KR102016600B1 - Method of producing product using microorganism containing Daucus carota Hsp17.7 gene - Google Patents
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Abstract
당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 배양하여 산물을 생산하는 방법을 제공한다.Provided is a method for producing a product by culturing a microorganism of the genus Escherichia comprising a carrot Hsp17.7 gene.
Description
당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 에스케리키아 속 미생물을 배양하여 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다. It relates to a method for producing a product by culturing a microorganism of the genus Escherichia containing the carrot Hsp17.7 gene.
열 충격 단백질(Heat shock protein, 이하 'HSP'라 함)은 열과 무생물적 스트레스 하에서 발현되는 단백질이다. 그들은 그들의 분자량에 기초하여 5종의 다른 계열로 분류된다: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, 및 작은 HSP(small HSP: sHSP) (12-42 kDa). sHSP는 식물에서 풍부하고 다양하게 존재한다. sHSP는 Drosophila melanogaster에서 4 종, 사람(Homo sapiens)에서 10 종, Caenorhabditis elegans에서 16 종, 및 Arabidopsis thaliana에서 19 종이 발견되었다. 이들은 식물들에서 무생물적 스트레스에 대해서 증가된 내성을 줄 수 있는 것으로 여겨진다.Heat shock protein (hereinafter referred to as'HSP') is a protein expressed under heat and abiotic stress. They are classified into five different families based on their molecular weight: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, and small HSP (sHSP) (12-42 kDa). sHSP is abundant and diverse in plants. sHSP was found in 4 species from Drosophila melanogaster, 10 from human (Homo sapiens), 16 from Caenorhabditis elegans, and 19 from Arabidopsis thaliana. It is believed that they can give plants increased tolerance to inanimate stress.
그러나, 당근 Hsp17.7 유전자가 도입된 에스케리키아 속 미생물, 및 상기 미생물이 아세테이트 및 알코올에 내성을 갖는지에 대하여 전혀 개시된 바가 없다. However, there is no disclosure at all about the microorganism of the genus Escherichia into which the carrot Hsp17.7 gene has been introduced, and whether the microorganism is resistant to acetate and alcohol.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 유전적 변이를 포함하는 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 산물을 생산하는 방법을 제공한다. One aspect provides a method of producing a product comprising culturing a microorganism comprising a genetic mutation that increases the level of the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in a medium.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 유전적 변이를 포함하는 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 산물을 생산하는 방법으로서, 상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물인 것인 방법을 제공한다. One aspect is a method for producing a product comprising culturing a microorganism containing a genetic mutation that increases the level of the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in a medium, wherein the microorganism is a microorganism of the genus Escherichia. Provides a way.
상기 폴리펩티드는 당근 (Daucus carota L.) 유래의 열충격 단백질 Hsp17.7 일 수 있다. 상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 유전적 변이는 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 카피 수를 증가시키는 것은 외부로부터 상기 유전자를 도입하는 것일 수 있다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질감염, 또는 전기천공이 포함될 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. The polypeptide may be a heat shock protein Hsp17.7 derived from carrots (Daucus carota L.). The genetic variation includes anything that increases the level of the polypeptide. The genetic variation may be, for example, increasing the number of copies of the gene encoding the polypeptide. Increasing the number of copies may be introducing the gene from outside. The introduction may include transformation, transduction, transfection, or electroporation. The gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
상기 유전적 변이는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 상기 미생물의 게놈 중에 도입된 것일 수 있다. 상기 유전자는 상기 게놈과 상동 재조합에 의하여 도입된 것일 수 있다. 상기 상동 재조합은 예를 들면, 균주가 대장균인 경우, 게놈의 삽입 부위의 서열 즉 yddE 수도유전자(pseudogene)에 병치된(flanked) 리포단백질(lipoprotein) (Lpp) 유전자 프로모터-Hsp17.7 유전자-플리파제 재조합 표적(Frt) 카세트를 대장균에 도입하고, 선발함으로써 제작될 수 있다. The genetic variation may be that a gene encoding the polypeptide is introduced into the genome of the microorganism. The gene may be introduced by homologous recombination with the genome. The homologous recombination is, for example, when the strain is E. coli, the sequence of the insertion site of the genome, i.e., a lipoprotein (Lpp) gene promoter-Hsp17.7 gene-flanked to the yddE pseudogene. It can be produced by introducing and selecting a lipase recombinant target (Frt) cassette into E. coli.
