KR101992539B1 - miRNA Based composition and method of diagnosis of cognitive disorder - Google Patents

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Abstract

본원은 인지장애진단에 사용되는 miRNA 바이오마커를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 인지장애 진단 방법에 관한 것으로, 본원에 따른 마커는 증상이 없는 초기 진단이 가능하고, 혈액을 이용할 수 있어, 인지장애 진단의 편리성을 증대시킬 수 있다.The present application relates to a composition comprising a miRNA biomarker used for diagnosing cognitive impairment and a method for diagnosing cognitive impairment using the same. Convenience can be increased.

Description

miRNA 기반의 인지장애 질환 진단용 조성물 및 방법{miRNA Based composition and method of diagnosis of cognitive disorder}miRNA Based composition and method of diagnosis of cognitive disorders

본 발명은 인지장애 질환의 진단과 관련된 기술분야이다.The present invention is in the technical field related to the diagnosis of cognitive disorders.

알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD)은, 치매 중 가장 일반적인 형태로서, 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 80세 이상 노인의 20% 이상이 알츠하이머병의 영향을 받고 있을 것으로 추정되며, 고령화 사회가 될수록 그 수가 급격히 증가하고 있다. 알츠하이머병(AD) 환자의 뇌조직에서 일어나는 변화는, 환경 및 다양한 병인학적인 요인들에 의한 것으로서, 아직까지 뚜렷한 진단방법과 치료방법이 없다. 현재, 가장 일반적인 AD 진단 방법으로는, MRI(Magnetic resonance Imaging), PET(positron emission tomography) 등의 이미지 방법이나, 미니-인지 상태 검사(Mini mental state examination: MMSE), 문진 등의 간접적인 방법이 사용되고 있으나, MMSE를 통한 진단은 나이, 학력 등에 의해 그 결과가 달라지므로, 진단의 정확성이 문제가 되고 있다.Alzheimer's disease (AD), the most common form of dementia, is a representative neurodegenerative disease. It is estimated that more than 20% of elderly people over 80 years of age are affected by Alzheimer's disease, and the number is rapidly increasing in an aging society. Changes in the brain tissue of Alzheimer's disease (AD) patients are due to environmental and various etiological factors, and there is no clear diagnosis and treatment. Currently, the most common AD diagnostic methods include imaging methods such as magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography (PET), and indirect methods such as mini mental state examination (MMSE) and questionnaire. Although it is used, the diagnosis through the MMSE is a result of the age, education, etc., the accuracy of the diagnosis is a problem.

알츠하이머성 치매의 원인물질이며 질병의 진행에 따라 뇌에 축적되는 아밀로이드 베타에 대해 특이적으로 결합하는 물질로 최근 개발된 Pittsburgh compound B (PIB)는 알츠하이머성 치매의 진단에 유용한 물질이다. PIB를 투여한 후 PET 영상을 찍음으로서 뇌의 아밀로이드 베타의 축적 정도를 측정하고 이를 알츠하이머성 치매의 진단에 효율적으로 이용할 수 있기 때문이다. 하지만 이 진단 방법은 고가의 비용과 장비의 제한성 때문에 보편적인 알츠하이머성 치매의 진단 방법으로 사용하기에 한계가 있다. 따라서 알츠하이머성 진단을 위한 PIB PET 측정 필요성의 prescreening을 할 수 있는 방법이 절실히 요구된다. Pittsburgh compound B (PIB), which is a causative agent of Alzheimer's dementia and which specifically binds to amyloid beta that accumulates in the brain as the disease progresses, is useful for the diagnosis of Alzheimer's dementia. After taking PIB, PET images can be taken to measure the degree of accumulation of amyloid beta in the brain and can be effectively used for the diagnosis of Alzheimer's dementia. However, due to the high cost and the limited equipment, this diagnostic method is limited to the general diagnosis of Alzheimer's dementia. Therefore, there is an urgent need for a method for prescreening the necessity of measuring PIB PET for Alzheimer's diagnosis.

현재 전세계적으로 알츠하이머성 치매의 정확한 진단을 위한 혈중 단백질 바이오마커에 대한 연구가 활발히 진행되어지고 있으나 현재까지 결과물은 극히 제한적이며 이에 대해서도 다양한 반박의 의견 및 결과가 나오고 있다. 이는 혈중 다양한 단백질들이 혼재함으로서 단백질 바이오마커와 타단백질간의 결합 상태나 자가 단백질간의 응집 상태 등에 따라 정량적 수치의 차이를 보이기 때문이다. 따라서 단백질 형태 이외의 다른 형태의 바이오마커의 가능성 및 필요성이 절실해졌다. Currently, studies on blood protein biomarkers for the accurate diagnosis of Alzheimer's dementia have been actively conducted, but the results are extremely limited, and various rebuttal opinions and results have been issued. This is because the various proteins in the blood are mixed, showing a difference in quantitative value depending on the binding state between protein biomarkers and other proteins or the aggregation state between autologous proteins. Therefore, the possibility and necessity of biomarkers of other forms than protein forms is urgent.

MicroRNA (miRNA)는 최근 암을 비롯한 다양한 질병에서 활발한 연구가 이루어지고 있는 새로운 진단 및 치료의 타겟물질이다. MicroRNA는 그 타겟하는 mRNA에 결합하여 mRNA의 전사 정도를 조절함으로서 타겟 단백질의 발현양을 변화시킨다. 알츠하이머병에서도 다양한 miRNA들의 변화가 뇌조직내에서 일어나며 간접적 또는 직접적으로 알츠하이머병의 진행 과정에 영향을 미치게 된다. MicroRNA (miRNA) is a new diagnostic and therapeutic target that is being actively studied in various diseases including cancer. MicroRNA changes the amount of expression of a target protein by binding to the target mRNA and controlling the degree of transcription of the mRNA. In Alzheimer's disease, changes in various miRNAs occur in the brain tissue, which indirectly or directly affect the progression of Alzheimer's disease.

대한민국 공개특허 제10-2014-0044375호는 ‘알츠하이머병을 나타내는 마이크로RNA 바이오마커들’에 관한 것으로, 진단마커로 사용될 수 있는 miR-191 등이 개시되어 있다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2014-0044375 relates to 'microRNA biomarkers representing Alzheimer's disease,' miR-191, etc. that can be used as a diagnostic marker is disclosed.

대한민국 등록특허 제10-1734645호는 ‘초기 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단방법’에 관한 것으로, 후각조직의 miR-206을 이용한 진단 방법이 개시되어 있다.Republic of Korea Patent No. 10-1734645 relates to a 'diagnosis method for early Alzheimer's disease or mild cognitive impairment,' a diagnostic method using miR-206 of the olfactory tissue is disclosed.

그런데, 알츠하이머는 조기 진단이 어렵고, 병증이 계속 진행되면 사회적 비용이 많이 요구되는 정상 생활이 어려운 심각한 질환임을 고려하면, 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료를 위한 새로운 마커의 발굴을 포함하는 새로운 기술 개발의 필요성이 있다.However, considering that Alzheimer's is a serious disease that is difficult to diagnose early and that normal life is difficult if the condition continues, social detection requires the early detection, progression suppression, and the discovery of new markers for early treatment of high-risk groups. There is a need for new technology development.

본원은 인지장애 질환 진단용 바이오마커를 제공하고자 한다.The present application is to provide a biomarker for diagnosing cognitive disorders.

한 양태에서 본원은 혈액 샘플을 사용하여 인지장애를 특히 진행 단계별로 구분할 수 있는 다음과 같은 마이크로알엔에이 마커를 제공한다: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-500a-5p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-631, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-942, 및 hsa-miR-98. In one embodiment, the present application provides the following microRNA markers that can be used to distinguish cognitive impairment, particularly with stages of progression, using blood samples: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa- let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa- miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p, hsa- miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR- 500a-5p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-631, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-942, and hsa-miR-98.

상기 각 마커의 서열을 각각 서열번호 1 내지 42로 본 명세서에 첨부되어 있다. The sequence of each of these markers is attached herein to SEQ ID NOs: 1 to 42, respectively.

