KR102011117B1

KR102011117B1 - CAPS marker for selecting watermelon cultivar of red flesh and uses thereof

Info

Publication number: KR102011117B1
Application number: KR1020180120656A
Authority: KR
Inventors: 이긍주; 사미나단
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2019-08-14

Abstract

The present invention relates to a CAPS marker for selecting watermelon cultivars with red pulp and uses thereof. The SNP-derived CAPS marker selected by a genome reanalysis technique of the present invention can effectively determine watermelon cultivars with red pulp, and thus can be usefully used for the development and breeding of watermelon cultivars with red pulp.

Description

적색 과육의 수박 품종 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도{CAPS marker for selecting watermelon cultivar of red flesh and uses thereof}CAPS marker for selecting watermelon cultivar of red flesh and uses approximately}

본 발명은 적색 과육의 수박 품종 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to CAPS markers for selecting watermelon varieties of red pulp and uses thereof.

수박(Citrullus lanatus)은 박과(Cucurbitaceae) 작물 중 하나로, 약 4천년 전 아프리카에서 유래되었으며 현재는 전세계적으로 재배되고 있다. 수박은 열매의 모양, 표면 무늬의 색깔, 과육의 색깔 등으로 구별할 수 있다. 수박은 원형, 아원형, 길쭉한 원통형 등 다양한 모양의 수박 품종들이 있으며, 수박을 재배할 때 일정한 틀을 이용하여 만들어진 사각 수박은 수박 품종에 포함되지 않는다. 우리나라에서는 주로 원형 또는 아원형의 수박 품종을 재배하고 있으며 같은 모양이더라도 표면의 색깔이 초록 및 검초록빛이 나는 품종 등이 재배되고 있다. 또한, 과육의 색이 적색, 오렌지색, 주황색, 노란색 등을 띄는 다양한 수박 품종이 있으며, 우리나라를 비롯하여 세계적으로 주로 적색 품종이 많이 재배되고 있다. 수박은 주로 생과일, 화채, 주스 등으로 섭취하고, 종자는 건조시켜 볶은 후 간식으로 섭취할 수 있다. 종자는 단백질, 지방 및 탄수화물이 풍부하고, 과육은 수분함량이 높다. 과육에는 영양소가 풍부하지 않으나, 적색 과육 품종의 경우 리코펜의 함량이 6,300~6,800 ㎍/100g으로 매우 높다. 최근 기능성 수박의 수요증가로 인해 다양한 과육색의 품종 개발이 중요한 수박 육종의 목표가 되고 있다.Watermelon ( Citrullus lanatus ) is one of the Cucurbitaceae crops, originated in Africa about 4,000 years ago and is now grown worldwide. Watermelon can be distinguished by the shape of the fruit, the color of the surface pattern, and the color of the flesh. Watermelon has a variety of watermelon varieties, such as round, sub-circular, elongated cylindrical, and watermelons made by using a regular frame when growing watermelons are not included in the watermelon varieties. In Korea, a variety of watermelons are grown in the form of circular or subcircular watermelons, and even though they have the same shape, the varieties of green and dark green color of the surface are grown. In addition, there are a variety of watermelon varieties with a fleshy color of red, orange, orange, yellow, and the like, and many red varieties are cultivated mainly in Korea and around the world. Watermelon is usually eaten as raw fruit, vegetables, juice, etc., and seeds can be dried and roasted and eaten as a snack. Seeds are rich in protein, fat and carbohydrates, and the flesh is high in water. The flesh is not rich in nutrients, but the red flesh cultivars have a very high content of 6,300-6,800 ㎍ / 100g. Due to the recent increase in the demand for functional watermelons, development of various flesh-colored varieties has become an important watermelon breeding goal.

분자표지를 이용한 선발(marker-assisted selection, MAS)은 최근 유전체 서열정보가 대량 보급되면서 점차 이용이 확대되었고, 대량의 유전자원을 표준 유전체 서열과 비교하여 유전체 재분석(genome resequencing)이 가능해지면서 수박에서도 기존의 유전자지도(genetic map) 작성과 양적형질유전자좌(quantitative trait locus)의 탐색 없이도 형질연관 SNP와 이를 기반으로 한 분자표지 개발이 가능해졌다. 유전체 재분석은 기존에 공개된 표준 유전체 데이터를 참조하여, 시퀀싱을 수행하는 개체의 서열 단편들을 맞추어 나가며 분석하는 방식을 말한다. 이와 같이 개체의 염기서열 정보를 공개된 표준 유전체와 비교하여 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 상기 SNP를 기반으로 한 특정 형질에 대한 분자마커의 개발이 가능하며, 유전자형 분석(genotyping)이 가능하게 되었다.Marker-assisted selection (MAS) has become increasingly available as genome sequence information has recently been disseminated, and even in watermelons, it is possible to genome resequencing by comparing a large number of gene sources with standard genome sequences. It is possible to develop transgenic SNPs and molecular markers based on them without the need for conventional genetic map and quantitative trait locus. Genome reanalysis refers to a method of fitting and analyzing sequence fragments of an individual performing sequencing by referring to previously published standard genomic data. As such, it is possible to develop single nucleotide polymorphism (SNP) and molecular markers for specific traits based on the SNP by comparing the nucleotide sequence information of the individual with the published standard genome, and genotyping is possible. It became possible.

CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 단형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편이다. 사전에 품종 간에 염기서열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA 를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.Cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS), also known as restriction amplified polymorphic sequences, are polymorphic fragments generated by restriction enzyme treatment of a single-substrate monomorphic PCR product. Detection is carried out for the purpose of genes that already know that there is a difference in nucleotide sequence between varieties, and only the genes of the genome of the species are selected and amplified by PCR. In most markers, there is no difference between the length and variety of amplified genes, but since the sequence inside the gene is different, a restriction enzyme that recognizes the difference between the sequences is selected and processed. Differences between varieties with DNA cleaved with restriction enzymes and varieties with DNA that are not cleaved can be distinguished, and the difference in length can be easily detected by electrophoresis.

한편, 한국등록특허 제1699149호에는 '수박의 과형 구별용 DNA 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1822995호에는 '쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 DNA 마커'가 개시되어 있으나, 본 발명의 적색 과육의 수박 품종 선발용 CAPS 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 1699149 discloses 'DNA marker for distinguishing watermelon's hypertype', and Korean Patent No. 1822995 discloses 'Jubilee-based watermelon skin pattern transfection DNA marker', but the present invention There is no description of CAPS markers for selecting watermelon varieties of red flesh and their use.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 적색, 노란색 및 오렌지색 과육의 수박 유전자원 계통의 염기분석을 수행하여 적색 과육의 수박에 특이적인 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 및 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자를 확인한 후 상기 유전자와 표준유전체의 염기서열 정보를 맵핑하여 유전자 내 다형성을 보이는 단일염기다형성(SNP) 마커를 발굴하였고, 상기 SNP를 기반으로 CAPS 마커를 제작한 후 상기 CAPS 마커가 적색 과육의 수박 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived by the above-described needs, and the present inventors performed a basic analysis of the watermelon gene source line of red, yellow and orange pulp to find specific PPR (Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) specific to watermelon of red pulp. And TRAPPC3 (Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) genes were identified and mapping of the gene and nucleotide sequence information of the standard dielectric to find a single nucleotide polymorphism (SNP) marker showing a polymorphism within the gene, CAPS based on the SNP The present invention was completed by confirming that the CAPS markers can effectively distinguish watermelon varieties of red flesh after preparing the markers.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 SNP 마커 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a sequence of at least eight consecutive nucleotide polymorphisms (SNPs) located at the 884th base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived watermelon-derived PPR (Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859 ) gene of SEQ ID NO: 1. Polynucleotides consisting of nucleotides or complementary polynucleotides thereof; And a polynucleotide consisting of at least 8 contiguous nucleotides including a SNP located at 2,828 base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived TRAPPC3 (Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209 ) gene of SEQ ID NO: 2, or a complementary polynucleotide thereof Provided is a SNP marker composition for selecting a red flesh watermelon variety, comprising one or more polynucleotides selected from the group.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 PPR 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP 또는 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 마이크로어레이를 제공한다.The present invention also provides a sequence of at least 8 consecutive SNPs comprising an SNP located at the 884th base of the watermelon-derived PPR gene of SEQ ID NO: 1 or the SNP located at the 2,828th base of the base sequence of the watermelon-derived TRAPPC3 gene of SEQ ID NO: 2. Provided is a microarray for selecting a red flesh watermelon variety, comprising a polynucleotide consisting of nucleotides or a polynucleotide selected from the group consisting of complementary polynucleotides thereof.

