(a)) 의 순서가 되고 있다. 따라서, 공정(1)에서, 쿠도아 셉템푼타타 포자의 동결?융해 처리에 더해, 가용화 처리나 초음파를 조사하는 처리를 함으로써, mouse의 항체력가를 더욱 상승시키는 효과가 있다.

공정(3)(세포 융합 공정)

상기 공정(1)의 (a)의 항원을 사용해 얻어진 항체생성세포를 포함한 세포 현탁액 및 골수종 세포(P3X63Ag8u. 1)을 각각 소태아 혈청(이하 「FBS」라고 한다. ) 불함RPMI1640 배양지(Gibco)에서 2회 원심 세정해(1200 rpm, 5분 , 실온), 최종적으로 복수의 항체생성세포를 포함한 세포 현탁액과 복수의 골수종 세포를 1개의 환저 튜브에 정리했다. 해당 항체생성세포의 해당 세포 현탁액과 해당 골수 세포의 혼합물을 원심분리하고(1200 rpm, 5분 , 실온), 상등액을 제거해, 세포덩어리를 태으로 푼 후, 세포 융합용 시약의50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000을 함유 하는 배양지(RPMI1640 배양지(FBS불함)) 2 mL를 세포가 들어가 있는 튜브에 1분간 더 두었다, 복수의 항체생성세포와 복수의 골수종 세포를 세포 융합시켜 복수의 불활화 항체생성세포 A를 얻었다. 그 후, RPMI1640 배양지(FBS불함) 10 mL를 해당 튜브에 3분간 더 두었다.

공정(4)(선별(스크리닝) 공정)

그 후, 10%FBS 함유 HAT 배양지(Sigma-Aldrich)를 100 mL 더해 96 웹 배양 플레이트에 200μL씩 나누어 주입해, 37℃, 5% CO_２ 존재 하에서 1주일 배양했다. 배양 개시 3일 후에, 10%FBS 함유 HAT 배양지에서 배양지 교환을 실시했다. 해당 배양지 교환을 실시한 배양지(불활화 항체생성세포 A)를, 1주일 배양한 후에 배양 플레이트의 각 웹(이하 「웹」이라고 한다)에서 배양상청 100μL를 회수해, ELISA법(자세한 것은 단락 0062)을 이용하고, 이하의 2종류의 방법으로 선별해, 다음 공정(클로닝 공정)으로 진행되는 웹(불활화 항체생성세포 B 또는 C)을 선택했다.

(가) 쿠도아 셉템푼타타만을 대조로 한 스크리닝 공정

(나) 쿠도아 셉템푼타타, 쿠도아 티르시테스, 쿠도아 라테오라브라시스를 대조로 한 스크리닝 공정

2종류의 스크리닝의 결과에 의해(하기 표2,3에 데이터를 나타낸다), 표2에 대해서는, 쿠도아 셉템푼타타에 대한 반응성이 높은 웹(웹중의 불활화 항체생성세포가 생성하는 항체의 항체력가가 높은 웹), 표3에 대해서는, 쿠도아 셉템푼타타에 대한 반응성이 높은 웹에서, 또한 쿠도아 티르시테스, 쿠도아 라테오라브라시스에 반응성이 낮은 웹을 선택했다.

쿠도아 셉템푼타타만을 대조로 한 스크리닝 공정의 데이터

웹 (불활화항체생성세포 B)명	K.septempunctata 0.5% SDS 가용화항원
Ks-1A1	0.609
Ks-2D12	0.414
Ks-4A11	0.438
Ks-5H5	0.746
Ks-5E7	0.900

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 배양 플레이트의 약 600웹 중, 쿠도아 셉템푼타타에 높은 반응성을 나타낸 상기 표 2에 기재된 5웹의 세포(불활화 항체생성세포 B)를 선별했다. 표2를 통해 본 공정으로 얻어진 5종류의 불활화 항체생성세포 B는, 쿠도아 셉템푼타타 포자의 내부 구조에 유래하는 단백질을 포함한, 쿠도아 셉템푼타타 포자에 유래하는 단백질에 높은 반응성을 나타내고 있다.

쿠도아 셉템푼타타, 쿠도아 티르시테스, 쿠도아 라테오라브라시스를 대조한 스크리닝 공정의 데이터

웹(불활화항체생성세포C) 명	K.septempunctata 0,5% SDS 가용화항원	K. thyrsites 0,5% SDS 가용화항원	K.lateolabracis 05% SDS 가용화항원
Ks-1B11	0.859	0.132	0.142
Ks-2A2	0.659	0.152	0.112
Ks-3C5	0.793	0.050	0.046
Ks-4B1	0.632	0.044	0.049
Ks-6F9	0.326	0.043	0.050

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 쿠도아 셉템푼타타에 대한 반응성이 높은 웹에서, 또한 쿠도아 티르시테스, 쿠도아 라테오라브라시스에 반응성이 낮은 웹의 세포(불활화 항체생성세포 C)로서 상기 표3에 기재된 5웹의 세포를 선별했다.

(ELISA법에 의한 불활화 항체생성세포의 스크리닝)

퍼콜 밀도구배원심으로 정제 해, -80℃ 그리고 동결 보존 한 쿠도아 셉템푼타타를 준비했다. １×１０^６개/mL의 농도에 조정한 포자현탁용액을 공정(1)과 동일 조건으로 동결해 융해하는 처리를 2회 실시해, 해당 용액을 공정(1)과 동일한 가용화 처리를 실시한 가용화 포자액을 1×10개/웹이 되도록 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 4℃에서 하룻밤 두었다. 가용화 포자액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 블로킹액으로서 0.5%젤라틴 함유 PBS를 300μL 각 웹에 나누어 주입해, 실온에서 1시간 두었다. 블로킹액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다.

