KR102013064B1 - Preparation method of organoid derived from teratoma - Google Patents

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KR102013064B1 KR1020180031926A KR20180031926A KR102013064B1 KR 102013064 B1 KR102013064 B1 KR 102013064B1 KR 1020180031926 A KR1020180031926 A KR 1020180031926A KR 20180031926 A KR20180031926 A KR 20180031926A KR 102013064 B1 KR102013064 B1 KR 102013064B1
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도정태
이정언
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Abstract

The present invention relates to a preparation method of an organoid, combined with in vivo and in vitro differentiation methods while being applicable to conventional cell lines where organoids have not been easily formed. By using three-dimensional culture by separating GFP-expressing neural stem cells and tissue including the surrounding cells thereof in teratomas induced by Sox1-GFP transgenic embryonic stem cells, brain organoids have been effectively formed, which can be used as organoid manufacturing techniques.

Description

테라토마 유래 오가노이드 제조 방법{PREPARATION METHOD OF ORGANOID DERIVED FROM TERATOMA}Teratoma-derived organoid manufacturing method {PREPARATION METHOD OF ORGANOID DERIVED FROM TERATOMA}

본 발명은 오가노이드 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 만능줄기세포로 유발한 테라토마 유래 신경줄기세포 조직을 이용한 뇌 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing organoids, and more particularly, to a method for producing brain organoids using teratoma-derived neural stem cell tissue induced by pluripotent stem cells.

줄기세포는 무한한 범위까지 분열하는 능력과 다른 유형의 세포를 형성하기 위해 적합한 환경 하에서 그리고/또는 적합한 자극을 통해 분화하는 능력을 가지는 세포이다. 줄기세포는 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가진다. 다른 유형의 세포로 분화하기 위한 줄기세포들의 다른 잠재력 때문에, 지금까지 배아줄기세포와 성체줄기세포 사이에 구분이 있어 왔다. 수정란세포로부터 배아단계로, 성체 유기체로 발달하면서 줄기세포의 잠재력이 줄어든다는 것이 일반적으로 일치된 의견이다. 이러한 성질에 따라, 수정란세포는 만능(totipotent)이라 일컬어지고, 배아줄기세포는 전분화능(pluripotent)이라 일컬어지고, 성체줄기세포는 다능성(multipotent)이라 일컬어진다. 만능줄기세포(배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포)는 태반 조직을 제외한 모든 세포로 분화가 가능한 다분화능을 지니고 있다. 따라서, 만능줄기세포를 이용한 분화기술을 이용하여 세포치료제를 개발할 수 있다. 세포치료제로 사용되기 위해서는 만능줄기세포에서 분화된 세포는 체내 조직의 세포와 같은 특징을 가지고 있어, 이식 후 정상적인 역할을 해야 한다. 따라서, 만능줄기세포를 이용한 효능성, 안전성을 지닌 세포로 분화 시키는 것이 세포치료제 개발에 있어 선행되어야 할 단계이다. Stem cells are cells that have the capacity to divide to an infinite extent and to differentiate under suitable circumstances and / or with suitable stimuli to form other types of cells. Stem cells have the potential to develop into cells with characteristic shapes and specialized functions. Because of the different potential of stem cells to differentiate into other types of cells, so far there has been a distinction between embryonic stem cells and adult stem cells. It is generally agreed that the development of adult organisms from fertilized egg cells to embryonic stages reduces the potential of stem cells. According to this property, fertilized egg cells are called totipotent, embryonic stem cells are called pluripotent, and adult stem cells are called multipotent. Pluripotent stem cells (embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells) have a multipotent ability to differentiate into all cells except placental tissue. Therefore, it is possible to develop a cell therapy using a differentiation technique using pluripotent stem cells. In order to be used as a cell therapy, cells differentiated from pluripotent stem cells have the same characteristics as the cells of tissues in the body, so they should play a role after transplantation. Therefore, differentiation into cells having efficacy and safety using pluripotent stem cells is a step to be preceded in developing cell therapy products.

