KR102001120B1

KR102001120B1 - 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 및 이를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드

Info

Publication number: KR102001120B1
Application number: KR1020170082919A
Authority: KR
Inventors: 이강원; 양충모; 고원건; 국윤민
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2019-07-16
Also published as: KR20190002253A

Abstract

본 발명의 일 양상은 나노섬유;
제 1 하이드로젤 내에 상기 나노 섬유를 캡슐화하는, 제 1 하이드로젤층; 및
제 2 하이드로젤 내에 상기 제1하이드로젤층을 캡슐화하는, 제 2 하이드로젤층을 포함하는, 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체, 그 복합체를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드, 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 및 이를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드{Complex of nanofiber and hydrogel and a scaffold for tissue regeneration}

본 발명은 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 및 이를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체 조직 재생, 특히 심근조직의 재생에 효과적으로 사용될 수 있는 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 와 이를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드, 그리고 그 제조방법에 관한 것이다.

서구화된 식습관과 운동부족, 고령화로 인해 관상동맥질환, 부정맥, 심부전증 등 심혈관 질환 환자들이 급증하여 현재 심장질환으로 일한 사망은 주요 사망 원인 중 두 번째로 높은 사망률을 나타내어 심혈관 질환의 근본적 치료를 위해 심혈관 조직 재생은 매우 중요하다.

심혈관 및 심근조직의 손상에 의한 질환은 치료가 어렵고 재생이 잘 일어나지 않기 때문에 기존에는 치료를 위해 심장이식이나 세포이식치료방법이 사용되었다. 그러나, 심장이식의 경우에는 필요한 환자 수에 비해 기증자의 수가 현저히 모자라며, 수술 비용 또한 환자들에게 큰 부담이 된다. 또한, 세포이식치료방법은 손상된 조직에 심근세포를 동종이식하는 방법이지만, 아직까지 필요한 만큼 많은 양의 심근세포를 적절한 시기에 증식시키는 것은 불가능하여 이를 대체하는 기술개발이 필요한 실정이다.

상기 문제점을 해결하기 위해, 세포를 이용해 체외에서 인공 조직을 만들어 효과적으로 체내로 이식함으로써 조직을 재생하는 방식이 최근에 크게 각광을 받고 있으며, 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

특허문헌 1은 생체 친화성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol) 하이드로젤 기반의 장치를 이용하여 사람 췌장 세포와 PDX1(duodenal homeobox gene 1) 양성 사람 췌장 전구세포를 캡슐화 하는 방법을 개시한다. 이에 따르면, 캡슐화된 전구세포가 잘 분화된다는 장점이 있으나, 분화 배지를 이용하여 분화를 조절하기 때문에 하이드로젤의 생분해능 등의 물성을 쉽게 조절할 수 없다는 단점이 있다.

특허문헌 2는 PDMS(polydimethylsiloxane)를 이용한 3차원 세포 캡슐화 장치를 제작하여 PDX1 양성 사람 췌장 전구 세포를 캡슐화 하는 방법을 개시한다. 이 방법은 세포 분화에는 효과적이나, 장치를 구성하는 물질인 PDMS의 특성상 세포 부착능이 떨어지고 개질이 어려워 물성을 조절하는데 어려움이 있다.

이와 같은 문제 등을 개선하기 위하여 전기방사에 의한 나노섬유와 하이드로젤의 복합체를 제작하여 세포를 캡슐화 하는 방법이 개발되었다. 특허문헌 3은 전기방사에 의한 나노섬유와 알긴산염(Sodium Alginate)의 하이드로젤 복합체를 고안하였다. 나노섬유를 세포부착층으로 하고, 그 나노섬유를 하이드로젤로 캡슐화하여 조직 재생용 스캐폴드를 제작하였다. 그러나, 알긴산 하이드로젤의 특성상 부착 증식하는 세포에 대하여 원활하게 증식하지 못하는 문제점이 있으며, 이로 인해 조직 재생 시 매우 중요한 혈관 생성에 어려움이 있다.

미국특허등록 8278106 미국특허공개 20140257515 한국특허등록 1685248

본 발명의 목적은 조직 재생에 중요한 혈관 형성을 촉진시킬 수 있으며, 조직 이식에 적합한 물성을 가질 수 있는 효과적인 조직 재생용 스캐폴드로서 사용될 수 있는 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은

나노섬유;

제 1 하이드로젤 내에 상기 나노 섬유를 캡슐화하는, 제 1 하이드로젤층; 및

제 2 하이드로젤 내에 상기 제1하이드로젤층을 캡슐화하는, 제 2 하이드로젤층을 포함하는, 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 포함하는 조직 재생용 스캐폴드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양상은

틀에 나노섬유를 넣고 제 1 하이드로젤 전구체 용액을 가한 다음 가교반응시켜 상기 나노섬유를 캡슐화하는 제 1 하이드로젤층을 형성시키는 단계; 및