그 후, 세포 배양 플레이트의 배양액(배양상청)으로부터 100μL채취해, 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 해당 방치 후 배양상청을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 페르오키시다제 표지항mouse IgG 항체(Kirkegaard&PerryLaboratories)를 0.5%젤라틴 함유 PBS로 2500배 희석해, 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지항mouse IgG 항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 웹에 더해 실온으로 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해서 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치에 의해 490 nm의 흡광도를 측정했다. 그 결과를 표2와 표 3에 나타낸다.

배양 플레이트의 약 600웹( 약 600의 불활화 항체생성세포 B) 중, 쿠도아 셉템푼타타에 높은 반응성을 나타낸 불활화 항체생성세포 B(Ks-1 A1주, Ks-2 D12주, Ks-4 A11주, Ks-5 H5주, Ks-5 E7주)를 선별했다. 표2에서 본 공정으로 얻어진 5종류의 불활화 항체생성세포 B는, 쿠도아 셉템푼타타 포자 및 포자의 내부 구조에 유래하는 단백질에 대해 높은 반응성을 나타내고 있다. 표3에서는, 쿠도아 셉템푼타타에 대한 반응성이 높은 불활화 항체생성세포 C로, 또한 쿠도아 티르시테스, 쿠도아 라테오라브라시스에 반응성이 낮은 불활화 항체생성세포 C로서 5 종류의 세포(Ks-1 B11주, Ks-2 A2주, Ks-3 C5주, Ks-4 B1주, Ks-4 B1주, Ks-6 F9주)를 선별했다.

예를 들면, Ks-3 C5주의 경우는, 표3에 의하면, 쿠도아 셉템푼타타의 0.5%SDS 가용화 항원에 대한 490 nm의 흡광 도수치는 0.793인데 비해, 쿠도아 티르시테스의 해당 항원의 해당 수치는 0.050이며, 쿠도아 라테오라브라시스의 해당 항원의 해당 수치는 0.046이며, 흡광 도수치의 높은 항원에의 반응성은 높고, 특이적이고, 흡광 도수치의 낮은 항원에의 반응성은 낮아, 불활화 항체생성세포 C(Ks-3 C5주)는 쿠도아 티르시테스트와 쿠도아 라테오라브라시스에의 반응성은 낮고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응한다. 따라서, 앞서 기술한 스크리닝 공정에 의해, 넙치육에서 식중독을 일으키는 쿠도아 셉템푼타타만을 특이적으로 검출할 수 있는 불활화 항체생성세포 C가 선별되었다.

공정(5)(클로닝 공정)

상기 공정(4)에서 선택한 웹에서 성육하고 있는 불활화 항체생성세포 B 또는 C를, 피펫을 이용해 채취해 PBS에 투입해 현탁시킨 후, 혈구 계산반으로 세포수를 계측했다. 그 후, 1개/100 μL가 되도록(듯이) 10%FBS 함유 RPMI1640 배양지에서 희석해, 100μL씩 새로운 세포 배양 플레이트에 나누어 주입했다. 37℃, 0.5%CO_２ 존재하에서 2주일 정도 배양해, 그 배양상청을 이용해 ELISA법시험을 실시했다. 이 작업을 4회 반복해 실시해, 불활화 항체생성세포 B 및 C를 단일 세포화해, 해당 세포 B에 대해서는 5주의 하이브리드마주를 얻었다. 또, 해당 세포 C에 대해서는, 최종적으로 3주(Ks-3 C5주, Ks-6 F9주, Ks-1 B11주)의 하이브리드마주를 수립했다. 표4는, 해당 하이브리드마주가 산출하는 단일클론항체가, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응해, 쿠도아 티르시테스와 쿠도아 라테오라브라시스에 반응하지 않는 것을 나타낸다.

스크리닝, 클로닝 후에 취득된 3주의 하이브리드마주(클론(불활화 항체생성세포 C의 클론)) 의 생성하는 단일클론항체의 항체력가를 표4에 나타낸다.

클론명 (단일클론 항체명칭)	K.septempunctata 0.5% SDS 가용화 항원	K.thyrsites 0.5% SDS 가용화 항웡	K.lateolabracis 05% SDS 가용화 항원	0.5% 젤라틴 (백그라운드)
Ks-3D5	0.602	0.046	0.042	0.040
Ks-6F9	0.377	0.043	0.040	0.040
Ks-1B11	0.764	0.103	0.110	0.042

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 표4는, 3주의 하이브리드마주(클론(불활화 항체생성세포 C의 클론)) 의 생성하는 항체가, 식중독을 일으키는 쿠도아 셉템푼타타에 반응성이 높고, 넙치에 기생하고, 사람에게 병원성이 없는 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스에 반응성이 낮은 것을 나타내 보이고 있다.

본 발명과 관련되는 단일클론항체 중에서 면역크로마트법(면역크로마트 시험편)으로 사용하는 단일클론항체의 편성(고상화 항체와 표지 항체의 편성)을 샌드위치 ELISA법으로 선택함과 동시에, 선택된 해당 항체가 쿠도아 셉템푼타타 포자 내부에 유래하는 단백질을 인식해 결합하는 것을 확인했다.