이와 같은 줄기세포의 배양 및 분화 방법에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 예컨대,세포의 생체 외 배양 방법으로는, Emerson 등(Emerson et al., U. S. Patent No. 6,326, 198 entitled "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", issued December 4, 2001)이 인간 줄기세포 분열 및/또는 인간 조혈 전구 줄기세포의 생체 외 배양방법과 배양 배지조건을 개시하였다. 개시된 방법에 따라, 골수로부터 기인한 인간 줄기세포 또는 전구세포는 연속적으로 또는 정기적으로, 약 24 내지 48시간 주기 당 배양 ml당 배지 1ml의 속도로 교체되고, 바람직하게는 관류되는 액체 배양 배지에서 배양된다. Kraus 등은(Kraus et al., U. S. Patent No. 6,338, 942, entitled "Selective expansion of target cell populations," issued January 15, 2002) 미리 정해진 표적 세포군을 탯줄 혈액 또는 말초혈액으로부터 성장 배지에 주입하고, 표적 세포 군의 세포를 분열시켜, 세포(CD34 세포와 같은)의 미리 정해진 군에 대한 특정 친화성을 갖는 결합하는 분자(CD34에 대한 단클론 항체)를 포함하는 선택 원소와 성장 배지 내 세포들을 접촉함으로써 선택적으로 확장될 수 있다고 개시한다. Rodgers 등은 (U. S. Patent No. 6,335, 195 entitled "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation", issued January 1, 2002) 조혈 및 중간엽 줄기 세포의 체외 배양과 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 안지오텐신 I (AI), AI 유사물, AI 조각 및 이들의 유사물, 안지오텐신 II (AII), All 유사물, All 단편 또는 이들의 유사물 또는 All AT2 유형 2 수용체 작용제의 존재 하에서 단독으로 또는 다른 성장 인자 및 사이토카인과 병용한 성장에 의한 계통-특정 세포 증식 및 분화 방법을 개시한다. 그러나, 이러한 체외적인 방법(ex vivo method)들의 단점은 시간이 많이 소비되고, 수율이 낮다는 것이다.Various studies have been made on the method of culturing and differentiating stem cells. For example, as an in vitro culture method of cells, Emerson et al. (Emerson et al., US Patent No. 6,326, 198 entitled "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and / or IL-6 secretion of human stromal cells ", issued December 4, 2001). Started. According to the disclosed method, human stem cells or progenitor cells derived from bone marrow are continuously or regularly replaced at a rate of 1 ml of medium per ml of culture per cycle of about 24 to 48 hours, preferably in a perfused liquid culture medium. do. Kraus et al. (Kraus et al., US Patent No. 6,338, 942, entitled “Selective expansion of target cell populations,” issued January 15, 2002) inject a predetermined target cell population into the growth medium from umbilical cord blood or peripheral blood, By dividing the cells of the target cell population by contacting the cells in the growth medium with a selection element comprising binding molecules (monoclonal antibodies to CD34) having a specific affinity for a predetermined group of cells (such as CD34 cells). It is disclosed that it can be selectively extended. Rodgers et al. (US Patent No. 6,335, 195 entitled "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation", issued January 1, 2002) in vitro culture of hematopoietic and mesenchymal stem cells and angiotensinogen, angiotensin Alone or other growth factors in the presence of I (AI), AI analogues, AI fragments and analogues thereof, angiotensin II (AII), All analogues, All fragments or analogues thereof or All AT2 type 2 receptor agonists And a method of lineage-specific cell proliferation and differentiation by growth in combination with cytokines. However, a disadvantage of these ex vivo methods is that they are time consuming and yield low.

최근에는 체내 조직을 모사할 수 있는 분화 방법으로 3차원 조직으로 분화하는 방법인 오가노이드(organoid) 분화 기술이 개발되어 많은 연구가 되고 있으며, 현재까지의 오가노이드 형성 방법은 주로 체외 시스템을 이용하고 있다.Recently, an organoid differentiation technique, which is a method of differentiating into three-dimensional tissues, has been developed as a differentiation method capable of simulating internal tissues, and many researches have been conducted. Until now, an organoid formation method mainly uses an in vitro system. have.