상기 제 1 하이드로젤층에 제 2 하이드로젤 전구체 용액을 가한 다음 가교반응시켜 상기 제 1 하이드로젤층을 캡슐화하는 제 2 하이드로젤층을 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체는 나노섬유에 세포의 부착배양이 가능한 제1하이드로젤층을 도입함으로써, 나노섬유 상에는 조직 재생용 세포의 배양이 이루어지고, 제1하이드로젤층에는 조직 재생에 필수적인 혈관세포의 배양이 이루어지도록 할 수 있다. 더욱이, 상기 복합체는 최외곽에 세포의 부착배양이 어려운 제2하이드로젤층을 포함함으로써, 상기 복합체를 조직 재생용 스캐폴드로서 조직 재생을 위해 생체 내에 이식할 경우 그 스캐폴드로의 생체의 섬유아세포 및 콜라겐 등의 부착을 막아 섬유화 과정을 차단할 수 있어 원활한 이식이 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 양상에 따른 복합체는 조직 재생에 필수적이 혈관의 형성이 충분히 이루어지면서, 스캐폴드 이식 과정에서 발생될 수 있는 섬유화와 같은 생체의 거부반응을 회피할 수 있으므로, 보다 효과적인 조직재생용 스캐폴드, 특히 심혈관조직 재생용 스캐폴드로서 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 조직 재생용 스캐폴드의 개요도로서, 전기방사 나노섬유, 그 나노섬유를 캡슐화한 피브린 하이드로젤층, 및 그 피브린 하이드로젤층을 캡슐화한 알지네이트 하이드로젤층을 포함하는 것으로서, 상기 알지네이트 하이드로젤층에서는 생체물질의 방출 및 교환이 이루어질 수 있으며, 외부로부터의 단백질 및 세포침습을 방지 혹은 제어할 수 있으며, 전기방사 나노섬유 상에서는 세포의 공배양이 이루어질 수 있으며, 피브린 하이드로젤에 혈관 조직의 생성이 가능하다.
도 2는 전기방사에 의한 나노섬유 스캐폴드의 제조(단계 1), 스캐폴드의 소독(단계 2), 피브린 하이드로젤 캡슐화(단계 3), 및 알지네이트 하이드로젤 캡슐화(단계 4) 과정을 포함한, 본 발명 일 구체예에 따른 복합체의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 전기방사에 의한 나노섬유의 제조과정 (a,b), 주사형 전자현미경을 통해서 본 전기방사 나노섬유 스캐폴드의 형태(c,d)를 나타낸다.
도 4는 실시예 1 내지 3에서 제조된 각각의 피브린 하이드로젤 (a), 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체(b), 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체(c)를 육안으로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 5는 실시예 1, 2 및 3에서 제조된 전기방사 나노섬유(Fibrin), 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체(Fibrin-PCL), 그리고 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체(Fibrin-PCL-알지네이트)의 기계적 강도를 측정한 결과를 나타낸 그래프를 나타낸다.
도 6은 동결주사전자현미경(Cryo-Scanning electron microscopy, Cryo-SEM)을 이용해 실시예 3 에서 제조된 나노케이지의 단면을 관찰하고 촬영한 사진이다.
도 7은 HUVEC 의 피브린 하이드로젤 내부에서의 생존 능력을 확인하기 위해, 전기방사 나노섬유가 없이 피브린 하이드로젤 내부에 HUVEC을 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 일주일 간 배양하고 세포의 생존성을 Live/Dead cell viability assay법으로 염색하여 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 8은 1차 하이드로젤과 2차 하이드로젤의 복합체 모습을 확인하기 위해, 전기방사 나노섬유 없이 HUVEC 함유 피브린 하이드로젤을 알지네이트 하이드로젤로 코팅한 후, EGM-2 Bullekit 혼합 배지에서 1, 4, 및 7 일동안 배양한 후에 광학현미경을 통해 두 하이드로젤의 단면을 촬영한 사진이다
도 9는 피브린 하이드로젤의 혈관 생성의 적합성을 확인하기 위해 전기방사 나노섬유 없이 HUVEC가 포함된 피브린 하이드로젤을 제작한 뒤, 1일, 4일, 7일 시간에 광학 현미경을 통해 HUVEC의 혈관 생성 과정을 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 나노케이지 내부에서 세포의 활성을 관찰하기 위해 HUVEC과 ADSC를 각각 피브린 하이드로젤과 전기방사 나노섬유에 1 주일간 배양하여 세포의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 “약”의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 조직 재생용 세포의 배양뿐만 아니라 조직 재생에 필수적인 혈관조직을 형성할 수 있는 혈관세포의 배양에 유리한 스캐폴드에 대해 예의 연구하였으며, 그 결과 나노섬유, 그 나노섬유를 캡슐화하는 제1차 하이드로젤층 및 그것을 다시 캡슐화하는 제2하이드로젤층을 도입한 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체을 착안하게 되었다.

본 발명은 일 양상에 있어서,

나노섬유;

본 명세서에서는, 상기 본 발명의 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체를 간략히 "나노케이지"라고 명명하기도 한다.

상기 복합체 중에서 상기 나노섬유는 상기 복합체에서 가장 내부에 위치하게 되며, 상기 복합체를 조직 재생용 스캐폴드로서 이용 시 조직 재생용 세포의 배양, 예를 들어 줄기세포 및 심근세포의 공배양을 위해 사용되는 부위이다.

상기 나노섬유는 조직 재생용 세포가 배양될 수 있는 나노섬유라면 특별히 한정되는 것은 아니나, 일 구체예에서 상기 나노섬유는 전기방사에 의해 제조된 전기방사 나노섬유이다. 전기방사 나노섬유는 종래 생체 세포의 배양에 적합한 것으로 공지된 임의의 전기방사 나노섬유일 수 있다.

상기 전기방사 나노섬유는 수십 나노미터에서 수 마이크로미터의 직경을 갖는 섬유의 집합체이며, 상기 구조체는 다수의 크기가 다양한 공극(pore)을 포함하고 있으며, 세포 부착이 가능한 3차원적 구조체를 형성할 수 있다. 또한 이러한 공극은 소정의 모양, 크기 및 부피를 가지고 있다. 전기방사 나노섬유의 직경은 전기방사 나노섬유의 재료가 되는 고분자 용액의 농도, 전기방사의 유속, 전압 등을 조건을 조절하여 변화시킬 수 있으며 고분자 용액에 염을 첨가하여 변화시킬 수도 있다.

일 구체예에서, 상기 전기방사 나노섬유의 공극의 크기는 20 내지 100 ㎛로 조절될 수 있다. 대부분의 세포는 스캐폴드에 고정되어 형질변환이 일어나기 전에는 10 내지 15 ㎛로 존재하기 때문에, 조직 재생용 세포가 상기 크기 범위에서 공극 내부로 들어가 스캐폴드 내부에 고정되어 성장과 분화가 일어나기 적합할 수 있다.

상기 전기방사 나노섬유는 공지의 전기방사법에 의해 제조된 나노섬유일 수 있다. 나노섬유를 제조하기 위해 사용되는 물질은 조직 재생용 세포의 배양에 적합하면서 나노섬유를 생성될 수 있는 물질이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 나노섬유로 형성된 스캐폴드는 생체물질이 나노섬유에 잘 고정되도록 하기 위하여 추가적 변형(modification)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적 변형에는 산소 플라즈마 처리, 라디에이션 그라프팅(Radiation grafting) 방법 또는 자기조립 단일층(Selfassembly monolayer, SAM) 방법이 이용될 수 있다. 산소 플라즈마 처리의 경우 소수성이 큰 나노섬유의 경우 친수성을 증가시키기 위해 사용된다. 라디에이션 그라프팅 방법으로 예를 들어 나노섬유 스캐폴드에 UV 조사로 벤조페논과 아자이드 물질을 사용하여 나노섬유의 표면을 원하는 물질로 변형시킬 수 있도록 반응성을 줄 수 있다. SAM 방법은 하이드록시 작용기가 존재하는 표면과 실란(Silane)의 자발적인 반응을 이용하여 실란과 결합된 부분을 표면에 고정시키는 방법이다. 라디에이션 그라프팅이나 SAM 방법에서는 일반적으로 단백질과 화학적 결합을 하는 물질인 N-하이드록시숙신이미드(Nhydroxysuccinimide, NHS)를 결합시켜 사용하게 된다. 이러한 나노섬유로 형성된 스캐폴드에 대한 추가적 변형은 나노섬유 생성 물질의 종류에 상관없이 생체물질이 잘 고정될 수 있도록 해주므로, 나노섬유 생성 물질의 종류에는 제한이 없다.