(정제 단일클론항체의 조정)

표지항체를 제작하기 위해, 본 발명과 관련되는 단일클론항체를 다음(α)~(γ)의 처리에 의해 정제했다.

(α) 복수의 채취

수립한 하이브리드마주를 10%FBS 함유 I1640 배양지에서 배양해, 1×10^６세포/mL에 조정한 세포 현탁액을 준비했다. 각 하이브리드마주에 대해 3마리씩 세포를 투여해, 2주일 전에 0.5 mL의 프리스탄(와코순약)을 복강내에 접종 한 BALB/cmouse를 준비해, 상기 조정 세포를 1 mL씩 복강내에 접종 했다. 접종 1주일 후~2주일 후의 사이에, 정기적으로 복부에 저장한 복수를 시린지로 채취했다. mouse 1마리당, 5 mL정도의 복수를 채취할 수 있었다. 채취한 복수는, 원심분리(3000 rpm, 15분 , 4℃)를 실시해, 상청을 -80℃에서 동결 보존 했다.

(β) 복수의 정제

상기로 채취한 복수를, PBS로 2배 희석해, ProteinG을 이용한 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 의해 단일클론항체의 정제를 실시했다. ProteinG 컬럼(GE헬스케어)을 배트 체적의 10배 용량의 PBS로 세정해, 희석한 복수를 더했다. 그 후, 배트 체적의 20배 용량의 PBS로 컬럼을 세정한 후, 배트 체적의 5배 용량의 0.1 M글리신(pH2. 5)를 더해 컬럼에 흡착한 IgG화분을 용출시켰다. 용출 후, 1 M트리스 완충액(pH9. 0)을 더해 용출용액을 중화시켰다. 그 후, PBS에서 투석을 실시해, 용매를 PBS에 치환했다.

(γ) 단일클론항체의 농축

정제 용액을 50,000의 분획 분자량의 한외여과 장치(메르크미리포아)에 의해 5 mg/mL가 되도록 농축한 후,-80℃에서 동결 보존 했다.

(정제 단일클론항체의 페르오키시다제 표지)

상기(α)~(γ)의 처리에 의해 정제한 단일클론항체를 사용해 샌드위치 ELISA에 사용하는 표지 항체를 제작했다. 해당 정제 한 단일클론항체의 페르오키시다제 표지는, PeroxidaseLabelingKit-NH_２ (동인화학)를 이용해, 작업을 실시했다. 최종적으로는, 1 mg/mL의 페르오키시다제 표지 단일클론항체를 얻은 후,-80℃에서 동결 보존 했다.

(면역크로마트법(면역크로마트 시험편)으로 사용하는 단일클론항체의 선별)

면역크로마트법을 구축하기 위해서는, 2 종류의 단일클론항체로 항원 단백질을 샌드위치 할 필요가 있기 때문에, 불활화 항체생성세포 C의 생성하는 항체 중에서 항원 단백질을 샌드위치 하는데 적합한 항체의 편성을 샌드위치 ELISA법(자세한 것은 단락 0072)에 의해 검토했다(표5 참조). 그 결과, Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성과 Ks-1 B11와 Ks-1 B11의 편성에 좁혀졌다. 그 때문에, 다음에 티르시테스와 라테오라브라시스와의 교차 반응성을 검토했다(표6 참조). 그 결과, Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성이, 교차성이 낮았기 때문에, 면역크로마트법에 이용하는 항체를 이 편성으로 결정했다.

샌드위치 ELISA법에 따른 면역크로마트법에 적절한 클론의 편성의 검토 결과를 표5에 나타낸다(항원은 쿠도아 셉템푼타타).

	클론명 (단일클론항체명)	플레이트 고상화항체
	클론명 (단일클론항체명)	Ks-3C5	Ks-6F9	Ks-1B11
페르오키시다제 표지항체	Ks-3C5	0.179	3.873	0.09
	Ks-6F9	3.903	0.116	0.305
	Ks-1B11	0.601	0.105	3.614

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 표5는, 선별한 3주의 클론(단일클론항체를 생성하는 불활화 항체생성세포 C의 클론) 의 편성 중, Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성의 흡광 도수치가 3.873으로 3.903이며, Ks-1 B11와 Ks-1 B11의 편성의 흡광 도수치가 3.614이며, 이것들 편성의 흡광도 즉 항체력가(항원(쿠도아 셉템푼타타)에의 반응성)이 다른 조합(예를 들면, Ks-1 B11와 Ks-3 C5의 편성의 흡광도는 0.601)에 비해 매우 높은 것을 나타내고 있다. 따라서, 이러한 항체의 편성은, 면역크로마트법(면역크로마트 시험편)에 따른 항원의 특이적인 검출에 사용할 수 있다.

Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성으로의 샌드위치 ELISA법의 검출 감도를 표6에 나타낸다(항원은 쿠도아 셉템푼타타 등).

