KR102018422B1 - Recombinant vector, transformant and method for producing pterostilbene using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형질전환된 대장균(E. coli) 및 방선균(Actinomyces)을 공배양하는 새로운 생합성 시스템을 통하여 테로스틸벤(pterostilbene)을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(4-Coumarate CoA Ligase; 4CL)를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소(Stilbene synthase; STS)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균과 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase; ROMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 이용하여 이들 균주를 공배양함으로써, 테로스틸벤을 생합성적 방법으로 고수율로 수득할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 형질전환함에 있어서, O-메틸트랜스퍼라제 코딩 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 최적화되도록 변이하여 형질전환에 이용함으로써, 테로스틸벤 생산율을 현저히 증가시키는 효과를 나타낸다.The invention and the interrogating stilbene (pterostilbene) through the new biosynthesis system of co-culture the transformed E. coli (E. coli) and actinomycetes (Actinomyces) relates to a method of producing in a high yield.
The present invention relates to E. coli transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding 4-Coumarate CoA Ligase (4CL) and a gene encoding Stilbene synthase (STS). Terostilbene by co-culturing these strains using a Streptomyces venezuelae DHS2001 strain transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding an O-methyltransferase (ROMT) There is an advantage that can be obtained in high yield by a biosynthetic method.
In addition, in the present invention, in transforming a Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, the O-methyltransferase coding gene is mutated to be optimized for the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, thereby transforming the production rate of tetrosetilbene Has an effect of significantly increasing.

Description

재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 테로스틸벤의 생산 방법{Recombinant vector, transformant and method for producing pterostilbene using the same}Recombinant vector, transformant and method for producing pterostilbene using the same

본 발명은 대장균(E. coli) 및 방선균(Actinomyces)을 공배양하는 새로운 생합성 시스템을 통하여 테로스틸벤(pterostilbene)을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of producing a high yield of the interrogating stilbene (pterostilbene) through the new biosynthesis system of co-culture of E. coli (E. coli) and actinomycetes (Actinomyces).

구체적으로 본 발명은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(4-Coumarate CoA Ligase; 4CL)를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소(Stilbene synthase; STS)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균과 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase; ROMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 공배양하여 테로스틸벤을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 재조합 벡터, 그리고 상기 형질전환체에 관한 것이다.Specifically, the present invention is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding 4-Coumarate CoA Ligase (4CL) and a gene encoding Stilbene synthase (STS). A method for producing tetrostilbene by co-culturing a Streptomyces venezuelae DHS2001 strain transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding E. coli and O-methyltransferase (ROMT) It relates to the recombinant vector, and to the transformant.

스틸벤(stilbene)은 식물 유래의 유용 생리 활성 물질로서 항암, 항산화, 함염, 항균 등 효능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 스틸벤 계열 화합물 중, 레스베라트롤(resveratrol)의 유도체인 테로스틸벤(pterostilbene)은 화학구조에 추가적으로 두 개의 메틸기를 더 가지고 있으며, 활성적으로는 수배 내지는 수십 배 향상된 생리 활성 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.Stilbene is a useful plant-derived physiologically active substance known to have anti-cancer, anti-oxidation, salt-containing, and antibacterial effects. Of these stilbene-based compounds, pterostilbene, a derivative of resveratrol, has two additional methyl groups in its chemical structure, and is known to have several times or tens of times more bioactive functions. have.

테로스틸벤의 생합성은 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)를 거쳐 이루어진다. 구체적으로 p-쿠마릭산(p-coumaric acid)이 p-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(p-Coumarate CoA Ligase; 4CL)에 의해 p-쿠마릭 조효소 A (p-coumaric CoA)로 전환된 후, 스틸벤 합성효소(stilbene synthase; STS)에 의해 세 개의 말로닐 조효소 A (malonyl-CoA)와 결합하여 레스베라트롤을 형성한다. 그 후 3,5-O-메틸트랜스퍼라제(3,5-O-methyltranferase; 3,5-OMT)의 연속적 효소작용에 의해, 메틸기가 한 개인 피노스틸벤(pinostilbene)을 거쳐, 최종 목표물질인 테로스틸벤으로 생합성 된다.Biosynthesis of telostilbene is via the phenylpropanoid pathway. Specifically p - Kumar acid (p -coumaric acid) is p - Kumar rate coenzyme A ligase (p -Coumarate CoA Ligase; 4CL) by p - Kumar rigs coenzyme A (p -coumaric CoA) after a conversion to, steel Resveratrol is formed by binding to three malonyl coenzymes A (malonyl-CoA) by a bentilase synthase (STS). Then 3,5- O - methyl transferase (3,5- O -methyltranferase; 3,5-OMT ) via a by continuous enzymatic activity, a methyl group an individual Pinot stilbene (pinostilbene) of a final target substance It is biosynthesized with tetrosetilbene.

테로스틸벤은 항암, 항산화, 항염, 항균 효능 등이 탁월하여 여러 의약품 원료로 활용되고 있으나, 자연에서 얻을 수 있는 양이 매우 제한적이고 화학적 합성도 용이하지 않아, 테로스틸벤을 안정적이고 고수율로 수득할 수 있는 방법에 대한 요구가 지속되고 있다(CN103102254(출원공개공보A), CN104672066(출원공개공보A)). 그러나 아직까지 생합성 루트를 통해 안정적으로 높은 수율의 테로스틸벤을 생산할 수 있는 방법에 대한 개발이 미비한 상태이며, 형질전환된 서로 다른 종류의 균주를 공배양하여 테로스틸벤의 수율을 극대화한 생합성 시스템에 대하여는 전혀 연구된 바가 없다.Terostilbene has been used as a raw material for many medicines because of its excellent anti-cancer, anti-oxidation, anti-inflammatory and antibacterial effects, but it is very limited in amount that can be obtained in nature and its chemical synthesis is not easy. There is a continuing need for methods that can be obtained (CN103102254 (Application Publication A) and CN104672066 (Application Publication A)). However, the development of a method capable of producing a stable and high yield of the testosterone through the biosynthetic route is still insufficient, and the biosynthesis system maximizing the yield of the testosterone by co-cultivating different kinds of transformed strains Has not been studied at all.

본 발명은 형질전환된 대장균(E. coli) 및 방선균(Actinomyces)을 공배양하는 새로운 생합성 시스템을 통하여 테로스틸벤(pterostilbene)을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The invention and the interrogating stilbene (pterostilbene) through the new biosynthesis system of co-culture the transformed E. coli (E. coli) and actinomycetes (Actinomyces) and an object thereof is to provide a method for producing in a high yield.

구체적으로 본 발명은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(4-Coumarate CoA Ligase; 4CL)를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소(Stilbene synthase; STS)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균과 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase; ROMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 공배양하여 테로스틸벤을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Specifically, the present invention is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding 4-Coumarate CoA Ligase (4CL) and a gene encoding Stilbene synthase (STS). A method for producing tetrostilbene by co-culturing a Streptomyces venezuelae DHS2001 strain transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding E. coli and O-methyltransferase (ROMT) The purpose is to provide.

또한, 본 발명은 상기 공배양에 이용되는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is also an object of the present invention to provide a recombinant vector and transformants used in the co-culture.

본 발명은 형질전환된 대장균(E. coli) 및 방선균(Actinomyces)을 공배양하는 새로운 생합성 시스템을 통하여 테로스틸벤(pterostilbene)을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.The invention and the interrogating stilbene (pterostilbene) through the new biosynthesis system of co-culture the transformed E. coli (E. coli) and actinomycetes (Actinomyces) provides a method for producing in a high yield.

본 발명은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(4-Coumarate CoA Ligase; 4CL) 및 스틸벤 합성효소(Stilbene synthase; STS) 발현능을 갖는 대장균; 및 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase; ROMT) 발현능을 갖는 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 공배양하여 테로스틸벤을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention is Escherichia coli having 4-Coumarate CoA Ligase (4CL) and Stilbene synthase (STS) expression ability; And co-culturing the Streptomyces venezuelae DHS2001 strain having O-methyltransferase (ROMT) expression ability.

본 발명에서 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제 및 스틸벤 합성효소 발현능을 갖는 대장균은 바람직하게는 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균일 수 있다.E. coli having the 4-coumarate coenzyme A ligase and stilbene synthase expression ability in the present invention preferably comprises a gene encoding 4-coumarate coenzyme A ligase and a gene encoding stilbene synthase E. coli transformed with the recombinant vector.

본 발명에서 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 4CL (At4CL; Genbank accession no. U18675; 서열번호 1) 유전자일 수 있고, 상기 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 STS (VvSTS; Genbank accession no. DQ459351; 서열번호 2) 유전자일 수 있다.In the present invention, the gene encoding the 4-coumarate coenzyme A ligase is preferably Arabidopsis thaliana ( Arabidopsis). 4CL ( At4CL ; Genbank accession no. U18675; SEQ ID NO: 1) gene derived from thaliana ), and the gene encoding the stilbene synthase is preferably STS ( VvSTS ; Vitis vinifera ); Genbank accession no.DQ459351; SEQ ID NO: 2) gene.

본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.As used herein, the term "recombinant vector" refers to a gene construct that is designed to express a protein of interest in a suitable host cell, and includes a gene construct that contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.

본 발명에서 사용되는 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.As used herein, the term “operably linked” refers to the functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest to perform a general function. For example, a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein can be operably linked to affect the expression of the encoding nucleic acid sequence. Operational linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation may employ enzymes commonly known in the art.

본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등과 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.Vectors that can be used in the present invention include plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors and viral vectors such as adenovirus vectors, retrovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and the like. Suitable expression vectors may include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers and the like, and may be prepared in various ways depending on the purpose.

본 발명에서 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 이를 대장균에 도입하여 발현될 수 있도록 제조된 것이라면 그 제조 방법, 형태 등이 특별히 제한되지 않는다.In the present invention, if the recombinant vector comprising the gene encoding the 4-coumarate coenzyme A ligase and the gene encoding the stilbene synthase is prepared to be expressed by introducing it into E. coli, the preparation method, form, etc. It is not particularly limited.