또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention also provides oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And one or more primer sets selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is the oligonucleotide primer set; Reagents for conducting amplification reactions; And it provides a kit for selection of red flesh watermelon varieties, including restriction enzymes.

또한, 본 발명은 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종을 선발하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of separating the genomic DNA from the watermelon sample; Amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using an oligonucleotide primer set according to the present invention; Cutting the product of the amplification step with a restriction enzyme; And electrophoresis the products of the restriction enzyme cleavage step to separate the cleavage products by size.

본 발명의 SNP 기반 CAPS 분자마커는 적색 과육의 수박 품종을 조기에 효율적으로 판별할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 수박 품종의 분자육종 연구 및 수박 육종 산업에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.SNP-based CAPS molecular markers of the present invention can efficiently discriminate watermelon cultivars of red flesh early and can save time, cost and effort for breeding, and are useful for molecular breeding research and watermelon breeding industry of watermelon cultivars. It is expected to be utilized.

도 1은 표준유전체, 적색 과육의 수박 유전체, 노란색 과육의 수박 유전체 및 오렌지색 과육의 수박 유전체들 간의 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 유전자(A) 및 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자 염기서열 정렬 및 유전체 비교 분석을 나타내는 모식도로, 화살표는 프라이머의 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 CAPS 마커인 Cl.PPR-884 및 Cl.TRAPPC3-2828를 이용한 분석 결과로, A와 C는 2개의 CAPS 마커로 적색(801, 802, 803, 812, 829, 830, 832, 917, 45), 노란색(816, 819, 833, 834, 835, 837, 838, 3, 919) 및 오렌지색 과육(820, 840, 842, 843, 1, 29)의 수박 품종을 분석한 전기영동 사진이고, B와 D는 12개의 상업종 수박 품종을 대상으로 2개의 CAPS 마커를 검증한 전기영동 사진이다. 1 shows a PPR (Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) gene (A) and TRAPPC3 (Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) between a standard dielectric, a watermelon genome of red flesh, a watermelon genome of yellow flesh, and a watermelon genome of orange flesh. ), The arrow indicates the position of the primer.
2 is a result of analysis using the CAPS markers Cl.PPR-884 and Cl.TRAPPC3-2828 of the present invention, A and C are red with two CAPS markers (801, 802, 803, 812, 829, 830, 832). , 917, 45), electrophoresis of watermelon varieties of yellow (816, 819, 833, 834, 835, 837, 838, 3, 919) and orange flesh (820, 840, 842, 843, 1, 29) Photographs B and D show electrophoresis images of two CAPS markers from 12 commercial watermelon varieties.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 수박 유래 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 SNP 마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention is 8 or more including a single nucleotide polymorphism (SNP) located at the 884th base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived PPR (Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859 ) gene of SEQ ID NO: 1 Polynucleotides consisting of contiguous nucleotides or complementary polynucleotides thereof; And a polynucleotide consisting of at least 8 contiguous nucleotides including a SNP located at 2,828 base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived TRAPPC3 (Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209 ) gene of SEQ ID NO: 2, or a complementary polynucleotide thereof Provided is a SNP marker composition for selecting a red flesh watermelon variety, comprising one or more polynucleotides selected from the group.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 수박 유래 PPR 유전자 염기서열로, PPR 유전자는 Pentatricopeptide repeat-containing protein(PPR) 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있고(Cla006859), 서열번호 2의 염기서열은 수박 유래 TRAPPC3 유전자 염기서열로, TRAPPC3 유전자는 Trafficking protein particle complex subunit 3 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA일 수 있으나(Cla004209), 이에 제한되지 않는다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.In the SNP marker composition according to an embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a watermelon-derived PPR gene sequence, and the PPR gene may be DNA or RNA encoding a Pentatricopeptide repeat-containing protein (PPR) protein. ( Cla006859 ), the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is a watermelon-derived TRAPPC3 gene sequence, and the TRAPPC3 gene may be DNA or RNA encoding a Trafficking protein particle complex subunit 3 protein ( Cla004209 ), but is not limited thereto. DNA includes cDNA, genomic DNA or artificial synthetic DNA. DNA can be single stranded or double stranded. DNA may be a coding strand or a non-coding strand.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the contiguous nucleotide may be 8 to 100 contiguous nucleotides, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.As used herein, the term “nucleotide” is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide that exists in single- or double-stranded form and includes analogs of natural nucleotides unless specifically stated otherwise.

본 발명의 SNP 마커를 적색 과육의 수박 품종 선발에 사용할 수 있는 것은 수박 유래 PPR 유전자인 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 884번째가 T 또는 C; 및 수박 유래 TRAPPC3 유전자인 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 2,828번째가 A 또는 G로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 상기 SNP 위치 염기에 있어서, 앞에 기술한 염기는 적색 과육의 수박 품종의 염기이고, 뒤에 기술한 염기는 노란색 또는 오렌지색 과육의 수박 품종의 염기이다. 예를 들어, 서열번호 1의 884번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 T 또는 C로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 T 유전자형을 갖는 수박은 과육색이 적색인 수박 품종으로, C 유전자형을 갖는 수박은 과육색이 노란색 또는 오렌지색인 수박 품종으로 판단할 수 있는 것이다. 상기 PPR 유전자의 884번째 염기는 엑손 부위에 존재하는 SNP이고, TRAPPC3 유전자의 2,828번째 염기는 인트론 부위에 존재하는 SNP이다.The SNP marker of the present invention can be used to select a watermelon cultivar of red flesh, the 884th position of the SNP mutation position in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 of watermelon-derived PPR gene is T or C; And the 2,828th position of the SNP mutation position in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, which is a watermelon-derived TRAPPC3 gene, is different from A or G. In the SNP position base, the base described above is the base of the red flesh watermelon variety, and the base described later is the base of the yellow or orange flesh watermelon variety. For example, the SNP corresponding to the 884th nucleotide of SEQ ID NO: 1 shows nucleotide polymorphism with T or C. In this SNP, the watermelon with the T genotype is the watermelon variety with the red flesh color, and the watermelon with the C genotype is the flesh It can be judged as a watermelon variety that is yellow or orange in color. The 884th base of the PPR gene is SNP present in the exon region, and the 2,828 base of the TRAPPC3 gene is SNP present in the intron region.