상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균일 수 있다.The microorganism of the genus Escherichia may be E. coli.
상기 산물은 알코올, 아미노산, 또는 단백질일 수 있다. 상기 알코올은 C1-C20 알코올, 예를 들면, C1-C15 알코올, C1-C10 알코올, 또는 C1-C6 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 1,4-부탄디올, 펜탄올, 또는 헥산올일 수 있다. 상기 아미노산은 리신, 트레오닌, 아르기닌, 또는 트립토판일 수 있다. 상기 단백질은 항체, 효소, 또는 호르몬일 수 있다. The product may be an alcohol, an amino acid, or a protein. The alcohol may be a C1-C20 alcohol, for example, a C1-C15 alcohol, a C1-C10 alcohol, or a C1-C6 alcohol. The alcohol may be methanol, ethanol, propanol, butanol, 1,4-butanediol, pentanol, or hexanol. The amino acid may be lysine, threonine, arginine, or tryptophan. The protein may be an antibody, enzyme, or hormone.
상기 미생물은 산물 생산 경로를 구성하는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 산물이 알코올인 경우, 상기 유전자는 효소코드(EC) 1.1.1.1에 속하는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자일 수 있다. The microorganism may further include a gene encoding an enzyme or a polypeptide constituting a product production pathway. For example, when the product is an alcohol, the gene may encode an enzyme belonging to the enzyme code (EC) 1.1.1.1. The gene may be a gene encoding alcohol dehydrogenase.
또한, 상기 미생물은 상기 산물을 분해하거나 그 농도를 감소시키는 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다. In addition, the microorganism may be a gene encoding an enzyme or protein constituting a pathway for degrading or reducing the concentration of the product is inactivated or attenuated.
상기 배양하는 단계는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다. The step of culturing may be performed according to a conventional method known in the art. The medium used for the culture is, for example, sugar and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, etc. Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, organic acids such as acetic acid may be included individually or as a mixture. The medium is a nitrogen source, for example, peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate individually. Or as a mixture. The medium may contain, for example, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or a corresponding sodium-containing salt as a person. The medium may contain, for example, a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth. In addition, in the culture, essential growth substances such as amino acids and vitamins or appropriate precursors may be added to the culture. The material may be added in a suitable manner to the culture during the cultivation process, for example, batchwise or continuously. The cultivation may be performed under aerobic conditions.
상기 방법은, 얻어진 배양물로부터 목적 산물을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리는 목적 산물에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 산물이 알코올인 경우, 증류를 수행하는 것이 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 산물이 단백질인 경우, 배양액을 원심분리, 또는 여과하여 세포를 분리하고, 세포 파쇄, 침전, 투석, 이온 또는 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함할 수 있다. The method may further include the step of separating the target product from the obtained culture. The separation may vary depending on the desired product. For example, when the target product is alcohol, it may include performing distillation. For example, when the target product is a protein, the culture medium may be centrifuged or filtered to separate cells, and cell disruption, precipitation, dialysis, ion or affinity chromatography may be performed.