본 발명의 실시예에서, 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하기 위하여, 유전자 발현벡터로 암피실린(ampicillin) 저항성 마커를 가지는 pET32를 사용하였으며, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 At4CL과 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 VvSTS 두 개의 유전자를 합성하여 실험을 진행하였다(Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2001 May25, 3451-3460). 구체적으로, pET32에 NotI, XbaI 제한효소를 처리하고, 상기 두 개 식물 유래의 At4CL과 VvSTS 생합성 유전자에 각각 NotI, HindIII 와 HindIII, XbaI 제한효소를 처리한 다음, 라이게이션(ligation)을 통해 pET32-PT7-At4CL-VvSTS 발현벡터 pYJ1869를 구축하였다(도 3).In an embodiment of the present invention, in order to construct a recombinant vector comprising a gene encoding the 4-coumarate coenzyme A ligase and a gene encoding a stilbene synthase, an ampicillin resistance marker is used as a gene expression vector. Eggplant pET32 was used and two genes, At4CL from Arabidopsis thaliana and VvSTS from Vitis vinifera , were synthesized and tested (Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered). Escherichia coli.Appl Environ Microbiol. 2001 May 25, 3451-3460). Specifically, pET32 is treated with NotI and XbaI restriction enzymes, At4CL and VvSTS biosynthetic genes derived from the two plants are treated with NotI, HindIII and HindIII, and XbaI restriction enzymes , respectively , and then pET32- through ligation. P T7 - At4CL - VvSTS expression vector pYJ1869 was constructed (FIG. 3).

본 발명의 실시예에서, 상기 대장균은 대장균 BL21 (DE3) (NEB사의 제품)을 사용하였다.In the embodiment of the present invention, the E. coli was used E. coli BL21 (DE3) (NEB Co.).

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.As used herein, the term “transformation” refers to the introduction of DNA into a host so that the DNA can be replicated as a factor of chromosome or by chromosomal integration, and by introducing external DNA into the cell artificially It means a phenomenon that causes a change.

본 발명에서 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 대장균을 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 재조합 벡터가 대장균에 도입되어 발현될 수 있도록 처리하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 형질전환 방법을 포함한다. In the present invention, the method for transforming E. coli using a recombinant vector comprising the gene encoding the 4-coumarate coenzyme A ligase and the gene encoding the stilbene synthase is not particularly limited, and the recombinant vector is E. coli. Any method that is introduced into and treated to be expressed includes all transformation methods that can be used in the art.

구체적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 환원물질인 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기 천공법(electroporation), 전기 충격 유전자 전달법, 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.Specifically, the transformation method includes the CaCl 2 precipitation method, the Hanahan method which improved efficiency by using DMSO (dimethyl sulfoxide) as the reducing material in the CaCl 2 method, electroporation, electroshock gene transfer method, calcium phosphate precipitation method, Protoplast fusion, agitation with silicon carbide fibers, agro bacteria mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation, and the like. .

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터 pYJ1869를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하기 위하여 전기 충격 유전자 전달법을 사용하였고, 콜로니 선별은 암피실린(50 μg/ml)이 포함된 LB (Luria Bertani) 한천배지를 사용하였으며 생산용 배지로 YM9 (Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2001 May25, 3451-3460) 혹은 R2YE 액체 배지를 사용하였다.In an embodiment of the present invention, the transfected vector pYJ1869 was transformed into E. coli BL21 (DE3) using electric shock gene transfer method, colony selection LB (Luria Bertani) agar containing ampicillin (50 μg / ml) The medium was used and YM9 (Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2001 May25, 3451-3460) or R2YE liquid medium was used as the production medium.

본 발명에서 상기 O-메틸트랜스퍼라제 발현능을 갖는 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주는 바람직하게는 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주일 수 있다.In the present invention, the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain having the O-methyltransferase expression ability is preferably Streptomyces Venezuelan DHS2001 transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding O-methyltransferase. May be a strain.

본 발명에서 상기 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 ROMT (VvROMT; Genbank accession no. FM178870; 서열번호 3) 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주의 코돈에 맞추어 최적화되도록 변이시킨 VvROMTop (서열번호 4) 유전자일 수 있다. 이와 같이 VvROMT 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 최적화되도록 변이하여 이용함으로써, 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에서의 O-메틸트랜스퍼라제 발현을 극대화하여 테로스틸벤 생산율을 현저히 증가시키는 이점이 있다.In the present invention, the gene encoding the O-methyltransferase is preferably a ROMT derived from Vitis vinifera . ( VvROMT ; Genbank accession no. FM178870; SEQ ID NO: 3) The gene may be a VvROMT op (SEQ ID NO: 4) gene that is mutated to optimize for the codon of Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain. As such, by using the VvROMT gene mutated to be optimized for the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, the advantage of maximizing O-methyltransferase expression in Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain and significantly increasing the rate of the production of terosetilbene have.

본 발명에서 상기 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 이를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 도입하여 발현될 수 있도록 제조된 것이라면 그 제조 방법, 형태 등이 특별히 제한되지 않는다.In the present invention, the recombinant vector including the gene encoding the O-methyltransferase is not particularly limited as long as it is manufactured to be expressed by introducing it into the Streptomyces Venezuela DHS2001 strain.

본 발명의 실시예에서, 상기 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하기 위하여, 유전자 발현벡터로 티오스트렙톤(thiostrepton) 저항성 마커를 가지는 pSE34를 사용하였으며, 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 VvROMT 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주의 코돈에 맞추어 최적화되도록 변이시킨 VvROMTop (서열번호 4) 유전자를 이용해 실험을 진행하였다. 구체적으로, 이종숙주에서의 pYJ1852 발현벡터를 구축하기 위하여 단계별 서브클로닝을 진행하였다. 먼저 리트머스 28 벡터를 이용하여 pstS 프로모터(서열번호 5), VvROMTop와 터미네이터 (terminator)를 다단계 라이게이션을 통해 이어준 다음(pLitmus28-PpstS-VvROMTop-Tdes), MfeI 과 XbaI 제한효소를 처리하여, 최종 pSE34 발현벡터에 삽입해 넣었다(도 6).In an embodiment of the present invention, in order to construct a recombinant vector including the gene encoding the O-methyltransferase, pSE34 having a thiostrepton resistance marker was used as a gene expression vector, and it was a Vitis vinifera. (Vitis vinifera) was carried out an experiment using the VvROMT op (SEQ ID NO: 4) in which the gene VvROMT gene derived from the variation to be optimized in accordance with the Streptomyces Venetian state elrae codon of DHS2001 strain. Specifically, stepwise subcloning was performed to construct pYJ1852 expression vectors in heterologous hosts. First, the pstS promoter (SEQ ID NO: 5), gave after the VvROMT op and terminator (terminator) through a multi-step ligation following (pLitmus28-P pstS-VvROMT op-T des), MfeI and XbaI restriction enzymes, using the Litmus 28 vector The cells were treated and inserted into the final pSE34 expression vector (FIG. 6).

본 발명에서 상기 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래 ATCC15439 균주로부터 피크로마이신(pikromycin) 생합성 관련 유전자를 제거하여 본 발명자들의 선행연구에서 제조한 균주를 의미한다.In the present invention, the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain refers to a strain prepared in the present inventors by removing the pikromycin biosynthesis-related gene from the Streptomyces Venezuelan ATCC15439 strain.

상기 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 제조하는 방법은 다음과 같다. 스트렙토마이세스 베네주엘래 ATCC15439 균주에서 이차대사산물인 피크로마이신 생합성 유전자를 제거하기 위하여 pikAI 생합성 유전자의 왼쪽(left arm; LA) 영역, pikV 생합성 유전자의 오른쪽(right arm; RA) 영역 및 하그로마이신 B류(Hygromycin B) 저항성 유전자를 유전자 결실용 온도 민감성 대장균-스트렙토마이세스 셔틀벡터 pKC1139 (Bierman M, et al. Plasmids cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene 1992 July1, 43-49)에 클로닝하여 최종 유전자 제거 벡터인 pKC1139-LA-HyB-RA를 제작하였다. 다음 벡터를 스트렙토마이세스 베네주엘래에 도입하여 이중교차 재조합에 의해 생합성 유전자 집단이 제거되었다(Yoon et al. Heterologous expression of tylosin polyketide synthase and production of a hybrid bioactive macrolide in Streptomyces venezuelae. Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Feb22, 763-769).The method for producing the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain is as follows. To remove the secondary metabolite, pyromycin biosynthetic gene from Streptomyces Venezuela ATCC15439 strain, the left arm (LA) region of pikAI biosynthetic gene, the right arm (RA) region of pikV biosynthetic gene, and hagro Temperature-sensitive E. coli-Streptomyces shuttle vector pKC1139 (Bierman M, et al. Plasmids cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from E scherichia coli to Streptomyces spp. Gene 1992 July 1 , 43-49), to construct the final gene removal vector pKC1139-LA-HyB-RA. The following vectors were introduced into Streptomyces Venezuela to remove biosynthetic gene populations by double-cross recombination (Yoon et al. Heterologous expression of tylosin polyketide synthase and production of a hybrid bioactive macrolide in Streptomyces venezuelae.Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Feb 22, 763-769).

본 발명에서 사용된 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주는 특히 이차대사산물을 생산하기에 매우 적합한 이종숙주라는 이점이 있다(Yoon et al. Engineering of plant-specific phenylpropanoids biosynthesis in Streptomyces venezuelae. 2009 March 20, 181-188).The Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain used in the present invention has the advantage of being a heterogeneous host that is particularly suitable for producing secondary metabolites (Yoon et al. Engineering of plant-specific phenylpropanoids biosynthesis in Streptomyces venezuelae. 2009 March 20, 181 -188).