종래의 체외 시스템을 이용한 오가노이드 형성 방법의 한계를 극복하기 위해, 종래의 오가노이드 형성이 용이하지 않던 세포주에도 적용가능한 체내 및 체외 분화 방법을 융합한 오가노이드 형성 방법을 개발하는 것을 목적으로 한다.In order to overcome the limitations of the organoid formation method using a conventional in vitro system, an object of the present invention is to develop an organoid formation method incorporating in vitro and in vitro differentiation methods applicable to cell lines that were not easy to form conventional organoids.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 오가노이드 제조 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing an organoid.

아울러, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 오가노이드를 제공한다.In addition, the present invention provides an organoid prepared by the method of the present invention.

본 발명에 따르면, Sox1-GFP 형질전환 배아줄기세포에 의해 발생 유발된 테라토마에서 GFP를 발현하는 신경줄기세포와 이의 주변 세포를 포함하는 조직을 분리하여 3차원 배양함으로써, 뇌 오가노이드가 효과적으로 형성되었으므로, 이를 오가노이드 제조 기술로서 활용할 수 있다.According to the present invention, brain organoids are effectively formed by separating three-dimensional cultures of neural stem cells expressing GFP and tissues including their surrounding cells in teratomas caused by Sox1-GFP transgenic embryonic stem cells. This can be utilized as an organoid manufacturing technique.

도 1은 테라토마에서 분리한 GFP를 발현하는 신경줄기세포와 이의 주변 세포를 포함하는 초기 신경조직을 3차원 배양하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 테라토마에서 분리한 초기 신경조직의 배양 10일차, 11일차 및 15일차의 모습을 나타낸 도이다.
도 3은 테라토마에서 분리한 신경조직을 오가노이드로 배양한 뒤, 섹션하여 신경마커와 신경줄기세포마커인 Tuj1, Sox2을 면역세포화학을 이용하여 나타낸 도이다.
도 4는 테라토마를 형성하지 않고 바로 오가노이드로 배양된 ESC의 배양 22일차 및 배양 32일차의 모습을 나타낸 도이다.
도 5는 테라토마에서 분리한 단일 신경세포가 배양 10일차에 형성한 신경세포구를 나타낸 도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the process of three-dimensional culture of the initial neural tissue including neural stem cells expressing GFP isolated from the teratoma and its surrounding cells.
Figure 2 is a view showing the state of the 10 days, 11 days and 15 days of culture of the initial neural tissue isolated from the teratoma.
Figure 3 is a diagram showing the neural tissue isolated from the teratoma cultured with organoids, and then sectioned by using the immunocytochemistry Tuj1, Sox2, the neuromarker and neural stem cell markers.
Figure 4 is a view showing the state of day 22 and day 32 culture of the ESC cultured immediately without forming the teratoma organoids.
Figure 5 is a diagram showing the neuronal cells formed on the day 10 culture of single neurons isolated from the teratoma.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the following embodiments are presented by way of illustration of the present invention, and if it is determined that the detailed description of the well-known technology or construction well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description thereof may be omitted. However, the present invention is not limited thereto. The invention is susceptible to various modifications and applications within the scope of the following claims and the equivalent scope thereof.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Also, the terminology used herein is a term used to properly express a preferred embodiment of the present invention, which may vary depending on a user, an operator's intention, or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, the definitions of the terms should be made based on the contents throughout the specification. Throughout the specification, when a part is said to "include" a certain component, it means that it can further include other components, without excluding other components unless specifically stated otherwise.

일 측면에서, 본 발명은 만능줄기세포를 포유동물에 주입하여 테라토마를 형성시키는 단계; 상기 테라토마로부터 성체줄기세포를 포함하는 조직을 분리하는 단계; 상기 조직을 3차원 배양하는 단계를 포함하는 오가노이드(organoid) 제조 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention comprises the steps of forming a teratoma by injecting pluripotent stem cells into a mammal; Separating the tissue containing adult stem cells from the teratoma; It relates to an organoid manufacturing method comprising the step of three-dimensional culture of the tissue.