플레이트 고상화항체	Ks-6P9
페르오키시다제 표지항체	Ks-3C5
포자수	K. Septempunctata 0.5% SDS 가용화 항원	K. Septempunctata 포르말린	K. Thyrsites 0.5% SDS가용화항원	K. Thyrsites 포르말린	K. Lateolabracis 05% SDS 가용화항원	K. Lateolabracis 포르말린
5 ×103	3.608	3.452	0.134	0.235	0.13	0.125
1×103	3.176	2.496	0.13	0.144	0.124	0.124
2×102	1.58	0.882	0.125	0.124	0.12	0.12
4×10	0.561	0.316	0.124	0.121	0.125	0.124
8.0	0.265	0.182	0.123	0.123	0.124	0.125
1.6	0.183	0.137	0.126	0.127	0.125	0.126
0.3	0.154	0.139	0.126	0.127	0.127	0.127
0.5%젤라틴	0.148	0.132	0.131	0.131	0.133	0.133

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 표6의 결과를 통해 Ks-3 C5와 Ks-6 F9의 편성으로의 샌드위치 ELISA법의 검출 감도는, 쿠도아 셉템푼타타의 가용화 포자액이면 8개 이상의 포자로 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출할 수 있다. 포르말린 포자액이면 40개로 이상의 포자에서 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출할 수 있다.

(샌드위치 ELISA법에 따른 면역크로마트법에 적절한 항체의 추출)

5 mg/mL의 정제 단일클론항체를 PBS로 5μg/mL가 되도록 희석해, 100μL씩 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 4℃에서 하룻밤 두었다. 항체 용액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 블로킹액으로서 0.5%젤라틴 함유 PBS를 300μmL 각 웹에 나누어 주입해, 실온으로 1시간 두었다. 블로킹액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 1×106/mL의 농도에 조정한 포자액을 2회 동결 융해해, 전술의 가용화 처리를 실시한 가용화 포자액, 혹은 포르말린 함유 PBS로 현탁된 것만의 포르말린 포자 용액을 5×103개/웹이 되도록 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 실온에서 1시간 두었다.

포자액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체를 0.55 젤라틴 함유 PBS로 200배 희석해, 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 웹에 더해 실온으로 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해서 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치에 의해 490 nm의 흡광도를 측정했다.

(면역크로마트법에 사용하는 항체가 결합하는 항원 단백질의 확인)

단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9의 항원 인식 부위를 결정하기 위해, 면역 염색법과 웨스턴 블랏법을 실시했다(자세한 것은 각각 단락 0074로 0075). 이 결과로부터, K-3 C5와 Ks-6 F9는 ,　모두 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 단백질에 결합해(그림1 참조), 분자량 25,000~37,000의 범위(28,000 부근)의 단백질을 인식하고 있는 항체인 것을 확인했다(도2 참조).

(면역 염색법에 따르는 항체의 항원에의 결합 상태 관찰)

단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9의 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 단백질에의 결합 상태를 이하의 면역 염색법(항원 항체 반응(해당 결합 상태)을 가시화하기 위한 발색법)으로 관찰했다. 1×10^６/mL의 포르말린 함유 쿠도아 셉템푼타타를 10μL사용했다. PBS로 2회 원심 세정해(6,000 rpm, 3분 , 실온), 상청을 제거한다. 심사를 10μg/mL에 희석한 정제 단일클론항체 100μL로 현탁시켜, 30분, 실온에서 두었다. 그 후, PBS로 2회 원심 세정해(6,000 rpm, 3분 , 실온), FITC 표지 된 항mouse IgG 항체(SantaCruzBiotechnology, Inc)를 PBS로 50배 희석해, 30분 , 실온에서 두었다. 그 후, PBS로 2회 원심 세정해(6,000 rpm, 3분 , 실온), 심사를 20μL의 PBS로 현탁시켜, 이 현탁액을 형광 현미경으로 관찰했다. 그림1의 위상차 현미경상과 FITC 형광 염색상에 나타나는 것처럼 단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9가, 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 단백질에 결합하고 있는 것이 알았다.

(웨스턴 블랏법에 따른 항체가 인식하는 항원 단백질 분자량의 분류)

단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9가 인식하는 쿠도아 셉템푼타타의 포자 내부의 단백질의 분자량을 웨스턴 블랏으로 분류했다. 1×10^６개/mL의 포르말린 함유 쿠도아 셉템푼타타를 10μL사용했다. 포자액에, 등량의10%2- 메르캅토 에탄올 함유 SDS-PAGE 샘플 버퍼를 더한 후, 100℃에서 10분간 가열했다. 가열한 포자액을, 폴리아크릴 아미드겔 인 SuperSep10-20%(와코우순약)를 이용해 전기 영동 한 후, 폴리 불화비닐리덴(이하 「PVDF」라고 한다. ) 막에 전사했다. 전사 후, PVDF막은, 1% 스킴밀크 함유 PBS로 블로킹 작업을 실시했다. 블로킹 후, 0.05%Tween20 함유 PBS로 3회 세정해, 블로킹액으로 10μg/mL에 희석한 페르오키시다제 표지한 단일클론항체를 더해 실온에서 60분간 두었다. 그 후, 0.05%Tween20 함유 PBS로 3회 세정해, 발색 기질인 EzWestBlue(아토 주식회사)를 2 mL 더해 1분간 반응시켰다. 그 후, 대량의 증류수로 세정 후, 출현한 밴드를 확인했다. 출현한 밴드의 위치로부터 마커의 단백질 분자량을 분류한 결과, 도2에 나타나는 바와 같이 단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9는 ,모두 분자량 25,000~37,000의 범위(28,000 부근)의 단백질을 인식했다.

(Ks-3 C5주, Ks-6 F9주의 서브 클래스의 확인)

단일클론항체 K-3 C5와 Ks-6 F9의 특성인 서브 클래스를 조사하기 위해, IsoStripMouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit (RocheLifeScience)를 이용해 시험했다. 그 결과, 양쪽 항체모두 IgG1의 서브 클래스에 속해, 경쇄가 κ사슬로 분류했다.