본원에 따른 마커는 인지장애를 진행단계에 따라 전임상 알츠하이머병 환자 (NDAN), 경도인지장애 (MCI), 및 알츠하이머병 (AD)으로 구분할 수 있다. Markers according to the present application can be divided into preclinical Alzheimer's disease patients (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), and Alzheimer's disease (AD) according to the progression stage.

일 구현예에서, 상기 NDAN을 구분할 수 있는 마커는 hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874. hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, 및 hsa-miR-93-5p로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기 MCI를 구분할 수 있는 마커는 hsa-miR-151a-3p, 및 hsa-miR-192-5p. hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, 및 hsa-miR-93-5p로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 AD를 구분할 수 있는 마커는 hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p,hsa-miR-106a-5p+hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761 및 hsa-miR-93-5p으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. In one embodiment, the marker that can distinguish the NDAN is hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa -miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874. hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa- miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, and hsa-miR-93-5p, and markers that can distinguish the MCI are hsa-miR-151a-3p, and hsa-miR- 192-5p. hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa- miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR- 761, hsa-miR-874, and hsa-miR-93-5p, wherein the markers capable of distinguishing AD are hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p , hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR -106a-5p + hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192 -5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR -576-5p, hsa-miR-761 and hsa-miR-93-5p.

본원은 또한 상기 마커를 검출하기 위한 물질을 포함하는, 조성물을 제공한다. The application also provides a composition comprising a substance for detecting the marker.

본원은 또한 상기 마커 또는 상기 조성물을 이용해서, 인지장애 질환의 진단을 위해, 이러한 질환의 진단이 필요한 대상체로부터 분리된 혈액시료에서 상기 하나 이상의 마커를 검출하는 방법 또는 키트를 제공한다. The present application also provides a method or kit for detecting the one or more markers in a blood sample separated from a subject in need of diagnosis of a cognitive disorder disease using the marker or the composition.

본원의 방법은 또한 바이오마커의 검출에 추가하여, 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), 또는 MMSE(mini-mental status examination) 또는 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET) 중 하나 이상의 비마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. In addition to the detection of biomarkers, the methods herein can also be used to examine the age, sex, weight, diet, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), or MMSE of the subject. Non-marker clinical information of one or more of mini-mental status examination or positron emission tomography (PET) may be additionally used.

본원에 따른 마커, 조성물 또는 방법은 뇌의 베타 아밀로이드 축적과 관련된 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 또는 헌팅톤병 치매의 진단에 또한 사용될 수 있다.Markers, compositions or methods according to the invention can also be used in the diagnosis of Parkinson's disease dementia, Lewy body dementia, or Huntington's disease dementia associated with beta amyloid accumulation in the brain.

본원은 인지장애진단에 사용되는 miRNA 바이오마커를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 인지장애 진단 방법에 관한 것으로, 본원의 방법은 기존의 단백질 단계에서 벗어나 한 단계 앞선 miRNA 단계에 포커스를 맞추어 혈중 농도의 변화를 관찰하였으며 바이오마커로의 활용가능한 miRNA를 마커로 사용함으로써 인지장애 증상이 나타나지 않는 질병의 초기에 질환의 진단이 가능하고, 또한 혈액을 이용할 수 있어, 편리성이 증대된다. 특히 본원에 따른 마커는 알츠하이머의 진단, 특히 알츠하이머를 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머병(AD)과 같이 진행 단계별로 진단이 가능하다. 또한 본원의 마커는 기존의 PIB-PET 결과, 즉 뇌의 아밀로이드 베타의 침착과 상관성이 있는 혈액의 바이오마커로서 기존 방법과 조합하여 활용가능하므로 인지장애 질환 진단의 민감도 및 효율성을 최대한 증대시킬 수 있을 것이며 초기 진단을 위한 다중 바이오마커로의 역할을 할 수 있다.The present invention relates to a composition comprising a miRNA biomarker used for diagnosing cognitive impairment, and a method for diagnosing cognitive impairment using the same. Observation and use of a miRNA available as a biomarker as a marker makes it possible to diagnose the disease in the early stages of the disease without cognitive impairment symptoms and to use the blood, thereby increasing convenience. In particular, the marker according to the present application can diagnose Alzheimer's disease, in particular, Alzheimer's disease in stages such as preclinical Alzheimer's disease patients (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease (AD). In addition, the marker of the present application can be used in combination with existing methods as a biomarker of blood correlated with the existing PIB-PET results, that is, the amyloid beta deposition of the brain, which can maximize the sensitivity and efficiency of diagnosing cognitive disorders. And may serve as multiple biomarkers for initial diagnosis.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 마커 검출 대상자의 PIB-PET 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일실시예에 따른 마커 검출 대상자의 그룹별 환자 분류로서, A는 인원수, B는 평균 나이 및 C는 교육정도를 나타낸 것이다.
도 3은 Fragment analyzer(Advanced Analytical Technologies, Inc)를 이용한 혈액에서 분리한 RNA 샘플들의 quality control 실시 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 miRNA의 발현량을 나타낸 것으로, 첫 번째 결과는 정상 시료 샘플 중 한 명과 NDAN 샘플 한 명의 모든 miRNA의 발현양을 스팟으로 나타낸 것으로, 예를 들어 보여준 샘플, 직선에서 벗어난 것들이 증가 또는 감소를 나타내는 miRNA이다. 두 번째 결과는 정상 시료 샘플 중 한 명과 MCI 샘플 한 명의 모든 miRNA의 발현양을 스팟으로 나타낸 것이다. 세 번째 결과는 정상 시료 샘플 중 한 명과 AD 샘플 한 명의 모든 miRNA의 발현양을 스팟으로 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 본원의 일 실시예에 따른 마커를 이용한 인지장애 진단에 있어서, 정상 대조군(CN control normal)에 대한 NDAN(non demented Alzheimers neuropathy), MCI(mild cognitive impairment), AD(Alzheimer’s disease)에서 변화를 나타내는 miRNA 마커 목록 및 결과를 나타낸 것이다. 도 5a는 두 그룹에서 1.3배 이상 변화를 보이는 miRNA 마커 목록이고, 도 5b는 세 그룹 모두에서 1.3배 이상 변화를 보이는 miRNA 마커 목록이다 (CN: 인지기능정상, 뇌 아밀로이드 베타 축적 음성, NDAN: 인지기능정상, 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성, MCI: 경도인지장애, 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성, A: 알츠하이머성 치매, 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성).
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 마커를 이용한 인지장애 진단에 있어서, 도 6a는 두 그룹이상에서 1.3배 이상 변화를 보이는 miRNA 마커를 표시한 그래프이고, 도 6b는 세 그룹이상에서 1.3배 이상 변화를 보이는 miRNA 마커를 표시한 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 마커 중 miRNA-126-3p를 이용한 검증실험 결과를 나타낸 것이다. 도 7a는 개별검증 실험에서도 NDAN과 MCI에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다. CN(NDAN + MCI)대비 miR-126-3p가 감소했다 (*p<0.05, ANOVA test). 도 7b는 miRNA126-3p의 정상군 대비 NDAN과 MCI에서의 감소가 뇌의 아밀로이드 베타 축적 정도를 나타내는 SUVR 값과 유의한 상관 관계를 나타내고 있다 (p=0.02, r=-0.1357). 초기 알츠하이머 단계에서의 뇌축적 아밀로이드 베타와 miR-126-3p가 음의 상관관계를 나타냈다 (*p<0.05, Pearson’s correlation). 도 7c는 CN VS. NDAN; miRNA126-3p를 이용한 NDAN의 진단 ROC 분석을 실시해보았을 때 민감도 91%, 정확도 75%이다. 도 7d는 CN VS. (NDAN과 MCI를 합친 것, 즉 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 환자군); miRNA126-3p를 이용한 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 진단 ROC 분석을 실시해보았을 때 민감도 84%, 정확도 75%이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 마커 중 miRNA-378e를 이용한 검증실험 결과를 나타낸 것이다. 도 8a는 개별검증 실험에서도 NDAN에서는 감소경향을, MCI에서는 거의 변화가 없음을 확인하였다. 도 8b는 miRNA378e가 정상군 대비 MCI에서 큰 변화가 없기 때문에 뇌의 아밀로이드 베타 축적 정도를 나타내는 SUVR 값과 유의한 상관 관계를 나타내고 있지 않다 (p=0.15, r=0.4342). 도 8c는 miRNA378e의 NDAN진단 AUC 분석을 해보면 민감도 33, 정확도 100% 수준을 나타낸다. 도 8d는 miRNA378e의 NDAN+MCI진단 (즉 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 진단) AUC 분석을 해보면 민감도 85, 정확도 50% 수준을 나타낸다. 도 8e는 miRNA126-3p와 378e 두 가지 모두를 이용해 함께 NDAN의 진단 ROC 분석을 실시해보았을 때 민감도 100%, 정확도 75%를 나타낸다. 126-3p와 378e 등 조합으로 사용할 경우는 각각 사용했을때보다 진단의 효과가 좋아지며 (378e 단독사용시보다 민감도 15% 증가, 정확도 25% 증가), 이는 한 예로서 39개의 마커를 다양한 조합으로 사용했을 때 뇌 아밀로이드 베타 축적을 예측할 수 있는 진단 민감도 및 정확도는 더욱 유의적으로 향상된다. 1 shows a PIB-PET image of a marker detection subject according to an embodiment of the present application.
Figure 2 is a patient classification for each group of marker detection subjects according to an embodiment of the present application, A is the number of people, B is the average age and C is the degree of education.
Figure 3 shows the results of the quality control of the RNA samples isolated from the blood using a fragment analyzer (Advanced Analytical Technologies, Inc).
Figure 4 shows the expression level of miRNA, the first result shows the expression level of all miRNA of one of the normal sample and one NDAN sample as a spot, for example, the sample shown, the deviation from the straight line increase or decrease MiRNA. The second result is a spot showing the expression level of all miRNAs in one normal sample and one MCI sample. The third result is a spot showing the expression level of all miRNAs in one normal sample and one AD sample.
5A and 5B illustrate non-demented Alzheimers neuropathy (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), and Alzheimer's disease (ADN) for a CN control normal in diagnosing cognitive impairment using a marker according to an embodiment of the present application. ) Shows a list of miRNA markers indicating the change and the results. FIG. 5A is a list of miRNA markers showing more than 1.3-fold change in both groups, and FIG. 5B is a list of miRNA markers showing 1.3-fold change in all three groups (CN: cognitive function, brain amyloid beta accumulation negative, NDAN: cognition). Normal function, positive brain amyloid beta accumulation, MCI: mild cognitive impairment, positive brain amyloid beta accumulation, A: Alzheimer's dementia, positive brain amyloid beta accumulation).
6 is a graph showing a miRNA marker showing a change of more than 1.3 times in two groups or more in diagnosing cognitive impairment using a marker according to an embodiment of the present application, and FIG. 6B is more than 1.3 times in three or more groups. A graph showing miRNA markers showing changes.
Figure 7 shows the verification test results using miRNA-126-3p of the marker according to an embodiment of the present application. Figure 7a also showed a significant decrease in NDAN and MCI even in individual verification experiments. MiR-126-3p decreased compared to CN (NDAN + MCI) (* p <0.05, ANOVA test). FIG. 7B shows that the decrease in NDAN and MCI of miRNA126-3p was significantly correlated with the SUVR value indicating the degree of amyloid beta accumulation in the brain (p = 0.02, r = -0.1357). Brain accumulation amyloid beta and miR-126-3p at the early Alzheimer's stage showed a negative correlation (* p <0.05, Pearson's correlation). 7C shows CN VS. NDAN; The diagnostic ROC analysis of NDAN using miRNA126-3p showed 91% sensitivity and 75% accuracy. 7D shows CN VS. (A combination of NDAN and MCI, ie, a group of patients with brain amyloid beta accumulation); Diagnostic ROC analysis using miRNA126-3p for brain amyloid beta accumulation showed 84% sensitivity and 75% accuracy.
Figure 8 shows the verification test results using miRNA-378e of the marker according to an embodiment of the present application. FIG. 8a shows that there was little change in NDAN and little change in MCI even in individual verification experiments. 8B does not show a significant correlation with SUVR values indicating the degree of amyloid beta accumulation in the brain since miRNA378e has no significant change in MCI compared to the normal group (p = 0.15, r = 0.4342). Figure 8c shows the sensitivity of 33, 100% accuracy when performing the NDAN diagnostic AUC analysis of miRNA378e. FIG. 8D shows a sensitivity of 85% and an accuracy level of 50% when the NDAN + MCI diagnosis of miRNA378e (ie diagnosis of brain amyloid beta accumulation) was performed. FIG. 8E shows 100% sensitivity and 75% accuracy when performing a diagnostic ROC analysis of NDAN using both miRNA126-3p and 378e. In combination with 126-3p and 378e, the effectiveness of the diagnosis is better than with each case (15% higher sensitivity and 25% higher accuracy than 378e alone). Diagnostic sensitivity and accuracy, which can predict brain amyloid beta accumulation, are significantly improved.