본 발명에서 상기 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 재조합 벡터가 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 도입되어 발현될 수 있도록 처리하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 형질전환 방법을 포함한다.In the present invention, a method for transforming a Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain using a recombinant vector comprising the gene encoding the O-methyltransferase is not particularly limited, and the recombinant vector is Streptomyces Venezuelan. Methods for processing to be introduced and expressed in the DHS2001 strain include all transformation methods that can be used in the art.

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터 pYJ1852를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001에 형질전환하기 위하여 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 SGGP 액체배지에 배양하여 원형질체(protoplast)를 제조한 다음 (Kieser et al. Practical Streptomyces Genetics. John Innes Centre. 2000), 콜로니 선별을 위해 R2YE 한천배지를 사용하여 형질전환체를 24 시간 배양 후, 티오스트렙톤(50 μg/ml)을 도포하였다. 포자회수는 ISP4 (50 μg/ml 티오스트렙톤) 한천배지를 사용하였고 생산용으로는 R2YE 액체 배지를 사용하였다.In an embodiment of the present invention, in order to transform the recombinant vector pYJ1852 into Streptomyces Venezuelan DHS2001, the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain was cultured in SGGP liquid medium to prepare a protoplast (Kieser et. Practical Streptomyces Genetics.John Innes Centre. 2000), and transformants were incubated for 24 hours using R2YE agar medium for colony selection, followed by thiostrepton (50 μg / ml). Spore collection was performed using ISP4 (50 μg / ml thiostrepton) agar medium and R2YE liquid medium for production.

본 발명에서 상기 대장균과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 공배양하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 두 가지 상이한 균주가 함께 생존할 수 있도록 배양하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 배양 방법을 포함한다.In the present invention, the method of co-culturing the E. coli and Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain is not particularly limited, and any culture method that may be used in the art may be used if the two different strains are cultured to survive together. It includes.

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터 pYJ1869로 형질전환시킨 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869 및 상기 재조합 벡터 pYJ1852로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852 두 가지 균주를 각각 배양하여 세포를 회수한 다음, 공배양을 진행하였다.In an embodiment of the present invention, cells were recovered by culturing two strains of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 transformed with the recombinant vector pYJ1869 and two strains of Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 transformed with the recombinant vector pYJ1852. Then, coculture was performed.

구체적으로, 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869의 경우, 2 ml LB 배지에서 230 RPM, 37℃ 조건에서 12 시간 동안 종균 배양(seed culture) 후, 50 ml의 LB 배지에서 OD600가 0.1이 되도록 재접종을 진행하였다. 이어지는 본 배양(mian culture)에서는, 배양액의 OD600 값이 0.8이 되었을 때, 1 mM의 IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하였고, 3 시간 배양 후 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다.Specifically, in the case of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869, seed culture for 12 hours at 230 RPM, 37 ℃ condition in 2 ml LB medium, re-inoculated so that the OD 600 is 0.1 in 50 ml of LB medium. Proceeded. In the following mian culture, when the OD 600 value of the culture medium was 0.8, 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) was added, and the culture solution was centrifuged after 3 hours of culture. Supernatant was removed and cells were harvested.

스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852의 경우, 포자 현탁액을 5 ml R2YE 액체 배지를 사용하여 230 RPM, 30℃ 조건에서 36 시간 동안 종균 배양하였다. 이어 본 배양에서는 종균 배양액 500 μl를 50 ml의 R2YE에 재접종 하였고, 48 시간 배양 후 세포를 회수하였다.For Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852, spore suspensions were spawned for 36 hours at 230 RPM, 30 ° C. using 5 ml R2YE liquid medium. In this culture, 500 μl of the spawn medium was reinoculated into 50 ml of R2YE, and the cells were recovered after 48 hours of incubation.

그 다음, 상기와 같이 각각 회수된 균주 중 0.025 g의 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869과 0.25 g의 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852를 취하여, 50 μg/l 암피실린, 50 μg/l 티오스트렙톤, 1 mM IPTG, 2 mM p-쿠마릭산을 함유한 25 ml의 R2YE 액체 배지에서 230 RPM, 30℃ 조건에서 48 시간 동안 공배양하였다.Next, take 0.025 g of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 and 0.25 g of Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 in each of the recovered strains as described above, 50 μg / l ampicillin, 50 μg / l thiostrepton , Co-cultured in 25 ml of R2YE liquid medium containing 1 mM IPTG, 2 mM p -coumaric acid at 230 RPM, 30 ° C. for 48 hours.

본 발명은 상기 형질전환된 대장균과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 공배양함으로써, 그 배양액으로부터 테로스틸벤을 높을 수율로 수득할 수 있다.In the present invention, by co-culturing the transformed E. coli and Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, it can be obtained in a high yield of the testosterone from the culture.

본 발명에서 사용되는 용어, "배양액"은 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함한 것, 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 본 발명에서 배양액은 배양액 자체, 배양액을 농축한 농축액 또는 배양액을 건조시킨 건조물 형태일 수 있다.As used herein, the term "culture liquid" refers to the culture by inoculating the strain into the liquid medium. The culture solution may be one containing a strain, or a culture filtrate in which the strain is inoculated, and then cultured by inoculation. In the present invention, the culture medium may be in the form of a culture medium itself, a concentrated solution of concentrated culture medium or a dried product of dried culture medium.

본 발명에서 상기 형질전환된 대장균과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 공배양한 배양액으로부터 테로스틸벤을 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양액을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.In the present invention, the method of separating the terosetilbene from the culture medium co-cultured with the transformed E. coli and Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain is not particularly limited, and may be performed by conventional methods known in the art. . In such a separation method, methods such as centrifugation, filtration, ion exchange chromatography, and crystallization may be used. For example, the culture solution may be centrifuged at low speed to remove the biomass, and the obtained supernatant may be separated by ion exchange chromatography.

본 발명의 실시예에서, 상기 형질전환된 대장균과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 공배양한 후, 그 배양액으로부터 화합물을 추출하고 분리하기 위하여, 우선 배양액 내의 화합물을 에틸아세테이트로 추출 및 분리하였다. 그 다음, 추출 농축액을 메탄올에 용해시켰고, ES positive (+) 이온모드에서 Phenomenex Synergi Polar-RP 컬럼(150ㅧ4.6 mm, 4 um)을 사용하여 LC-ESI-MS/MS (liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, Waters/Micromass-Quattro microTMAPI) 분석을 수행하였다. 분석 용매로는 0.1% (v/v) 포름산(formic acid) 수용액을 용출 용매 A로 하고, 0.1% (v/v) 포름산 수용액과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 20:80으로 섞인 수용액을 용출 용매 B로 하여, 분석 과정에서 유속 400 μl/min으로 용매를 흘려주었다.In an embodiment of the present invention, after co-culturing the transformed E. coli and Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, in order to extract and isolate the compound from the culture, the compound in the culture was first extracted and separated with ethyl acetate . The extract concentrate was then dissolved in methanol and liquid chromatography-electrospray ionization (LC-ESI-MS / MS) using a Phenomenex Synergi Polar-RP column (150 x 4.6 mm, 4 um) in ES positive (+) ion mode. -mass spectrometry, Waters / Micromass-Quattro micro TM API) analysis was performed. As analytical solvent, 0.1% (v / v) formic acid aqueous solution was used as elution solvent A, and 0.1% (v / v) aqueous formic acid solution and acetonitrile were mixed at 20:80 as elution solvent. As B, the solvent was flowed at a flow rate of 400 μl / min during the analysis.

분석을 위한 용매 기울기 조건은 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 초기 40% 용출 용매 B를 0.3 분간 유지 후, 7 분까지 75% 용출 용매 B가 되도록 상승시키고, 이어 15 분까지 85% 용출 용매 B가 되도록 상승시킨 후, 22 분까지 100% 용출 용매 B가 되도록 상승시킨다. 이후 3 분간 100% 용출 용매 B 농도를 유지한 후, 초기 조건 40% 용출 용매 B가 되도록 10 분간 유지하였다.Solvent gradient conditions for analysis were performed as follows. Specifically, after maintaining the initial 40% eluting solvent B for 0.3 minutes, it was raised to be 75% eluting solvent B until 7 minutes, and then increased to be 85% eluting solvent B by 15 minutes, and then 100% eluting solvent B until 22 minutes. Raise to After maintaining the concentration of 100% eluting solvent B for 3 minutes, it was maintained for 10 minutes to be the initial condition 40% eluting solvent B.

목표물질에 대한 MS/MS (mass spectrum) 검출방법 및 정량은 MRM (multiple reactions monitoring) 모드로 수행하였다. 양이온화된 분자 이온이 선택된 분석물질에 특이적인 해당조각(산물) 이온으로 전환되는 것을 탐지하기 위하여 두 개의 질량이온 [모이온(parent mass ion) > 딸이온(daughter mass ion)]을 선택하여 수행하였다: 레스베라트롤 229>135, 피노스틸벤 243>121, 테로스틸벤 257>133. 표준물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다.MS / MS (mass spectrum) detection and quantification of the target material was carried out in MRM (multiple reactions monitoring) mode. Performed by selecting two mass ions [parent mass> daughter mass ion] to detect the conversion of cationized molecular ions into corresponding fragment ions specific to the selected analyte. Resveratrol 229> 135, pinostilbene 243> 121, terrostilbene 257> 133. Standards were purchased from Sigma-Aldrich.

본 발명은 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에서 발현이 증가되도록 변이시킨 서열번호 4의 O-메틸트랜스퍼라제 코딩 유전자를 제공한다.The present invention provides an O-methyltransferase coding gene of SEQ ID NO: 4 which is mutated to increase expression in Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain.