본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 다형성 염기 정보는 표 3에 나타내었다.The present invention relates to a base variant of the SNP position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, when such a SNP base mutation is found in a double stranded gDNA (genomic DNA), the polynucleotide complementary to the nucleotide sequence It is also interpreted to include nucleotide sequences. Thus, the base of the SNP position in the complementary polynucleotide sequence also becomes the complementary base. In this respect, all sequences presented herein are based on sequences in the sense strand of genomic DNA, unless otherwise noted. In the SNP composition according to the embodiment of the present invention, the SNP polymorphic base information is shown in Table 3.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 수박 유래 PPR 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP, 또는 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 마이크로어레이를 제공한다.The present invention also relates to watermelon-derived PPR of SEQ ID NO: 1 A polynucleotide consisting of at least 8 contiguous nucleotides comprising a SNP located at 884 base of the gene sequence, or a SNP located at 2,828 base of the watermelon-derived TRAPPC3 gene of SEQ ID NO: 2, or a complementary polynucleotide thereof Provided is a microarray for selecting watermelon varieties of red flesh, comprising a polynucleotide selected from the group consisting of:

바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리 L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.Preferably, the polynucleotide can be immobilized on a substrate coated with an active group of amino-silane, poly L-lysine or aldehyde, but is not limited thereto. Preferably, the substrate may be, but is not limited to, a silicon wafer, glass, quartz, metal or plastic. As a method of immobilizing the polynucleotide on a substrate, a micropipetting method using a piezoelectric method, a method using a pin type spotter, or the like can be used.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.Microarrays according to the invention can be prepared by conventional methods known to those skilled in the art using the polynucleotides or their complementary polynucleotides according to the invention, the polypeptides encoded by them or the cDNAs thereof.

본 발명은 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 프라이머 세트를 제공한다.The invention also provides oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And one or more primer sets selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.

본 발명의 일 구현 예에 따른 적색 과육의 수박 품종 선발용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1의 수박 유래 PPR 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 산물을 증폭할 수 있고, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 산물을 증폭할 수 있다.In the primer set for selecting a red flesh watermelon variety according to an embodiment of the present invention, the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is located at the 884th base of the base sequence of the watermelon-derived PPR gene of SEQ ID NO: 1 Amplified product comprising the SNP base located, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is a product containing the SNP base located at the 2,828 base of the base sequence of watermelon-derived TRAPPC3 gene of SEQ ID NO: Can be amplified.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 적색 과육의 수박 품종을 더욱 효율적으로 선발할 수 있다.The primer set of the present invention preferably comprises one or more primer sets selected from the group consisting of two primer sets, comprising two primer sets, ie oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. Using two sets of primers simultaneously allows for more efficient selection of watermelon cultivars of red flesh.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3, 4, 5 및 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4, 5 및 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primer is an oligonucleotide consisting of segments of at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20 contiguous nucleotides in the sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, and 6, depending on the sequence length of each primer It may include. For example, the primer of SEQ ID NO: 3 (20 oligonucleotides) may comprise an oligonucleotide consisting of segments of at least 16, at least 17, at least 18, at least 19 consecutive nucleotides within the sequence of SEQ ID NO: 1. . In addition, the primer may include a sequence of addition, deletion or substitution of base sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, and 6.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primers should allow to start the synthesis of extension products. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.As used herein, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioate, alkylphosphothioate or peptide nucleic acid, or It may comprise an intercalating agent.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 키트를 제공한다.The present invention also provides an oligonucleotide primer set according to the present invention; Reagents for conducting amplification reactions; And it provides a kit for selection of red flesh watermelon varieties, including restriction enzymes.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 키트는 제한효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소는 바람직하게는 SpeI 또는 Bsu36I일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In the kit of the present invention, the reagent for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffers, and the like, and the kit according to the present invention may further include a restriction enzyme. The restriction enzyme may preferably be Spe I or Bsu36 I. In addition, the kits of the present invention may further comprise a user guide describing the optimal reaction performance conditions. The guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare a PCR buffer, and the reaction conditions presented. The instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kits and instructions on the surface of the package containing the kits. In addition, the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.

또한, 본 발명은In addition, the present invention

수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;Separating genomic DNA from watermelon samples;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; Amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set;

상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및Cutting the amplification product with restriction enzymes; And

상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종을 선발하는 방법을 제공한다.It provides a method for selecting a watermelon variety of red flesh, comprising the step of separating the cleavage products by size by electrophoresis of the product of the restriction enzyme cleavage step.

본 발명의 방법은 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.The method of the present invention comprises the step of separating genomic DNA from watermelon samples. As a method for separating genomic DNA from the watermelon sample, a method known in the art may be used. For example, the CTAB method may be used, or the Wizard prep kit (Promega) may be used. Using the isolated genomic DNA as a template, an amplification reaction may be performed using a primer set according to an embodiment of the present invention to amplify a target sequence. Methods for amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification systems, There are any suitable methods for amplifying via strand displacement amplification or Qβ replication or for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among these, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers specifically binding to the target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.

본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 EcoRI, Bsu36I, HindⅢ, MboⅡ, PstI, SpeI, BamHI, MluI, AluI, DraI, PvuI, XhoI, BclI, TaqI, KpnI 및 MspI일 수 있고, 바람직하게는 SpeI 또는 Bsu36I일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "limiting enzyme" refers to an enzyme that is special as an endonuclease that identifies a particular nucleotide sequence of DNA and cleaves a double chain. In a specific embodiment of the present invention, PCR was performed based on the selected primer set, purified with a PCR purification kit, and then processed under active temperature using a restriction enzyme combined with a primer. In the method of the present invention, the restriction enzyme is EcoR I , Bsu36 I , Hind III , Mbo II , Pst I , Spe I , BamH I , Mlu I , Alu I , Dra I , Pvu I , Xho I , Bcl I , Taq I , Kpn I and Msp I, preferably Spe I or Bsu36 I, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 적색 과육의 수박 품종을 선발하는 방법에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 SpeI 제한효소 처리에 의해 절단되면 적색 과육 품종으로 선발될 수 있고, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 Bsu36I 제한효소 처리에 의해 절단되지 않으면 적색 과육 품종으로 선발될 수 있다(도 1 참고).In the method for selecting a watermelon cultivars of red pulp according to an embodiment of the present invention, the red pulp when the amplification product amplified by the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is cut by Spe I restriction enzyme treatment It may be selected as a variety, and may be selected as a red pulp variety if the amplification products amplified by the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are not cleaved by Bsu36 I restriction enzyme treatment (see Figure 1).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and methods

1. 수박 유전자원 및 수박 유전체 재분석1. Watermelon Gene Source and Watermelon Genome Reanalysis

유전체 재분석(genome resequencing)에 활용된 수박 유전자원은 국내 육종회사(현대종묘)에서 자체 육성된 순계(>F4~F8세대) 24개 분양된 자원으로, 적색 과육의 수박 9개, 노란색 과육의 수박 9개, 오렌지색 과육의 수박 6개로 구성되어 있다(표 1). 상기 순계의 유전체 재분석 결과 적색 과육에 특이적인 대립유전자 연관 SNP에 기반한 CAPS 마커의 검증에는 국내에서 재배 유통되고 있는 다양한 과육색의 수박 유전자원 12 품종을 사용하였다(표 2). Watermelon genetic resources used for genome resequencing are resources distributed 24 domestically (> F4 ~ F8 generations) grown by domestic breeding companies (Hyundai Seedling), 9 watermelons of red flesh, watermelon of yellow flesh It consists of nine watermelons of six orange slices (Table 1). As a result of genome re-analysis of the pure system, 12 varieties of watermelon genes of various flesh color were cultivated and distributed in Korea for the verification of CAPS markers based on allele-associated SNP specific to red flesh (Table 2).