본원은 기존의 일츠하이머 진단 방법인 신경심리검사 및 PIB-PET 영상에 기초하여 정상인(NC), 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN, 인지기능정상/뇌 아밀로이드 베타의 축적 양성), 경도인지장애(MCI, 경도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성) 및 알츠하이머병(AD, 중증도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성)의 4 종류로 분류된 환자군의 혈액으로부터 분리한 miRNA(마이크로알엔에이)를 분석한 결과를 근거로 인지장애 질환 진단을 가능하게 하는 miRNA 바이오마커 발견에 근거한 것이다. The present application is based on the neuropsychological test and PIB-PET imaging, which is a conventional diagnosis method of ILZheimer's disease (NC), patients with preclinical Alzheimer's disease (NDAN, positive accumulation of cognitive function / brain amyloid beta), mild cognitive impairment (MCI, MiRNAs (microalgae) isolated from blood of patients grouped into four categories: mild cognitive decline / positive accumulation of brain amyloid beta) and Alzheimer's disease (AD, positive cognitive impairment / positive accumulation of brain amyloid beta) Based on the results of the analysis, it is based on the discovery of miRNA biomarkers that enable the diagnosis of cognitive disorders.

MicroRNA는 그 타겟하는 mRNA에 결합하여 mRNA의 전사 정도를 조절함으로서 타겟 단백질의 발현양을 변화시킨다. 알츠하이머병에서도 다양한 miRNA들의 변화가 뇌조직내에서 일어나며 간접적 또는 직접적으로 알츠하이머병의 진행 과정에 영향을 미치게 되고, 따라서 혈중 miRNA 단계에서 질병의 발병 및 진행과정 중 변화가 나타날 수 있어 이를 질병의 진단에 이용할 수 있다. 정상 대조군을 포함하는 알츠하이머병 환자군의 혈액을 분석하여 정상 대조군과 비교하여 혈액 내 농도 차이를 보이는 miRNA를 선별하여, 마커로 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-500a-5p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-631, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-942, 및 hsa-miR-98을 도출하였다.MicroRNA changes the amount of expression of a target protein by binding to the target mRNA and controlling the degree of transcription of the mRNA. In Alzheimer's disease, various miRNA changes occur in the brain tissue and indirectly or directly affect the progression of Alzheimer's disease. Therefore, the development and progression of the disease may occur in the miRNA stage of the blood. It is available. Analyzing the blood of the Alzheimer's disease patients group including the normal control group to select miRNA showing a difference in blood concentration compared to the normal control group, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let as markers -7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa -miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR -224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa -miR-761, hsa-miR-874, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR -20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-500a -5p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-548aa, hsa-miR-631, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-942, and hsa-miR-98 were derived.

따라서 한 양태에서 본원은 상기 하나 이상의 miRNA 마커를 포함하는, 인지장애 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.Thus, in one aspect, the present application relates to a composition for diagnosing cognitive disorder disease, comprising the one or more miRNA markers.