상기 전기방사 나노섬유를 형성하는 고분자의 종류는 조직재생용 세포의 배양을 저해하지 않는다면 특별히 한정 되어있지 않으며, 다양한 천연 고분자 및 합성 고분자가 사용될 수 있다. 세포 부착 측면에서 생분해 특성을 갖지 않는 고분자 물질이 사용될 수도 있으나, 바람직하게는 약물전달의 측면, 세포 이식 및 세포 치료의 측면에서 생분해 특성을 갖는 고분자 물질이 사용될 수 있다. 이러한 생분해성 고분자는 예를 들어 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온 (PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린 (PAN), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 전기방사 나노섬유의 제조에 사용되는 생분해성 고분자는 PCL 및 젤라틴의 혼합물의 전기방사 나노섬유이다. 상기 전기방사 나노섬유는 또한 조직 재생용 세포뿐만 아니라 줄기세포의 부착, 증식 및 분화에 적합할 수 있다.

상기 나노섬유는 필요에 따라 세포의 보다 원활한 부착을 위해 파이브로넥틴(Fibronectin)을 코팅하여 사용될 수도 있다. 또한, 약물전달 측면에서 세포의 증식 및 분화를 돕기 위해 사용되는 성장인자를 전기방사 나노섬유에 도입할 수 있다. 이를 위해서, 전기방사 과정에서 고분자 용액에 섞어서 섬유의 내부에 주입하거나, 섬유 외부에 물리적/화학적으로 부착시켜 도입할 수도 있다.

상기 전기방사 나노섬유는 고분자 용액을 전기방사하여 제조하는데, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

전기방사 나노섬유의 제조를 위한 상기 열거한 바와 같은 고분자를 용해할 수 있는 적합한 용매를 선택하여 전기방사를 위한 고분자 용액을 제조할 수 있다. 이러한 용매는 상기 조건을 만족시키면 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 클로로포름(Chloroform), 트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol, TFE), 테트라하이드로퓨한(Tetrahydrofuran, THF), 디메틸포름알데하이드(Dimethylformaldehyde, DMF), 및 이들의 임의의 조합에서 선택될 수 있으며, 용액의 점도, 유전율 등의 요인을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

상기 전기방사 나노섬유를 제조하기 위한 전기방사법은 고분자 용액에 높은 전압을 걸어주면 + 또는 -의 한쪽 전하가 고분자 용액에 축적되게 되고 같은 전하끼리의 상호 반발력에 의해 고분자 용액이 가지는 표면 장력을 넘어서면서 용매가 증발되면서 섬유가 용액에 전가된 반대쪽 전하로 하전되거나 접지된 기판으로 모아지게 되는 방법을 이용한다. 상기 용매를 이용하여 고분자를 녹인 용액의 농도, 유속, 전압 등을 조절하여 섬유의 직경을 조절할 수 있으며, 전기방사의 시간 및 노즐과 기판의 높이 조절을 통해 섬유의 밀도를 조절할 수 있다.

상기 전기방사 나노섬유 제조를 위한 고분자 용액에 사용되는 용매는 조직재생용 세포의 배양에 적합하지 않는 독성을 가질 수 있으며, 전기방사 과정에서 완벽하게 증발되지 않아 얻어지는 나노섬유에 남게 되어 세포독성을 일으킬 우려가 있다. 따라서, 상기 복합체를 조직 공학용 스캐폴드로 이용하기 위해서는 잔여 용매를 완벽하게 제거할 필요가 있다. 잔여 용매를 제거하기 위해서는 용매의 증발을 위해 수 십 ℃의 온도에서 섬유를 보관하거나 진공 상태에서 섬유를 보관하는 방법 등이 있으며, 보다 효과적인 처리를 위해 상기 방법을 조합하여 사용할 수도 있다. .

상기 나노섬유는 제1하이드로젤로 캡슐화된 다음, 다시 제2하이드로젤로 캡슐화되어, 상기 나노섬유 및 하이드로젤 복합체를 형성한다.

상기 나노섬유를 캡슐화하는 제 1 하이드로젤은 상기 나노섬유를 제 1 하이드로젤 내부에 삽입시켜 나노섬유를 캡슐화함으로써 형성될 수 있다. 상기 캡슐화를 위해, 예를 들어 나노섬유를 하이드로젤 전구 용액(Precursor solution)에 넣고 하이드로젤 전구 용액을 가교시켜 하이드로젤로 형성시킴으로써 나노섬유를 제 1 하이드로젤로 캡슐화할 수 있다. 또한, 제 1 하이드로젤로 캡슐화된 나노섬유는, 동일한 방식으로 제 2 하이드로젤로 캡슐화될 수 있다.

상기 제 1 하이드로젤은 세포 부착능이 높아 혈관 형성에 필요한 혈관세포의 배양에 적합한 하이드로젤이며, 제 2 하이드로젤은 세포 부착능이 떨어져 상기 복합체를 스캐폴드로서 생체에 이식할 경우 부착증식을 막아 단백질 및 세포의 외부 침습을 막을 수 있는 하이드로젤이다. 즉, 상기 제 1 하이드로젤은 혈관내피세포의 부착능이 뛰어나고 증식 및 혈관생성에 큰 도움을 줄 수 있는 역할을 하며, 제 2 하이드로젤은 제 1 하이드로젤에 비해 공극의 크기가 현저히 작고, 세포 부착능이 떨어져 세포를 캡슐화 할 수는 있으나 부착증식하는 세포의 증식에는 도움이 되지 않지만, 비부착증식하는 세포의 증식과 체내로의 이식 과정에서 단백질 및 세포의 외부 침습을 막아줄 수 있는 장점이 있다.

구체적으로, 상기 제 1 하이드로젤은 1um - 100um의 공극을 가진 다공성 하이드로젤일 수 있으며, 상기 제 2 하이드로젤은 1nm - 10nm 의 공극을 갖는 다공성 하이드로젤일 수 있다.