상기 방법에 있어서, 상기 배양은 호기 배양으로서 상기 배지는 글루코스를 탄소원으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 호기 배양은 대기와 접촉시키는 상태에서 배양하거나, 또는 배지 중에서 공기와 같은 산소 함유 기체를 불어넣어는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 호기 배양은 배양물을 교반하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 호기 배양에서 산소 농도는 공기 중 포화 농도의 50% 이상, 예를 들면, 50% 내지 100%, 50% 내지 150%, 또는 100% 내지 200%를 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 글루코스는 1 내지 20 (w/v)%, 1 내지 15 (w/v)%, 1 내지 10 (w/v)%, 5 내지 20 (w/v)%, 5 내지 15 (w/v)%, 5 내지 10 (w/v)%, 또는 3 내지 10 (w/v)%일 수 있다. In the above method, the culture is an aerobic culture, and the medium may include glucose as a carbon source. The aerobic culture may further include the step of culturing in contact with the atmosphere, or blowing an oxygen-containing gas such as air in a medium. The aerobic culture may include stirring the culture. In the aerobic culture, the oxygen concentration may include 50% or more of the saturation concentration in the air, for example, 50% to 100%, 50% to 150%, or 100% to 200%. Glucose in the medium is 1 to 20 (w/v)%, 1 to 15 (w/v)%, 1 to 10 (w/v)%, 5 to 20 (w/v)%, 5 to 15 (w /v)%, 5 to 10 (w/v)%, or 3 to 10 (w/v)%.
상기 배양은 0.5 (v/v)% 내지 30.0%, 0.5% 내지 20.0%, 0.5% 내지 15.0%, 0.5% 내지 10.0%, 0.5% 내지 5.0%, 1.0% 내지 30.0%, 1.0% 내지 20.0%, 2.0% 내지 30.0%, 2.5% 내지 30.0%, 3.0% 내지 30.0%, 2.0% 내지 20.0%, 2.5% 내지 15.0%, 3.0% 내지 10.0%, 3.5% 내지 5.0%, 3.5% 내지 10.0%, 또는 1.0 % 내지 3.5 %의 에탄올의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 에탄올은 배양 전 기간 또는 그 일부분에서 존재하는 것일 수 있다. 상기 일부분은 전 배양 배양의 50% 이상의 기간일 수 있다. 상기 에탄올은 배양 말기에 존재하는 것일 수 있다.The culture was 0.5 (v/v)% to 30.0%, 0.5% to 20.0%, 0.5% to 15.0%, 0.5% to 10.0%, 0.5% to 5.0%, 1.0% to 30.0%, 1.0% to 20.0%, 2.0% to 30.0%, 2.5% to 30.0%, 3.0% to 30.0%, 2.0% to 20.0%, 2.5% to 15.0%, 3.0% to 10.0%, 3.5% to 5.0%, 3.5% to 10.0%, or 1.0 % To 3.5% of ethanol. The ethanol may be present in the entire period or a portion thereof. The portion may be a period of 50% or more of the entire culture. The ethanol may be present at the end of the culture.
상기 배양은 10 mM 내지 300 mM, 예를 들면, 10 mM 내지 200 mM, 10 mM 내지 100 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 200 mM, 50 mM 내지 100 mM, 또는 50 mM 내지 200 mM 아세테이트의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 아세테이트는 배양 전 기간 또는 그 일부분에서 존재하는 것일 수 있다. 상기 일부분은 전 배양 배양의 50% 이상의 기간일 수 있다. 상기 에탄올은 배양 말기에 존재하는 것일 수 있다.The culture is 10 mM to 300 mM, for example, 10 mM to 200 mM, 10 mM to 100 mM, 50 mM to 200 mM, 50 mM to 200 mM, 50 mM to 100 mM, or 50 mM to 200 mM acetate It may be performed in the presence of. The acetate may be present in the entire period or a portion thereof. The portion may be a period of 50% or more of the entire culture. The ethanol may be present at the end of the culture.
도 1은 DNA 구조체 제작 과정을 도식화한 것이다.
도 2a 내지 2f는 형질전환 대장균을 지정된 농도 즉, 0 mM, 50 mM, 100 mM, 120 mM, 150 mM, 및 200 mM 소듐 아세테이트를 포함하는 배지 중에서 배양하였을 때 성장을 나타낸다.
도 3a 내지 3f는 형질전환 대장균을 지정된 농도 즉, 0 %, 1 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 및 3.5 % (v/v) 에탄올을 포함하는 배지 중에서 배양하였을 때 성장을 나타낸다. 1 is a schematic diagram of a DNA structure manufacturing process.
2A to 2F show the growth when transformed E. coli was cultured in a medium containing designated concentrations, i.e., 0 mM, 50 mM, 100 mM, 120 mM, 150 mM, and 200 mM sodium acetate.