본원 명세서에서, “인지장애”는 신경 퇴행성 질환을 일컫는 것으로 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매 또는 헌팅톤병 치매는 물론, 이로 진행되기 전단계인 전임상 알츠하이머병(NDAN) 및 경도인지장애(MCI)를 또한 포함하는 것이다. 이러한 질환의 진행단계에 따른 중증도는 MMSE(Mini mental state examination) 스코어 등과 같은 방법으로 판단될 수 있으며, PIB-PET 영상은 아밀로이드베타 축적의 판별에 사용될 수 있다. As used herein, "cognitive impairment" refers to neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's dementia, Lewy body dementia or Huntington's disease dementia, as well as preclinical Alzheimer's disease (NDAN) and mild cognitive impairment (MCI) also. The severity according to the progression of the disease may be determined by a method such as a mini mental state examination (MMSE) score, and the PIB-PET image may be used to determine amyloid beta accumulation.

“알츠하이머병”은 퇴행성 뇌질환으로 기억력을 포함한 인지기능의 약화가 점진적으로 진행되는 병이다. 알츠하이머병 환자의 뇌에는 신경반(혹은 노인반) 또는 신경섬유다발이 생성되는데, 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 신경섬유다발은 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상때문인 것으로 알려져 있다. 상기 전임상 알츠하이머병은 임상적 소견은 보이지 않지만 뇌의 아밀로이드 침착이 보여지는 단계를 말한다. 전임상 알츠하이머병은 PET을 촬영을 해야 진단이 가능하다, 하지만 아무 증상이 없는데 PET 검사를 하는 경우는 거의 없기 때문에, 따라서, 본원에 개시된 마커를 이용한 조기 진단이 중요하다. "Alzheimer's disease" is a degenerative brain disease that progressively weakens cognitive function, including memory. Neurons (or senile plaques) or nerve fiber bundles are produced in the brains of Alzheimer's disease patients, which are characterized by the deposition of beta amyloid protein and the neurofibrous bundle by hyperphosphorylation of tau protein, inflammatory reactions, It is known to be due to oxidative damage. The preclinical Alzheimer's disease refers to a stage in which amyloid deposition of the brain is seen, although there are no clinical signs. Preclinical Alzheimer's disease can be diagnosed only by taking PET, but since there are few symptoms of PET testing without any symptoms, early diagnosis using the markers disclosed herein is therefore important.

특히 본원의 마커는 이러한 질환의 진행단계에 따른 분류에 사용될 수도 있다. 특히 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN, 인지기능정상/뇌 아밀로이드 베타의 축적 양성), 경도인지장애(MCI, 경도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성) 및 알츠하이머병(AD, 중증도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성)을 구분할 수 있다. In particular, the markers herein may be used for classification according to the stage of progression of such a disease. In particular, patients with preclinical Alzheimer's disease (NDAN, positive accumulation of cognitive function / brain amyloid beta), mild cognitive impairment (MCI, mild cognitive decline / positive accumulation of brain amyloid beta), and Alzheimer's disease (AD, severe cognitive impairment / brain Positive accumulation of amyloid beta).

본원에 사용된 용어 “miR”, “miRNA” 또는 “마이크로 RNA” 또는 “마이크로알엔에이”는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2016년 10월 현재 miRNA 데이터베이스(21판, miRBase)에 의하면 223개 종에서 유래한 35,828개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.As used herein, the terms “miR”, “miRNA” or “microRNA” or “microalA” are used to regulate gene expression after transcription by promoting degradation of target RNA or inhibiting their translation. To 23 non-coding RNAs. As used herein, the mature sequence of miRNA can be obtained from the miRNA database (http://www.mirbase.org). As of October 2016, the miRNA database (21 edition, miRBase) registered 35,828 mature miRNAs from 223 species. Generally, microRNAs are transcribed into precursors of about 70-80 nt (nucleotide) in length with a hairpin structure called pre-miRNA, and are then cut and matured by Dicer, an RNAse III enzyme. MicroRNAs form ribonucleocomplexes called miRNPs that cleave target genes through complementary binding to target sites or inhibit translation. More than 30% of human miRNAs are present in clusters, transcribed into one precursor, and cleaved to form the final mature miRNA.

본원에서 상기 miRNA는 인간 유래로 각각 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 성숙 서열을 가지며, 이의 전구 서열 역시 포함하는 것이며, 또는 이들 서열의 cRNA 또는 cDNA를 포함한다. The miRNA herein herein has a mature sequence as shown in Table 1, each of which is derived from human, also includes its precursor sequence, or includes cRNA or cDNA of these sequences.

[표 1] miRNA 성숙 서열 및 DB 정보TABLE 1 miRNA mature sequence and DB information

Figure 112017104230462-pat00001
Figure 112017104230462-pat00001

Figure 112017104230462-pat00002
Figure 112017104230462-pat00002

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 특히 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN, 인지기능정상/뇌 아밀로이드 베타의 축적 양성), 경도인지장애(MCI, 경도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성) 및 알츠하이머병(AD, 중증도 인지기능저하/ 뇌아밀로이드 베타의 축적 양성)을 검출하는 것을 포함한다. As used herein, the term “diagnosis” refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, that is, a test subject, determining whether an object currently has a particular disease or condition, Determining the prognosis of a subject or diseased or diseased subject, or therametrics (eg, monitoring the subject's condition to provide information about treatment efficacy). In particular, patients with preclinical Alzheimer's disease (NDAN, positive accumulation of cognitive function / brain amyloid beta), mild cognitive impairment (MCI, mild cognitive decline / positive accumulation of brain amyloid beta), and Alzheimer's disease (AD, severe cognitive impairment / brain Positive detection of amyloid beta).

본원에 따른 마커는 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머병(AD)의 질병의 단계에 따라 변화를 나타내는 miRNA의 종류가 다르고 증감도 다르기 때문이다. 예를 들면 has-miR 378e는 NDAN과 AD에서 두 배 이상의 감소(정상군에 비해 각각 2.74배, -2.06배의 감소)를 보이지만 MCI에서는 전혀 변화가 없다. 반면 has-miR-151a-3p는 AD에서는 변화가 없으나 MCI에서 1.88배(정상군에 비해) 증가한다. This is because the marker according to the present invention differs in the type of miRNA and the sensitization varies according to the stage of the disease of preclinical Alzheimer's disease (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease (AD). For example, has-miR 378e is more than doubled in NDAN and AD (2.74 and -2.06 times less than normal, respectively) but no change in MCI. Has-miR-151a-3p, on the other hand, increased 1.88-fold (compared to normal) in MCI.

본원에 따른 진단용 마커 또는 진단 마커는 인지장애를 정상과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 인지장애를 가진 대상체 유래의 혈액에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 핵산, 특히 miRNA, 또는 cRNA 또는 cDNA를 포함한다.The diagnostic marker or diagnostic marker according to the present invention is a substance capable of diagnosing cognitive impairment from normal, and nucleic acid, especially miRNA, or cRNA, which shows an increase or decrease in blood from a subject with a cognitive impairment as compared to a normal control group. cDNA.

구체적으로 본원에서 NDAN에서 발현이 증가하는 마커는 다음과 같다: hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p+hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, 및 hsa-miR-874. Specifically, markers that increase expression in NDAN herein are as follows: hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p + hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR- 1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, and hsa-miR-874.

본원에서 NDAN에서 발현이 감소하는 마커는 다음과 같다: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, 및 hsa-miR-93-5p. Markers with reduced expression in NDAN herein are as follows: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR- 148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a- 5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, and hsa-miR-93-5p.

본원에서 MCI에서 발현이 증가하는 마커는 다음과 같다: hsa-miR-151a-3p, 및 hsa-miR-192-5p. Markers with increased expression in MCI herein are as follows: hsa-miR-151a-3p, and hsa-miR-192-5p.

본원에서 MCI에서 발현이 감소하는 마커는 다음과 같다: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p+hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, 및 hsa-miR-93-5p. Markers with reduced expression in MCI herein are as follows: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p + hsa-miR- 17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa- miR-21-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR- 4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-874, and hsa-miR-93-5p.

본원에서 AD에서 발현이 증가하는 마커는 다음과 같다: hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, 및 hsa-miR-874.Markers with increased expression in AD herein are as follows: hsa-miR-1266, hsa-miR-1302, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, And hsa-miR-874.

본원에서 AD에서 발현이 감소하는 마커는 다음과 같다: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p,hsa-miR-106a-5p+hsa-miR-17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, 및 hsa-miR-93-5p.Markers with reduced expression in AD herein are as follows: hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p + hsa-miR- 17-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21- 5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR- 761, and hsa-miR-93-5p.