(하이브리드마의 기탁)

단일클론항체 Ks-3 C5를 생성하는 하는 하이브리드마는, 2016년 1월 15일부로 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 수탁 번호 「NITEP-02181」으로 기탁되었다. 단일클론항체 Ks-6 F9를 생성하는 하이브리드마는, 2016년 1월 15일부로 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 수탁 번호 「NITEP-02182」로 기탁되었다.

검사 키트를을 구성하는 검사도구의 제작과 제작한 검사도구의 성능을 평가했다.

(면역크로마트 시험편의 제작과 쿠도아 셉템푼타타의 검출의 확인)

(A) 항체 고상화 멤브레인의 제작

도포에 사용하는 단일클론항체 Ks-6 F9의 농도를 1 mg/mL에 5 mM인산 완충액(pH7. 0)으로 희석해, 도포기를 이용해 Hi-FlowPlusHF135 니트로셀 루 로스 멤브레인(메르크 미리포아)에 1μL/cm의 조건으로 도포했다. 그 후, 60℃에서 30분간 두고, 건조시켰다. 건조 후, 0.5%함유 50 mM붕산 완충액(pH8. 5)에 담근 후, 실온에서 하루 건조시켰다. 해당 건조시킨 후, 저습보관고로 해당 멤브레인을 보존했다.

(B) 복합체 패드의 제작

금 콜로이드에 결합시키는 단일클론항체 Ks-3 C5를 100μg/mL에 순수한 물로 희석해, 10 mL의 40 nm의 금 콜로이드 용액(BBISolutions)에 더해 실온에서 30분간 두었다. 그 후, 20 mL1%소 혈청알부민 함유 트리스 완충액(pH8. 0)에서 2회 원심 세정 후(10,000 rpm, 4℃로 15분간), 상청을 제거해, 심사를 2 mL의1% 소 혈청알부민 함유 트리스 완충액(pH8. 0)에서 현탁시켜, 4℃에서 냉장 보존했다. 냉장 보존 후에 1 mL의 양의, 항체가 결합한 금 콜로이드 용액을 10 mm×150 mm의 Glassfiberconjugatepad(메르크 미리포아)에 도포해, 진공 저온 건조기를 이용해 60℃에서 30분간 해당 Glassfiberconjugatepad를 건조한 후, 해당 복합체 패드를 저습보관고에서 보존했다.

(C) 각부재의 적층(맞붙임) 공정

상기에서 제작한 항체 고상화 멤브레인, 복합체 패드, 샘플 패드로서 흡수 패드로서 Cellulosefibersamplepad(메르크 미리포아), 벡킹 시트(Lohmann)를 준비했다. 벡킹 시트의 각부재의 붙임 위치에, 항체 고상화 멤브레인, 흡수 패드, 복합체 패드, 샘플 패드의 순서로 각 부재가 2 mm씩 겹치도록 붙여 맞추었다.

(D) 재단 공정

부재를 접착시킨 벡킹 시트를 재단기로 5 mm폭으로 절단 해, 저습보관고에 보존했다. 또한 이 공정으로 면역크로마트 시험편의 샘플 패드 측의 단부의 형상과 흡액패드측의 단부의 형상을 다른 것으로 하기 위해, 흡액 측 단부를 시료의 흐름 방향에 피스듬하게 컷 할 수 있다.

(검출 감도의 정성적 평가)

포르말린 함유 PBS로 현탁된 것 만의 쿠도아 셉템푼타타 포르말린 포자 용액을 5×10⁴/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석해, 그리고 5배 단계 희석을 실시한 시험 샘플을 얻었다. 그 후, 100μL의 희석 포자액을 제작한 면역크로마트 시험편에 적하시켜, 면역크로마트 시험편의 검출 감도의 정성적 평가를 했다.

면역크로마트 시험편의 쿠도아 셉템푼타타의 검출 감도를 표7에 나타낸다.

K.septempunctata
5×104개/mL	1×104개/mL	0.2×104개/mL	PBS
+	-	-	-

상기 표 7의 결과를 통해, 포자수 5,000개 정도가 검출 감도인 것이 판명되었다.

(교차성의 정성적 평가)

쿠도아 셉템푼타타 포자를 포르말린 함유 PBS로 현탁된 것 만의 포르말린 포자 용액을 5×10⁴/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석해, 100 μL의 희석 포자액을 제작한 면역크로마트 시험편에 적하시켜, Ks-6 F9항체와 Ks-3 C5항체를 도포한 면역크로마트 시험편의 교차성을 정성적으로 평가했다. 대상으로, 넙치육 1 g를 1 mL의 PBS에 더해 핑거매셔(Sarstedt)로 동질화 해, 똑같이 반응성의 유무를 평가했다.

Ks-6 F9항체와 Ks-3 C5항체를 도포한 면역크로마트 시험편에 의한 교차성을 표8에 나타낸다.

K septempunctata 포르말린	K thyrsites 포르말린	K lateolabracis 포르말린	넙치육	PBS
+	-	-	-	-

상기 표8에서, 상기 표8에 기재한 각 검체의 해당 현탁액을 적하한 해당 면역크로마트 시험편의 해당 멤브레인상의 테스트 라인이 발색했을 때(해당 항체가 항원과 반응한 것을 나타낸다. ) 를 「+」라고 하고, 발색하지 않았을 때를 「-」이라고 했다. 상기 표8의 결과를 통해, 해당 시험편에 사용되는 Ks-6 F9항체와 Ks-3 C5항체의 편성은, 넙치에 기생하는 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스에 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응하는 것이 인정되었다. 이것으로, 해당 단일클론항체를 사용한 면역크로마트 시험편을 사용하는 것으로, 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 본 면역크로마트 시험편을 넙치 이외 어류의 쿠도아속 점액포자충의 검출에 사용하는 것도, 특별히 제한은 없다.

