KR102004322B1

KR102004322B1 - 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102004322B1
Application number: KR1020180153705A
Authority: KR
Inventors: 민진우; 임효정; 황진혁; 김훈중; 조미경; 여은희; 이대우; 김다애
Original assignee: 주식회사 웰코스; (주)더마랩
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-10-01

Abstract

본 발명은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 본 발명 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물은 우수한 피부장벽 강화효과, 보습, 피부진정 및 재생효과를 나타내므로 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing botanical extract complex}

본 발명은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 자귀나무껍질(Albizia Julibrissin Bark), 숙근안개초(Gypsophila Paniculata), 시계꽃(Passiflora Incarnata), 권백(Selaginella Tamariscina) 및 딜(Peucedanum graveolens) 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부장벽강화, 보습, 피부진정 및 재생효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부지질 중에서도 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있는데, 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약 40~65%, 10% 및 25%를 차지한다. 또한 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재하는 조성을 가진다.

세라마이드는 스핑고신에 지방산이 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 스핑고지질의 일종이다. 세라마이드는 피부각질층을 구성하는 각질세포간지질 중 약 40% 이상을 차지하며, 수분증발을 억제하는 방어벽 역할과 각질층의 정연한 구조를 유지하게 하는 기능을 가지고 있다. 피부 각질층은 각화된 세포가 벽돌모양의 다층구조로 구성되어 있으며 이러한 각화세포는 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리 지방산에 의해 견고히 결합되어 있어 피부 장벽기능 및 피부보습에 도움이 된다.

피부는 외부의 세균 침입 및 손상으로부터 보호하는 방어역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지 하는 것 인데 표피에서 재생 능력을 보이는 것으로 알려진 것에는 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포 keratinocyte stem cell)가 있으며 피부 표면에 존재하는 표피 세포들은 바깥 표피 쪽으로 분화되어 나가면서 지질을 생산하고 분비하여 단백질로 각질화된(cornified) 원형질막에 이중층으로 된 조직을 형성한다. 외피 세포는 끊임없이 벗겨지고 다시 자라나는 이 과정이 반복된다. 외부로부터 피부 손상이 일어났을 경우 상처 치유 과정이 일어나는데 표피와 진피의 손상으로 기저막에 노출되어 있으면서 표피가 손실된 상처는 상처 표면에 선홍색을 띤다.

새로운 결체 조직을 형성하는 것으로 새로운 혈관 생성과 콜라겐 합성 과정이 있다. 섬유아세포는 콜라겐 합성 및 기타 결체 조직 형성에서 가장 중요한 세포 이므로 상처 복구 과정에서도 중요한 역할을 한다. 섬유아세포는 혈소판 대식 세포 등에 의해 염증기에 생성된 산물과 성장인자 등에 반응하여 움직이고 증식하며 염증기 후반부의 상처에 나타나기 시작한다. 노화가 진행되면서 피부 손상을 회복시키는 섬유아세포의 증식이 줄어들게 되고 콜라겐 등의 합성능이 떨어지면서 재생 능력이 낮아져 이로 인해 상처 부위의 회복이 느려지게 된다. 따라서 활성 생성 억제, 이로 인해 발생하는 염증 반응 억제 및 상처로부터 피부 재생을 촉진시켜 피부를 보호하여야 한다.

민감성피부란 외부의 자극성물질이나 인체 내부 원인 등에 대하여 정상인 피부보다 더 민감하게 반응하여 자극반응이나 피부염이 잘 나타나는 피부로 화장품산업에서는 피부관리나 화장품 도포 시 작열감을 호소하는 피부를 말한다. 최근 생활환경의 변화나 대기오염, 공해, 식생활, 생활환경의 변화, 복잡한 인간관계, 질병, 스트레스, 내적 혹은 외적 자극의 증가 등으로 인해 스스로를 민감성피부로 생각하는 사람이 증가하고 있다. 민감성피부의 진단은 건조하거나 따갑거나 가려움을 호소하는 주관적 반응과 붉음증, 팽진, 농포, 미란, 각질을 관찰할 수 있는 객관적인 반응 등으로 진단할 수 있다. 따라서 세포의 재생을 촉진하고, 면역과 신체의 신진대사를 강화하며, 보습기능과 피부두께 개선 및 항염작용을 통해 피부 자극을 완화시킬 수 있다.