하이드로젤은 전기방사 나노섬유와 마찬가지로 3차원 구조를 갖고 있기 때문에, 세포의 3차원 배양에 도움을 주지만, 하이드로젤을 이루는 고분자의 특성에 따라서 세포의 부착능에 대한 큰 차이를 보일 수 있다. 예를 들어 콜라겐 같은 고분자는 하이드로젤 형태에서 세포의 부착능에 좋은 특성을 나타내나, PEG, 알지네이트와 같은 고분자는 하이드로젤로 제작되었을 때 세포의 부착에 큰 제약이 있기 때문에 비부착증식 세포에 배양에 적합하다. 따라서, 고분자를 적절히 선택하여 제1하이드로젤 및 제2하이드로젤을 제조할 수 있다. 이외에도, 하이드로젤을 제조하는 조건에 따라서도 세포의 부착능이 달라질 수 있다.. 따라서, 제조 조건에 따른 다공성의 조절에 의해서도 하이드로젤의 세포부착능을 조절할 수 있으며, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 제조할 수 있다.

상기 제 1 하이드로젤은 혈관형성에 필요한 혈관세포의 배양에 적합한 생체 적합성 고분자로 형성될 수 있으며, 예를 들어 콜라겐, 키토산, 피브린, 이들의 공중합체, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 생체적합성 고분자의 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 제 1 하이드로젤은 피브린 하이드로젤이다.

상기 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체는 다공성의 제1 하이드로젤층을 포함하는 것으로 인해, 혈관세포의 부착배양이 가능하며 이로 인해 조직 재생에 필수적인 혈관의 형성을 가능하게 할 수 있다.

상기 제 2 하이드로젤은 세포의 부착증식을 차단할 수 있으면서 생체 적합성인 고분자로 형성될 수 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프로락톤(PCL), 젤라틴, 알긴산, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 무수말레인산/비닐에테르, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 생체적합성 고분자의 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 제2하이드로젤은 알긴산 하이드로젤이다.

상기 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체는 2차 하이드로젤층을 추가로 포함하는 것으로 인해, 상기 복합체를 스캐폴드로서 이식할 경우 섬유화와 같은 체내 거부반응을 차단할 수 있다는 장점이 있다. 나노섬유만으로 이루어진 스캐폴드나 나노섬유와 다공성 제 1 하이드로젤로 이루어진 스캐폴드만을 이용하여 생체에 이식할 경우, 섬유화가 발생하여 체외 조직의 이식의 효과가 매우 떨어지게 되는데, 제 2 하이드로젤로 제 1 하이드로젤을 캡슐화하여 패시베이션(Passivation)할 경우에는 생체 내 이식에 있어서 우수한 효과를 얻을 수 있다.

상기 제 1 하이드로젤층 및 제 2 하이드로젤층은 하이드로젤 전구용액을 가하고 가교반응을 수행함으로서 하이드로젤층을 형성시킬 수 있다. 하이드로젤을 형성하는 고분자는 각각의 특징에 따라 가교시키는 방법이 다양하다. 예를 들어, 자외선(UV) 조사에 의한 광가교(Photo-crosslinking), 반응성 가교제(Reactive crosslinker)를 활용한 가교 등을 들 수 있는데, 이러한 방법을 이용한 가교된 하이드로젤은 쉽게 분해되지 않으며, 가교 과정에서 마스크를 사용하여 특정한 부분만 하이드로젤을 가교시켜 패터닝 기술을 접목시킬 수 있다. 또한, 온도에 의해 가교시키는 열가교(Thermal-crosslinking) 방법은 특정한 온도 이상에서 가교되어 하이드로젤이 형성되는데 온도 변화를 통해 세포 방출 및 약물 전달에 응용이 가능하다. 또한, 특정한 단백질 반응 및 이온과 고분자 간의 반응을 이용한 가교 방법은 널리 알려진 단백질 간의 반응을 이용하여 하이드로젤을 가교시킬 수 있으며 쉽게 하이드로젤을 제작할 수 있다는 장점이 있다.

일 구체예에서, 상기 제 1 하이드로젤로서 피브린 하이드로젤을 포함할 경우, 피프리노겐을 하이드로젤 전구체 용액으로서 사용하고, 트롬빈을 가교제로서 부가하여 피브린 하이드로젤을 형성시킬 수 있다. 또한, 상기 제 2 하이드로젤로서 알지네이트 하이드로젤을 포함할 경우, 알지네이트염 용액을 칼슘 클로라이드와 같은 전구체 용액으로서 사용하여 알지네이트 하이드로젤을 형성시킬 수 있다.

상기 하이드로젤은 전기방사 나노섬유와 마찬가지로 3 차원의 다공성 구조를 가지므로, 내부로부터 약물의 방출을 통한 약물전달 시스템으로서 기능할 수 있다. 상기 하이드로젤은 지속적인 약물의 방출이 가능할 수 있다. 하이드로젤에 약물을 도입하기 위해서는, 하이드로젤 형서을 위한 가교반응 전에 약물을 부가한 다음 가교반응시키면 하이드로젤 내부에 약물을 함입시킬 수 있고, 하이드로젤로부터 함입된 약물의 지속적인 전달이 가능하다. 또한, 하이드로젤에 약물을 도입하기 위한 다른 방법으로서, 하이드로젤을 이용한 세포 배양 과정에서 외부의 배지에 약물을 부가하여 배지로부터 하이드로젤 내부로 약물을 함입시킬 수 있다.

일 구체예에서는, 혈관형성에 도움이 되는 성장인자인 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 또는 S1P(Sphingosin-1-phosphate)를 배지에 섞어 하이드로젤 내부로 전달시킬 수 있으며, 상기 성장인자는 제 1 하이드로젤층에서의 혈관 형성을 촉진시킬 수 있다.

상기 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체는 조직 재생을 위해 생체 내에서 이식되는 과정에서 쉽게 파손되지 않을 정도의 충분한 강도를 가질 수 있다. 상기 복합체는 나노섬유를 캡슐화 하는 제1하이드로젤층 및 제2하이드로젤층을 포함하는 것으로 인해 보다 우수한 강도를 가질 수 있으며 상기 강도는 하이드로젤의 가교 정도, 나노섬유의 두께, 하이드로젤의 두께, 등에 따라 통상의 기술자가 공지된 방법에 따라 조절할 수 있다. 이에 따라 상기 복합체가 충분한 정도의 강도를 가질 경우, 재생하고자 하는 각 조직의 세포외기질의 물리적 강도와 비슷하게 조직 재생용 스캐폴드를 제작할 수 있고, 이와 같이 물리적 강도가 유사할 경우 스캐폴드 내의 세포의 조직특이적 특이성이 쉽게 부여될 수 있다는 장점이 있다,

일 구체예에서, 상기 복합체는 0.1 내지 0.5 MPa의 강도를 가질 수 있다. 상기 강도보다 높을 경우, 혈관 재생이 원활하게 이루어지지 않을 수 있으며, 낮은 경우에는 줄기세포의 분화를 조절하기가 어려워질 수 수 있다.

상기 복합체는 조직 재생용 스캐폴드로서 사용되기 위해 상기 나노섬유 상에 부착배양된 조직 재생용 세포를 포함할 수 있다.