(ELISA법검사도구에 의한 쿠도아 셉템푼타타 검출의 확인)

본 발명과 관련되는 단일클론항체를 이용한 ELISA법검사도구의 구성과 해당검사도구의 성능을 확인했다.

(ELISA법검사도구의 구성 부재)

ELISA법 용 96 웹 마이크로 플레이트는 맥시 소프(Thermo Scientific 주식회사)를 사용했다. ELISA법 용 마이크로 플레이트 고상화용 항체는 Ks-6 F9주, 페르오키시다제 표지 항체는 Ks-3 C5주를 사용했다. 세정 용액은 0.05%Tween20 함유 PBS를 사용했다. 블로킹 용액은 0.5%젤라틴 함유 PBS를 사용했다. 기질은 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 사용했다. 반응 정지액으로서는 2 N황산을 사용했다.

(페르오키시다제 효소 표지 항체의 제작)

샌드위치 ELISA법으로 사용하는 페르오키시다제가 표지된 항체를 제작하기 위해, 정제한 단일클론항체(Ks-3 C5주)를 PeroxidaseLabelingKit-NH2(동인화학)를 이용하고, 항체에 페르오키시다제를 표지 했다. 최종적으로는, 1 mg/mL의 페르오키시다제 표지 단일클론항체(Ks-3 C5주)를 얻은 후, -80℃에서 동결 보존 했다.

(검출 감도의 정량적 평가)

쿠도아 셉템푼타타 포자를 포르말린 함유 PBS로 현탁시킨 것만의 포르말린 포자 용액을 5×10⁴의 농도가 되도록 PBS로 희석해, 그리고 5배 단계 희석을 실시해, 시험 샘플을 얻었다. 그 후, 100μL의 각 희석 포자액을 이용해 ELISA법시험을 실시해, 반응성을 정량적으로 평가했다. 5 mg/mL의 정제 단일클론항체(Ks-6 F9)를 PBS로 5μg/mL가 되도록 희석해, 100μL씩 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 4℃에서 하룻밤 두었다. 항체 용액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 블로킹액으로서 0.5%젤라틴 함유 PBS를 300μL 각 웹에 나누어 주입해, 실온에서 1시간 두었다. 블로킹액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다.

그 후, 상기 희석 포자액을 각 웹에 100μL 더해 실온에서 1시간 두었다. 희석 포자액을 제거한 후, 0.05% Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체(Ks-3 C5)를 0.5% 젤라틴 함유 PBS로 2000배 희석해, 각 웹 더해 실온으로 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 웹에 더해 실온에서 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치로 490 nm의 흡광도를 측정했다. 쿠도아 셉템푼타타에 대한 ELISA법검사도구의 검출 감도를 표9에 나타낸다.

포자수	K. septempumnctata 포르말린
5×103	2.504
１×103	0.974
２×103	0.291
４×10	0.108
8.0	0.058
0.5％젤라틴	0.052

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 상기의 결과를 통해, 포자수 40개 정도가 검출 감도인 것을 판명되었다.

(교차성의 정량적 평가)

포르말린 함유 PBS로 현탁시킨 것만의 포르말린 포자 용액을 5×10⁴개/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석해, 100μL의 희석 포자액을 제작한 면역크로마트 시험편에 적하시켜, 반응성을 확인했다. 5 mg/mL의 정제 단일클론항체(Ks-6 F9)를 PBS로 5μg/mL가 되도록 희석해, 100μL씩 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 4℃에서 하룻밤 두었다. 항체 용액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 블로킹액으로서 0.5%젤라틴 함유 PBS를 100μL 각 웹에 나누어 주입해, 실온에서 1시간 두었다. 블로킹액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 상기 희석 포자액을 각 웹에 100μL 더해 실온에서 1시간 두었다. 희석 포자액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다.

그 후, 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체(Ks-3 C5)를 0.5%젤라틴 함유 PBS로 2000배 희석해, 각 웹에 더해 실온에서 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 혈에 더해 실온으로 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치로 490 nm의 흡광도를 측정했다. ELISA법검사도구에 의한 단일클론항체(Ks-6 F9, Ks-3 C5)의 교차성의 평가 결과를 표10에 나타낸다.

ELISA법검사도구에 의한 단일클론항체(Ks-6 F9, Ks-3 C5)의 교차성의 정량적 평가의 평가 결과를 표10에 나타낸다.

포자수	K. septempunctata 포르말린	K. thyrsites 포르말린	K. lateolabracis 포르말린
5 ×103	2.504	0.058	0.047
1×103	0.974	0.047	0.047
2×102	0.291	0.047	0.048
4×10	0.108	0.044	0.046
8.0	0.058	0.046	0.046
0.5%젤라틴	0.052	0.049	0.05

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 상기의 표10를 통해, 쿠도아 셉템푼타타의 흡광도와 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스의 흡광도를 비교하면, 쿠도아 티르시테스나 쿠도아 라테오라브라시스의 수치와 비교해 쿠도아 셉템푼타타의 수치가 유의하게 높기 때문에(쿠도아 티르시테스 등의 수치는 해당 항체가 반응하지 않는 배경인 0.5%젤라틴과 동등), 해당 단일클론항체를 사용한 해당 검사도구는 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 알았다.