본원에서 대조군 대비 NDAN, MCI, AD 모두에서 발현 증가하는 마커는 다음과 같다: hsa-miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p+hsa-miR-501-5p, hsa-miR942, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p+hsa-miR-501-5p, hsa-miR942, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p+hsa-miR-501-5p,및 hsa-miR942. Herein, markers that increase expression in all of NDAN, MCI, and AD compared to the control group are as follows: hsa-miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p + hsa-miR-501-5p, hsa-miR942, hsa- miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p + hsa-miR-501-5p, hsa-miR942, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-500a-5p + hsa-miR-501-5p, And hsa-miR942.

본원에서 NDAN, MCI, AD 모두에서 발현이 감소하는 마커는 다음과 같다: hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, hsa-miR-98,hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, hsa-miR-98, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, 및 hsa-miR-98. Markers with reduced expression in all of NDAN, MCI, AD are as follows: hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, hsa-miR-98, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, hsa-miR-98, hsa-miR-1183, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-190a, hsa-miR-200c-3p. hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, sa-miR-548aa, hsa-miR631, hsa-miR7-5p, and hsa-miR-98.

인지장애 진단용 마커로서 상기 마커 중 어느 하나를 이용할 수도 있으나, 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다. 상기 마커들은 두 개 이상의 조합으로 사용되어 정상 대조군으로부터 인지장애 환자의 진단 및/또는 예후, 인지장애의 진행 상태를 구분할 수 있는 변별력을 향상시키는 방법으로 활용될 수 있다. 본원에 따른 마커 중 이러한 용도에 최적의 효과를 나타내는 조합을 선별하여 사용할 수 있으며, 당업자라면 용도에 맞는 적절한 조합을 선택할 수 있을 것이다.Although any one of the above markers may be used as a marker for diagnosing cognitive impairment, preferably, it is a complex marker including two or more of these markers. The markers may be used in a combination of two or more to improve diagnosis and / or prognosis of the cognitive impairment patient from the normal control group, and to distinguish the progress of the cognitive impairment. Among the markers according to the present application, a combination showing an optimal effect for this use can be selected and used by those skilled in the art.

본원에서 용어 “생물학적 시료 또는 검체”는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 조직, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 마커는 혈액 시료를 이용해서 검출된다. As used herein, the term “biological sample or sample” includes, but is not limited to, any solid or liquid sample obtained from a human or mammal, such as tissue, urine, saliva, whole blood, plasma or serum samples from a particular organ. According to one embodiment of the present disclosure, the marker of the present disclosure is detected using a blood sample.

본원의 마커는 본 질환의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 본 질환의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.The markers herein can be indicative of the onset and progression of the disease and can be used for the onset of the disease, the progression of the disease, the diagnosis or prognosis of the disease.

본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 마커는 인지 장애 진단용 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 인지장애의 진단에 필요한 정보 제공 방법에 사용될 수 있다. According to one embodiment of the present application, the marker of the present application may be used in a method for providing information necessary for diagnosing cognitive disorder using a composition or diagnostic kit for diagnosing cognitive disorder.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 마커가 사용되는 검체는 예를 들면 전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다. In one embodiment according to the present application, the sample in which the marker of the present application is used is for example one or more of whole blood, plasma or serum. In another embodiment, the sample used herein may be a sample from a test subject in need of diagnosis, as well as a sample from a normal control group or a control group having a specific disease, for comparative analysis.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 마커가 사용되는 검체는 예를 들면 혈전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.In one embodiment according to the present application, the sample in which the marker of the present application is used is for example one or more of thrombosis, plasma or serum. In another embodiment, the sample used herein may be a sample from a test subject in need of diagnosis, as well as a sample from a normal control group or a control group having a specific disease, for comparative analysis.

본원에서 용어 “검출용 시약”은 본원에 따른 마커 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이를 검출할 수 있는 시약 또는 물질을 포함한다.As used herein, the term “detection reagent” includes a reagent or a substance capable of detecting the presence of a marker miRNA or a cRNA or cDNA according to the present invention and / or its expression amount itself, a change in expression amount, or a difference in expression amount. do.

일 구현예에서 이러한 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함한다. 프로브는 주형으로서 단일가닥의 RNA 또는 DNA에 특이적으로 상보적으로 결합하며, 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3‘말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산분자를 일컫는 것으로, 이는 주형 또는 표적에의 특이적 결합에 의해, 표적의 정성 및/또는 정량적 측정을 가능하게 하며, 후술하는 바와 같이 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 또한 증폭된 산물의 검출을 위해 후술하는 바와 같이 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다.In one embodiment such material comprises a probe that specifically binds to a miRNA or cRNA or cDNA disclosed herein. The probe specifically binds to a single strand of RNA or DNA as a template, and has a free 3 'hydroxyl group that allows reverse transcriptase or DNA polymerase to initiate replication of the template. Nucleic acid molecules, which allow for qualitative and / or quantitative determination of a target by specific binding to a template or target, can be used in various methods as described below, and also for the detection of amplified products. It may be labeled as a color, luminescent or fluorescent material as described below.

당업자라면, 본원 및 miRBase에 개시된 본원의 miRNA 마커의 서열을 참조하여, 본원에 따른 프로브가 사용되는 구체적 방법에 따라 적절한 프로브 서열을 선택할 수 있을 것이다.Those skilled in the art will be able to select appropriate probe sequences according to the specific methods in which the probes according to the present disclosure are used, with reference to the sequences of the miRNA markers herein disclosed herein and in miRBase.

다른 구현예에서 본원에 따른 검출용 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 상보적으로 결합하며, 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3‘말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 프라이머이다. 프라이머는 일반적으로 핵산 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 대상의 부위의 양 말단 부근에 결합하도록 고안되며, 이는 주형(또는 표적)에 특이적으로 결합하여, 주형 또는 표적 물질의 정성 및/또는 정량적 분석을 가능하게 하며, 후술하는 바와 같이 다양한 방법에 사용될 수 있다. 또한 증폭된 산물의 검출을 위해 후술하는 바와 같이 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다.In another embodiment the detecting agent according to the present invention specifically complements the miRNA or its cRNA or cDNA disclosed herein and free 3 'terminus to allow reverse transcriptase or DNA polymerase to initiate replication of the template. It is a primer having a hydroxyl group (free 3 'hydroxyl group). Primers are generally designed to bind near both ends of a site of amplification target of a target nucleic acid in a nucleic acid amplification reaction, which specifically binds to a template (or target), thereby allowing qualitative and / or quantitative analysis of the template or target material. It is possible and can be used in various methods as described below. It may also be labeled with a chromophore, luminescent or fluorescent material as described below for detection of the amplified product.

당업자라면, 본원 및 miRBase에 개시된 본원의 miRNA 마커의 서열을 참조하여, 본원에 따른 프로브가 사용되는 구체적 방법에 따라 적절한 프라이머 서열을 선택할 수 있을 것이다.Those skilled in the art will be able to select appropriate primer sequences according to the specific methods in which the probes according to the present disclosure are used, with reference to the sequences of the miRNA markers herein disclosed herein and in miRBase.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 검출용 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 프라이머 쌍을 포함하며, 이 경우 상기 프로브는 상기 프라이머 쌍의 사이에 위치한다.In another embodiment the detecting agent according to the present invention comprises a probe and primer pair that specifically binds to a miRNA or cRNA or cDNA disclosed herein, wherein the probe is located between the primer pairs.

본원에 따른 miRNA 마커를 검출할 수 있는 프로브 및/또는 프라이머는 공지된 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 구체적으로 사용되는 방법에 맞추어 다양한 시약이 본원에 따른 조성물에 또한 포함될 수 있다.Probes and / or primers capable of detecting miRNA markers according to the present disclosure may be used in a variety of known methods, and various reagents may also be included in the compositions according to the present disclosure, depending on the method used specifically.

이러한 방법은 예를 들면 핵산 교잡, 중합, 증폭 방법 및 교잡기반 라이게이션 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.Such methods include, but are not limited to, for example, nucleic acid hybridization, polymerization, amplification methods, and hybridization-based ligation.