본 발명자들은 천연 소재로부터 피부자극을 유발하지 않으면서도 우수한 피부장벽강화, 보습, 피부진정 및 재생 효능을 나타내는 화장료를 개발하고자 노력하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제1913235호 (2018.10.24) (0002) 대한민국 공개특허 제2013-0084523호 (2013.07.25)

본 발명은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 함유하여 우수한 피부장벽강화, 보습, 피부진정 및 재생효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합추출물은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 추출용매로 추출 후, 효모를 접종하여 알코올 발효하고, 다시 초산균을 접종하여 초산 발효한 후, 가수분해효소 처리하여 제조되는 것이다.

상기 알코올 발효는 효모를 접종하여 25~28℃의 배양온도에서 5일 이상, 바람직하게는 5~10일간 발효하는 것이다. 상기 초산 발효는 초산균을 접종하여 30~32℃의 배양온도에서 1주일 이상, 바람직하게는 7~10일간 발효하는 것이다. 상기 가수분해효소는 바람직하게는 β-글루코시다아제이다.

상기 혼합추출물은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 건조중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것이다.

상기 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 포함된다.

상기 화장료 조성물은 피부장벽강화, 보습, 피부 진정 및 재생용임을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)세척 건조된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; B)상기 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매로 추출하여 용매추출물을 제조하는 단계; C)상기 용매추출물에 효모를 접종하여 25~28℃의 배양온도에서 5~10일간 알코올 발효하는 단계; D)초산균을 접종하여 30~32℃의 배양온도에서 7~10일간 초산 발효하는 단계; E)상기 발효물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소 반응시키는 단계; 및 F)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 B)단계의 용매추출은 혼합물을 30% 에탄올 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하는 것으로 이루어지는 것이 바람직하다.

알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 본 발명 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물은 우수한 피부장벽 강화효과, 보습, 피부진정 및 재생효과를 나타내므로 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 피부장벽강화 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 피부보습 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명 화장료 조성물에 함유되는 추출물 원료인 자귀나무는(Albizia julibrissin) 콩목 콩과의 식물이다. 원산지는 남동아시아의 이란과 중국, 한국에 이른다. 겨울을 겨우겨우 살아가므로 겨우살이, 오릿길을 지날 때마다 이정표로 이 나무를 심어 놓았다고 해서 오리나무, 쥐똥 같은 열매를 맺는다고 해서 쥐똥나무, 물에 담그면 푸른 물이 나와서 물푸레나무라고 불리기도 한다. 이 나무의 껍질을 합환피라 하여 약재로 사용하며, 합환피는 불면, 건망, 실면(失眠) 등의 치료에 사용하며, 타박상 골절 등에도 사용된다. 또한 다량의 폴리페놀을 함유하고 있어 피부미백, 항산화 효과, 티로시나제 억제활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

숙근안개초(Gypsophila paniculata)는 지중해 연안의 원산지로 석죽과에 속하며 내한성이 강한 숙환이다. 많은 가지에 작은 꽃이 많이 피며 숙근은 뿌리가 오래 살아서 남아 있다는 뜻으로 안개초 중에서도 여러해살이 풀이라는 뜻이다. 숙근안개초 뿌리는 피부컨디셔닝, 피부진정 및 노폐물을 제거해주는 효과가 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 숙근안개초의 뿌리가 사용될 수 있다.

시계꽃(Passiflora caerulea)은 브라질 원산의 상록성 덩굴식물로 많은 나라에서 관상 식물로 재배한다. 줄기는 약 4m 자라고, 잎은 손바닥처럼 다섯 갈래로 깊게 갈라져 있다. 지름이 약 8cm인 꽃에는 꽃잎과 꽃받침잎이 각각 다섯 장씩 달려 있는데, 꽃잎은 안쪽이 옅은 붉은색이나 파란색을 띠고, 꽃받침잎은 안쪽이 흰색이나 연분홍색 또는 옅은 파란색을 띤다. 시계꽃의 맛은 쓰며, 성질은 따뜻하고 독이 없다. 신경통, 정신안정, 고혈압 불안, 긴장완화에 사용된다. 또한 항균 및 항산화효능이 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 시계꽃의 전초가 사용될 수 있다.