상기 조직 재생용 세포는 목적하는 임의의 조직 재생에 필요한 세포가 사용될 수 있으며, 예를 들어 심근세포, 평활근세포, 연골 세포, 뼈세포, 피부세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 신경세포, 슈반세포, 줄기세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 나노섬유 상에 심근세포 및 줄기세포를 공배양시켜 도입할 수 있다.

상기 제 1 하이드로젤층은 세포, 생체물질, 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 상기 세포 및/또는 생체물질은, 조직 재생에 기여할 수 있는 임의의 세포 또는 생체물질 일 수 있다. 이러한 세포로는 섬유아세포, 혈관내피세포, 신경세포, 슈반세포, 줄기세포, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 간질세포가 조합되어 사용될 수 있다. 상기 생체 물질은 조직 재생에 기여할 수 있의의 생체 물질일 수 있으며, 예를 들어 혈관세포의 증식을 촉진시키는 앞서 언급한 VEGF 또는 S1P와 같은 성장인자일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 제 1 하이드로젤층은 사람제대혈정맥내피세포 (HUVEC)를 함유할 수 있으며, HUVEC를 함유하는 것으로 인해 혈관형성이 촉진될 수 있어 조직 재생을 현저히 유리하게 할 수 있다. 추가적으로, 상기 제 1 하이드로젤층은 성장인자를 함유할 수 있으며, 성장인자의 함유로 인해 나노섬유 상의 부착배양되는 세포의 증식 및 제 1 하이드로젤층에서의 혈관세포의 증식을 촉진시킬 수 있다. 일 구체예에서, 성장인자는 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 이다.

일 구체에에서, 상기 복합체는 나노섬유 상에 부착배양된 심근세포 및 줄기세포를 함유하고, 상기 제 1 하이드로젤층은 HUVEC를 함유하는 것인 복합체이다.

일 구체에에서, 상기 복합체는 나노섬유 상에 부착배양된 심근세포 및 줄기세포를 함유하고, 상기 제 1 하이드로젤층은 HUVEC 및 VEGF를 함유하는 것인 복합체이다.

본 발명은 다른 일 양상에 있어서, 상기 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드를 제공한다.

상기 조직 재생용 스캐폴드의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "스캐폴드"는 조직 재생 공학 분야에서 중요한 기본 요소 중의 하나로서 세포의 부착, 분화 및 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 증식과 분화에 적합한 환경을 제공하는 역할을 하는 구조물을 의미한다.

상기 조직 재생용 스캐폴드는 나노섬유 상에 부착배양된 세포의 종류에 따라 재생 가능한 조직이 결정될 수 있다. 예를 들어, 심혈관 조직 재생을 위해 심근세포, 연골 조직 재생을 위해 연골세포, 뼈 조직의 재생을 위해 뼈세포, 피부조직 재생을 위해 피부세포, 상처 조직 재생을 위해 섬유아세포 등을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조직 재생용 스캐폴드는 심혈관 조직 재생용 스캐폴드이며, 나노섬유 상에는 부착배양된 심근세포 또는 추가적으로 줄기세포를 함유한다.

일 구체예에서, 상기 조직 재생용 스캐폴드는 상처 치료용 스캐폴드이며, 나노섬유 상에는 섬유아세포, 또는 추가적으로 줄기세포를 함유한다.

종래에는 세포를 함유하는 스캐폴드를 생체 내에 이식할 경우, 생체 내에서 섬유화로 인한 이식 실패 사례가 많이 보고되었다. 그러나, 상기 본 발명에 따른 조직 재생용 스캐폴드는 2차 하이드로젤층의 도입에 의한 패시베이션으로 인해 그 스캐폴드로의 생체의 섬유아세포 및 콜라겐의 부착을 막아 섬유화 과정을 차단할 수 있어 원활한 이식이 가능하다.

또한, 상기 조직 재생용 스캐폴드는 제 1 하이드로젤층에 혈관세포를 배양시켜 혈관조직을 형성시킬 수 있어, 스캐폴드의 생체 내 이식 시 안정적이고 효과적으로 생체 조직을 재생할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 양상에 따른 복합체는 조직 재생에 필수적인 혈관의 형성이 충분히 이루어지면서, 스캐폴드 이식 과정에서 발생될 수 있는 섬유화와 같은 생체의 거부반응을 회피할 수 있으므로, 보다 효과적인 조직재생용 스캐폴드, 특히 심혈관조직 재생용 스캐폴드로서 사용될 수 있다.

또한, 상기 조직 재생용 스캐폴드는 전기방사 나노섬유 및 하이드로젤 내에 원하는 약물을 함입시켜 지속적인 약물 방출을 가능하게 할 수 있으며, 세포외기질(Extracellular matrix, ECM) 구성에 효과적인 약물을 함입시킴으로써 스캐폴드를 이식하는 주변 조직의 원활한 세포외기질의 형성을 촉진시킬 수 있다. 이러한 약물의 함유로 인해 상처치료(wound healing) 등의 분야에 보다 효과적인 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 조직 재생용 스캐폴드의 개요도를 나타낸 것이다.

도 1에 따른 조직 재생용 스캐폴드는 전기방사 나노섬유, 그 나노섬유를 캡슐화한 피브린 하이드로젤층, 및 그 피브린 하이드로젤층을 캡슐화한 알지네이트 하이드로젤층을 가진다. 상기 알지네이트 하이드로젤층에서는 생체물질의 방출 및 교환이 이루어질 수 있으며, 외부로부터의 단백질 및 세포침습을 방지 혹은 제어할 수 있으며, 전기방사 나노섬유 상에서는 세포의 공배양이 이루어질 수 있으며, 피브린 하이드로젤에 혈관 조직의 생성이 가능하다.

본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서,

상기 제 1 하이드로젤층에 제 2 하이드로젤 전구체 용액을 가한 다음 가교반응시켜 상기 제 1 하이드로젤층을 캡슐화하는 제 2 하이드로젤층을 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체의 제조방법을 제공한다.

상기 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체의 제조방법의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 제 1 하이드로젤 전구체는 피브리노겐이고, 상기 가교반응은 트롬빈을 가교제로 하여 가교반응 시킬 수 있다. 또한, 상기 제 2 하이드로젤 전구체는 알긴산염 수용액이고, 상기 가교반응은 칼슘클로라이드를 가교제로 하여 가교반응 시킬 수 있다. 상기 알긴산염 수용액은 예를 들어 일간산 나트륨이다.