3A to 3F show growth when transformed E. coli is cultured in a medium containing a designated concentration, that is, 0%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, and 3.5% (v/v) ethanol.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예1: 게놈에 당근 Hsp17.7 유전자가 도입된 형질전환 대장균의 제작Example 1: Construction of transformed E. coli into which the carrot Hsp17.7 gene was introduced into the genome
대장균의 게놈에 당균 Hsp17.7 유전자를 RecE/RecT 재조합(Zhang, Natl. Genet. 20: 123-128, 1998)에 기초하여 도입하여, 형질전환 대장균을 제작하였다. A glycosyl Hsp17.7 gene was introduced into the genome of E. coli based on RecE/RecT recombination (Zhang, Natl. Genet. 20: 123-128, 1998) to prepare transformed E. coli.
구체적으로, 삽입 부위, yddE 수도유전자의 서열이 병치된 "Lpp 유전자 프로모터-Hsp17.7 유전자-Frt 카세트"를 포함한 DNA 구조체를 제조하였다. Frt 카세트는 카나미신 선발 마커를 포함한다. Specifically, a DNA construct including the "Lpp gene promoter-Hsp17.7 gene-Frt cassette" in which the sequence of the insertion site and the yddE capital gene was juxtaposed was prepared. The Frt cassette contains a kanamycin selection marker.
Lpp 유전자 프로모터 및 Hsp17.7 유전자는 Lpp 유전자 (NCBI accession no.: NC_000913.2) 프로모터 특이적(서열번호 3 및 4) 및 Hsp17.7 유전자(서열번호 2) 특이적 프라이머(서열번호 5 및 6)를 사용한 PCR에 의하여 각각 대장균 및 당근으로부터 증폭하였다. Frt 카세트도 Frt 카세트 특이적 프라이머(서열번호 7 및 8)를 사용한 PCR에 의하여 Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit(Gene Bridges 사)에 포함된 FRT 카세트로부터 증폭하였다. 증폭된 Lpp 유전자 프로모터 및 Hsp17.7 유전자는 프라이머 없이 2단계-연장 PCR(two-step extension PCR)에 의하여 결합시켰다. 또한, 증폭된 Lpp 유전자 프로모터, Hsp17.7 유전자, 및 Frt 카세트는 프라이머 없이 2단계-연장 PCR(two-step extension PCR)에 의하여 결합시켰다. 서열번호 3(Is-Lpp_F) 및 8(Frt-Is_R) 프라이머는 삽입 부위, yddE 수도유전자의 서열을 포함하고 있다. The Lpp gene promoter and the Hsp17.7 gene are Lpp gene (NCBI accession no.: NC_000913.2) promoter specific (SEQ ID NOs: 3 and 4) and Hsp17.7 gene (SEQ ID NO: 2) specific primers (SEQ ID NOs: 5 and 6). ) Was amplified from E. coli and carrot, respectively. The Frt cassette was also amplified from the FRT cassette included in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit (Gene Bridges) by PCR using Frt cassette specific primers (SEQ ID NOs: 7 and 8). The amplified Lpp gene promoter and Hsp17.7 gene were bound by two-step extension PCR without primers. In addition, the amplified Lpp gene promoter, Hsp17.7 gene, and Frt cassette were bound by two-step extension PCR without primers. The primers of SEQ ID NOs: 3 (Is-Lpp_F) and 8 (Frt-Is_R) contain the sequence of the insertion site and the yddE sequence.
도 1은 DNA 구조체 제작 과정을 도식화한 것이다. 도 1에서, Is-Lpp_F, Lpp-Hsp17.7_R, Lpp-Hsp17.7_F, Hsp17.7_Frt_R, Hsp17.7_Frt_F, 및 Frt-Is_R는 각각 서열번호 3 내지 8의 프라이머를 나타낸다. 1 is a schematic diagram of a DNA structure manufacturing process. In FIG. 1, Is-Lpp_F, Lpp-Hsp17.7_R, Lpp-Hsp17.7_F, Hsp17.7_Frt_R, Hsp17.7_Frt_F, and Frt-Is_R represent primers of SEQ ID NOs: 3 to 8, respectively.