권백(Selaginella tamariscina)은 부처과에 속한다. 권백은 부처손, 불사초, 장생불사초, 회양초 등의 이름이 있다. 가지는 편평하게 갈라지며, 앞면은 녹색, 뒷면은 다소 흰빛을 띈다. 건조할 때는 가지가 수축되어 공처럼 되었다가, 습기가 있으면 다시 활짝 펴진다. 월경이 순조롭지 못할 때, 타박상 등으로 상처가 생겼을 때, 피를 토하거나 대변에서 피가 보이는 증상 등을 치료한다. 또한 항염 및 항산화 효능이 있다고 알려져 있다.

딜(Peucedanum graveolens)은 허브의 일종으로, 자라는 장소에 따라 여러해살이허브, 한해살이 허브로 불리며 시라, 소회향으로도 부른다. 지중해 동부, 러시아 남부에서 유럽 중서부에서 자라며, 향신료인 동시에 치유식물로도 사용되었다. 미나리과 식물이고 1.2m까지 그늘에서 자라는 음지식물이다. 우울증, 불면치료에 효능이 있으며, 모노테르펜이 매우 풍부하여 항암효능이 있다고 알려져 있다. 항균효능이 뛰어나고 피부탄력개선, 항노화 및 항산화 효능이 있다. 본 발명에서는 딜의 전초가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜은 오프라인 또는 인터넷 마켓에서 구입할 수 있다. 본 발명의 추출물의 제조에 있어서 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백, 딜은 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나, 가루로 만들어 사용할 수 있다.

본 발명 화장료 조성물의 유효성분인 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 제조를 위해 먼저 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합물을 용매로 추출한다. 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 물, 에탄올 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합)중에서 선택된 용매가 사용될 수 있으며, 통상의 추출방법에 의해서 추출물을 제조할 수 있다. 바람직하게는 30% 에탄올 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출한다.

본 발명에서는 상기 용매추출 후 알코올 발효, 초산 발효를 거쳐 가수분해효소 처리 공정을 통하여 유효성분을 더욱 효율적으로 추출한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 먼저, 세척 건조 후 세절한 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 혼합하여 혼합물을 제조하고, 그 건조 중량의 1~80배 부피량의 용매, 즉 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 부틸렌글라이콜 및 프로필렌글라이콜로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하고 50~55℃에서 감압 농축하여 용매추출물을 제조한다.

이 후 용매추출물에 효모를 접종하여 25~28℃에서 5일이상, 바람직하게는 5~10일간 알코올 발효한다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 루시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 오비폴미스(Saccharomyces oviformis) 및 사카로마이세스 스테이네리(Saccharomyces steineri)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것을 사용할 수 있다.

상기 알코올 발효 후에 이어서 초산균을 접종하여 30~32℃에서 1주일 이상, 바람직하게는 7~10일간 다시 발효한다. 상기 초산균으로는 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum), 아세토박터 파스테리아누스(Acetobacter pasteurianus), 및 아세토박터 한세니(Acetobacter hansenii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다.

상기 발효를 통해 얻어진 발효물에 가수분해효소, 바람직하게는 β-글루코시다아제 효소를 넣어 50~55℃에서 100rpm 정도로 교반하면서 4~5시간 동안 반응시킨다. 90℃로 5분 정도 가온하여 효소반응을 정지시킨 후, 여과하고 감압농축기로 농축하여 혼합추출물을 제조한다.

본 발명의 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물은 각각의 추출물을 제조한 후 혼합하거나, 원료를 혼합하여 혼합물을 제조한 후 추출하여 제조될 수 있다. 본 발명의 혼합추출물은 감압 농축액, 농축액을 동결 건조한 분말 또는 농축액을 분무 건조하여 건조한 분말일 수 있다.

상기 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 건조중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출된 것이며, 각각의 추출물을 제조 후 상기 비율로 혼합하여 이루어진 것일 수 있다. 각각 1:2:1:2:2로 이루어지는 경우에 가장 우수한 피부장벽강화, 보습, 진정 및 재생 효능을 나타내므로 가장 바람직하다.

상기 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001~10 중량%의 양으로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5 중량%의 양으로 함유된다.

알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 본 발명의 혼합추출물은 그 상승작용에 의하여 우수한 피부장벽강화 효과(시험예 2), 피부보습 효과(시험예 3), 피부진정효과(시험예 4) 및 피부재생효과(시험예 5)를 나타내었다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 혼합추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 혼합추출물 이외에 피부보습, 진정 및 재생 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

실시예 1 내지 6: 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 제조

세척 건조되어 분쇄된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 하기 표 1의 중량비로 혼합하여 100g의 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물의 제조에 있어서 숙근안개초의 뿌리, 시계꽃의 전초, 딜의 전초를 사용하였다.