상기 나노섬유는 나노섬유 상에 앞서 설명한 바와 같은 조직 재생용 세포의 세포분산액을 시딩한 다음 배양한 다음 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 세포분산액은 심근세포 및 줄기세포의 혼합 분산액이고, 제 1 하이드로젤 전구체 용액은 HUVEC를 함유할 수 있으며, 추가적으로 VEGF를 더 함유할 수 있다.

일 구체예에 따른 상기 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체의 제조방법의 단계별 과정을 나타낸 모식도를 도 2에 나타내었다. 도 2에 따르면, 전기방사에 의한 나노섬유의 제조(단계 1), 나노섬유의 소독(단계 2), 나노섬유를 캡슐화하는 피브린 하이드로젤층의 형성(단계 3), 및 그 피브린 하이드로젤층을 캡슐화하는 알지네이트 하이드로젤층의 형성(단계 4) 과정을 포함한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 전기방사법을 이용한 PCL-젤라틴 섬유층의 형성

폴리카프로락톤(PCL, Sigma) 0.5g과 젤라틴(Gelatin, Sigma) 0.5g을 트리플루오로에탄올(TFE, Sigma) 5ml에 혼합한 후 용매가 증발하지 않도록 완전히 밀봉하여 80 ℃에서 12시간 두어 PCL과 젤라틴을 완전히 녹였다. 이 제조 된 고분자 용액을 상온에서 식힌 후, 완전히 섞어 주기 위해 볼텍싱(Voltexing) 하였다.

전기방사를 하기 위하여 용액을 주사기에 넣고 전기방사 시스템 내에 탑재한 후, 시린지펌프(Syringe pump) 을 이용하여 0.7ml/hr의 일정한 유량(Flow rate)으로 용액을 밀어주어 금속으로 이루어진 원통형 바늘(Needle tip)로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치(Power supply)를 이용하여 8kV의 전압을 흘려주었다. 전기방사로 얻어지는 섬유를 받기 위한 집진판(Collecting plate)을 접지한 뒤, 그 위에 알루미늄 호일(Aluminium foil)을 깔고 일정한 크기의 전기방사 나노섬유 스캐폴드를 만들기 위하여 1.8 cm × 1.8 cm 크기의 커버글라스(Cover glass)를 알루미늄 호일로 감싼 틀을 집진판 위에 두고 30분 간 전기방사를 통해 섬유층(Fibrous sheet)을 얻었다. 전압이 가해지는 원통형 바늘과 집진판과의 거리는 약 10 cm였다. 전압차이로 인해 고분자 용액의 용매가 증발되면서 접지된 집진판으로 용액이 잡아당겨지면서 섬유층을 형성하였다. 생성된 전기방사 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 60 ℃, 진공 상태에서 24 시간정도 두었다.

도 3의 a,b는 상기 방법에서 진공상태에서 잔여 용매를 제거한 전기방사 섬유를 핸드폰 카메라를 이용해 촬영한 모습이고, c,d는 전기방사 섬유를 15mA의 백금으로 1 분간 코팅한 후 주사형 전자현미경을 통해 촬영한 사진 이다.

실시예 2: 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체 제작

실시예 1에서 제조된 전기방사 나노섬유를 잔존 용매를 완벽하게 제거하기 위하여 PBS(Phosphate-buffered saline) 용액으로 2번 세척한 뒤, 5 mm × 5 mm 크기로 잘라 96 well plate에 넣었다.

피브린 하이드로젤 전구 용액(즉, 피브리노겐 용액)을 제조하기 위해, 소듐클로라이드(NaCl) 0.1 mg을 증류수(Distilled water) 5 ml에 넣고 상온에서 30 분간 볼텍싱하여 녹인 뒤, 이 용액에 피브리노겐(Fibrinogen from human plasma, Sigma) 100 mg을 넣어 상온에서 10분간 녹였다.

또한, 피브리노겐을 피브린으로 가교시키기 위하여 가교제로서 트롬빈(Thrombin)을 사용하였는데, 트롬빈 용액을 제조하기 위하여 칼슘클로라이드(CaCl₂) 0.2 mmol을 증류수 5 ml에 넣고 상온에서 30분간 볼텍싱하여 녹인 뒤, 이 용액에 트롬빈을 100 U(Enzyme unit)을 넣어 상온에서 10 분간 녹여 피브린 용액을 제조하였다.

먼저 전기방사 나노섬유를 96 well plate 안에 넣고 그 전기방사 나노섬유가 잠길 정도로 상기 제조된 피브리노겐 용액을 가하고 상기 제조된 트롬빈 용액을 피브리노겐 용액과 1:1의 부피 비를 갖는 양만큼 넣어주고 피펫팅(Pipetting) 하여 잘 섞어주었다. 섞인 용액을 피브리노겐의 가교를 위해 37 ℃에서 30 분간 보관하였고, 이를 통해 전기방사 나노섬유와 피브린 하이드로젤의 복합체가 제작되었다.

실시예 3: 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤 , 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체 제작

알지네이트 하이드로젤 전구 용액을 제조하기 위해, 소듐 알지네이트(Sodium alginate, Wako) 0.1 g을 증류수 5 ml에 넣고 증류수가 증발하지 않도록 밀봉하여 37 ℃에서 2 시간 동안 완전히 녹였다. 또한, 가교제로서 칼슘클로라이드(CaCl₂) 0.1 g을 증류수 10 ml에 넣고 상온에서 30 분간 완전히 녹였다.

상기 방법을 이용하여 제작된 알지네이트 하이드로젤 전구 용액을 96 well plate에 100 μl을 넣고 그 안에 실시예 2에서 제조된 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체를 넣었다. 그런 다음, 알지네이트 하이드로젤을 형성시키기 위해 가교제로서 칼슘클로라이드 용액 50 μl을 소듐 알지네이트 수용액 안에 넣고 상온에서 5 분간 두었다. 그 결과, 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체인 나노케이지가 제조되었다.

상기 실시예 1, 2 및 3에서 제조된 피브린 하이드로젤 (a), 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체(b), 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체(c)의 사진을 도 4에 나타내었다.

실험예 1: 피브린 하이드로젤 , 전기방사 나노섬유와 피브린 하이드로젤 복합체, 및 나노케이지 물성 평가

상기 조건에서 만들어진 피브린 하이드로젤, 전기방사 섬유와 피브린 하이드로젤의 복합체, 및 나노케이지를 잔존 하이드로젤 전구체를 제거하기 위하여 PBS 용액으로 세척한 뒤 압축 응력(Compressive stress) 및 압축 변형(Compressive strain)을 측정하기 위하여 instron(Instron corporation) 장비 기판 위에 놓았다.