2. 수박 유전체 재분석(whole genome 2. Whole genome reanalysis resequencingresequencing ) 및 SNP 탐색) And SNP navigation

수박 유전체 재분석에 활용된 24개 유전자원의 실생의 2~3번째 잎을 채취하여 액체질소에 곧바로 동결시킨 후 -80℃에서 보관하였다. DNA는 0.2g의 잎 조직을 이용하여 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 추출하였고, DNA 순도와 농도는 Nanodrop 1000 Spectrophotometer(Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 계측하였다. 유전체 재분석을 위해 최종 quality 및 quantity check(1.6-2.2 at 260/280, >1.62 at 260/230, and >30 ng·㎕^-1)를 통과한 고순도 DNA는 국내 유전체분석 회사에 의뢰하였다. The second to third leaves of the 24 genes used for watermelon genome reanalysis were taken and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. DNA was extracted by CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) method using 0.2 g of leaf tissue, and DNA purity and concentration were measured using a Nanodrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA). High-purity DNA that passed the final quality and quantity check (1.6-2.2 at 260/280,> 1.62 at 260/230, and> 30 ng · l ⁻¹ ) for genome reanalysis was commissioned by a domestic genome analysis company.

유전체 재분석은 Illumina사의 Hiseq 2000과 Nextseq의 paied-end sequencing 방법을 이용하여 수행하였고, 이를 위해 100~150 bp의 짧은 DNA 단편을 위한 라이브러리를 제작하였으며 염기분석 후 SolexaQA package(v.1.13)을 통해 3가지 기준[1) p-value 0.05, 2) Phred score (the accuracy of base calling value between 0 and 40, Dynamic Trim ≥ 20), 3) short read length (length sort) ≥ 25 bp]을 통과한 염기서열 정보만을 분석에 활용하였다.Genome reanalysis was performed using Illumina's Hiseq 2000 and Nextseq's paied-end sequencing method. A library for short DNA fragments of 100-150 bp was prepared for this purpose. After base analysis, the SolexaQA package (v.1.13) was used. Nucleotide sequences that passed the p-value 0.05, 2) Phred score (the accuracy of base calling value between 0 and 40, Dynamic Trim ≥ 20), 3) short read length (length sort) ≥ 25 bp] Only information was used for analysis.

24개의 수박 유전자원을 수박 표준 유전체(97103 v1, http://cucurbitgenomics.org/)에 맵핑하여 각각 유전자원 특이 SNP 매트릭스를 만들었고, 이 중 신뢰성이 낮은 SNP, 즉 품질기준[(read depth <3, mapping quality <30, biallelic SNP(InDel), unmapped reads]을 통과하지 못한 SNP는 제거하였다.Twenty-four watermelon gene sources were mapped to watermelon standard genomes (97103 v1, http://cucurbitgenomics.org/) to create gene source specific SNP matrices, of which the less reliable SNPs, or quality criteria [(read depth <3 , SNPs that did not pass mapping quality <30, biallelic SNP (InDel), unmapped reads] were removed.

3. 적색 과육의 수박에 특이적인 CAPS 3. CAPS specific to watermelon of red flesh 마커의Of marker 개발 Development

유전체 재분석에 활용된 총 24개 자원 중에서 적색의 과육의 수박 9개에서 단일 밴드를 확인하였고, 다른 과육색 수박(노란색 과육 9개 및 오렌지색 과육 6개)에서는 적색 과육에서 나타난 단일 밴드와 다른 크기의 단일 밴드를 확인하였다. 그리고 적색 과육과 다른 과육색 간에 다형성 밴드를 보이는 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 및 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자를 최종적으로 선별하였다.Of the 24 resources used for genome reanalysis, a single band was identified in nine watermelons of red flesh, while the other fleshy watermelons (9 yellow flesh and six orange flesh) were of different size than the single band found in the red flesh. A single band was identified. Finally, PPR ( Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859 ) and TRAPPC3 ( Traffking protein particle complex subunit 3 , Cla004209 ) genes showing polymorphic bands between red and other flesh were finally selected.

상기 2개의 유전자 염기서열의 SNP를 탐지할 수 있는 제한효소를 스크리닝하기 위하여 17개의 제한효소 EcoRI, Bsu36I, HindⅢ, MboⅡ, PstI, SpeI, BamHI, MluI, AluI, DraI, PvuI, XhoI, BclI, TaqI, KpnI 및 MspI의 타겟 염기서열을 예측한 후 확인된 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 다자인하였다. 프라이머 디자인은 길이 18-26 bp, GC 함량 40-60%, 결합 온도(annealing temperature) 56-60℃, PCR 증폭산물의 길이 100-500 bp로 조정하였다.In order to screen for restriction enzymes capable of detecting SNPs of the two gene sequences, 17 restriction enzymes EcoR I , Bsu36 I , Hind III , Mbo II , Pst I , Spe I , BamH I , Mlu I , Alu I , Dra I , Pvu I , Xho I , Bcl I , Taq I , Kpn I and After predicting the target sequence of Msp I, primers capable of amplifying the identified sites were designed. Primer designs were adjusted to 18-26 bp in length, 40-60% GC content, 56-60 ° C. of annealing temperature, 100-500 bp in length of PCR amplification products.

4. CAPS 4. CAPS 마커의Of marker 검증 Verification

제작된 PCR 프라이머를 이용하여 적색 과육의 수박에 특이적인 2개의 유전자 SNP 타겟 부위의 영역과 12개의 상업종을 함께 증폭시켜 확인하였다. PCR 증폭은 DNA 30 ng, 정방향 프라이머(8-10 pmol) 및 역방향 프라이머(8-10 pmol)가 혼합된 총 반응 부피 12 ㎕를 사용하여 수행하였다. 증폭 조건은 초기 변성 단계(95℃, 3분)에 이어 95℃에서 30초간, 58℃에서 30초간 결합 단계 및 72℃에서 30초간 신장 단계를 조합하여 40 사이클을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 제한효소 SpeI과 Bsu36I로 절단되었다. 제한효소의 반응은 총 15 ㎕에서 이루어졌고, 반응 혼합액은 각각 PCR 증폭산물 12 ㎕, 10x 버퍼액 1.5 ㎕, 제한효소 1 U(Unit) 및 DDH₂0로 구성되었다. Using the prepared PCR primers, the regions of two gene SNP target sites specific to watermelon of red flesh and 12 commercial species were amplified together. PCR amplification was performed using 12 μl of total reaction volume of 30 ng DNA, forward primer (8-10 pmol) and reverse primer (8-10 pmol). Amplification conditions were performed for 40 cycles in combination with an initial denaturation step (95 ° C., 3 min) followed by 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 58 ° C. and 30 seconds at 72 ° C. The amplified PCR product was digested with restriction enzymes Spe I and Bsu36 I. The reaction of restriction enzyme was carried out in a total of 15 μl, and the reaction mixture was composed of 12 μl of PCR amplification product, 1.5 μl of 10 × buffer solution, restriction enzyme 1 U (Unit), and DDH ₂₀ .