본 발명에서 상기 서열번호 4의 O-메틸트랜스퍼라제 코딩 유전자는 바람직하게는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 ROMT (VvROMT; Genbank accession no. FM178870; 서열번호 3) 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주의 코돈에 맞추어 최적화되도록 변이시킨 VvROMTop 유전자일 수 있다. 이와 같이 VvROMT 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 최적화되도록 변이하여 이용함으로써, 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에서의 O-메틸트랜스퍼라제 발현을 극대화하여 테로스틸벤 생산율을 현저히 증가시키는 이점이 있다.In the present invention, the O-methyltransferase coding gene of SEQ ID NO: 4 is preferably a ROMT derived from Vitis vinifera . ( VvROMT ; Genbank accession no. FM178870; SEQ ID NO: 3) The gene may be a VvROMT op gene which is mutated to be optimized for codons of the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain. As such, by using the VvROMT gene mutated to be optimized for the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, the advantage of maximizing O-methyltransferase expression in Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain and significantly increasing the rate of the production of terosetilbene have.

본 발명은 상기 서열번호 4의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 이를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 도입하여 발현될 수 있도록 제조된 것이라면 그 제조 방법, 형태 등이 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 도 6의 개열지도와 같이 제조되었다. 상기 재조합 벡터의 정의, 사용 가능한 벡터 등에 대한 구체적인 설명은 상기에서 설명한 바와 같다. The present invention provides a recombinant vector comprising the gene of SEQ ID NO: 4. The recombinant vector is not particularly limited as long as the recombinant vector is prepared to be expressed by introducing it into Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain. In an embodiment of the present invention, the recombinant vector was prepared as shown in FIG. 6. The definition of the recombinant vector, the detailed description of the usable vector, etc. are as described above.

본 발명은 상기 서열번호 4의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 형질전환시키는 방법 및 그 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 제공한다.The present invention provides a method for transforming a Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain using a recombinant vector comprising the gene of SEQ ID NO: 4, and provides the transformed Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain.

본 발명에서 상기 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 재조합 벡터가 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 도입되어 발현될 수 있도록 처리하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 형질전환 방법을 포함한다. 상기 형질전환의 정의, 구첵저인 형질전환 방법의 예시 등은 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the method for transforming the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain is not particularly limited, and the recombinant vector may be introduced into the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain and treated so as to be expressed in the art. Includes all transformation methods that can be used. The definition of the transformation, an example of a transformation method that is a composer, etc. are as described above.

본 발명은 형질전환된 대장균(E.coli) 및 방선균(Actinomyces)을 공배양하는 새로운 생합성 시스템을 제공함으로써 테로스틸벤(pterostilbene)을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.The present invention by providing new biosynthetic system of co-culture of the transformed Escherichia coli (E.coli) and actinomycetes (Actinomyces) and the interrogating stilbene (pterostilbene) provides a method for producing in a high yield.

구체적으로 본 발명은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제(4-Coumarate CoA Ligase; 4CL)를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소(Stilbene synthase; STS)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균과 O-메틸트랜스퍼라제(O-methyltransferase; ROMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 이용하여 이들 균주를 공배양함으로써, 충분한 양의 자연적 수득이 어렵고 화학적 합성도 용이하지 않은 테로스틸벤을 생합성적 방법으로 고수율로 수득할 수 있는 이점이 있다.Specifically, the present invention is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding 4-Coumarate CoA Ligase (4CL) and a gene encoding Stilbene synthase (STS). By co-culturing these strains using a Streptomyces venezuelae DHS2001 strain transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding E. coli and O-methyltransferase (ROMT), There is an advantage that it is possible to obtain terrostilbene, which is difficult to obtain naturally in an amount and not easily chemically synthesized, in high yield by a biosynthetic method.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주를 형질전환함에 있어서, O-메틸트랜스퍼라제 코딩 유전자를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주에 최적화되도록 변이하여 형질전환에 이용함으로써, O-메틸트랜스퍼라제의 발현을 극대화하여 테로스틸벤 생산율을 현저히 증가시키는 효과를 나타낸다.In addition, in the present invention, in transforming a Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain, O-methyltransferase coding gene is mutated to be optimized for the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain and used for transformation, O-methyltransfer Maximizing the expression of lase shows an effect of significantly increasing the production rate of testilbene.

도 1은 테로스틸벤의 생합성 경로를 나타낸 것이다(도면에서, 4CL은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제; STS는 스틸벤 합성효소; 3,5-OMT는 3,5-O-메틸트랜스퍼라제를 나타냄).
도 2는 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869와 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852의 공배양을 통한 테로스틸벤 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 pET32 벡터에 아라비돕시스 탈리아나 유래 4CL 코딩 유전자 At4CL과 비티스 비니훼라 유래 STS 코딩 유전자 VvSTS를 포함하는 pYJ1869 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869에서의 레스베라트롤 생합성 과정을 나타낸 것으로, 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869를 이종숙주로 사용하고 이에 p-쿠마린산을 첨가하는 경우, At4CL과 VvSTS 유전자에 의해 레스테라트롤이 생합성 된다.
도 5는 LC-ESI MS 장비를 이용한 레스베라트롤의 MRM (multiple-reaction-monitoring) 크로마토그램 및 MS/MS (mass spectrum) 분석 결과를 나타낸 그래프로, (A)는 레스베라트롤 표준물질 MRM TIC, (B)는 레스베라트롤 m/z 299 MS/MS, (C)는 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869 발현을 통한 레스베라트롤 생산 추출물 MRM TIC, (D)는 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869로 생산된 레스베라트롤 MS/MS를 나타낸다.
도 6은 대장균-방선균 셔틀벡터(E.coli-Streptomyces shuttle vector)인 pSE34에 비티스 비니훼라 유래의 O-메틸트랜스퍼라제 유전자인 VvROMT를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001에 적합하도록 코돈 최적화한 VvROMTop를 포함하는 pYJ1852 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852에서의 테로스틸벤 생합성 과정을 나타낸 것으로, 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852를 이종숙주로 사용하고 이에 레스베라트롤을 첨가하는 경우, VvROMTop 유전자에 의해 테로스틸벤이 생합성된다.
도 8은 LC-ESI MS 장비를 이용한 테로스틸벤의 MRM 크로마토그램 및 MS/MS 분석 결과를 나타낸 그래프로, (A)는 피노스틸벤 표준물질 MRM TIC, (B)는 피노스틸벤 m/z 243 MS/MS, (C)는 테로스틸벤 표준물질 MRM TIC, (D)는 테로스틸벤 m/z 257 MS/MS, (E)는 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1869의 발현을 통한 테로스틸벤 생산 추출물 MRM TIC, (F)는 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1869로부터 생산된 테로스틸벤 MS/MS를 나타낸다.
도 9는 대장균 BL21(DE3)/pYJ1869와 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852의 공배양시, p-쿠마릭산 첨가 후의 배양시간에 따른 레스베라트롤, 피노스틸벤 및 테로스틸벤의 생산량에 관한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 1 shows the biosynthetic pathway of the telostilbene (in the figure, 4CL is 4-coumarate coenzyme A ligase; STS is stilbene synthase; 3,5-OMT is 3,5-O-methyltransferase Indicates).
Figure 2 shows the pathogen for the synthesis of terostilbene via co-culture of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 and Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852.
Figure 3 shows a cleavage map of the pYJ1869 expression vector containing the Arabidopsis thaliana-derived 4CL coding gene At4CL and Vitis vinifera -derived STS coding gene VvSTS in the pET32 vector.
Figure 4 shows the resveratrol biosynthesis process in Escherichia coli BL21 (DE3) / pYJ1869, when using Escherichia coli BL21 (DE3) / pYJ1869 as a heterologous host and p- coumarin acid added thereto, the resveratrol by the At4CL and VvSTS gene This is biosynthetic.
5 is a graph showing the results of multiple-reaction-monitoring (MRM) chromatogram and MS / MS (mass spectrum) analysis of resveratrol using LC-ESI MS equipment, (A) is a resveratrol standard MRM TIC, (B) Resveratrol m / z 299 MS / MS, (C) shows the resveratrol production extract MRM TIC through E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 expression, (D) shows resveratrol MS / MS produced with E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 .
Figure 6 is the E. coli - VvROMT op one codon optimized for a methyl transferase gene VvROMT suitable for Streptomyces Venetian state elrae DHS2001 - Streptomyces shuttle vector (E.coli-Streptomyces shuttle vector) of the non-tooth beanie Blow derived from the pSE34 O It shows a cleavage map of the pYJ1852 expression vector comprising.
Figure 7 shows the process for the synthesis of telostilbene in Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852, when using the Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 as a heterogeneous host and resveratrol added to the Tero by VvROMT op gene Stilbene is biosynthesized.
Figure 8 is a graph showing the results of the MRM chromatogram and MS / MS analysis of the testosterone using LC-ESI MS equipment, (A) is the pinostilbene standard MRM TIC, (B) is the pinostilbene m / z 243 MS / MS, (C) is Terostilbene standard MRM TIC, (D) is Terostilbene m / z 257 MS / MS, (E) is Tero via expression of Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1869 The stilbene production extract MRM TIC, (F), represents the telostilbene MS / MS produced from Streptomyces Venezuela DHS2001 / pYJ1869.
Figure 9 shows the results of the production of resveratrol, pinotistilbene and terrostilbene with co-culture of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 and Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852, according to the culture time after the addition of p -coumaric acid. The graph shown.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 균주, 플라스미드 및 배양 조건Example 1: Strains, Plasmids and Culture Conditions

서브클로닝(subcloning)을 위하여 대장균 DH5α (Escherichia coli DH5 α)와 플라스미드 리트머스 28 (Litmus 28, New England Biolabs 제품)을 이용하였다. 레스베라트롤(resveratrol) 생산을 위한 생합성 유전자 발현벡터로 암피실린(ampicillin) 저항성 마커를 가지는 pET32를 사용하였고, 이종숙주로 대장균 BL21 (DE3) (NEB사의 제품)를 사용하였다.E. coli DH5α ( Esherichia coli DH5α) and plasmid litmus 28 (Litmus 28, New England Biolabs) were used for subcloning. PET32 having an ampicillin resistance marker was used as a biosynthetic gene expression vector for resveratrol production, and Escherichia coli BL21 (DE3) (product of NEWB Co., Ltd.) was used as a heterologous host.