다음으로, Quick and Easy E.coli Gene Deletion Kit (Gene Bridges GmbH)의 프로토콜에 따라 Red/ET 발현 플라스미드를 상동 재조합을 촉진하기 위하여 대장균 BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 대장균과 플라스미드를 혼합한 후 전기천공(electroporation)을 수행한 후 암피실린 함유 LB 배지에서 배양하여 상기 플라스미드가 도입된 대장균을 얻었다. Next, according to the protocol of the Quick and Easy E.coli Gene Deletion Kit (Gene Bridges GmbH), the Red/ET expression plasmid was introduced into E. coli BL21 (DE3) to promote homologous recombination. After mixing the E. coli and the plasmid, electroporation was performed, and then cultured in an LB medium containing ampicillin to obtain E. coli into which the plasmid was introduced.
다음으로, 선발된 상기 플라스미드가 도입된 대장균을 상기 DNA 구조체와 혼합한 전기천공을 수행한 후 카나미신 함유 LB 배지에서 배양하여 생존하는 세포를 선발하였다. Next, after performing electroporation in which the selected E. coli into which the plasmid was introduced was mixed with the DNA construct, cells that survived by culturing in LB medium containing kanamycin were selected.
ExiPrep Bacterial Genomic DNA kit(Bioneer, 대전)를 사용하여 선발된 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, Hsp17.7 유전자 특이적 프라이머 (서열번호 5 및 6)를 사용한 PCR에 의하여 게놈에 Hsp17.7 유전자가 삽입되었다는 것을 확인하였다. 반면, 공 플라스미드만을 포함하는 세포는 Hsp17.7 유전자가 확인되지 않았다. Genomic DNA was extracted from the selected cells using the ExiPrep Bacterial Genomic DNA kit (Bioneer, Daejeon), and the Hsp17.7 gene was inserted into the genome by PCR using Hsp17.7 gene-specific primers (SEQ ID NOs: 5 and 6). It was confirmed that it was done. On the other hand, the Hsp17.7 gene was not identified in cells containing only the empty plasmid.
또한, 상기 선발된 대장균 세포 중에 Hsp17.7 단백질이 축적되는지 확인하였다. 카나미신 함유 LB 배지 중에서 배양된 세포 배양물을 원심분리하고 얻어진 세포 펠렛을 단백질 추출 버퍼 중에 녹인 후 초음파 처리하고, 이를 다신 원심분리하여 얻어진 상층액에 대하여 SDS-PAGE 겔 전기영동하여 쿠마시 블루 염료를 사용하여 확인하거나, 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 다음 면역블롯팅 분석(immunoblot analysis)을 수행하였다. 면역블롯팅은 ECL Plus system을 사용한 Hsp17.7 단백질에 대한 폴리클론 항체를 사용하여 수행되었다. 그 결과, 형질전환된 대장균 세포에서 Hsp17.7가 대조군에 비하여 현저하게 많이 발현되었다. In addition, it was confirmed whether Hsp17.7 protein was accumulated in the selected E. coli cells. After centrifuging the cell culture cultured in LB medium containing kanamycin, the resulting cell pellet was dissolved in a protein extraction buffer, sonicated, and the supernatant obtained by centrifugation was subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis to Coomassie blue dye. It was confirmed using or transferred to a nitrocellulose membrane, and then immunoblot analysis was performed. Immunoblotting was performed using a polyclonal antibody against Hsp17.7 protein using the ECL Plus system. As a result, Hsp17.7 was significantly more expressed in the transformed E. coli cells than in the control group.
실시예 2: 아세테이트 및 에탄올에 대한 내성의 확인 Example 2: Confirmation of resistance to acetate and ethanol
실시예에서 얻어진 형질전환 대장균을 아세테이트 및 에탄올이 각각 포함된 배지에서 배양하여 생장에 미치는 영향을 확인하였다.The transformed E. coli obtained in the example was cultured in a medium containing acetate and ethanol, respectively, and its effect on growth was confirmed.