실시예Example 1. 적색 과육의 수박에 특이적인 유전자 및 유전자 내 다형성을 보이는 SNP 발굴 1. Identifying SNPs showing genes and polymorphisms specific to watermelon of red flesh

차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS) 기술 중 하나인 유전체 재분석을 통해 다양한 형질의 24개 수박 유전자원 계통(표 1)의 염기분석을 수행한 결과, 적색 과육의 수박에 특이적인 PPR 및 TRAPPC3 유전자를 확인하였다. 중국에서 발표된 97103 품종의 표준 유전체 정보에 상기 2개의 유전자 염기서열 정보를 맵핑하여 이들 유전자 내 다형성을 보이는 SNP를 확인하였고(표 3), 과육색 차이를 보이는 수박 계통간 상기 두 개 유전자에 위치한 대립 유전자간에 완벽하게 분리되는 현상을 염기서열을 통해 확인할 수 있었다(도 1).Genome reanalysis, one of the Next Generation Sequencing (NGS) technology, performed basic analysis of 24 watermelon gene source lines (Table 1) of various traits, resulting in PPR and TRAPPC3 specific to watermelons in red flesh. The gene was identified. SNPs showing polymorphisms in these genes were identified by mapping the two gene sequences to standard genome information of 97103 varieties published in China (Table 3). The phenomenon of complete separation between alleles could be confirmed through the nucleotide sequence (FIG. 1).

적색 과육의 수박 9개 계통(801, 802, 803, 812, 829, 830, 832, 917, 45)의 PPR 유전자의 엑손 884번째 염기서열은 공통적으로 'T' 염기를 가지고 있었고, 다른 과육색의 수박 계통들(노란색: 816, 819, 833, 834, 835, 837, 838, 919, 3; 오렌지색: 820, 840, 842, 843, 1, 29)은 모두 'C' 염기를 갖고 있었다. 또한, TRAPPC3 유전자의 인트론 2,828번째 염기서열에서는 적색 과육의 수박 9개 계통에서는 'A' 염기를 가지고 있었고, 다른 과육색 수박 15개 계통에서는 모두 'G' 염기를 갖고 있음을 확인하였다(표 4).The exon 884th sequence of the PPR gene of the nine strains of the red flesh flesh (801, 802, 803, 812, 829, 830, 832, 917, 45) had a common 'T' base and had a different flesh color. The watermelon strains (yellow: 816, 819, 833, 834, 835, 837, 838, 919, 3; orange: 820, 840, 842, 843, 1, 29) all had a 'C' base. In addition, the intron 2,828th nucleotide sequence of the TRAPPC3 gene had 'A' bases in nine strains of red flesh watermelon and 'G' bases in all 15 strains of watermelon flesh (Table 4). .

실시예Example 2. 수박 유래 2. Watermelon Origin PPRPPR 및 And TRAPPC3TRAPPC3 유전자내Within genes SNP 기반 CAPS SNP-based CAPS 마커의Of marker 개발 및 검증 Development and Verification

수박 유래 PPR 및 TRAPPC3 유전자로부터 적색 과육의 수박 계통에서 다형성을 보이는 SNP의 탐지가 가능한 제한효소를 스크리닝하여 최종적으로 선별된 SpeI 및 Bsu36I로 SNP를 탐지할 수 있는 2개의 CAPS 마커를 개발하였으며, 각각 Cl.PPR-884 및 Cl.TRAPPC3-2828로 명명하였다(표 3). 우선 SpeI 제한효소는 ACTAGT의 염기서열을 인식하여 절단하므로, PPR 유전자의 884번째 염기가 'T'인 적색 과육 수박의 경우, PCR 증폭산물이 2개의 절편(26 및 99 bp)으로 절단되었고, 다른색 과육의 수박에는 제한효소 인식자리가 존재하지 않아 127 bp 크기의 단일 절편만을 가지고 있음을 확인하였다(도 2A). 이를 검증하기 위해 CAPS 마커를 유전체 재분석에 이용되지 않은 12개 상업 품종에 적용한 결과, 상기 결과와 동일하게 적색 과육의 수박 계통에서만 Cl.PPR-884 CAPS 마커가 작용하였고 다른 과육색 수박 계통에서는 작용하지 않음을 확인하였다(도 2B).We screened restriction enzymes capable of detecting SNPs showing polymorphism in watermelon-derived watermelon lines from watermelon-derived PPR and TRAPPC3 genes, and developed two CAPS markers capable of detecting SNPs with finally selected Spe I and Bsu36 I. They were named Cl.PPR-884 and Cl.TRAPPC3-2828, respectively (Table 3). First, since Spe I restriction enzyme recognizes and cleaves the nucleotide sequence of ACTAGT, in the case of red flesh watermelon whose 884th base of the PPR gene is 'T', PCR amplification products were cleaved into two fragments (26 and 99 bp), There was no restriction enzyme recognition site in the watermelon of different color flesh, so it was confirmed that it had only a single fragment of 127 bp size (FIG. 2A). To verify this, the CAPS marker was applied to 12 commercial varieties that were not used for genome reanalysis. As a result, the Cl.PPR-884 CAPS marker acted only on the red flesh watermelon strain and not on the other flesh flesh watermelon strain. Was confirmed (FIG. 2B).

또한, Bsu36I 제한효소는 CCTNAGG의 염기서열을 인식하여 절단하므로, TRAPPC3 유전자의 2,828번째 염기가 'A'인 적색 과육 수박의 경우 제한효소 인식자리가 존재하지 않아 146 bp 크기의 단일 밴드를 형성하였으나, 다른색 과육의 수박 계통에서는 2,828번째 염기 'G'를 탐지하여 PCR 증폭산물이 2개의 절편(35 bp 및 101 bp)으로 절단되는 것을 확인하였다(도 2C). 이를 검증하기 위해 CAPS 마커를 유전체 재분석에 이용되지 않은 12개의 상업품종에 적용한 결과, 4개의 적색 과육 수박 계통을 8개의 다른 과육색 수박 계통으로부터 완벽하게 선발할 수 있음을 확인하였다(도 2D).In addition, since Bsu36 I restriction enzyme recognizes and cleaves the nucleotide sequence of CCTNAGG , the red flesh watermelon with 2,828th base of TRAPPC3 gene 'A' does not have restriction enzyme recognition site and thus forms a single band of 146 bp. , Watermelon strains of different color pulp detected the 2,828th base 'G' and confirmed that the PCR amplification products were cut into two fragments (35 bp and 101 bp) (FIG. 2C). In order to verify this, the CAPS marker was applied to 12 commercial varieties that were not used for genome reanalysis, and it was confirmed that four red flesh watermelon strains could be perfectly selected from eight different flesh flesh watermelon strains (FIG. 2D).