추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g의 혼합용매를 사용하였으며, 상기 혼합물을 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 용매추출물을 얻었다. 이 후 30g의 용매추출물에 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 25℃에서 5일간 발효하였다. 이후 초산균(Acetobacter xylinum)을 접종하여 30℃에서 1주일간 발효하였다. 얻어진 발효물에 β-글루코시다아제 효소 3g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 혼합추출물을 얻었다.

비교예 1: 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물 제조

세척 건조되어 분쇄된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 하기 표 1의 중량비로 혼합하여 100g의 혼합물을 제조하였다. 10배 중량의 추출용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하였으며, 95℃에서 1시간 동안 중탕 추출하고, 50℃에서 감압 농축하여 30g의 추출물을 얻었다.

비교예 2: 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물 제조

이 후 30g의 용매추출물에 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 25℃에서 5일간 발효하였다. 얻어진 발효물에 β-글루코시다아제 효소 3g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 혼합추출물을 얻었다.

비교예 3: 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물 제조

이 후 30g의 용매추출물에 초산균(Acetobacter xylinum)을 접종하여 30℃에서 1주일간 발효하였다. 얻어진 발효물에 β-글루코시다아제 효소 3g을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응 시켰다. 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 혼합추출물을 얻었다.

비교예 4: 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물 제조

이 후 30g의 용매추출물에 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 25℃에서 5일간 발효하였다. 이 후 초산균(Acetobacter xylinum)을 접종하여 30℃에서 1주일간 발효하였다. 얻어진 발효물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 혼합추출물을 얻었다.

중량비	자귀나무껍질	숙근안개초	시계꽃	권백	딜
실시예 1	1	1	1	1	1
실시예 2	1	2	1	1	1
실시예 3	1	1	2	1	1
실시예 4	1	1	1	2	1
실시예 5	1	1	1	1	2
실시예 6	1	2	1	2	2
비교예 1	1	2	1	2	2
비교예 2	1	2	1	2	2
비교예 3	1	2	1	2	2
비교예 4	1	2	1	2	2

효능을 확인 하고자 각각의 추출물은 농축 후 동결 건조하여 샘플을 준비하였다.

시험예 1: 세포 생존율 측정 시험

세포 배양

트랜스글루타미네이즈-1(transglutaminase-1, Tgase-1)은 각질형성세포가 각질 생성 또는 각질 분화시에 증가하는 대표적인 각질분화인자이다. 각질형성세포의 Tgase-1 발현량이 증가하면, 각질형성촉진에 따른 피부장벽이 강화되는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 실시예 및 비교예의 혼합추출물의 효능을 확인하기 위해 Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과는 각질형성세포 HaCaT Cell을, Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과는 CCD-986Sk 세포를 사용하였다. 또한 세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과도 HaCaT와 CCD-986Sk 세포를 사용하였다.

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT [3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인 하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO₂, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

구분	세포 생존율(%)
구분	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
실시예 1	101	100	100	101
실시예 2	101	101	100	100
실시예 3	101	100	101	100
실시예 4	100	100	100	100
실시예 5	101	101	100	100
실시예 6	100	100	101	101
비교예 1	100	101	100	100
비교예 2	101	101	100	100
비교예 3	100	100	101	100
비교예 4	100	101	100	101
대조군Adenosine	100	100	101	101

구분	세포 생존율(%)
구분	0.001 %	0.005 %	0.01 %	0.05 %
대조군 Hyaluronic Acid	100	100	101	101

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 4 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 2: 피부장벽강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 4의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 3에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Tgase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
Tgase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

그 결과는 각각 도 1에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 실시예 1 내지 6의 혼합추출물은, 초산발효, 알코올발효 및 효소처리 하지 않은 비교예 1, 초산 발효 하지 않은 비교예 2, 알코올 발효하지 않은 비교예 3 및 효소처리 하지 않은 비교예 4 보다 우수한 Transglutaminase-1 유전자 발현 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 실시예 6에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 3: 피부보습 효과

Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과

실시예 1 내지 6, 비교예 1 내지 4의 혼합추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Hyaluronan Synthase-3의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
HAS-3	Forward : ACTGCCTTCAAGGCCCTTGG
HAS-3	Reverse : AATGTTCCAGATGCGGCCAC

그 결과는 각각 도 2에 나타내었다. 대조군으로 히알루론산(HA)을 사용하였다. PT-PCR 수행 후 관찰결과, 알코올 발효 및 초산 발효 후 가수분해효소 처리하여 제조되는 실시예 1 내지 6의 혼합추출물은, 초산발효, 알코올발효 및 효소처리 하지 않은 비교예 1, 초산발효 하지 않은 비교예 2, 알코올발효 하지 않은 비교예 3 및 효소처리 하지 않은 비교예 4의 혼합추출물보다 우수한 Hyaluronan Synthase-3 유전자 발현효과를 나타내었다.