일 측면에서, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물 유래의 Sox1-GFP 형질전환 만능줄기세포를 인간을 제외한 포유동물에 이식하여 테라토마(teratoma) 형성을 유도하며; 테라토마로부터 성체줄기세포를 포함하는 조직을 분리하고; 및 분리한 성체줄기세포를 포함하는 조직을 3차원 배양하는 것을 포함하는 오가노이드(organoid) 제조 방법에 관한 것이다.In one aspect, the invention transplants Sox1-GFP transformed pluripotent stem cells derived from mammals other than humans into mammals other than humans to induce teratoma formation; Separating the tissue containing adult stem cells from the teratoma; And it relates to a method for producing an organoid (organoid) comprising three-dimensional culture of the tissue containing the separated adult stem cells.

일 구현예에서, 상기 만능줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있으며, 마우스 유래 배아줄기세포인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment, the pluripotent stem cells may be induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells, more preferably mouse-derived embryonic stem cells, but is not limited thereto.

일 구현예에서, 상기 성체줄기세포는 Sox1-GFP를 발현할 수 있으며, 상기 성체줄기세포는 신경줄기세포(Neural stem cell, NSC)일 수 있고, 상기 신경줄기세포는 신경상피세포(neuroepithelial cell)일 수 있다.In one embodiment, the adult stem cells may express Sox1-GFP, the adult stem cells may be neural stem cells (NSC), the neural stem cells may be neuroepithelial cells (neuroepithelial cells) have.

일 구현예에서, 상기 오가노이드는 뇌 오가노이드일 수 있다.In one embodiment, the organoid may be a brain organoid.

일 구현예에서, 3차원 배양은 성체줄기세포를 포함하는 조직을 세포외기질 내부에서 배양하는 것을 포함할 수 있으며, 뇌 오가노이드를 제조하는 경우에는 ESC 배지, NIM(neural induction media), CORD 배지 및 CORDA 배지의 순서로 배지를 교환하여 배양할 수 있다. In one embodiment, the three-dimensional culture may include culturing the tissue containing adult stem cells in the extracellular matrix, and when producing brain organoids, ESC medium, NIM (neural induction media), CORD medium And the culture medium may be exchanged in the order of the CORDA medium.

일 구현예에서, 성체줄기세포를 포함하는 조직은 마트리젤 내부에서 배양될 수 있다.In one embodiment, the tissue comprising adult stem cells may be cultured inside Matrigel.

일 구현예에서, 3차원 배양시 성체줄기세포를 포함하는 조직은 신경세포구(neurosphere)를 형성한 뒤 오가노이드로 발달될 수 있다. In one embodiment, the tissue containing adult stem cells in the three-dimensional culture can be developed into an organoid after forming a neurosphere (neurosphere).

일 구현예에서, 성체줄기세포를 포함하는 조직은 신경줄기세포인 신경상피세포 및 주변 세포로 이루어진 신경조직일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 신경줄기세포와 이의 주변 세포를 포함하는 조직을 3차원 배양한 경우 분화 10일 이후 신경세포구를 형성하고 11일 이후에는 뇌 오가노이드를 형성하였으나, 단일 신경줄기세포를 동일한 조건으로 3차원 배양한 경우에는 신경세포구는 형성하였으나, 뇌 오가노이드로의 발달은 불가능한 것으로 나타났다. 신경세포구는 표면이 매끄러운 구 모양을 형성하고, 오가노이드는 구불거리고 복잡한 표면을 가지며, 신경세포구는 NSC 및 NPC 마커가 발현되나, 뇌오가노이드는 신경줄기세포로부터 분화된 뉴런, 아교세포 등 여러 세포가 섞여 있고, 뇌오가노이드는 단면으로 잘랐을 때, 가장 바깥쪽에는 분화된 세포가 위치해 있고, 안쪽으로 갈수록 분회가 덜 된 신경줄기세포가 존재한다.In one embodiment, the tissue comprising adult stem cells may be neural tissue consisting of neuronal epithelial cells and peripheral cells. In one embodiment, when the three-dimensional culture of the tissue containing the neural stem cells and the surrounding cells of the present invention after 10 days of differentiation, the neuronal cells were formed and after 11 days the brain organoids were formed, but a single neural stem cells are the same In the three-dimensional culture under the condition, neuronal cells were formed, but development into brain organoids was not possible. Neuron cells form smooth spherical surfaces, organoids have a wavy and complex surface, and NSCs and NPC markers are expressed, but brain organoids contain neurons and glial cells differentiated from neural stem cells. When the brain organoids are mixed and cut into sections, the outermost cells are differentiated, and the inner part of the neuronal stem cells is less branched.