(검사 키트의 성능 평가)

(I) 면역크로마트 시험편을 사용한 검사 키트

검체채취도구로서 나사 외경 2.1 mm, 길이 38 mm의 나사((주) 야하타 나사 「미니 피스」MN-38 Cu)를 사용했다. 해당 면역크로마트 시험편으로서는, 실시예 3의 시험편을 사용했다. 해당 시험편의 항체 고상화 멤브레인에는 단일클론항체 Ks-6 F9가 도포되고 있어 복합체 패드에는, 금 콜로이드 용액으로 표지된 단일클론항체 Ks-3 C5가 도포되었다. 넙치 육편 1 g 당의 감염되어 있는 개수가 다른 3 종류(1.23×10^６개/g, 4.5×10⁵개/g, 7.5×10⁴/g)의 쿠도아 셉템푼타타에 감염된 넙치육과 미감염 넙치육(현미경검사에서 미감염을 확인)의 합계 4종류를 샘플로 했다. 해당 나사를 넙치에게 직접 찔러, 넙치의 생체로부터 직접 넙치육을 채취했다. 그 후 넙치육을 포함한 나사의 무게를 계량해, 사전에 계량해둔 나사 단체의 무게를 뺀 넙치육의 무게를 계량 했다.

그 결과, 채취한 넙치육 중량은 15 mg였다. 해당 넙치육과 PBS중의 넙치육이 10 mg/mL의 농도가 되도록 PBS를 튜브에 더해, 상하로 충분히 흔들어 혼합하여, 넙치육의 현탁액을 얻었다. 또한 샘플을 더욱 소편화하는 경우에는, 튜브로 바꾸어 핑거 매셔 등의 호모지나이저를 사용했다. 그 후, 스포이드(0.2 mL용, 아즈 원 주식회사)를 이용해 튜브내의 넙치육 현탁액을 채취해, 면역크로마트 시험편에 3방울 적하했다. 면역크로마트 시험편의 판정 결과의 측정 부위에 있는 테스트 라인의 발색의 유무에 따라, 쿠도아 셉템푼타타에 감염되어 있는 넙치육과의 반응성(쿠도아 셉템푼타타와의 반응성)을 확인했다. 면역크로마트 시험편을 사용한 검사 키트의 성능 평가 결과를 표11에 나타낸다.

K. septempunctata 감염 넙치			Ref.
1.23×106개/g	, 4.5×105개/g,	7.5×104/g	미감염 넙치육	PBS
+	+	+	-	-

상기의 표11에 있어서, 해당 시험편의 테스트 라인이 발색했을 때(해당 면역크로마트 시험편에 이용되고 있는 단일클론항체(Ks-6 F9와 Ks-3 C5의 편성)가 항원에 반응했을 때)를 「+」, 발색하지 않았을 때(해당 반응하지 않았을 때)를 「-」이라고 했다. 표11에서는, 미감염의 넙치육으로부터 제작한 해당 현탁액에는 반응하지 않고, 쿠도아 셉템푼타타에 감염한 넙치육으로부터 제작한 해당 현탁액에만 반응하고 있다. 이것으로, 해당 검사 키트가이, 홈 막대 모양 채취도구로 넙치에서 직접, 신속하고 간편하게 넙치육을 채취할 수 있는 것, 해당 검사 키트를을 구성하는 해당 면역크로마트 시험편의 테스트 라인의 발색의 유무에 따라 반응성을 확인할 수 있으므로, 넙치육에서 직접 쿠도아 셉템푼타타에의 반응성을 신속, 간편하게 판정할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

(II) ELISA법검사도구를 사용한 검사 키트

검체채취도구로서는, 실시예 4로 동일한 나사를 사용했다. ELISA용 마이크로 플레이트 고상화용 항체와 페르오키시다제 표지 항체는, 실시예 3과 동일한 Ks-6 F9와 Ks-3 C5의 편성을 이용했다. 넙치 육편 1 g 당의 감염되어 있는 개수가 다른 3 종류(1.23×10^６개/g, 4.5×10⁵개/g, 7.5×10⁴/g)의 쿠도아 셉템푼타타에 감염된 넙치육과 미감염 넙치육(현미경검사에서 미감염을 확인)의 합계 4종류를 샘플로 했다. 해당 나사를 넙치에게 직접 찔러, 넙치육을 채취했다. 그 후 넙치육을 포함한 나사의 무게를 계량해, 사전에 계량해둔 나사 단체의 무게를 뺀 넙치육의 무게를 계량했다. 그 결과, 채취한 넙치육 중량은 15mg였다. 해당 넙치육과 PBS중의 넙치육이 10mg/mL의 농도가 되도록 PBS를 튜브에 충분히 상하로 흔들어 혼합해, 넙치육의 현탁액을 얻었다. 또한 샘플을 더욱 소편화하는 경우에는, 튜브로 바꾸어 핑거 매셔 등의 호모지나이저를 사용했다. 5 mg/mL의 정제 단일클론항체(Ks-6 F9)는 PBS로 5μg/mL가 되도록 희석해, 100μL씩 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 나누어 주입해, 4℃에서 하룻밤 두었다. 항체 용액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다.