시험예 4: 염증 매개 인자 IL-1α 발현 억제효과 확인

각질형성세포 (HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 x 10⁵cells/wel로 조절한 수 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 IL-1α의 발현 증가율을 확인 하였다. IL-1α 발현 억제율은 하기식에 의해 산출 되었고 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 대조군으로 덱사메타손(dexamethasone)을 사용 하였다.

IL-1α의 억제율(%) = 시료 IL-1a 발현양/대조군 IL-1α발현양 X 100

상기 시험결과 하기의 표 5와 같은 결과를 얻었다

IL-1α 억제율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
IL-1α 억제율(%)	100	500	1000
실시예 1	30.10	42.37	67.32
실시예 2	32.54	40.21	64.36
실시예 3	41.25	57.23	68.12
실시예 4	39.45	60.32	67.42
실시예 5	42.84	58.96	67.14
실시예 6	54.30	67.83	75.23
비교예 1	30.01	43.12	53.62
비교예 2	40.14	53.69	61.32
비교예 3	42.16	52.98	60.25
비교예 4	41.13	50.98	59.45
Dexamethason	60.28	72.56	75.62

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 6의 혼합추출물은 비교예 1 내지 4의 혼합추출물 보다 높은 IL-1α 억제율을 나타내었다.

시험예 5: 상처 치유 효과 확인

피부 상처 치유 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5 x 10⁵cells/well의 세포를 분주 후 상기 실시예 및 비교예의 추출물 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

세포재생율(%)= 시료 세포 재생율/ 대조군 세포 재생율 x 100

시료명	처리농도 (㎍/㎖)	피부세포 재생율(%)
실시예 1	1000	70.65
실시예 2	1000	65.53
실시예 3	1000	75.86
실시예 4	1000	68.21
실시예 5	1000	70.25
실시예 6	1000	92.54
비교예 1	1000	60.31
비교예 2	1000	72.54
비교예 3	1000	79.25
비교예 4	1000	78.12
덱사메타손	500	86.30

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 실시예의 혼합추출물은 우수한 피부세포 재생율을 나타내었으며, 특히 실시예 6의 혼합추출물은 비교예의 혼합추출물들에 비하여 매우 높은 피부세포 재생율을 나타내어 상처치유효과가 가장 높은 것으로 확인되었다.

제형 실시예 1: 스킨로션의 제조

하기 표 7의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 스킨로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물(실시예 6)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 7에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2: 영양로션의 제조

하기 표 8의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합추출물을 함유한 하이드로좀 영양로션을 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물(실시예 6)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 8에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85 ℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims

자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출 후, 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 25~28℃의 배양온도에서 5~10일간 알코올 발효하고, 다시 초산균(Acetobacter xylinum)을 접종하여 30~32℃의 배양온도에서 7~10일간 초산 발효한 후, β-글루코시다아제 효소 처리하여 제조되는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽강화, 보습, 피부 진정 및 재생용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 건조중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 피부장벽강화, 보습, 피부 진정 및 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 피부장벽강화, 보습, 피부 진정 및 재생용 화장료 조성물.
삭제
A)세척 건조된 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜을 각각 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
B)상기 혼합물을 30% 에탄올 추출용매로 90~95℃에서 1~2시간 중탕 추출하여 용매추출물을 제조하는 단계;
C)상기 용매추출물에 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 25~28℃의 배양온도에서 5~10일간 알코올 발효하는 단계;
D)초산균(Acetobacter xylinum)을 접종하여 30~32℃의 배양온도에서 7~10일간 초산 발효하는 단계;
E)상기 발효물에 β-글루코시다아제 효소를 가하여 효소 반응시키는 단계; 및
F)상기 효소반응 완료 후 여과하는 단계를 포함하는 자귀나무껍질, 숙근안개초, 시계꽃, 권백 및 딜 혼합추출물의 제조방법.
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