O-메틸트랜스퍼라제의 기능 확인을 위한 생합성 유전자 발현벡터로 티오스트렙톤(thiostrepton) 저항성 마커를 가지는 pSE34를 사용하였다(Yoon et al. Generationof multiple bioactive macrolides by hybrid modular polyketide synthasesin Streptomyces venezuelae. Chem Biol. 2002 Feb9, 203-14). 이종숙주로 피크로마이신(picromycin) 생합성 관련 유전자가 삭제된 돌연변이 균주인 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 (Yoon et al. Heterologous expression of tylosin polyketide synthase and production of a hybrid bioactive macrolide in Streptomyces venezuelae. Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Feb22, 763-769)을 사용하였고, SGGP 액체 배지에 배양하여 원형질체(protoplast)를 제조하였다(Kieser et al. Streptomyces Genetics. 2000 John Innes Centre, Norwich).PSE34 with a thiostrepton resistance marker was used as a biosynthetic gene expression vector to confirm the function of O- methyltransferase (Yoon et al. Generation of multiple bioactive macrolides by hybrid modular polyketide synthasesin Streptomyces) venezuelae . Chem Biol. 2002 Feb 9, 203-14). Streptomyces venezuelae DHS2001 (Yoon et al. Heterologous expression of tylosin polyketide synthase and production of a hybrid bioactive macrolide in Streptomyces venezuelae . Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Feb 22, 763-769) was used and cultured in SGGP liquid medium to prepare protoplasts (Kieser et al. Streptomyces Genetics. 2000 John Innes Centre, Norwich).

실시예Example 2: 발현벡터 구축 및 돌연변이체 확보 2: Construct expression vector and secure mutants

실시예 2-1: pET32-PExample 2-1: pET32-P T7T7 -- At4CLAt4CL -- VvSTSVvSTS 발현벡터 pYJ1869 Expression vector pYJ1869

레스베라트롤 생합성 시스템을 위하여, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 4CL (At4CL; Genbank accession no. U18675; 서열번호 1)과 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 STS (VvSTS; Genbank accession no. DQ459351; 서열번호 2) 두 개의 유전자를 합성하여 실험을 진행하였다(Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2001 May25, 3451-3460). 구체적으로, pET32에 NotI, XbaI 제한효소를 처리하고, 상기 두 개 식물 유래의 At4CL과 VvSTS 생합성 유전자에 각각 NotI, HindIII 와 HindIII, XbaI 제한효소를 처리한 다음, 라이게이션(ligation)을 통해 pET32-PT7-At4CL-VvSTS 발현벡터 pYJ1869를 구축하였다(도 3).For the resveratrol biosynthesis system, 4CL ( At4CL ; Genbank accession no. U18675; SEQ ID NO: 1) from Arabidopsis thaliana and STS ( VvSTS ; Genbank accession no. DQ459351) from Vitis vinifera ; SEQ ID NO: 2) Two genes were synthesized and tested (Koffas et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2001 May 25, 3451-3460). Specifically, pET32 is treated with NotI and XbaI restriction enzymes, At4CL and VvSTS biosynthetic genes derived from the two plants are treated with NotI, HindIII and HindIII, and XbaI restriction enzymes , respectively , and then pET32- through ligation. P T7 - At4CL - VvSTS expression vector pYJ1869 was constructed (FIG. 3).

실시예 2-2: pSE34-PExample 2-2: pSE34-P pstS-VvROMTpstS-VvROMT op-Top-T desdes 발현벡터 pYJ1852 Expression vector pYJ1852

스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 돌연변이주 내에서 비티스 비니훼라(Vitis vinifera) 유래의 ROMT (VvROMT; Genbank accession no. FM178870; 서열번호 3) (Hugueney P et al. A stress-inducible resveratrol O-methyltransferase involved in the biosynthesis of pterostilbene in grapevine. Plant Physiol. 2008 Sep17, 1630-1639)를 발현시키고자, 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 코돈에 맞추어 최적화하였으며, 상기 최적화한 유전자 VvROMTop (서열번호 4)를 이용해 실험을 진행하였다. 구체적으로, 이종숙주에서의 pYJ1852 발현벡터를 구축하기 위하여 단계별 서브클로닝을 진행하였다. 먼저 리트머스 28 벡터를 이용하여 pstS 프로모터(서열번호 5), VvROMTop와 터미네이터 (terminator)를 다단계 라이게이션을 통해 이어준 다음(pLitmus28-PpstS-VvROMTop-Tdes), MfeI 과 XbaI 제한효소를 처리하여, 최종 pSE34 발현벡터에 삽입해 넣었다(도 6).ROMT from Vitis vinifera in Streptomyces Venezuelan DHS2001 Mutant ( VvROMT ; Genbank accession no.FM178870; SEQ ID NO: 3) To express (Hugueney P et al. A stress-inducible resveratrol O -methyltransferase involved in the biosynthesis of pterostilbene in grapevine.Plan Physiol. 2008 Sep17, 1630-1639) , Streptomyces Venezuelan DHS2001 codon was optimized, and the experiment was conducted using the optimized gene VvROMT op (SEQ ID NO: 4). Specifically, stepwise subcloning was performed to construct pYJ1852 expression vectors in heterologous hosts. First, the pstS promoter (SEQ ID NO: 5), gave after the VvROMT op and terminator (terminator) through a multi-step ligation following (pLitmus28-P pstS-VvROMT op-T des), MfeI and XbaI restriction enzymes, using the Litmus 28 vector The cells were treated and inserted into the final pSE34 expression vector (FIG. 6).

테로스틸벤 생산 시스템을 구축하기 위한 상기 pYJ1869와 pYJ1852 발현벡터는 모두 유전자 염기서열 분석을 통해 확인하였고, 각각 대장균 BL21 (DE3)과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001로 형질전환하였다.The pYJ1869 and pYJ1852 expression vectors for constructing the telostilbene production system were confirmed by gene sequencing, and transformed into E. coli BL21 (DE3) and Streptomyces Venezuelan DHS2001, respectively.

실시예Example 3: 균주 배양조건 3: strain culture conditions

실시예 3-1: 대장균 BL21 (DE3) 배양조건Example 3-1: Escherichia coli BL21 (DE3) culture conditions

pYJ1869를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하기 위하여 암피실린(50 μg/ml)이 포함된 LB (Luria Bertani) 한천배지에서 콜로니를 선별하였고, 생산용 배지로 YM9 (Koffas et al. 2011) 혹은 R2YE 액체 배지를 사용하였다.To transform pYJ1869 into Escherichia coli BL21 (DE3), colonies were selected from LB (Luria Bertani) agar medium containing ampicillin (50 μg / ml), and YM9 (Koffas et al. 2011) or R2YE liquid as a production medium. Medium was used.

레스베라트롤 생산을 위하여, 먼저 2 ml LB 배지에서 230 RPM, 37℃ 조건에서 12 시간 동안 종균 배양(seed culture) 후, 50 ml의 LB 배지에서 OD600가 0.1이 되도록 재접종을 진행하였다. 이어지는 본 배양(mian culture)에서는, 배양액의 OD600 값이 0.8이 되었을 때, 1 mM의 IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하였고, 3 시간 배양 후 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 25 ml YM9 혹은 R2YE 배지에 옮긴 후, 50 μg/ml 암피실린, 1 mM IPTG, 2 mM p-쿠마릭산을 첨가하여 230 RPM, 30℃ 조건에서 12 시간 동안 배양 하였다.For resveratrol production, seed culture was first performed at 230 RPM and 37 ° C. for 12 hours in 2 ml LB medium, followed by reinoculation to make OD 600 0.1 in 50 ml of LB medium. In the following mian culture, when the OD 600 value of the culture medium was 0.8, 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) was added, and the culture solution was centrifuged after 3 hours of culture. Supernatant was removed and cells were harvested. The recovered cells were transferred to 25 ml YM9 or R2YE medium, and then cultured for 12 hours at 230 RPM and 30 ° C by adding 50 μg / ml ampicillin, 1 mM IPTG, and 2 mM p -coumaric acid.

실시예 3-2: 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 배양조건Example 3-2: Streptomyces Venezuela DHS2001 Culture Conditions

pYJ1852를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001에 형질전환하기 위하여 R2YE 한천배지를 사용하였고, 콜로니 선별을 위해 형질전환체를 24 시간 배양 후, 티오스트렙톤(50 μg/ml)을 도포하였다. 포자회수는 ISP4 (50 μg/ml 티오스트렙톤) 한천배지를 사용하였고 생산용으로는 R2YE 액체 배지를 사용하였다.R2YE agar medium was used to transform pYJ1852 into Streptomyces Venezuelan DHS2001, and after thirty-four hours incubation of the transformants for colony selection, thiostrepton (50 μg / ml) was applied. Spore collection was performed using ISP4 (50 μg / ml thiostrepton) agar medium and R2YE liquid medium for production.

VvROMT 유전자 기능 확인을 위하여 포자 현탁액을 5 ml R2YE 액체 배지를 사용하여 230 RPM, 30℃ 조건에서 36 시간 동안 종균 배양하였다. 이어 본 배양에서는 종균 배양액 500 μl를 50 ml의 R2YE에 재접종 하였고, 48 시간 배양 후 70 μM의 레스베라트롤을 첨가하여 48 시간 동안 추가 배양하였다.Spore suspensions were seeded for 36 hours at 230 RPM, 30 ° C using 5 ml R2YE liquid medium to confirm VvROMT gene function. In this culture, 500 μl of the seed culture was reinoculated into 50 ml of R2YE. After 48 hours of incubation, 70 μM of resveratrol was added and further cultured for 48 hours.