그 후, 블로킹액으로 0.5%젤라틴 함유 PBS를 300μL 각 웹에 나누어 주입해, 실온에서 1시간 두었다. 블로킹액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 넙치 현탁액을, 스포이드(0.2 mL용, 아즈 원 주식회사)를 이용해 튜브로 채취해 3방울 96 웹 마이크로 플레이트의 각 웹에 적하시켜, 실온에서 1시간 두었다. 포자액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체(Ks-3 C5)를 0.5%젤라틴 함유 PBS로 2000배 희석해, 각 구명에 더해 실온에서 1시간 두었다. 페르오키시다제 표지 정제 단일클론항체 희석액을 제거한 후, 0.05%Tween20 함유 PBS에서 3회 세정을 실시했다. 그 후, 0.5 mg/mL의 OPD 기질액(Sigma-Aldrich)을 100μL 각 웹에 더해 실온에서 10분 두고, 반응을 정지시키기 위해 2 N황산을 50μL 각 웹에 더해 흡광도 측정 장치로 490 nm의 흡광도를 측정했다. 도구를 사용한 검사 키트의 성능 평가 결과를 표12에 나타낸다.

ELISA법검사도구를 사용한 검사 키트의 성능 평가 결과를 표12에 나타낸다.

K. septempunctata 감염 넙치			Ref.
1.23×106개/g	4.5×105개/g,	7.5×104/g	미감염 넙치육	0.5% 젤라틴
1.339	1.173	0.847	0.232	0.049

상기 수치는 490 nm의 흡광 도수치이다. 표12에 있어서, 쿠도아 셉템푼타타에 감염된 넙치육으로부터 제작된 해당 현탁액(3 종류)의 흡광도가, 미감염의 넙치육으로부터 제작한 해당 현탁액의 흡광도에 비해서 유의하게 높은 수치를 나타내고 있다. 이 결과로부터, 해당 면역크로마트 시험편과 동일한 단일클론항체를 사용한 ELISA법검사도구에 의한 본검사 키트에 있어서도, 원주방향의 홈 막대 모양 채취도구로, 넙치로부터 신속, 간편하게 검체의 넙치육을 채취할 수 있어 넙치육(를 포함한 현탁액)으로부터 직접 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 알았다.

본 발명은, 넙치 등의 물고기에 감염되 식중독의 원인이 되는 쿠도아속 점액포자충을 어육으로부터 직접 검출할 수 있어 대량의 검체의 검사에도 대응할 수 있는, 검사도구, 검사 키트 및 이것들에 이용하는 단일클론항체를 제공할 수 있다.

1 : 샘플 패드 2 : 복합체 패드
3 : 멤브레인 4 : 흡수 패드
5 : 벡킹 시트 6 : 나사
7 : 스포이드 8 : 튜브
9 : 면역크로마트 시험편 10 : ELISA용 마이크로 플레이트

Claims

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(1) 넙치육으로부터 쿠도아 셉템푼타타를 분리하여, 분리된 쿠도아 셉템푼타타의 포자를 포함한 포자 현탁용액을 동결해 융해하는 처리를 실시하는 것으로 포자껍질과 포자 내부의 세포를 파괴하여, 세포를 구성하는 단백질을 용출시킨 현탁용액을 조정하는 공정,
(2) 공정(1)으로 얻어진 단백질을 포유류 또는 조류의 동물에 1회 이상 접종하여, 상기 동물의 체내에서, 단백질에 반응하는 항체를 생성하는 항체생성세포를 만들어 내어, 항체생성세포를 상기 동물로부터 적출하는 공정,
(3) 공정(2)에 의해 얻어진 항체생성세포와 상기 동물과 동일한 동물종의 골수종 세포를 융합하여, 불활화 항체생성세포 A를 제작하는 공정,
(4) 공정(3)으로 얻어진 불활화 항체생성세포 A 중, 상기 쿠도아 셉템푼타타로부터 유래하는 단백질에 반응하는 불활화 항체생성세포 B를 선별하고 쿠도아 티르시테스 및 쿠도아 라테오라브라시스로부터 유래하는 단백질에는 반응하지 않는 불활화 항체생성세포 C를 선별하는 공정,
(5) 공정(4)에서 선별된 불활화 항체생성세포 B 및 불활화 항체생성세포 C를 단일의 세포로 단리한 후, 해당 세포에 단일클론 항체를 생성시키는 공정을 포함하는 단일클론항체 제조방법에 있어서;
상기 단일클론 항체는 IgG1의 서브 클래스에 속하고, κ경쇄를 가지며, 쿠도아 셉템푼타타 내부 구조 분자량 25,000에서 37,000의 범위에 있는 단백질을 인식하는 항체이고, 수탁번호 「NITE P-02181」로 기탁된 하이브리도마 또는 수탁번호 「NITE P-02182」로 기탁된 하이브리도마로부터 생성되는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응하는 단일클론항체 제조방법
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청구항 3항의 방법으로 제조된 쿠도아 셉템푼타타에 특이적으로 반응하는 단일클론항체
수탁번호「NITE P-02181」로 기탁된 하이브리도마 또는 수탁 번호 「NITE P-02182」로 기탁된 하이브리도마로부터 생산된 단일클론 항체를 이용하여 넙치육 시료중 쿠도아 셉템푼타타를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 쿠도아 셉템푼타타의 검출방법
수탁번호 「NITE P-02181」 또는 수탁번호 「NITE P-02182」로 기탁된 하이브리도마
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