상기 형질전환 대장균, 대조군 즉, 상기 Red/ET 발현 플라스미드만 도입된 대장균, 및 음성 대조군으로서 야생형 대장균을 Luria-Betani(LB) 배지 중에 동일한 농도로 접종하고 한 시간마다 9 시간 동안 배양물의 OD600 값을 측정하여 세포 성장을 확인하였다. 이때 배지 중에는 지정된 농도의 아세테이트, 또는 에탄올을 포함하거나, 또는 이 둘을 포함하지 않았다. The transformed E. coli, that is, E. coli into which only the Red/ET expression plasmid was introduced, and wild-type E. coli as a negative control were inoculated at the same concentration in Luria-Betani (LB) medium, and the OD 600 value of the culture for 9 hours every hour Cell growth was confirmed by measuring. At this time, the medium contained acetate or ethanol of a specified concentration, or did not contain both.
그 결과를 도 2a 내지 2f 및 도 3a 내지 3f에 나타내었다. The results are shown in FIGS. 2A to 2F and FIGS. 3A to 3F.
도 2a 내지 2f는 형질전환 대장균을 지정된 농도 즉, 0 mM, 50 mM, 100 mM, 120 mM, 150 mM, 및 200 mM 소듐 아세테이트를 포함하는 배지 중에서 배양하였을 때 성장을 나타낸다. 2A to 2F show the growth when transformed E. coli was cultured in a medium containing designated concentrations, i.e., 0 mM, 50 mM, 100 mM, 120 mM, 150 mM, and 200 mM sodium acetate.
또한, 표 1 및 표 2는 각각 지정된 농도의 에탄올 및 소듐 아세테이트를 포함하는 LB 배지에서 9 시간 동안 하였을 때의 세포 농도를 나타낸다.In addition, Tables 1 and 2 show the cell concentrations performed for 9 hours in LB medium containing ethanol and sodium acetate at the designated concentrations, respectively.
균주
Strain
균주
Strain
도 3a 내지 3f는 형질전환 대장균을 지정된 농도 즉, 0 %, 1 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 및 3.5 % (v/v) 에탄올을 포함하는 배지 중에서 배양하였을 때 성장을 나타낸다. 도 2a 내지 2f 및 도 3a 내지 도 3f에 나타낸 바와 같이, 상기 형질전환 대장균은 대조군에 비하여 더 높은 성장을 유지하였다. 따라서, 상기 형질전환 대장균은 아세테이트와 같은 산성에 대한 내성이 강할 뿐만 아니라, 에탄올과 같은 알코올에 대한 내성이 우수하였다. 따라서, 상기 형질전환 대장균은 산성 및/또는 알코올 함유 조건에서 산물을 생산하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 대장균은 산물을 코딩하는 유전자, 또는 산물 생산에 필요한 중간체를 생산하는데 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 3A to 3F show growth when transformed E. coli is cultured in a medium containing a designated concentration, that is, 0%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, and 3.5% (v/v) ethanol. As shown in FIGS. 2A to 2F and FIGS. 3A to 3F, the transformed E. coli maintained higher growth compared to the control group. Therefore, the transformed E. coli was not only resistant to acids such as acetate, but also to alcohols such as ethanol. Therefore, the transformed E. coli can be effectively used to produce a product under acidic and/or alcohol-containing conditions. Accordingly, the transformed E. coli may further include a gene encoding a product or a gene encoding a polypeptide used to produce an intermediate required for product production.