핵산 교잡은 핵산이 고상의 지지체, 예를 들면 비드, 나노입자 또는 바이오칩 어레이(마이크로에레이)에 결합된 형태로 또는 인시츄 교잡을 이용하여 수행될 수 있다. miRNA 마이크로어레이 기술은 동시에 다수의 miRNA의 분석을 가능하게 한다. 본원에 따른 miRNA에 상보적인 뉴클레오타이드는 코팅된 고상지지체에 스폿팅되거나 또는 인시츄 합성 방법으로 고상지지체에 스폿팅 될 수 있다. 실시예에서 생물학적 시료로부터 분리된 miRNA는 상기 고상지지체 상의 상보적인 서열, 예를 들면 프로브와의 교잡 후에 효소반응에 의해 검출되는 표지(예를 들면 바이오틴, 형광염료)의 혼입에 의해 검출될 수 있다. 다른 실시예에서, 생물학적 시료에서 분리된 miRNA는 형광물질로 표지되어, 상응하는 서열과 결합하고, 그 결과 방출된 형광신호는 특정 miRNA의 존재를 나타낸다. 마이크로어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA.93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 이런 경우, 검출용 물질 또는 시약은 고상의 지지체에 결합된 형태로 제공될 수 있다. 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있으며, 후술하는 바를 참조할 수 있다.Nucleic acid hybridization can be performed in the form of nucleic acid bound to a solid support, such as beads, nanoparticles or biochip arrays (microarrays) or using in situ hybridization. miRNA microarray technology enables analysis of multiple miRNAs simultaneously. The nucleotides complementary to the miRNAs according to the invention can be spotted on the coated solid support or spotted on the solid support by an in situ synthesis method. In an embodiment miRNA isolated from a biological sample can be detected by the incorporation of a complementary sequence on the solid support, for example a label (eg biotin, fluorescent dye) detected by enzymatic reaction after hybridization with a probe. . In another embodiment, miRNAs isolated from a biological sample are labeled with a fluorescent material to associate with the corresponding sequence, and the resulting fluorescent signal indicates the presence of a particular miRNA. Microarray manufacturing techniques are described, for example, in Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93 (20): 10614-9; Schena et al., 1995, Science 270 (5235): 467-70; And U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 or 5,631,734. In this case, the detecting substance or reagent may be provided in a form bound to the solid support. The detection reagent may be labeled directly or indirectly in the form of a sandwich for detection, and may be referred to below.

본원에 따른 miRNA의 검출에는 핵산 중합 또는 증폭 방법이 또한 사용될 수 있으며, 특히 미량으로 존재하는 miRNA 검출에 적합하다. 공지된 다양한 핵산 증폭 또는 합성 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 역전사 반응, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 RT-PCR, PCR, 실시간 PCR, 정량 RT-PCR, 정량 PCR, NASBA(Nucleic Acid Sequence-Base Amplification), LCR(Ligase Chain Reaction), 다중 연결 프로브 증폭(Multiple ligatable probe amplification), Invader 기술(Third Wave), SDA(Strand Displacement Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), 및 Eberwine RNA 증폭 등을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.Nucleic acid polymerization or amplification methods can also be used for the detection of miRNAs according to the invention, and are particularly suitable for the detection of miRNAs present in trace amounts. Various known nucleic acid amplification or synthesis methods can be used, for example reverse transcription, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real time RT-PCR, PCR, real time PCR, quantitative RT-PCR, quantitative PCR, NASBA ( Nucleic Acid Sequence-Base Amplification, LCR (Ligase Chain Reaction), Multiple Ligatable Probe Amplification, Invader Technology (Third Wave), Strand Displacement Amplification (SDA), Transcription Mediated Amplification (TMA), and Eberwine RNA Amplification, etc., but is not limited thereto.

전형적인 PCR 방법은 특정 표적 서열의 증폭을 위해, 주형의 변성, 포워드 및 리버스 프라이머가 표적 서열에 결합하는 어닐링 및 열안정 중합효소에 의한 신장의 단계로 구성되는 3 단계가 여러 주기 예를 들면 통상 20회 이상이 수행된다. 대안적으로 어닐링 및 신장은 동일한 단계에서 수행되기도 한다. 성숙한 miRNA는 단일가닥이기 때문에, PCR 전에 역전사 반응이 먼저 수행될 수 있다. 역전사 반응에는 프라이머와 역전사 효소의 사용을 필요로 한다.A typical PCR method consists of three cycles consisting of denaturation of the template, annealing by which the forward and reverse primers bind to the target sequence, and elongation by thermostable polymerase. More than one time is performed. Alternatively, the annealing and stretching may be performed in the same step. Because mature miRNAs are single stranded, reverse transcription reactions can be performed first before PCR. Reverse transcription requires the use of primers and reverse transcriptase.

PCR 및 정량 PCR에서는 포워드 및 리버스의 한 세트의 프라이머 또는 상기 프라이머와 함께 프로브가 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머의 길이는 교잡온도, 표적 서열의 구성, 표적 서열의 복잡성 등과 같은 다양한 요소에 따라 결정된다. 예를 들면 프로브는 7 뉴클레오타이드 이상, 프라이머의 길이는 약 10 내지 35 뉴클레오타이드, 예를 들면 15, 20, 25, 30 또는 35 뉴클레오타이드이다. 포워드 프라이머는 바이오마커 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하며, 5’쪽에 비상보적 서열을 추가로 포함할 수 있다. 리버스 프라이머의 서열은 바이오마커의 서열과는 독립적일 수 있으며, 다수의 miRNA 바이오마커가 한 종류의 리버스 프라이머로 증폭될 수 있거나, 또는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.In PCR and quantitative PCR, a set of forward and reverse primers or probes with the primers can be used. The length of the probes and primers depends on various factors such as hybridization temperature, composition of the target sequence, complexity of the target sequence, and the like. For example, the probe may be at least 7 nucleotides and the primer is about 10 to 35 nucleotides in length, for example 15, 20, 25, 30 or 35 nucleotides. The forward primer comprises at least one sequence capable of specifically binding to the biomarker miRNA, and may further comprise a non-complementary sequence on the 5 'side. The sequence of the reverse primer may be independent of the sequence of the biomarker, and multiple miRNA biomarkers may be amplified with one type of reverse primer, or may include one or more sequences specific to the biomarker.

증폭 산물은 증폭 과정에서 또는 증폭 후에 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP(single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE(HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.Amplification products can be analyzed by various methods known in the art during or after amplification. Such methods are known in the art and include, for example, gel electrophoresis, real-time PCR analysis, single strand conformational polymorphism (SSCP), restriction fragment length polymorphism (RFLP), capillary zone electrophoresis (CZE), and HPLC-based nucleic acid (WAVE). analyzing technology), including but not limited to microchips.

본원에 따른 일 구현예에서는 역전사 반응 후에 실시간 정량 PCR 방법, 즉 RT-PCR이 사용되며, 이는 검체의 RNA를 분리한 후, 이로부터 프라이머, 예를 들면 stem-loop를 형성할 수 있는 stem-loop 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 이를 주형으로 하여, 여기에, 포워드 및 리버스 프라이머, 또는 포워드 및 리버스 프라이머와 프로브의 조합을 사용하여 end-point로 또는 SYBR과 같은 핵산에 결합하는 염료를 사용하여 실시간으로, 또는 형광물질로 표지된 TaqMan 방식의 프로브를 사용한 stem-loop RT 기반의 핵산증폭방법이 사용된다. 이러한 방법은 예를 들면 Schmittgen, T.D. et al(2008) Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods 44, 31.8.; 및 Chen et al., Nucleic Acids Research, 33(20):e179, 2005 등을 참조할 수 있다. In one embodiment according to the present invention, a real-time quantitative PCR method, ie RT-PCR, is used after the reverse transcription reaction, which is a stem-loop capable of separating the RNA of a sample and forming a primer, for example, a stem-loop therefrom. After synthesizing cDNA using primers, using it as a template, forward and reverse primers or dyes that bind to nucleic acids such as SYBR or end-point using a combination of forward and reverse primers and probes are used. Stem-loop RT-based nucleic acid amplification using a TaqMan-type probe labeled in real time or with a fluorescent material is used. Such methods are described, for example, in Schmittgen, T.D. et al (2008) Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods 44, 31.8 .; And Chen et al., Nucleic Acids Research, 33 (20): e179, 2005 and the like.