실시예 3-3: 형질전환된 대장균 BL21 (DE3)과 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001의 공배양 조건Example 3-3 Coculture Conditions of Transformed Escherichia Coli BL21 (DE3) and Streptomyces Venezuelan DHS2001

테로스틸벤 생산을 위하여 상기 두 가지 균주를 각각 배양하여 세포를 회수한 다음 공배양을 진행하였다. 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869는 위와 같이 본 배양과정에서 1 mM의 IPTG를 첨가하여 3 시간 배양한 다음 세포를 회수하였고, 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852는 본 배양에서 48 시간 배양 후 세포를 회수하였다. 이어 0.025 g의 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869과 0.25 g의 DHS2001/pYJ1852를 취하여 50 μg/l 암피실린, 50 μg/l 티오스트렙톤, 1 mM IPTG, 2 mM p-쿠마릭산을 함유한 25 ml의 R2YE 액체 배지에서 230 RPM, 30℃ 조건에서 48 시간 동안 공배양하였다.The two strains were cultivated to recover cells after the production of telostilbene, and then coculture was performed. Escherichia coli BL21 (DE3) / pYJ1869 was incubated for 3 hours with 1 mM IPTG in the above culture process, and the cells were recovered, and Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 was cultured for 48 hours in this culture. Recovered. Subsequently, take 0.025 g of E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 and 0.25 g of DHS2001 / pYJ1852 and 25 ml of 50 μg / l ampicillin, 50 μg / l thiostrepton, 1 mM IPTG, 2 mM p -coumaric acid. Co-cultured for 48 hours at 230 RPM, 30 ° C conditions in R2YE liquid medium.

실시예 4: 생합성 화합물의 추출 및 분석Example 4: Extraction and Analysis of Biosynthetic Compounds

배양액에서의 화합물은 에틸아세테이트로 추출 및 분리하였다. 추출 농축액은 메탄올에 용해시켰고, ES positive (+) 이온모드에서 Phenomenex Synergi Polar-RP 컬럼(150ㅧ4.6 mm, 4 μm)을 사용하여 LC-ESI-MS/MS (liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, Waters/Micromass-Quattro microTMAPI) 분석을 수행하였다. 분석 용매로는 0.1% (v/v) 포름산(formic acid) 수용액을 용출 용매 A로 하고, 0.1% (v/v) 포름산 수용액과 아세토나이트릴(acetonitrile)이 20:80으로 섞인 수용액을 용출 용매 B로 하여, 분석 과정에서 유속 400 μl/min으로 용매를 흘려주었다.Compounds in the culture were extracted and separated with ethyl acetate. The extracted concentrate was dissolved in methanol and liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry using LC-ESI-MS / MS using a Phenomenex Synergi Polar-RP column (150 x 4.6 mm, 4 μm) in ES positive (+) ion mode. , Waters / Micromass-Quattro micro ™ API) analysis was performed. As analytical solvent, 0.1% (v / v) formic acid aqueous solution was used as elution solvent A, and 0.1% (v / v) aqueous formic acid solution and acetonitrile were mixed at 20:80 as elution solvent. As B, the solvent was flowed at a flow rate of 400 μl / min during the analysis.

분석을 위한 용매 기울기 조건은 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 초기 40% 용출 용매 B를 0.3 분간 유지 후, 7 분까지 75% 용출 용매 B가 되도록 상승시키고, 이어 15 분까지 85% 용출 용매 B가 되도록 상승시킨 후, 22 분까지 100% 용출 용매 B가 되도록 상승시킨다. 이후 3 분간 100% 용출 용매 B 농도를 유지한 후, 초기 조건 40% 용출 용매 B가 되도록 10 분간 유지하였다.Solvent gradient conditions for analysis were performed as follows. Specifically, after maintaining the initial 40% eluting solvent B for 0.3 minutes, it was raised to be 75% eluting solvent B until 7 minutes, and then increased to be 85% eluting solvent B by 15 minutes, and then 100% eluting solvent B until 22 minutes. Raise to After maintaining the concentration of 100% eluting solvent B for 3 minutes, it was maintained for 10 minutes to be the initial condition 40% eluting solvent B.

목표물질에 대한 MS/MS (mass spectrum) 검출방법 및 정량은 MRM (multiple reactions monitoring) 모드로 수행하였다. 양이온화된 분자 이온이 선택된 분석물질에 특이적인 해당조각(산물) 이온으로 전환되는 것을 탐지하기 위하여 두 개의 질량이온 [모이온(parent mass ion) > 딸이온(daughter mass ion)]을 선택하여 수행하였다: 레스베라트롤 229>135, 피노스틸벤 243>121, 테로스틸벤 257>133. 표준물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다.MS / MS (mass spectrum) detection and quantification of the target material was carried out in MRM (multiple reactions monitoring) mode. Performed by selecting two mass ions [parent mass> daughter mass ion] to detect the conversion of cationized molecular ions into corresponding fragment ions specific to the selected analyte. Resveratrol 229> 135, pinostilbene 243> 121, terrostilbene 257> 133. Standards were purchased from Sigma-Aldrich.

실시예 5: 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869 내 레스베라트롤의 생산 확인Example 5: Confirmation of Production of Resveratrol in Escherichia Coli BL21 (DE3) / pYJ1869

실시예 3-1의 방법으로 형질전환 및 배양한 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869로부터 레스베라트롤의 생산을 확인하기 위하여 실시예 4와 같은 방법으로 생합성 화합물을 추출하고 분석하였다. 간략하게, 이종 숙주에서 레스베라트롤의 생산을 확인하기 위하여 실시예 2에서 제조한 발현벡터 pYJ1869를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869 균주를 제작하였다(도 4). 그 다음, 본 배양과정에서 1 mM IPTG 를 넣어 3 시간 발현한 뒤 원심분리하여 세포를 회수하였다. 확보한 세포는 대조군(control)으로, 대장균 이차대사산물 생산배지 YM9, 그리고 실험군으로 방선균 이차대사산물 생산배지, 즉, 공배양을 위한 R2YE 액체 배지를 사용하여 추가배양을 진행하였으며, 각각에 대해 생산성을 비교분석 하였다.Biosynthetic compounds were extracted and analyzed in the same manner as in Example 4 to confirm the production of resveratrol from E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 transformed and cultured by the method of Example 3-1. Briefly, to confirm the production of resveratrol in a heterologous host, E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 strain was produced by transforming the expression vector pYJ1869 prepared in Example 2 into E. coli BL21 (DE3) (FIG. 4). Then, 1 mM IPTG was added in this culture process for 3 hours, followed by centrifugation to recover cells. The obtained cells were the control (control), Escherichia coli secondary metabolite production medium YM9, and the experimental group was further cultured using the actinomycetes secondary metabolite production medium, that is, R2YE liquid medium for co-culture, the productivity for each Was analyzed.

LC-ESI-MS/MS 분석 조건에서, 10 분에 용출되는 레스베라트롤은 분자이온 [M+H]+이 229 값을 나타내며, 이로부터 절단된 이온은 m/z 135의 값을 나타낸다. 레스베타트롤 표준물질의 정체 시간과 MS/MS 스펙트럼을 비교하여 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869 형질전환체에서 생산된 물질이 레스베라트롤 임을 확인하였다. 그 결과, 레스베라트롤은 YM9 배지에서 200 mg/l, R2YE 배지에서 60 mg/l를 얻어 방선균 생산배지 R2YE에서도 레스베라트롤이 생산됨을 확인하였다(도 5).Under LC-ESI-MS / MS analytical conditions, resveratrol eluted at 10 minutes had a molecular ion [M + H] + of 229 and an ion cleaved therefrom showed a value of m / z 135. The retention time of the resbetarol standard and MS / MS spectra were compared to confirm that the material produced in the E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 transformant was resveratrol. As a result, resveratrol was obtained 200 mg / l in YM9 medium, 60 mg / l in R2YE medium was confirmed that resveratrol is produced in actinomycete production medium R2YE (Fig. 5).

실시예 6: 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852 내 생물전환방법을 이용한 Example 6 Using a Biotransformation Method in Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 VvROMTVvROMT op의 기능 확인Check the function of op

실시예 3-2의 방법으로 형질전환 및 배양한 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852로부터 VvROMTop 유전자의 기능을 확인하기 위하여 실시예 4와 같은 방법으로 생합성 화합물을 추출하고 분석하였다. 간략하게, 이종숙주 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001에서 VvROMTop 유전자의 기능을 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제조한 발현벡터 pYJ1852를 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001에 형질전환 시켜 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852 돌연변이주를 제작하였다. 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852는 레스베라트롤을 전구체로 사용하여 테로스틸벤을 만들었으며(도 7) 이는 LC-ESI-MS/MS로 확인하였다(도 8).Biosynthetic compounds were extracted and analyzed in the same manner as in Example 4 to confirm the function of the VvROMT op gene from Streptomyces Venezuela DHS2001 / pYJ1852 transformed and cultured by the method of Example 3-2. Briefly, in order to confirm the function of the VvROMT op gene in heterologous Streptomyces Venezuela DHS2001, the expression vector pYJ1852 prepared in Example 2 was transformed into Streptomyces Venezuelan DHS2001, and then Streptomyces Venezuela DHS2001 / pYJ1852 mutant strains were constructed. Streptomyces Venezuelan DHS2001 / pYJ1852 made terrostilbene using resveratrol as a precursor (FIG. 7) which was confirmed by LC-ESI-MS / MS (FIG. 8).

실시예 7: 공배양을 통한 테로스틸벤의 생산 확인Example 7: Confirmation of production of terrostilbene through coculture

실시예 3-3의 방법으로 대장균 BL21 (DE3)/pYJ1869와 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001/pYJ1852를 공배양하고 실시예 4의 방법으로 생합성 화합물의 추출 및 분석을 수행하였다. 상기 두 균주의 공배양을 통한 테로스틸벤의 생산을 시간별로 확인한 결과, 48 시간 배양하였을 때 최대 7.8 mg/l의 테로스틸벤이 생산되었으며(도 9), 이는 LC-ESI-MS/MS로 확인하였다.E. coli BL21 (DE3) / pYJ1869 and Streptomyces Venezuela DHS2001 / pYJ1852 were co-cultured by the method of Example 3-3, and biosynthetic compounds were extracted and analyzed by the method of Example 4. As a result of confirming the production of terostilbene through co-culture of the two strains over time, up to 7.8 mg / l of terostilbene was produced when incubated for 48 hours (FIG. 9), which was LC-ESI-MS / MS. Confirmed.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.In the present specification, those skilled in the art of the present invention can fully recognize and infer the details that have been omitted, and the technical spirit or essential configuration of the present invention in addition to the specific examples described in this specification are changed. Many more variations are possible without departing. Therefore, the present invention may be implemented in a manner different from that specifically described and illustrated herein, which can be understood by those skilled in the art.