일 구현예에서, Sox1는 신경줄기세포인 신경상피세포에서 발현되고, 세포가 분화되면 발현되지 않으며, 분화된 신경세포는 Tuj1를 발현할 수 있다.In one embodiment, Sox1 is expressed in neural epithelial cells, which are neural stem cells, not expressed when the cells are differentiated, and differentiated neurons may express Tuj1.

본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, Hyperflask(Corning Co., USA)와 같이 전방위적인 공기 투과성을 갖는 세포배양 용기도 이에 해당된다.The cell culture vessel of the present invention generally refers to a dish or well plate used for cell culture, and is not particularly limited as long as it is a cell culture vessel used for cell culture. In addition, cell culture vessels having an omnidirectional air permeability such as Hyperflask (Corning Co., USA) are also applicable thereto.

본 발명에 사용된 마트리젤 이외에 세포외기질 역할을 하는 다공성 젤이 사용될 수 있으며, 이의 예로, sigma-aldrich사에서 제조한 HydroMatrixTM Peptide Cell Culture Scaffold, D.A. Narmoneva, et al. / Biomaterials 26 (2005) 4837-4846에 개시된 올리고펩타이드로 이루어진 젤, 국제공개특허 WO2007/029003에 개시된 하이드로젤 미국 특허 US20070099840에 개시된 하이드로젤, M. Zhou et.,al. Biomaterials, 2009, in press에 개시된 세포 부착/지지용 올리고펩타이드 매트릭스, 4 V. Jayawarna, et al.. Acta Biomaterialia, 2009, in press에 개시된 펩타이드 젤 등이 사용될 수 있으며, 세포를 부착 또는 지지하면서 공기 및 배지 투과성인 물질이라면 제한되지 않는다. In addition to the Matrigel used in the present invention, a porous gel that serves as an extracellular matrix may be used. Examples thereof include HydroMatrix ™ Peptide Cell Culture Scaffold manufactured by sigma-aldrich, DA Narmoneva, et al. / Biomaterials 26 (2005) Gels consisting of oligopeptides disclosed in 4837-4846, hydrogels disclosed in WO2007 / 029003, hydrogels disclosed in US Patent US20070099840, M. Zhou et., Al. Oligopeptide matrix for cell attachment / support as disclosed in Biomaterials , 2009, in press , 4V. Jayawarna, et al .. Peptide gels as disclosed in Acta Biomaterialia , 2009, in press , and the like can be used. And any material that is permeable to the medium.

본 발명에서 사용된 "Sox1-GFP 형질전환 만능줄기세포"는 신경줄기세포에서 발현하는 Sox1 유전자 프로모터에 의해 녹색형광단백질(GFP)의 발현이 조절되는 형질전환 세포를 말한다. 따라서, Sox1-GFP 형질전환 만능줄기세포가 신경줄기세포로 분화하면, GFP를 발현한다. As used herein, "Sox1-GFP transformed pluripotent stem cells" refers to transformed cells in which the expression of green fluorescence protein (GFP) is regulated by the Sox1 gene promoter expressed in neural stem cells. Thus, when Sox1-GFP transformed pluripotent stem cells differentiate into neural stem cells, they express GFP.