상기 결과를 통해, Cl.PPR-884 및 Cl.TRAPPC3-2828 CAPS 마커를 동시에 사용하면 대부분의 적색 대립유전자를 가진 교배 후대 또는 유전자원을 높은 확률로 선발할 수 있을 것으로 사료된다.Based on the above results, it is believed that the use of Cl.PPR-884 and Cl.TRAPPC3-2828 CAPS markers at the same time allows the selection of a hybrid progeny or gene source with most red alleles with high probability.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> CAPS marker for selecting watermelon cultivar of red flesh and uses thereof <130> PN18383 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1629 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Citrullus vulgaris <400> 1 atggaggagg ccattttggt tttccatgat ccgtgtcatg agcgtaatgt gtttgcatat 60 aatgctataa tttctgggtt tgtcgctaat ggtcttgctt caaaagggtt tcaattttat 120 aagcaaatga ggttagaggg tgtaatgcct gataagtaca cttttccatg tgtagttaga 180 acttgttgtg aggttatgga ggtgaagaag attcatggat gttcgtttaa aatggggttg 240 gagttggatg tgtttgttgg tagtgctttg gttaatactt acttgaagat tggctcaatg 300 gaggatgcac aaaaagtgtt tgaagaactg tcaataagag atgttgtact ttggaatgca 360 atgatcaatg ggtatgctca gattggttgc ctcgacaagg cattagaggt tttcagaaga 420 atgcatatag aagggattgc acctagtagg tttacaatta ctgccatttt atctattttt 480 gctttaaggg gagacttaga caatgggaaa acggttcatg ggattgtaac aaaaatgggt 540 tatgactcag gagttgcagt ttctaatgcg ttaattcata tgtatgggaa atgcaaacat 600 attggagatg ctttaataat ttttgagatg ataaatgaga aggatatttt ctcatggaat 660 tcaattatat cagttcatga acaaggtggt gatcatgatg gtaccttgag gctttttgat 720 aagatgttag gttctgggat tctacctgat ttggtaacca tcacaacggt agttccagct 780 tgctctcatt tggctgccct catgcatggt agagaaattc atggatatat gattgttaat 840 ggattgggaa aagatgatga aaacggagca gtagacgcat tactagtaaa taatgctgtt 900 atggatatgt atgcaaaatg tggaagtatg aacaatgccc tcaagatttt tgatctaatg 960 agcaataagg acgttgcatc atggaatatc atgattatgg gttatggtat gcatggttat 1020 ggtatggagg cattagatat gttttcccga atgtgtgagg ccggatttaa gccggatgaa 1080 gttacacttg ttggagttct atcagcatgc aatcatgcgg gttttgtatc tcaagggcgt 1140 ttttttttag ctgagatgga atctaaattt gacgttattc caactattga gcattttaca 1200 tgtgtaattg atatgctcgg tcgagctggg catctggagg atgcatatga ggttgctcag 1260 aaaatgccta ttcaagccaa tcctgttgtt tggagggctt tactgggagc atgtcgactt 1320 catgggaatg cagagttggc caaaattgca gcacgacgag taatgcaact tgaaccagag 1380 cattgtggga gttatgtatt gatgtccaat gtttatggag ttataggtcg atatgaagag 1440 gtgttggagg ttagaaaaac aatgaaggaa caaaatgtca agaagacacc tggttgtagt 1500 tggattgaac tcaaggatgg ggtgcatgtt tttcttaccg gagataggac acattcagaa 1560 ttgaatgctt tgactaatca actgtgtgat attggattca ttttagatga agtcttgaac 1620 ttatattga 1629 <210> 2 <211> 4124 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Citrullus vulgaris <400> 2 atgcctcccg ctggtcctcg atctggtgat gcgatcttcg ctagtgttga gcgagtggta 60 agcttctcag ctacaagttt ctctgttttt ttgattgttc ctgccgtttg gtttctgagg 120 aattttaagg aaatgtgaga agaaaaattg attagatgta ttcgaacggg taagtttgtt 180 cttgatcaag atgcgtgttt aatggtaatc gatgagaaag tacatttttt agggttttta 240 tttcatttct tttattgggt catcttctat tgataagaag ctaaagttga attgatgtag 300 aatgcggagc tgtttacgtt gacttatgga gcgactgtcc gtcaattgct tacagatctg 360 gaggaggttg aggaggttaa caaacagctc gatcagatgt aattttactc cacttctcct 420 gctctttgat ccagtttctt tttcataact tagaattctg ctttgtccgg agatgactta 480 cagttttttt tttttttttg tctgaattag ctgtttagtt ttgcttttgc tttgttactt 540 atttggttgt actggctctt atctttgtgt gaacttatac gaatgaaggc aattaaagga 600 tctgtataac agaacagtta tgacctctgt actatacaaa gtgtacattt aacaaatttc 660 tttacattcc ttccataaga ggcttgcaga agcttatttc ttctcatttt tatgaaatgt 720 gcttgaattt tagtttgaga gtttaaaata agatgcacgt gaaccactat ggattgacct 780 agttgtgttg gggcatgtaa aaaatatgaa ggaactttgg gagatagttc aaactttata 840 gttgccactt aaatgggata aaatcctaca agcttcttga taacaaaatg ttggtagagt 900 aaaactgttg tctgggtatg catgagaatt atattctcct atttggttct ttcgtcttct 960 gcaagaaagt tggtttttca ttaaaaagaa atagtgtgca tgacagataa atactaggca 1020 tattatgttt ttcaatgctt cctatgttca ttgataaaat actaaaaatt cttttgtgct 1080 taaacttaat gcccttgtga taagagctct taagtggagg ttgtggatgc aaaggaatag 1140 gaggattttc gaagataagt ctttttctct tgaattttct tgggactgtt ttcacttaaa 1200 tacttcttgg tggtgtcata gctatagtaa actcttttgt catatcccta tttccttgat 1260 tcttttggat tgcaagctat ttgtcagtag ttccttgggt gggggctttg cctttttgaa 1320 tgaatactac ttgatgtttc ttaaccaaac cgccccccac ccacccaccc acccacacac 1380 acacacaaaa aaaaaaaaaa aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngcacg accacgcaaa 1500 agaaaaaaaa aaaaacctat aatattggag tgaggctgat tgatgagttt caatgatttg 1560 actgatttgt caattgtttc aggggttata atattggaat caggctaatt gatgagtttc 1620 tagcaaaatc taatatctct agatgtgtgg acttcaagga gacagctgat gtgattgcaa 1680 aggtaagttg tagtttaata aatacatatg ccaaagtatt ttattcttcc cgggagtcat 1740 cgcgaagctg ttgaagtagt attctgttag gtacttaagc accttggaga accacacccc 1800 aaaagctagc tattgaggat tttaaccaat gtgggacaaa ggtagcccat actatcttgg 1860 ttcctaacaa tactccatcc cgaaaagcca acattccgac ggctactcca atggtacttc 1920 actcggccac actcggtcag aacgctccac tggatccact acaaaatgtc aacaacaggt 1980 ttttatatca ttgttaggta cttaagcacc ttggagaacc acaccccaaa agctagctat 2040 tgaggtggga gagccaagcc acttaagtac cacattggtc atcccattct aaccaatgtg 2100 ggacaaaggt agctcatact accttggttc ctaacatgta acctatcatc tcccaatcac 2160 aacttcattg tcacatattc atattagtat ctgaaccttt tttttatttt taatttttta 2220 attttttatt tttatccgtg agtgtctagg ccagcttatg cacacctcga ctaatctcat 2280 gggacaatcc gtctgggtgt caaggaaact cgtaagaaat taattcctaa gtagatggcc 2340 accatgtagt atctaaaccc tattcggttt aggaagtctt taccttggcc ttgttaggtt 2400 gagtcctata ctccatgctt tggtttgcct tgtccatatg gacaccgcta cttttggtag 2460 ttggcaccat ttgaaatttg gccctgcaat tgagggggta gcttccaagt aaagtgttca 2520 aattctgatg caataagctt tttgcagttg catagagtgg atctattcat gtccatttga 2580 attttttata gcattaaatt tcatgtccat ggcttaacta tgaaacagga tttctcttat 2640 atgcgggatt tttgttgggt ctgtcgagga tggtaggtat gttagataat agtggtgctc 2700 ctggctgtta ggataacaaa aacacactca agaatgaaca gaaaactcaa taacatcgaa 2760 atatgaaaat atacgaaaat atatgctata atattataag aaaagtaaca aagtaactta 2820 gccttagagt tagtctcttc acaattctcc aaaagaaatc tcacacaaaa ttcttcacac 2880 ctctagcctt actctcactt actatttata acccgaagga cctaacaaac ttaatataat 2940 tactaacatg ccccttccaa taaacatact aatattctac tattgatcct attatatctc 3000 tagctagggc tctcatatag gcagttgggt ttatttggta ttttggccta caatatactg 3060 tgcgaaatga aagttcaagg ccttttgaag tgtggggatc ttaatttatt ttccattttt 3120 aataggttgg cttaaaaatg tttctgggag tgaatgcaac ggtgaccaac tgggatgctg 3180 aaggcacatg ctgcagcatt gttctggagg acaatccact agtggacttt gttgagcttc 3240 ctgatacttg tcaaggtctc cattactgca acatcttaag tggagtaatt agaggagcac 3300 ttgagatggt gagttctctg catatttttc ttgtctaaac cgtgcttatt gtcatcttga 3360 tagcttatca tcgttatgag aagcacaagt atagatacaa gacacatata tgataaagac 3420 atgagtacgg caagtttgcg tttattaatg tatatcattt ttatacattt ataagcttaa 3480 aaaaaagagt atgtattttg cactcaaatt ttatttaagt atattcgata catttctaat 3540 agatgttgaa cctatataga ctttgtacaa ttaatgtcta acacacatct tatgctaaca 3600 agtgtccaat atgtgtccga ctgttggaca tgtgttgagg attgacgctc tagccaaact 3660 aaagtgttta tgcttcttag tcatcattgt ggctagttta tattttattc tttttcagag 3720 atatatttaa tatattcaat ataggttaaa gaatatattc aacacacaat tgaaatttcc 3780 gagatttatt gatatgaaat ataaaatttg aaagttcaag gactggacac aaaattaaaa 3840 cctcatggtt tattagacac ttttcaaaat tcaaaaacca aatagacatg cacctaaaag 3900 tttaggaacc aaaggtacaa tttaaccaca cttttacctt aattaaattt gtaggtatga 3960 attttgttat ttttctgatt gtggtatggt gtttggatca ggtgtcaatg aaaacagaag 4020 taacatggct acgcgacatg ctgagaggag acgacagctt cgaattacaa gtaaaattgc 4080 tgaagcaagt ccctgaagag tacccttaca aagacgatga ataa 4124 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaaacggagc agtagacgca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttccatgatg caacgtcctt 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acacactcaa gaatgaacag a 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgtgtgagat ttcttttgga ga 22 <110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> CAPS marker for selecting watermelon cultivar of red flesh and uses according <130> PN18383 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1629 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Citrullus vulgaris <400> 1 atggaggagg ccattttggt tttccatgat ccgtgtcatg agcgtaatgt gtttgcatat 60 aatgctataa tttctgggtt tgtcgctaat ggtcttgctt caaaagggtt tcaattttat 120 aagcaaatga ggttagaggg tgtaatgcct gataagtaca cttttccatg tgtagttaga 180 acttgttgtg aggttatgga ggtgaagaag attcatggat gttcgtttaa aatggggttg 240 gagttggatg tgtttgttgg tagtgctttg gttaatactt acttgaagat tggctcaatg 300 gaggatgcac aaaaagtgtt tgaagaactg tcaataagag atgttgtact ttggaatgca 360 atgatcaatg ggtatgctca gattggttgc ctcgacaagg cattagaggt tttcagaaga 420 atgcatatag aagggattgc acctagtagg tttacaatta ctgccatttt atctattttt 480 gctttaaggg gagacttaga caatgggaaa acggttcatg ggattgtaac aaaaatgggt 540 tatgactcag gagttgcagt ttctaatgcg ttaattcata tgtatgggaa atgcaaacat 600 attggagatg ctttaataat ttttgagatg ataaatgaga aggatatttt ctcatggaat 660 tcaattatat cagttcatga acaaggtggt gatcatgatg gtaccttgag gctttttgat 720 aagatgttag gttctgggat tctacctgat ttggtaacca tcacaacggt agttccagct 780 tgctctcatt tggctgccct catgcatggt agagaaattc atggatatat gattgttaat 840 ggattgggaa aagatgatga aaacggagca gtagacgcat tactagtaaa taatgctgtt 900 atggatatgt atgcaaaatg tggaagtatg aacaatgccc tcaagatttt tgatctaatg 960 agcaataagg acgttgcatc atggaatatc atgattatgg gttatggtat gcatggttat 1020 ggtatggagg cattagatat gttttcccga atgtgtgagg ccggatttaa gccggatgaa 1080 gttacacttg ttggagttct atcagcatgc aatcatgcgg gttttgtatc tcaagggcgt 1140 ttttttttag ctgagatgga atctaaattt gacgttattc caactattga gcattttaca 1200 tgtgtaattg atatgctcgg tcgagctggg catctggagg atgcatatga ggttgctcag 1260 aaaatgccta ttcaagccaa tcctgttgtt tggagggctt tactgggagc atgtcgactt 1320 catgggaatg cagagttggc caaaattgca gcacgacgag taatgcaact tgaaccagag 1380 cattgtggga gttatgtatt gatgtccaat gtttatggag ttataggtcg atatgaagag 1440 gtgttggagg ttagaaaaac aatgaaggaa caaaatgtca agaagacacc tggttgtagt 1500 tggattgaac tcaaggatgg ggtgcatgtt tttcttaccg gagataggac acattcagaa 1560 ttgaatgctt tgactaatca actgtgtgat attggattca ttttagatga agtcttgaac 1620 ttatattga 1629 <210> 2 <211> 4124 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Citrullus vulgaris <400> 2 atgcctcccg ctggtcctcg atctggtgat gcgatcttcg ctagtgttga gcgagtggta 60 agcttctcag ctacaagttt ctctgttttt ttgattgttc ctgccgtttg gtttctgagg 120 aattttaagg aaatgtgaga agaaaaattg attagatgta ttcgaacggg taagtttgtt 180 cttgatcaag atgcgtgttt aatggtaatc gatgagaaag tacatttttt agggttttta 240 tttcatttct tttattgggt catcttctat tgataagaag ctaaagttga attgatgtag 300 aatgcggagc tgtttacgtt gacttatgga gcgactgtcc gtcaattgct tacagatctg 360 gaggaggttg aggaggttaa caaacagctc gatcagatgt aattttactc cacttctcct 420 gctctttgat ccagtttctt tttcataact tagaattctg ctttgtccgg agatgactta 480 cagttttttt tttttttttg tctgaattag ctgtttagtt ttgcttttgc tttgttactt 540 atttggttgt actggctctt atctttgtgt gaacttatac gaatgaaggc aattaaagga 600 tctgtataac agaacagtta tgacctctgt actatacaaa gtgtacattt aacaaatttc 660 tttacattcc ttccataaga ggcttgcaga agcttatttc ttctcatttt tatgaaatgt 720 gcttgaattt tagtttgaga gtttaaaata agatgcacgt gaaccactat ggattgacct 780 agttgtgttg gggcatgtaa aaaatatgaa ggaactttgg gagatagttc aaactttata 840 gttgccactt aaatgggata aaatcctaca agcttcttga taacaaaatg ttggtagagt 900 aaaactgttg tctgggtatg catgagaatt atattctcct atttggttct ttcgtcttct 960 gcaagaaagt tggtttttca ttaaaaagaa atagtgtgca tgacagataa atactaggca 1020 tattatgttt ttcaatgctt cctatgttca ttgataaaat actaaaaatt cttttgtgct 1080 taaacttaat gcccttgtga taagagctct taagtggagg ttgtggatgc aaaggaatag 1140 gaggattttc gaagataagt ctttttctct tgaattttct tgggactgtt ttcacttaaa 1200 tacttcttgg tggtgtcata gctatagtaa actcttttgt catatcccta tttccttgat 1260 tcttttggat tgcaagctat ttgtcagtag ttccttgggt gggggctttg cctttttgaa 1320 tgaatactac ttgatgtttc ttaaccaaac cgccccccac ccacccaccc acccacacac 1380 acacacaaaa aaaaaaaaaa aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngcacg accacgcaaa 1500 agaaaaaaaa aaaaacctat aatattggag tgaggctgat tgatgagttt caatgatttg 1560 actgatttgt caattgtttc aggggttata atattggaat caggctaatt gatgagtttc 1620 tagcaaaatc taatatctct agatgtgtgg acttcaagga gacagctgat gtgattgcaa 1680 aggtaagttg tagtttaata aatacatatg ccaaagtatt ttattcttcc cgggagtcat 1740 cgcgaagctg ttgaagtagt attctgttag gtacttaagc accttggaga accacacccc 1800 aaaagctagc tattgaggat tttaaccaat gtgggacaaa ggtagcccat actatcttgg 1860 ttcctaacaa tactccatcc cgaaaagcca acattccgac ggctactcca atggtacttc 1920 actcggccac actcggtcag aacgctccac tggatccact acaaaatgtc aacaacaggt 1980 ttttatatca ttgttaggta cttaagcacc ttggagaacc acaccccaaa agctagctat 2040 tgaggtggga gagccaagcc acttaagtac cacattggtc atcccattct aaccaatgtg 2100 ggacaaaggt agctcatact accttggttc ctaacatgta acctatcatc tcccaatcac 2160 aacttcattg tcacatattc atattagtat ctgaaccttt tttttatttt taatttttta 2220 attttttatt tttatccgtg agtgtctagg ccagcttatg cacacctcga ctaatctcat 2280 gggacaatcc gtctgggtgt caaggaaact cgtaagaaat taattcctaa gtagatggcc 2340 accatgtagt atctaaaccc tattcggttt aggaagtctt taccttggcc ttgttaggtt 2400 gagtcctata ctccatgctt tggtttgcct tgtccatatg gacaccgcta cttttggtag 2460 ttggcaccat ttgaaatttg gccctgcaat tgagggggta gcttccaagt aaagtgttca 2520 aattctgatg caataagctt tttgcagttg catagagtgg atctattcat gtccatttga 2580 attttttata gcattaaatt tcatgtccat ggcttaacta tgaaacagga tttctcttat 2640 atgcgggatt tttgttgggt ctgtcgagga tggtaggtat gttagataat agtggtgctc 2700 ctggctgtta ggataacaaa aacacactca agaatgaaca gaaaactcaa taacatcgaa 2760 atatgaaaat atacgaaaat atatgctata atattataag aaaagtaaca aagtaactta 2820 gccttagagt tagtctcttc acaattctcc aaaagaaatc tcacacaaaa ttcttcacac 2880 ctctagcctt actctcactt actatttata acccgaagga cctaacaaac ttaatataat 2940 tactaacatg ccccttccaa taaacatact aatattctac tattgatcct attatatctc 3000 tagctagggc tctcatatag gcagttgggt ttatttggta ttttggccta caatatactg 3060 tgcgaaatga aagttcaagg ccttttgaag tgtggggatc ttaatttatt ttccattttt 3120 aataggttgg cttaaaaatg tttctgggag tgaatgcaac ggtgaccaac tgggatgctg 3180 aaggcacatg ctgcagcatt gttctggagg acaatccact agtggacttt gttgagcttc 3240 ctgatacttg tcaaggtctc cattactgca acatcttaag tggagtaatt agaggagcac 3300 ttgagatggt gagttctctg catatttttc ttgtctaaac cgtgcttatt gtcatcttga 3360 tagcttatca tcgttatgag aagcacaagt atagatacaa gacacatata tgataaagac 3420 atgagtacgg caagtttgcg tttattaatg tatatcattt ttatacattt ataagcttaa 3480 aaaaaagagt atgtattttg cactcaaatt ttatttaagt atattcgata catttctaat 3540 agatgttgaa cctatataga ctttgtacaa ttaatgtcta acacacatct tatgctaaca 3600 agtgtccaat atgtgtccga ctgttggaca tgtgttgagg attgacgctc tagccaaact 3660 aaagtgttta tgcttcttag tcatcattgt ggctagttta tattttattc tttttcagag 3720 atatatttaa tatattcaat ataggttaaa gaatatattc aacacacaat tgaaatttcc 3780 gagatttatt gatatgaaat ataaaatttg aaagttcaag gactggacac aaaattaaaa 3840 cctcatggtt tattagacac ttttcaaaat tcaaaaacca aatagacatg cacctaaaag 3900 tttaggaacc aaaggtacaa tttaaccaca cttttacctt aattaaattt gtaggtatga 3960 attttgttat ttttctgatt gtggtatggt gtttggatca ggtgtcaatg aaaacagaag 4020 taacatggct acgcgacatg ctgagaggag acgacagctt cgaattacaa gtaaaattgc 4080 tgaagcaagt ccctgaagag tacccttaca aagacgatga ataa 4124 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaaacggagc agtagacgca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttccatgatg caacgtcctt 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acacactcaa gaatgaacag a 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgtgtgagat ttcttttgga ga 22