각 스캐폴드의 압축 응력 및 압축 변형을 측정하는데 있어서 각 스캐폴드의 기존 높이에서 80%가 될 때까지 압축하여 압축 응력과 압축 변형을 측정하였다. 상기 방법으로 얻어진 압축 응력과 압축 변형을 수식을 이용하여 실제 압축 응력과 실제 압축 변형을 측정하고 그래프를 그린 뒤, 그래프의 일정한 구간에서의 기울기를 측정하여 압축 탄성율(Compressive modulus)를 계산하였다. 실제 압축 응력과 실제 압축 변형을 계산하는 수식은 다음과 같다.

s : 측정된 압축 응력, e : 측정 압축 변형, σ : 실제 압축 응력, ε : 실제 압축 변형

도 5는 실시예 1, 2 및 3에서 제조된 제작된 전기방사 나노섬유(Fibrin), 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤의 복합체(Fibrin-PCL), 그리고 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체(Fibrin-PCL-알지네이트)의 기계적 강도의 그래프를 나타낸다.

실험예 2: 나노케이지 단면 확인 시험

상기 제조된 나노케이지의 단면을 관찰하였다. 우선, 액체 질소를 사용하여 나노케이지를 급랭 냉각(quenching cooling) 시킨 후, 수직으로 절단하여 동결주사전자현미경(Cryo-Scanning electron microscopy, Cryo-SEM)을 이용해 나노케이지의 수직 단면을 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 동결주사전자현미경(Cryo-Scanning electron microscopy, Cryo-SEM)을 이용해 실시예 3 에서 제조된 나노케이지의 단면을 관찰하고 촬영한 사진이다.

도 6의 사진에 따르면, 나노케이지의 피브린 하이드로젤 및 알지네이트 하이드로젤 사이의 단면(a, b), 그리고 피브린 하이드로젤 및 전기방사 나노섬유 사이의 단면(c, d)이 확인되었고, 피브린 하이드로젤은 다공성을 나타내었으며, 알지네이트 하이드로젤은 평평한 모습의 단면을 나타내었다.

실시예 4: 세포가 포함된 나노케이지 제작

지방조직유래 중간엽줄기세포(Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSC)와 심근세포(Cardiomyocyte)를 배양하기 위한 배지는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)에 10 % FBS(Fetal bovine serum)와 1 %의 Penicillin/streptomycin을 혼합한 DMEM 혼합배지를 사용하였다. 또한 사람제대혈정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)를 배양하기 위한 배지는 EGM-2 Bullekit(Endothelial Cell Growth Medium)에 2 % FBS와 1 % Penicillin/streptomycin을 혼합한 용액을 사용하였다.

ADSC와 심근세포의 공배양을 위해 DMEM 혼합 배지에 총 세포가 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 1:1로 분산시켜 세포 분산액을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 전기방사 나노섬유를 96 well plate에 넣고 그 위에 앞서 제조한 세포 분산액을 시딩하였다. 세포 부착을 위해 세포가 시딩된 전기방사 나노섬유를 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다.

ADSC와 심근세포가 전기방사 나노섬유에 부착 배양한 뒤, HUVEC을 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 HUVEC 분산액을 제조하고, 상기 세포가 부착배양된 전기방사 나노섬유와 피브리노겐 하이드로젤 전구 용액 40 μl, 세포 분산액 10 μl, 트롬빈 용액 40 μl을 96 well plate에 넣고 잘 섞어준 뒤 37 ℃ 에서 30 분간 가교시켰다.

그리하여 제조된 세포가 배양된 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤 복합체를 알지네이트 하이드로젤로 코팅하기 위해, 2 wt%의 알지네이트 하이드로젤 전구 용액 100μl를 96 well plate에 넣고, 상기 제조된 세포가 배양된 전기방사 나노섬유 및 피브린 하이드로젤 복합체를 넣은 뒤, 칼슘클로라이드 용액 50 μl를 가했다. 37 ℃에서 5분간 가교시켜 세 가지 세포가 공배양 되어 있는 전기방사 나노섬유, 피브린 하이드로젤, 및 알지네이트 하이드로젤의 복합체인 세포가 포함된 나노케이지가 제조되었다.

실험예 3: 피브린 하이드로젤 내부에서의 HUVEC의 생존능 확인

HUVEC 의 피브린 하이드로젤 내부에서의 생존 능력을 확인하기 위해, HUVEC을 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 HUVEC 분산액을 제조하고, 나노섬유의 존재 없이, 피브리노겐 하이드로젤 전구 용액 40 μl, 상기 세포 분산액 10 μl, 및 트롬빈 용액 40 μl을 96 well plate에 넣고 잘 섞어준 뒤 37 ℃ 에서 30 분간 가교시킨 다음 일주일간 배양(EGM-2 Bullekit 혼합 배지에서 배양) 하고 세포의 생존성을 확인하였다. 일주일간 배양 후 Live/Dead cell viability assay를 이용해 세포를 염색한 후 형광현미경을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다

도 7은 HUVEC 의 피브린 하이드로젤 내부에서의 생존 능력을 확인하기 위해, 전기방사 나노섬유가 없이 피브린 하이드로젤 내부에 HUVEC을 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 일주일 간 배양하고 세포의 생존성을 Live/Dead cell viability assay법으로 염색하여 확인한 결과를 촬영한 사진이다. 살아있는 세포는 초록색, 죽은 세포는 붉은색을 나타낸다.

상기 결과에 따르면, 피브린 하이드로젤 내부에서 HUVEC가 높은 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 4: 세포가 포함된 나노케이지의 구조 확인 시험

세포가 포함되지 않은 나노케이지 단면을 확인하기 위해, 상기 실시예 4에서 단지 전기방사 나노섬유가 없는 것을 제외하고, 동일한 방법으로 피브린 하이드로젤을 알지네이트 하이드로젤로 코팅한 후, EGM-2 Bullekit 혼합 배지에서 1, 4, 및 7일 동안 배양 후에 광학현미경을 통해 두 하이드로젤의 단면을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 1차 하이드로젤과 2차 하이드로젤의 복합체 모습을 확인하기 위해, 전기방사 나노섬유가 없이 HUVEC함유 피브린 하이드로젤을 알지네이트 하이드로젤로 코팅한 후, EGM-2 Bullekit 혼합 배지에서 1, 4, 및 7일동안 배양한 후에 광학현미경을 통해 두 하이드로젤의 단면을 촬영한 사진이다. 경계를 기준으로 내측은 세포가 존재하는 피브린 하이드로젤 , 외측은 세포가 없는 알지네이트 하이드로젤을 나타낸다.

도 8에 따르면, HUVEC가 피브린 하이드로젤 내부에만 잘 캡슐화된 것으로 확인되었다.