일 측면에서, 본 발명은 방법으로 제조된 오가노이드에 관한 것이다.In one aspect, the invention relates to organoids prepared by the process.

일 구현예에서, 상기 오가노이드의 표면은 Tuj1를 발현하는 분화된 신경세포를 포함할 수 있다.In one embodiment, the surface of the organoid may comprise differentiated neurons expressing Tuj1.

일 구현예에서, 상기 오가노이드의 내부는 Sox2를 발현하는 신경줄기세포를 포함할 수 있다.In one embodiment, the interior of the organoid may include neural stem cells expressing Sox2.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only intended to embody the contents of the present invention, and the present invention is not limited thereto.

실시예 1. 체내 시스템Example 1 In vivo System

1-1. Sox1-GFP 배아줄기세포 배양1-1. Sox1-GFP Embryonic Stem Cell Culture

Sox1-GFP 형질전환 마우스의 배아줄기세포 (Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Takashima Y, Era T, Nakao K, Kondo S, Kasuga M, Smith AG, Nishikawa S. Cell. 2007 Jun 29;129(7):1377-88.의 Smith AG로부터 입수)를 일반 배아줄기세포 배지에 두 가지 억제제 (CHIR99021 3μM 및 PD0325901 1μM)를 첨가하여 배양하거나 N2B27 배지에 LIF와 상기 두 가지 억제제를 첨가하여 배양하였다. N2B27 배지는 DMEM 및 Neural basal 배지를 1:1로 혼합한 후 N2와 B27 첨가제를 첨가하고 1x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco) 및 0.005% BSA를 첨가하여 제조하였다.Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.Takashima Y, Era T, Nakao K, Kondo S, Kasuga M, Smith AG, Nishikawa S. Cell. 2007 Jun 29; 129 (7): 1377-88. Obtained from Smith AG) was cultured by adding two inhibitors (CHIR99021 3 μM and PD0325901 1 μM) to normal embryonic stem cell medium or by adding LIF and the two inhibitors to N2B27 medium. . N2B27 medium was prepared by mixing DMEM and Neural basal medium in a 1: 1 ratio, adding N2 and B27 additives, and adding 1 × penicillin / streptomycin / glutamine (Gibco) and 0.005% BSA.

1-2. 테라토마 형성 유도 및 초기 신경조직 분리1-2. Induction of teratoma formation and early neural tissue separation

Sox1-GFP 형질전환 마우스의 배아줄기세포 1x106개를 5주령 누드 마우스의 고환(testis)에 피하 이식하였다. 이식 5주 후, 생성된 테라토마를 적출한 뒤, Sox1-GFP가 양성으로 나타난 부위와 주변세포 덩어리를 절개 및 분리하였다. 분리한 초기 신경조직 (초기 신경줄기세포) 및 주변 세포는 DMEM (Gibco BRL)에 15% 소태아 혈청 (FBS; HyClone), 1×페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco BRL), 0.1 mM NEAA(nonessential amino acids) (Gibco BRL), 1 mM b-머캅토에탄올 (Gibco BRL) 및 1000 U/mL mLIF(leukemia inhibitory factor) (ESGRO, Chemicon International)를 추가하여 제조한 ESC 배지에서 하루 동안 배양하였다 (Day0-Day1).1 × 10 6 embryonic stem cells of Sox1-GFP transgenic mice were implanted subcutaneously into testis of 5 week old nude mice. Five weeks after the transplantation, the generated teratoma was extracted, and the site and the surrounding cell mass showing positive Sox1-GFP were excised and separated. Isolated early neural tissue (early neural stem cells) and surrounding cells were 15% fetal bovine serum (FBS; HyClone), 1 × penicillin / streptomycin / glutamine (Gibco BRL), 0.1 mM nonessential amino in DMEM (Gibco BRL). Incubated for one day in ESC medium prepared by adding acids (Gibco BRL), 1 mM b-mercaptoethanol (Gibco BRL) and 1000 U / mL leukemia inhibitory factor (mLG) (ESGRO, Chemicon International) (Day0- Day1).