또한 교잡에 기반한 라이게이션 기술이 miRNA의 정량 분석에 사용될 수 있다. Hybridization based ligation techniques can also be used for quantitative analysis of miRNAs.

이러한 방법은 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 OLA(oligonucleotide ligation) 및 예를 들면 미국공개공보 2006-0078894에 기재된 HARP-유사 프로브를 사용한 방법과 같은 표적 핵산 서열에 결합한 검출가능한 프로브를 결합하지 않은 프로브로부터 분리해 내는 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 라이게이션을 이용한 다른 기술은 MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)(Schouten et al., Nucleic Acids Research 30:e57 (2002))을 들 수 있다. 상기 기술은 한 쌍의 프로브가 표적서열에 나란히 결합한 경우에만 라이게이션이 일어나는 방식으로 결합하며, 라이게이션된 프로브는 PCR에 의해 증폭될 수 있도록 프라이머 결합부위를 포함한다.Such methods are known in the art and do not bind detectable probes that bind to the target nucleic acid sequence, such as, for example, using oligonucleotide ligation (OLA) and HARP-like probes described, for example, in US 2006-0078894. And the like, but are not limited thereto. Other techniques using ligation include Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) (Schouten et al., Nucleic Acids Research 30: e57 (2002)). The technique binds in such a way that ligation occurs only when a pair of probes bind side by side to the target sequence, and the ligation probe includes a primer binding site to be amplified by PCR.

상술한 바와 같은 교잡, 증폭 및/또는 교잡 기반 라이게이션 반응에서 표적의 염색 또는 표지, 프라이머 또는 프로브의 염색 또는 표지를 통해 교잡 또는 증폭된 miRNA 산물을 검출할 수 있다. 검출에는 당업계의 공지의 기술이 사용될 수 있으며, 당업자라면 검출의 민감도 및/또는 표적의 양을 고려하여 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 검출 방법의 민감도 및/또는 표적의 양에 따라 검출 전에 증폭이 필요하지 않을 수도 있다.In the hybridization, amplification and / or hybridization based ligation reactions described above, the hybridization or amplified miRNA products can be detected through staining or labeling of the target, staining or labeling of primers or probes. Techniques known in the art can be used for detection, and one skilled in the art will be able to select an appropriate method in view of the sensitivity of the detection and / or the amount of target. Depending on the sensitivity of the detection method and / or the amount of target, amplification may not be required prior to detection.

또한 miRNA는 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서 miRNA는 이에 결합된 검출가능한 표지로 표지되고 이어 비드와 같은 고상지지체에 연결된 프로브에 결합된 후 표지된 miRNA를 스크리닝하여 검출된다. 대안적으로 직접 검출에 표지된 프로브가 사용될 수 있으며, miRNA와 특이적 결합 후 표지된 프로브의 스크리닝을 통해 검출된다. 실시예에서는 증폭된 miRNA는 목적하는 핵산을 캡쳐할 수 있는 프로브와 컨쥬게이션된 비드를 이용하여 검출된다. 다른 실시예에서 프로브는 형광물질로 표지될 수 있다.MiRNAs can also be detected by direct or indirect methods. In a direct method miRNAs are detected by labeling with a detectable label bound thereto followed by binding to a probe linked to a solid support such as a bead followed by screening the labeled miRNA. Alternatively, labeled probes can be used for direct detection and detected through screening of labeled probes after specific binding with miRNA. In an example, the amplified miRNA is detected using beads conjugated with probes capable of capturing the desired nucleic acid. In other embodiments, the probe may be labeled with a fluorescent material.

간접적 검출방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면 바이오티닐화 프로브를 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 염료를 사용하여 결합된 핵산을 검출할 수 있다. 스트렙타비딘 분자는 증폭된 miRNA의 바이오틴 표지에 결합하며, 결합된 miRNA는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료에 의해 검출된다. 이러한 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 Phycolink(R) Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme)이 사용될 수 있다.Indirect detection methods can also be used. For example, biotinylated probes can be used to detect bound nucleic acids using streptavidin conjugated dyes. The streptavidin molecule binds to the biotin label of the amplified miRNA, and the bound miRNA is detected by dye conjugated to streptavidin. Dyes conjugated to such streptavidin are known in the art and for example Phycolink (R) Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme) can be used.

검출을 위한 표지자(label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다. 형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 플루오레신(예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민(예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진(예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료(예를 들면 미국특허 공개특허 10-2016-0022017 5,945,526) 및 사이아나인(예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPYR6G,BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다. 형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 실시예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein (“FAM”), TET, ROX, VICTM, 또는 JOE가 사용된다. 실시예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다.Labels for detection include, but are not limited to, compounds capable of generating or canceling detectable fluorescence, chemiluminescence or bioluminescence signals such as light emission, light scattering, light absorbing materials, for example Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997. Fluorescent materials are for example, but not limited to, fluorescein (e.g., U.S. Patent 6,020,481), rhodamine (e.g., U.S. Patent 6,191,278), benzophenoxazine (e.g., U.S. Patent 6,140,500), donor and acceptor Energy transfer fluorescent dyes (eg US Patent Application Publication No. 10-2016-0022017 5,945,526) and cyanine (eg WO1997-45539), lysamine, phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy3.5 , Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPYR6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6 -FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, and / or Texas Red As well as any fluorescent moiety capable of generating other detectable signals. Fluorescent dyes are 6-carboxyfluorescein; 2 ′, 4 ′, 1,4, -tetrachlorofluorescein; And 2 ′, 4 ′, 5 ′, 7 ′, 1,4-hexachlorofluorescein. In the examples, SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein (“FAM”), TET, ROX, VIC ™, or JOE is used as the fluorescent label. In the embodiment, a probe labeled with two fluorescent materials, a reporter fluorescent substance and an fluorescence fluorescent substance, is used. In this case, a fluorescent substance that emits a spectrum having a distinguishable wavelength is used.

또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. “DNA and RNA Structure” in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.Markers may also be used compounds that may enhance, stabilize or affect the binding of nucleic acids, such as intercalators, minor groove conjugates and crosslinkable functional groups, including cadmium bromide and SYBR-Green, , But not limited to Blackburn et al., Eds. See “DNA and RNA Structure” in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996).

miRNA 정량은 또한 다음의 문헌을 참조하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 miRNA microarrays (Calin, G.A. et al.(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101,11755.60.), SYBR-based miRNA RT-qPCR assays (Sharbati-Tehrani et al.(2008) miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complexsample. BMC Mol Biol 9, 34.), BeadArray (Chen, J. et al. (2008) Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology. Nucleic Acids Res 36, e87.), Invader Assays (Allawi, H.T. et al.(2004) Quantitationof microRNAs using a modified Invader assay. RNA 10, 1153.61.), 및 Padlock probe-based assays (Jonstrup, S.P. et al.(2006) A microRNA detection system based on padlockprobes and rolling circle amplification. RNA 12, 1747.52.)를 참조할 수 있다.MiRNA quantification can also be performed with reference to, for example, miRNA microarrays (Calin, GA et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101,11755.60.), SYBR-based miRNA RT-qPCR assays ( Sharbati-Tehrani et al. (2008) miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complexsample.BMC Mol Biol 9, 34.), BeadArray (Chen, J. et al. (2008) Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology.Nucleic Acids Res 36, e87.), Invader Assays (Allawi, HT et al. (2004) Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay.RNA 10, 1153.61 , And Padlock probe-based assays (Jonstrup, SP et al. (2006) A microRNA detection system based on padlockprobes and rolling circle amplification. RNA 12, 1747.52.).

또한 프라이머와 프로브를 사용한 RT-PCR 기반의 상용화된 키트를 사용할 수 있으며, 예를 들면 Stem-loop RT based TaqMan® MicroRNA Assays (ThermoFisher Scientific, USA)가 사용될 수 있다.RT-PCR-based commercialized kits using primers and probes can also be used, for example Stem-loop RT based TaqMan® MicroRNA Assays (ThermoFisher Scientific, USA).