실험예 5: 세포가 포함된 피브린 하이드로젤의 혈관생성능 확인

피브린 하이드로젤에서의 혈관생성능을 확인하기 위하여 HUVEC을 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 HUVEC 분산액을 제조하고, 피브리노겐 하이드로젤 전구 용액 40 μl, 세포 분산액 10 μl, 트롬빈 용액 40 μl을 96 well plate에 넣고 잘 섞어준 뒤 37 ℃ 에서 30 분간 가교시켰다. 상기 방법으로 제조된 세포가 포함된 피브린 하이드로젤을 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 주일간 배양한 뒤 HUVEC의 혈관생성을 광학현미경을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 피브린 하이드로젤의 혈관 생성의 적합성을 확인하기 위해 전기방사 나노섬유 없이 HUVEC가 포함된 피브린 하이드로젤을 제작한 뒤, 1일, 4일, 및 7일의 시점에서 광학 현미경을 통해 HUVEC의 혈관 생성 과정을 관찰하였다.

실험예 6: 세포가 포함된 나노케이지에서의 세포 활성 확인 시험

나노케이지에서의 ADSC의 세포 활성을 확인하기 위하여 ADSC를 DMEM 혼합 배지에 총 세포가 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 1:1로 분산시켜 세포 분산액을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 전기방사 섬유를 96 well plate에 넣고 그 위에 앞서 제조한 세포 분산액을 시딩하였다. 세포 부착을 위해 세포가 시딩된 전기방사 나노섬유를 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후에 상기 실시예 2에서의 방법과 동일하게 피브린 하이드로젤 복합체를 제작하고 실시예 3에서의 방법과 동일하게 나노케이지를 제작하였다. 이렇게 제작된 ADSC가 포함된 나노케이지를 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 주일간 배양하고 CCK-8 시약을 이용하여 ADSC의 활성을 측정하였다.

별도로, 나노케이지에서의 HUVEC의 세포 활성을 확인하기 위해 HUVEC을 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 × 10⁵ cells/ml의 비율이 되도록 분산시켜 HUVEC 분산액을 제조하고, 상기 실시예 1에서 제조된 세포가 없는 전기방사 나노섬유와 피브리노겐 하이드로젤 전구 용액 40 μl, 세포 분산액 10 μl, 트롬빈 용액 40 μl을 96 well plate에 넣고 잘 섞어준 뒤 37 ℃ 에서 30 분간 가교시켰다. 그 후에 실시예 3에서의 방법대로 나노케이지를 제작하였다. 이렇게 제작된 HUVEC가 포함된 나노케이지를 EGM-2 Bullekit 혼합 배지에 1 주일간 배양하고 CCK-8 시약을 이용하여 ADSC의 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10은 나노케이지 내부에서 세포의 활성을 관찰하기 위해 HUVEC과 ADSC를 각각 피브린 하이드로젤과 전기방사 나노섬유에 1 주일간 배양하여 세포의 활성을 측정한 결과로서, 이 결과에 따르면 1 주일 동안의 배양에서도 세포의 활성이 유지되는 것으로 확인되었다.

Claims

조직 재생용 세포의 배양을 위한 나노섬유;
제 1 하이드로젤 내에 상기 나노 섬유를 캡슐화하는, 혈관세포 배양을 위한 1um - 100um의 공극을 갖는 다공성의 제 1 하이드로젤층; 및
제 2 하이드로젤 내에 상기 제1하이드로젤층을 캡슐화하는, 세포의 부착배양 차단을 위한 1nm - 10nm 의 공극을 갖는 다공성의 제 2 하이드로젤층을 포함하는, 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체.
청구항 1에 있어서, 상기 나노섬유는 전기방사 나노섬유인 것인 복합체.
청구항 2에 있어서, 상기 나노섬유는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온 (PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린 (PAN), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 생체적합성 고분자로 제조된 전기방사 나노섬유인 것인 복합체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 제 1 하이드로젤은 콜라겐, 키토산, 피브린, 이들의 공중합체, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 생체적합성 고분자의 하이드로젤인 것인 복합체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 제 2 하이드로젤은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리카프로락톤(PCL), 젤라틴, 알긴산, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 무수말레인산/비닐에테르, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 생체적합성 고분자의 하이드로젤인 것인 복합체.
제1항에 있어서, 강도가 0.1 내지 0.5 MPa인 복합체.
제1항에 있어서, 나노섬유 상에 부착배양된 조직 재생용 세포를 포함하는 것인 복합체.
청구항 9에 있어서, 상기 조직 재생용 세포는 심근세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골 세포, 뼈세포, 피부세포, 슈반세포 및 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 복합체.
청구항 9에 있어서, 상기 제 1 하이드로젤층은 세포, 생체물질, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 것인 복합체.
청구항 11에 있어서, 상기 제 1 하이드로젤층은 사람제대혈정맥내피세포 (HUVEC)를 함유하는 것인 복합체.
청구항 1에 있어서,
나노섬유 상에 부착배양된 심근세포 및 줄기세포를 함유하고,
상기 제 1 하이드로젤층은 HUVEC를 함유하는 것인 복합체.
청구항 1-3, 5, 및 7-13 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드.
청구항 14에 있어서, 심혈관 조직 재생용인 것인 스캐폴드.
청구항 14에 있어서, 상처 치료용인 것인 스캐폴드.
틀에 나노섬유를 넣고 제 1 하이드로젤 전구체 용액을 가한 다음 가교반응시켜 상기 나노섬유를 캡슐화하는 제 1 하이드로젤층을 형성시키는 단계; 및
상기 제 1 하이드로젤층에 제 2 하이드로젤 전구체 용액을 가한 다음 가교반응시켜 상기 제 1 하이드로젤층을 캡슐화하는 제 2 하이드로젤층을 형성시키는 단계를 포함하는, 청구항 청구항 1-3, 5, 및 7-13 중 어느 한 항에 따른 복합체의 제조방법.
청구항 17에 있어서, 상기 제 1 하이드로젤 전구체는 피브리노겐이고, 상기 가교반응은 트롬빈을 가교제로 하여 가교반응 시키는 것인 제조방법.
청구항 17에 있어서, 상기 제 2 하이드로젤 전구체는 알긴산염 수용액이고, 상기 가교반응은 칼슘클로라이드를 가교제로 하여 가교반응 시키는 것인 제조방법.
청구항 17 있어서, 상기 나노섬유는 나노섬유 상에 세포분산액을 시딩한 다음 배양한 다음 사용하는 것인 제조방법.
청구항 20에 있어서, 상기 세포분산액은 심근세포 및 줄기세포의 혼합 분산액이고, 제 1 하이드로젤 전구체 용액은 HUVEC를 함유하는 것인 제조방법.