실시예 2. 체외 시스템Example 2 In Vitro System

2-1. 3차원 배양2-1. 3D culture

상기 실시예 1-2에서 분리한 초기 신경조직을 마트리젤(matrigel)과 혼합한 뒤 배양접시에 분주한 뒤, 신경 분화 배지인 NIM(neural induction media) (DMEM/F12 (Gibco RBL), 1:100 N2 supplement (Invitrogen), P/S/G (Gibco RBL), 0.1mL NEAA (nonessential amino acid) (Gibco RBL) 및 1㎍/mL heparin (Sigma))에서 5일 동안 배양한 뒤 (Day1-Day6), CORD(cerebral organoid without Vitamin media) 배지 (DMEM/F12, Neurobasal (Gibco BRL), N2 supplemnet, B27 without Vitamin A (Invitrogen), 2-mercaptoethanol, 2.5㎍/mL insulin (Gibco BRL), P/S/G 및 0.1mM NEAA)로 배지를 교체하여 배양하였다 (Day6-Day11). 그 후에는 CORDA(cerebral organoid B27 with vitamin A media) 배지 (DMEM/F12, Neurobasal, N2, B27 with vitamin A, 2-mercaptoethanol, 2.5㎍/mL insulin, P/S/G 및 0.1mM NEAA)로 교체하여 배양하였다 (도 1). 그 다음날 세포 교반기에 마트리젤과 혼합된 조직을 옮겨 배양하였다.The initial neural tissue isolated in Example 1-2 was mixed with Matrigel and then dispensed into a culture dish, followed by NIM (neural induction media) (DMEM / F12 (Gibco RBL), 1), which is a neural differentiation medium. Incubated in 100 N2 supplement (Invitrogen), P / S / G (Gibco RBL), 0.1 mL NEAA (nonessential amino acid) (Gibco RBL) and 1 μg / mL heparin (Sigma) for 5 days (Day1-Day6). ), CORD (cerebral organoid without Vitamin media) medium (DMEM / F12, Neurobasal (Gibco BRL), N2 supplemnet, B27 without Vitamin A (Invitrogen), 2-mercaptoethanol, 2.5 μg / mL insulin (Gibco BRL), P / S / G and 0.1 mM NEAA) were incubated with medium replacement (Day6-Day11). Subsequently replaced with CORDA (cerebral organoid B27 with vitamin A media) (DMEM / F12, Neurobasal, N2, B27 with vitamin A, 2-mercaptoethanol, 2.5 μg / mL insulin, P / S / G and 0.1 mM NEAA) And cultured (Fig. 1). The next day, the tissue mixed with Matrigel was transferred to a cell stirrer and cultured.

그 결과, 테라토마에서 분리한 초기 신경조직이 배양 10일차 (Day10)에 신경세포구를 형성하고, 11일차부터 조직 표면에 3차원적으로 오가노이드를 형성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 2). 시간이 지날수록 뇌 오가노이드의 표면이 복잡해지는 것을 확인 할 수 있었다. As a result, it was confirmed that the initial neural tissues separated from the teratoma formed neuronal cells on culture day 10 (Day10), and organoids were formed three-dimensionally on the surface of tissue from day 11 (FIG. 2). Over time, it was confirmed that the surface of the brain organoids became complicated.

2-2. 뇌 오가노이드 형성 확인2-2. Check brain organoid formation

상기 실시예 2-1에서 형성된 뇌 오가노이드를 섹션한 뒤, Tuj1 및 Sox2의 발현을 면역세포화학분석법으로 확인하였다. 그 결과, 오가노이드 표면에는 Tuj1 (초록색)이 발현하는 것이 확인되었고, 오가오이드 중앙부에는 Sox2 (빨간색)가 발현하는 것이 확인되었다 (도 3). 따라서, 내부에 Sox2를 발현하는 신경줄기세포와 표면에 Tuj1을 발현하는 분화된 신경세포로 이루어져 정상적인 뇌 오가노이드가 형성되었음을 알 수 있었다.After sectioning the brain organoids formed in Example 2-1, expression of Tuj1 and Sox2 was confirmed by immunocytochemical analysis. As a result, it was confirmed that Tuj1 (green) was expressed on the surface of the organoid, and that Sox2 (red) was expressed at the center of the organoid (FIG. 3). Therefore, it was found that normal brain organoids were formed by forming Sox2 expressing neurons and differentiated neurons expressing Tuj1 on the surface.