<110> Sangmyung University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method of producing product using microorganism containing Daucus carota Hsp17.7 gene <130> PN126001KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Daucus carota L. <400> 1 Met Ser Ile Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Val Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Val Trp Asp Pro Phe Lys Asp Phe Pro Leu 20 25 30 Val Thr Ser Ser Ala Ser Glu Phe Gly Lys Glu Thr Ala Ala Phe Val 35 40 45 Asn Thr His Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Gln Ala His Val Phe Lys 50 55 60 Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Leu Glu 65 70 75 80 Glu Gly Lys Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Glu Lys Glu 85 90 95 Glu Lys Asn Asp Lys Trp His Arg Val Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe 100 105 110 Leu Arg Arg Phe Arg Leu Pro Glu Asn Ala Lys Val Asp Glu Val Lys 115 120 125 Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Val Glu 130 135 140 Ile Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 474 <212> DNA <213> Daucus carota <400> 2 atgtcgatca ttccaagctt ttttggaggc cggagaagca acgttttcga cccattctct 60 cttgatgtat gggatccttt caaagatttt cctcttgtta cctcctctgc ctctgagttc 120 ggaaaagaga ctgcagcgtt tgtcaatacg cacattgact ggaaggagac tccccaggct 180 catgtgttca aggccgatct tccagggctg aagaaagaag aggtgaaggt agagcttgaa 240 gaaggaaagg ttcttcagat cagcggagag aggaacaaag agaaggagga gaagaacgac 300 aagtggcacc gagtggaacg cagcagtggc aaatttctga ggaggttcag gcttccagag 360 aatgcaaagg tggatgaggt gaaagctgct atggagaatg gggtgttgac tgttactgtt 420 ccaaaggtgg agatcaagaa gcccgaggtc aaggccattg atatttctgg ttaa 474 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggatcttc cacaatacca atcgcaggcg agaacatgcg accctgtaat attgcttt 58 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggaatgatc gacattatta ataccctcta 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tagagggtat taataatgtc gatcattcca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagaatagga acttcttaac cagaaatatc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatatttctg gttaagaagt tcctattctc 30 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtacgccgg gctttgaact gccgctggag ggtgaagtac gcgcgaatac gactcactat 60 agggc 65 <110> Sangmyung University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method of producing product using microorganism containing Daucus carota Hsp17.7 gene <130> PN126001KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Daucus carota L. <400> 1 Met Ser Ile Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Val Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Val Trp Asp Pro Phe Lys Asp Phe Pro Leu 20 25 30 Val Thr Ser Ser Ala Ser Glu Phe Gly Lys Glu Thr Ala Ala Phe Val 35 40 45 Asn Thr His Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Gln Ala His Val Phe Lys 50 55 60 Ala Asp Leu Pro Gly Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Leu Glu 65 70 75 80 Glu Gly Lys Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Glu Lys Glu 85 90 95 Glu Lys Asn Asp Lys Trp His Arg Val Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe 100 105 110 Leu Arg Arg Phe Arg Leu Pro Glu Asn Ala Lys Val Asp Glu Val Lys 115 120 125 Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Val Glu 130 135 140 Ile Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 474 <212> DNA <213> Daucus carota <400> 2 atgtcgatca ttccaagctt ttttggaggc cggagaagca acgttttcga cccattctct 60 cttgatgtat gggatccttt caaagatttt cctcttgtta cctcctctgc ctctgagttc 120 ggaaaagaga ctgcagcgtt tgtcaatacg cacattgact ggaaggagac tccccaggct 180 catgtgttca aggccgatct tccagggctg aagaaagaag aggtgaaggt agagcttgaa 240 gaaggaaagg ttcttcagat cagcggagag aggaacaaag agaaggagga gaagaacgac 300 aagtggcacc gagtggaacg cagcagtggc aaatttctga ggaggttcag gcttccagag 360 aatgcaaagg tggatgaggt gaaagctgct atggagaatg gggtgttgac tgttactgtt 420 ccaaaggtgg agatcaagaa gcccgaggtc aaggccattg atatttctgg ttaa 474 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggatcttc cacaatacca atcgcaggcg agaacatgcg accctgtaat attgcttt 58 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggaatgatc gacattatta ataccctcta 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tagagggtat taataatgtc gatcattcca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagaatagga acttcttaac cagaaatatc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatatttctg gttaagaagt tcctattctc 30 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtacgccgg gctttgaact gccgctggag ggtgaagtac gcgcgaatac gactcactat 60 agggc 65
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Plant Molecular Biology, Vol. 16, pp. 729-731 (1991.) |
| 박한슬, "식물 열충격단백질의 스트레스 내성 향상 기작 연구 및 산업용 E. coli 균주 개발", 석사학위논문, 상명대학교 (2015.) |
Also Published As
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