<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Recombinant vector, transforman and method for producing pterostilbene using the same <130> P17-064-EWHA <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1869 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> At4CL <400> 1 ttacaatggc gccacaagaa caagcagttt ctcaggtgat ggagaaacag agcaacaaca 60 acaacagtga cgtcattttc cgatcaaagt taccggatat ttacatcccg aaccacctat 120 ctctccacga ctacatcttc caaaacatct ccgaattcgc cactaagcct tgcctaatca 180 acggaccaac cggccacgtg tacacttact ccgacgtcca cgtcatctcc cgccaaatcg 240 ccgccaattt tcacaaactc ggcgttaacc aaaacgacgt cgtcatgctc ctcctcccaa 300 actgtcccga attcgtcctc tctttcctcg ccgcctcctt ccgcggcgca accgccaccg 360 ccgcaaaccc tttcttcact ccggcggaga tagctaaaca agccaaagcc tccaacacca 420 aactcataat caccgaagct cgttacgtcg acaaaatcaa accacttcaa aacgacgacg 480 gagtagtcat cgtctgcatc gacgacaacg aatccgtgcc aatccctgaa ggctgcctcc 540 gcttcaccga gttgactcag tcgacaaccg aggcatcaga agtcatcgac tcggtggaga 600 tttcaccgga cgacgtggtg 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tcgcaatgaa agaagaagca gctggtgaag 1500 ttcctgttgc atttgtggtg aaatcgaagg attcggagtt atcagaagat gatgtgaagc 1560 aattcgtgtc gaaacaggtt gtgttttaca agagaatcaa caaagtgttc ttcactgaat 1620 ccattcctaa agctccatca gggaagatat tgaggaaaga tctgagggca aaactagcaa 1680 atggattgtg atggatgatt tcaaccaaaa agcaaagatg atttcaatgt gtatatacat 1740 acaactgttt gacccaacca aggaaacaaa ctcatacgaa ccattgtctt ttgttgttgt 1800 tgttgttgtt gttgttgctg ttcttgcttg attcatgtaa tgagcctttg tgatgaaggt 1860 ggtttcttt 1869 <210> 2 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VvSTS <400> 2 atggcttcag tcgaggaatt tagaaacgct caacgtgcca agggtccggc caccatccta 60 gccattggca cagctacccc cgaccactgt gtctaccagt ctgattatgc tgatttctat 120 ttcagggtca ctaagagcga gcacatgact gcgttgaaga agaagttcaa tcgcatatgt 180 gacaaatcca tgatcaagaa gcgttacatt catttgaccg aagaaatgct tgaggagcac 240 ccaaacattg gtgcttatat ggctccatct cttaacatac gccaagagat tatcactgcc 300 gaggtaccca agctcggtaa ggaagcagcg ttgaaggctc ttaaagagtg gggtcagcct 360 aaatcgaaga tcacccacct 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<220> <223> VvROMT <400> 3 atggatttgg caaacggtgt gatatcagct gagctgcttc atgctcaagc tcatgtctgg 60 aatcatatat tcaacttcat aaagtctatg tcactaaaat gtgctattca actaggcatc 120 ccagacatca tccacaacca tggcaagccc atgactcttc ctgagctagt cgctaagctc 180 ccagtccacc ctaaaaggag tcagtgcgtg taccgtctca tgcgcattct tgttcattct 240 ggcttccttg ctgcgcaaag agtccaacaa ggtaaggaag aggaggggta tgtgcttaca 300 gatgcctcta ggctccttct aatggatgac tccttgagca taaggccctt ggtgcttgcc 360 atgctcgacc caattttaac taaaccatgg cattatctga gtgcttggtt tcaaaatgat 420 gatcccactc cgttccacac tgctcatgag cggtcatttt gggattatgc cggccatgaa 480 ccccagctca acaattcctt caatgaagcc atggctagcg atgctcgctt actcaccagc 540 gtgctgctta aggagggcca gggcgtattt gcggggttga actcattagt tgatgtaggg 600 ggtggcaccg gaaaagtggc caaggccatt gctaacgctt tcccacattt gaactgcacc 660 gtgttagatc tcccccacgt ggttgctggc ttgcaaggga gcaagaactt gaactacttt 720 gcaggtgata tgtttgaggc aattcctcct gcagacgcaa ttttactcaa gtggatactg 780 cacgactgga gcgatgaaga atgcgtgaag atactaaagc gatgcaggga agcaattccg 840 agcaaggaaa acggaggaaa ggtgattatc atagacatga tcatgatgaa gaatcaagga 900 gactacaagt ccacagaaac acagctgttc tttgatatga cgatgatgat tttcgccccg 960 ggtagagaga gggacgagaa cgaatgggag aagctattct tggatgctgg tttcagtcac 1020 tacaagataa ctcccatttt gggtttgagg tccctcattg aggtttatcc ttga 1074 <210> 4 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VvROMTop <400> 4 atggatttgg cgaacggtgt tatcagcgct gagttgttac acgctcaggc gcacgtttgg 60 aaccacattt tcaacttcat caagtccatg tccctgaagt gcgctattca gctcggcatt 120 ccagacatca tccacaacca cggcaagccc atgacgcttc cggagctcgt cgccaagctg 180 ccagtccacc caaagaggtc ccagtgcgtt taccgtctca tgcgcattct ggttcactct 240 ggctttcttg ctgcccagcg ggttcagcag ggaaaggagg aggaggggta tgtgctgaca 300 gacgcttcta ggctcctttt aatggatgac tccttgtcca tcaggccctt ggtgctggcc 360 atgctcgacc caatactcac caagccctgg cactatctgt cggcttggtt ccagaacgat 420 gaccccacgc cgtttcatac ggctcacgag cggtcttttt gggattatgc cggtcacgaa 480 ccgcagctca acaacagctt taatgaagca atggcgtcgg atgcgcgctt gctcaccagc 540 gtgctgctga aggaggggca gggcgtattt gcgggactca actcgttagt tgatgtcggg 600 ggcggcacgg gaaaggtggc caaggctatt gctaacgcct tcccgcacct taactgcacc 660 gtgttagatc tcccccacgt ggttgcgggc ctgcaaggga gcaagaactt gaactacttt 720 gcaggtgaca tgtttgaggc tatcccgccg gcagacgcaa tattactcaa gtggatactc 780 cacgactggt cggacgagga atgcgtgaag atcctcaagc ggtgccggga ggcaattcca 840 agcaaggaaa acggaggcaa ggtgataatc attgacatga tcatgatgaa gaaccaggga 900 gactacaagt ccacggaaac acagcttttc tttgatatga cgatgatgat tttcgccccg 960 ggacgggaga gggacgaaaa cgagtgggag aagctcttct tggatgctgg tttctcccac 1020 tacaagatca cccccatttt gggcctgagg tccctcattg aggtttatcc gtga 1074 <210> 5 <211> 220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS promoter <400> 5 cctcctcgtc tggctgccgc cgggcgaggc ccgcgcacgc ctcacccagc cgcgcgaccg 60 cgagctgctt gacgccgccg tggcgacctc acgccactga cgccttccgg agcgaccgca 120 cccgggcttc cggcacggtt cacttcccgt tcactctcct ccgtcgaccg cttcacctgt 180 tctgcctaat ttcggactca cacggtgcac ggagcactgc 220 <110> EWHA UNIVERSITY-INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Recombinant vector, transforman and method for producing          pterostilbene using the same <130> P17-064-EWHA <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1869 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> At4CL <400> 1 ttacaatggc gccacaagaa caagcagttt ctcaggtgat ggagaaacag agcaacaaca 60 acaacagtga cgtcattttc cgatcaaagt taccggatat ttacatcccg aaccacctat 120 ctctccacga ctacatcttc caaaacatct ccgaattcgc cactaagcct tgcctaatca 180 acggaccaac cggccacgtg tacacttact ccgacgtcca cgtcatctcc cgccaaatcg 240 ccgccaattt tcacaaactc ggcgttaacc aaaacgacgt cgtcatgctc ctcctcccaa 300 actgtcccga attcgtcctc tctttcctcg ccgcctcctt ccgcggcgca accgccaccg 360 ccgcaaaccc tttcttcact ccggcggaga tagctaaaca agccaaagcc tccaacacca 420 aactcataat caccgaagct cgttacgtcg acaaaatcaa accacttcaa aacgacgacg 480 gagtagtcat cgtctgcatc gacgacaacg aatccgtgcc aatccctgaa ggctgcctcc 540 gcttcaccga gttgactcag tcgacaaccg aggcatcaga agtcatcgac tcggtggaga 600 tttcaccgga cgacgtggtg gcactacctt actcctctgg cacgacggga ttaccaaaag 660 gagtgatgct gactcacaag ggactagtca cgagcgttgc tcagcaagtc gacggcgaga 720 acccgaatct ttatttccac agcgatgacg tcatactctg tgttttgccc atgtttcata 780 tctacgcttt gaactcgatc atgttgtgtg gtcttagagt tggtgcggcg attctgataa 840 tgccgaagtt tgagatcaat ctgctattgg agctgatcca gaggtgtaaa gtgacggtgg 900 ctccgatggt tccgccgatt gtgttggcca ttgcgaagtc ttcggagacg gagaagtatg 960 atttgagctc gataagagtg gtgaaatctg gtgctgctcc tcttggtaaa gaacttgaag 1020 atgccgttaa tgccaagttt cctaatgcca aactcggtca gggatacgga atgacggaag 1080 caggtccagt gctagcaatg tcgttaggtt ttgcaaagga accttttccg gttaagtcag 1140 gagcttgtgg tactgttgta agaaatgctg agatgaaaat agttgatcca gacaccggag 1200 attctctttc gaggaatcaa cccggtgaga tttgtattcg tggtcaccag atcatgaaag 1260 gttacctcaa caatccggca gctacagcag agaccattga taaagacggt tggcttcata 1320 ctggagatat tggattgatc gatgacgatg acgagctttt catcgttgat cgattgaaag 1380 aacttatcaa gtataaaggt tttcaggtag ctccggctga gctagaggct ttgctcatcg 1440 gtcatcctga cattactgat gttgctgttg tcgcaatgaa agaagaagca gctggtgaag 1500 ttcctgttgc atttgtggtg aaatcgaagg attcggagtt atcagaagat gatgtgaagc 1560 aattcgtgtc gaaacaggtt gtgttttaca agagaatcaa caaagtgttc ttcactgaat 1620 ccattcctaa agctccatca gggaagatat tgaggaaaga tctgagggca aaactagcaa 1680 atggattgtg atggatgatt tcaaccaaaa agcaaagatg atttcaatgt gtatatacat 1740 acaactgttt gacccaacca aggaaacaaa ctcatacgaa ccattgtctt ttgttgttgt 1800 tgttgttgtt gttgttgctg ttcttgcttg attcatgtaa tgagcctttg tgatgaaggt 1860 ggtttcttt 1869 <210> 2 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VvSTS <400> 2 atggcttcag tcgaggaatt tagaaacgct caacgtgcca agggtccggc caccatccta 60 gccattggca cagctacccc cgaccactgt gtctaccagt ctgattatgc tgatttctat 120 ttcagggtca ctaagagcga gcacatgact gcgttgaaga agaagttcaa tcgcatatgt 180 gacaaatcca tgatcaagaa gcgttacatt catttgaccg aagaaatgct tgaggagcac 240 ccaaacattg gtgcttatat ggctccatct cttaacatac gccaagagat tatcactgcc 300 gaggtaccca agctcggtaa ggaagcagcg ttgaaggctc ttaaagagtg gggtcagcct 360 aaatcgaaga tcacccacct tgtattttgt accacctcag gtgtagaaat gcctggtgca 420 gattataaac tcgctaatct cttaggcctc gaaccatctg tcagaagagt gatgttgtac 480 catcaagggt gctatgcagg tggaactgtc cttcgaactg ctaaggatct tgcagagaat 540 aatgcaggag cacgagttct tgtggtgtgc tctgagatca cagttgttac atttcgcggc 600 ccttccgaag atgctttgga ctctttagtt ggccaagccc tttttggtga tgggtctgca 660 gctgtaatcg taggatcaga tccggatatc tcaattgaac gaccactctt ccagcttgtc 720 tcagcagccc aaacatttat tcctaattct gcaggtgcca ttgcaggaaa cttacgtgag 780 gtgggactca cctttcattt gtggcccaat gtgcccactt taatttctga gaacatagag 840 aaatgtttga ctcaggcttt tgacccactt ggtattagcg attggaactc gttattttgg 900 attgctcacc caggtggccc tgcaattctt gatgcagttg aagcaaaact caatttagat 960 aaaaagaaac tcgaagcaac gaggcatgtg ctaagtgagt atggaaacat gtcaagtgca 1020 tgtgtgttgt ttattttgga tgagatgaga aagaaatccc ttaaggggga gagggccacc 1080 acgggtgaag gattggattg gggagtatta ttcggttttg gaccaggctt gactattgaa 1140 actgttgtgt tacatagcat tcctatggtt acaaattaag cc 1182 <210> 3 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VvROMT <400> 3 atggatttgg caaacggtgt gatatcagct gagctgcttc atgctcaagc tcatgtctgg 60 aatcatatat tcaacttcat aaagtctatg tcactaaaat gtgctattca actaggcatc 120 ccagacatca tccacaacca tggcaagccc atgactcttc ctgagctagt cgctaagctc 180 ccagtccacc ctaaaaggag tcagtgcgtg taccgtctca tgcgcattct tgttcattct 240 ggcttccttg ctgcgcaaag agtccaacaa ggtaaggaag aggaggggta tgtgcttaca 300 gatgcctcta ggctccttct aatggatgac tccttgagca taaggccctt ggtgcttgcc 360 atgctcgacc caattttaac taaaccatgg cattatctga gtgcttggtt tcaaaatgat 420 gatcccactc cgttccacac tgctcatgag cggtcatttt gggattatgc cggccatgaa 480 ccccagctca acaattcctt caatgaagcc atggctagcg atgctcgctt actcaccagc 540 gtgctgctta aggagggcca gggcgtattt gcggggttga actcattagt tgatgtaggg 600 ggtggcaccg gaaaagtggc caaggccatt gctaacgctt tcccacattt gaactgcacc 660 gtgttagatc tcccccacgt ggttgctggc ttgcaaggga gcaagaactt gaactacttt 720 gcaggtgata tgtttgaggc aattcctcct gcagacgcaa ttttactcaa gtggatactg 780 cacgactgga gcgatgaaga atgcgtgaag atactaaagc gatgcaggga agcaattccg 840 agcaaggaaa acggaggaaa ggtgattatc atagacatga tcatgatgaa gaatcaagga 900 gactacaagt ccacagaaac acagctgttc tttgatatga cgatgatgat tttcgccccg 960 ggtagagaga gggacgagaa cgaatgggag aagctattct tggatgctgg tttcagtcac 1020 tacaagataa ctcccatttt gggtttgagg tccctcattg aggtttatcc ttga 1074 <210> 4 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VvROMTop <400> 4 atggatttgg cgaacggtgt tatcagcgct gagttgttac acgctcaggc gcacgtttgg 60 aaccacattt tcaacttcat caagtccatg tccctgaagt gcgctattca gctcggcatt 120 ccagacatca tccacaacca cggcaagccc atgacgcttc cggagctcgt cgccaagctg 180 ccagtccacc caaagaggtc ccagtgcgtt taccgtctca tgcgcattct ggttcactct 240 ggctttcttg ctgcccagcg ggttcagcag ggaaaggagg aggaggggta tgtgctgaca 300 gacgcttcta ggctcctttt aatggatgac tccttgtcca tcaggccctt ggtgctggcc 360 atgctcgacc caatactcac caagccctgg cactatctgt cggcttggtt ccagaacgat 420 gaccccacgc cgtttcatac ggctcacgag cggtcttttt gggattatgc cggtcacgaa 480 ccgcagctca acaacagctt taatgaagca atggcgtcgg atgcgcgctt gctcaccagc 540 gtgctgctga aggaggggca gggcgtattt gcgggactca actcgttagt tgatgtcggg 600 ggcggcacgg gaaaggtggc caaggctatt gctaacgcct tcccgcacct taactgcacc 660 gtgttagatc tcccccacgt ggttgcgggc ctgcaaggga gcaagaactt gaactacttt 720 gcaggtgaca tgtttgaggc tatcccgccg gcagacgcaa tattactcaa gtggatactc 780 cacgactggt cggacgagga atgcgtgaag atcctcaagc ggtgccggga ggcaattcca 840 agcaaggaaa acggaggcaa ggtgataatc attgacatga tcatgatgaa gaaccaggga 900 gactacaagt ccacggaaac acagcttttc tttgatatga cgatgatgat tttcgccccg 960 ggacgggaga gggacgaaaa cgagtgggag aagctcttct tggatgctgg tttctcccac 1020 tacaagatca cccccatttt gggcctgagg tccctcattg aggtttatcc gtga 1074 <210> 5 <211> 220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS promoter <400> 5 cctcctcgtc tggctgccgc cgggcgaggc ccgcgcacgc ctcacccagc cgcgcgaccg 60 cgagctgctt gacgccgccg tggcgacctc acgccactga cgccttccgg agcgaccgca 120 cccgggcttc cggcacggtt cacttcccgt tcactctcct ccgtcgaccg cttcacctgt 180 tctgcctaat ttcggactca cacggtgcac ggagcactgc 220