비교예. 배아줄기세포 및 단일 신경줄기세포의 뇌 오가노이드 형성 확인Comparative example. Confirmation of Brain Organoid Formation in Embryonic Stem Cells and Single Neural Stem Cells

상기 실시예 1-2에서 생성된 테라토마에서 GFP가 양성으로 나타난 단일 신경줄기세포(NSC)를 분리하여 상기 실시예 2에 기재된 방법으로 오가노이드를 형성하였다. 또한, 실시예 1-1에서 분리한 배아줄기세포(ESC)를 상기 실시예 2에 기재된 방법으로 오가노이드를 형성하였다. 아울러, 분화일 수에 따른, 표면이 매끄러운 구 모양을 형성하고 있는 신경세포구 및 구불거리고 복잡한 표면을 가지고 있는 오가노이드의 형성을 판별하였다.In the teratoma produced in Example 1-2, single neural stem cells (NSCs) showing positive GFP were isolated to form organoids by the method described in Example 2. In addition, the embryonic stem cells (ESC) isolated in Example 1-1 formed organoids by the method described in Example 2. In addition, according to the number of days of differentiation, the formation of neural cell spheres having a smooth spherical surface and organoids having a wavy and complex surface was determined.

그 결과, 테라토마를 형성하지 않고 바로 오가노이드로 배양된 ESC는 Day32이 되어서야 오가노이드를 형성하였으며 (도 4), 테라토마에서 분리한 단일 신경줄기세포는 배양 10일 이후 신경세포구(neurosphere)는 형성하였으나 (도 5), 오가노이드로 발달되지 않고 점차 사멸하는 것으로 나타났다.As a result, ESCs cultured with organoids immediately without forming teratomas did not form organoids until day 32 (FIG. 4). Single neural stem cells isolated from teratomas formed neurospheres after 10 days of culture. (FIG. 5), it was found to gradually die without developing into organoids.

Claims (10)

인간을 제외한 포유동물 유래의 Sox1-GFP 형질전환 만능줄기세포를 인간을 제외한 포유동물에 이식하여 테라토마(teratoma) 형성을 유도하며;
테라토마로부터 성체줄기세포를 포함하는 조직을 분리하고; 및
분리한 성체줄기세포를 포함하는 조직을 3차원 배양하는 것을 포함하는 오가노이드(organoid) 제조 방법.Transplanting Sox1-GFP pluripotent stem cells derived from mammals other than humans into mammals except humans to induce teratoma formation;
Separating the tissue comprising adult stem cells from the teratoma; And
An organoid manufacturing method comprising three-dimensionally culturing a tissue containing separated adult stem cells. 제 1항에 있어서, 상기 만능줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포인, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 1, wherein the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells. 제 1항에 있어서, 성체줄기세포는 Sox1-GFP를 발현하는, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 1, wherein the adult stem cells express Sox1-GFP. 제 1항에 있어서, 성체줄기세포는 신경줄기세포(Neural stem cell, NSC)인, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 1, wherein the adult stem cells are neural stem cells (NSC). 제 4항에 있어서, 신경줄기세포는 신경상피세포(neuroepithelial cell)인, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 4, wherein the neural stem cells are neuroepithelial cells. 제 1항에 있어서, 오가노이드는 뇌 오가노이드인, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 1, wherein the organoid is a brain organoid. 제 1항에 있어서, 3차원 배양은 성체줄기세포를 포함하는 조직을 세포외기질 내부에서 배양하는 것을 포함하는, 오가노이드 제조 방법.The method of claim 1, wherein the three-dimensional culture comprises culturing the tissue containing adult stem cells in the extracellular matrix. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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