Claims

서열번호 1의 수박 유래 PPR(Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859) 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3(Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209) 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 SNP 마커 조성물. Polynucleotide consisting of 8 or more contiguous nucleotides comprising SNP (single nucleotide polymorphism) located at 884th base of the watermelon-derived watermelon-derived PPR (Pentatricopeptide repeat-containing protein, Cla006859 ) gene of SEQ ID NO: 1 Nucleotides; And a polynucleotide consisting of at least 8 contiguous nucleotides including a SNP located at 2,828 base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived TRAPPC3 (Trafficking protein particle complex subunit 3, Cla004209 ) gene of SEQ ID NO: 2, or a complementary polynucleotide thereof SNP marker composition for selecting a red flesh watermelon variety, comprising one or more polynucleotides selected from the group.

서열번호 1의 수박 유래 PPR 유전자의 염기서열 중 884번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 수박 유래 TRAPPC3 유전자의 염기서열 중 2,828번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 마이크로어레이.A polynucleotide consisting of at least 8 contiguous nucleotides comprising an SNP located at a 884th base of the watermelon-derived PPR gene of SEQ ID NO: 1 or a complementary polynucleotide thereof; And a polynucleotide selected from the group consisting of at least 8 contiguous nucleotides comprising a SNP located at the 2,828 base of the nucleotide sequence of the watermelon-derived TRAPPC3 gene of SEQ ID NO: 2, or a complementary polynucleotide thereof. Microarray for selecting watermelon varieties of red flesh.

서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 프라이머 세트.Oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.

제3항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 프라이머 세트.The method of claim 3, wherein the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And a set of primers for selecting watermelon varieties of red flesh, comprising oligonucleotide primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.

제3항 또는 제4항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종 선발용 키트.An oligonucleotide primer set according to claim 3 or 4; Reagents for conducting amplification reactions; And a red fruit watermelon variety selection kit comprising restriction enzymes.

제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.The kit of claim 5, wherein the reagent for performing the amplification reaction comprises DNA polymerase, dNTPs, and a buffer.

수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항 또는 제4항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는, 적색 과육의 수박 품종을 선발하는 방법.Separating genomic DNA from watermelon samples;
Amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set according to claim 3 or 4;
Cutting the product of the amplification step with a restriction enzyme; And
And electrophoresis the product of the restriction enzyme cleavage step to separate the cleavage product by size.