Claims (13)

4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제 및 스틸벤 합성효소 발현능을 갖는 대장균(E.coli); 및
레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 발현능을 갖는 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) DHS2001 균주를 하나의 배지 내에서 공배양하는 단계를 포함하는, 테로스틸벤을 생산하는 방법.E. coli with 4-coumarate coenzyme A ligase and stilbene synthase expression ability; And
A method for producing terrostilbene comprising coculturing a Streptomyces venezuelae DHS2001 strain having resveratrol O-methyltransferase expression capacity in one medium. 제1항에 있어서, 상기 대장균은 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제를 코딩하는 유전자 및 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인, 방법.The method of claim 1, wherein the E. coli is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding 4-coumarate coenzyme A ligase and a gene encoding stilbene synthase. 제2항에 있어서, 상기 4-쿠마레이트 조효소 A 리가아제는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 클로닝된 서열번호 1의 mRNA에 의해 코딩되는 것이고, 상기 스틸벤 합성효소는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera)로부터 클로닝된 서열번호 2의 mRNA에 의해 코딩되는 것인, 방법.According to claim 2, wherein the 4-coumarate coenzyme A ligase is encoded by the mRNA of SEQ ID NO: 1 cloned from Arabidopsis thaliana , the stilbene synthase Vitis vinifera ( Vitis vinifera) Encoded by the mRNA of SEQ ID NO. 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 것인, 방법.The method of claim 2, wherein the recombinant vector has a cleavage map of FIG. 3. 제1항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 베네주엘래 DHS2001 균주는 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인, 방법.The method of claim 1, wherein the Streptomyces Venezuelan DHS2001 strain is transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding resveratrol O-methyltransferase. 삭제delete 제5항에 있어서, 상기 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 유전자인 것인, 방법.The method of claim 5, wherein the gene encoding resveratrol O-methyltransferase is a gene of SEQ ID NO: 4. 7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 6의 개열지도를 갖는 것인, 방법.The method of claim 5, wherein the recombinant vector has a cleavage map of FIG. 6. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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