따라서 본원에 따른 조성물은 상술한 방법 중 어느 하나 이상의 방법에 사용되는 시약을 포함할 수 있다.Thus, the compositions according to the present disclosure may comprise reagents used in any one or more of the methods described above.

본원에 따른 바이오마커 또는 이를 포함하는 조성물은 인지장애 진단에 유용하게 사용될 수 있다.Biomarkers or compositions comprising the same according to the present application can be usefully used for diagnosing cognitive impairment.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이오마커 검출용 시약 또는 물질을 포함하는 인지장애 질환 진단용 키트 또는 방법에 관한 것이다.Thus in another aspect the present invention also relates to a kit or method for diagnosing a cognitive disorder disease comprising a reagent or substance for detecting a biomarker according to the present application.

상기 키트에 포함될 수 있는 시약 및 이를 이용한 검출은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서, 키트는 핵산 증폭에 사용되며, 특히 RT-PCR을 이용한 증폭에 사용된다. 이 경우 키트는 RT-PCR의 반응에 필요한 프라이머 세트 및/또는 프로브, 완충액, 역전사 효소, Taq 폴리머라제를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서는 단일가닥 핵산을 제거할 수 있는 뉴클리아제를 추가로 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Tris-HCl, pH 9.0 완충액이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 역전사 효소 및 Taq 폴리머라제는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 폴리머라제로 hot start 반응이 가능한 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA)와 같은 것을 사용할 수 있으며, 적절한 농도 예를 들면 1.5mM 내지 2.5mM의 MgCl2가 포함될 수 있다.Reagents that can be included in the kit and detection using the same can be referred to above. In one embodiment according to the invention, the kit is used for nucleic acid amplification, in particular for amplification with RT-PCR. In this case the kit may comprise a set of primers and / or probes, buffers, reverse transcriptase, Taq polymerase required for the reaction of RT-PCR. In other embodiments, it may further comprise nucleases capable of removing single stranded nucleic acid. Various buffers known in the art may be used, for example Tris-HCl, pH 9.0 buffer, may be used, but is not limited thereto. Reverse transcriptase and Taq polymerase are commercially available and can be used, for example, AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA) capable of hot start reactions with polymerase, and suitable concentrations, for example 1.5 mM to 2.5 mM. MgCl 2 may be included.

다른 양태에서 본원은 인지장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 시료에서 본원에 따른 마이크로알엔에이 바이오 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본원의 상기 방법은 본원에 따른 마이크로알엔에이 바이오마커의 혈액 내 농도를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 검출 결과를 검사 대상자의 인지장애 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함한다. In another aspect the present invention relates to a method for detecting a microRNA biomarker according to the present disclosure in a sample of a subject to provide information necessary for diagnosing cognitive impairment. The method herein comprises the steps of detecting the concentration in the blood of the microalgae biomarker according to the present application; And associating a detection result of the detected marker with a diagnosis or prognosis of a cognitive disorder of a test subject.

본원의 방법에서 마커의 혈액 내 농도 검출은 본원의 miRNA 발현 수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 언급한 바와 같다. The detection of the concentration in the blood of the marker in the methods herein can be determined at the miRNA expression levels herein, as mentioned above.

본원 방법은 마커의 검출 결과를 인지장애의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 혈액 내 농도를 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 진단하는 것이다. 예를 들면 대조군의 값과 비교하여 본원에 따른 마커 중 하나 이상이 유의하게, 예를 들어 1.3배 이상 증가 또는 감소된 경우, 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 일반적으로 1.3배 이상 차이가 있으면 유의하게 차이가 난다고 볼 수 있다. 일 구현예에서는 1.3배 이상, 예를 들면 1.5배 또는 2배 이상일 수 있다. The method includes correlating a detection result of a marker with a diagnosis or prognosis of cognitive impairment, and according to one embodiment, the step of correlating the concentration in the blood of each determined marker with the detection result of each marker determined in the control group. Comparison, for example, comparing the increase and decrease, and then diagnose based on this. For example, when one or more of the markers according to the present application are significantly increased or decreased, for example, by at least 1.3-fold compared to the value of the control group, information may be provided to diagnose that the disease has occurred in the subject. In general, if there is more than 1.3 times the difference can be said to be significantly different. In one embodiment it may be at least 1.3 times, for example at least 1.5 times or at least 2 times.

본원에서 “정상 대조군”이란, 증상이 나타나기 전 환자, MCI 및 AD를 구분하기 위해 사용될 수 있는 대조군을 포함하며, 이는 정상군의 혈액 또는 발병 전의 본인 혈액으로 검사해 놓은 것 또는 검사시점을 시작으로 정기적 longitudinal 검사를 통해 결정된 것을 포함하는 것이다. As used herein, “normal control” includes a control that can be used to distinguish between patients, MCI and AD before symptoms develop, beginning with or at the time of testing with normal blood or with your own blood prior to onset. It includes what is determined by periodic longitudinal tests.

본원의 방법은 인지장애의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), 또는 MMSE(mini-mental status examination) 또는 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET) 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. The method of the present invention may further use non-protein clinical information of the patient, that is, non-marker clinical information, in addition to the marker analysis result, to provide information regarding the diagnosis or prognosis of the cognitive disorder. Such nonprotein clinical information may include, for example, the age, sex, weight, diet, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), or mini-mental status of a patient. examination or positron emission tomography (PET) Including but not limited to one or more of the following.

본원의 방법에 사용되는 인지장애 질환은 상기한 바와 같다.Cognitive disorder diseases used in the methods herein are as described above.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, examples are provided to help understand the present invention. However, the following examples are provided only to more easily understand the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example

실시예Example 1. 인지장애 진단  1. Diagnosis of Cognitive Impairment miRNAmiRNA 바이오마커Biomarkers 선별 Selection

도 1 및 2에 나타나 있는 바와 같이, 일반적으로 알츠하이머병 진단에 사용되는 신경심리검사(주요 평가 인지영역: 주의력(Attention), 언어기능(Language), 언어적 기억력(Verbal memory), 시공간 기억력(Visuospatial memory), 구성행동 기능(Constructional praxis), 집행기능(Executive function), 전반적 인지기능(Global cognition) 검사를 포함한 임상검사와 더불어 Pittsburgh compound B(PiB)를 이용하여 뇌 아밀로이드 축적을 기반으로 정확하게 진단 분류된 정상인(NC), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머병(AD), 전임상 알츠아히머병 환자(NDAN)의 네 그룹 코호트를 이용하였다(하기 표 2 참조). As shown in Figs. 1 and 2, neuropsychological tests generally used for diagnosing Alzheimer's disease (main assessment cognitive area: attention, language function, verbal memory, and spatiotemporal memory) Precise diagnostic classification based on brain amyloid accumulation using Pittsburgh compound B (PiB) in addition to clinical tests including memory, constructional praxis, executive function, and global cognition tests. Four group cohorts of normal subjects (NC), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease (AD), and preclinical Alzheimer's disease patients (NDAN) were used (see Table 2 below).

[표 2]TABLE 2

Figure 112017104230462-pat00003
Figure 112017104230462-pat00003

각 환자의 전혈 샘플에서 miRNA를 분리하기 위하여 Paxgene blood miRNA kit (PreAnalytiX)를 제조자의 방법에 따라 사용하였다. 상기 분리한 miRNA 분석은 Nanostrings의 nCounter expression array를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하여 각 그룹당 NC 32명, NDAN 10명, MCI 13명, AD 19명의 환자수를 분석하였다. 각 그룹당 성별과 평균 나이를 맞추었으며 정상인 기준으로 각 그룹에서 차이를 보이는 miRNA를 선별하여 알츠하이머병과 연관성이 있는 혈중 miRNA 바이오마커를 발굴하였다(도 6 및 표 1 참조). Paxgene blood miRNA kit (PreAnalytiX) was used according to the manufacturer's method to isolate miRNAs from whole blood samples of each patient. The isolated miRNA analysis was performed using the nCounter expression array of Nanostrings according to the manufacturer's manual to analyze the number of patients 32 NC, 10 NDAN, 13 MCI, 19 AD. The sex and mean age of each group were matched, and miRNAs that differed from each group on the basis of normal group were selected to identify blood miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease (see FIG. 6 and Table 1).

본원에 따른 마커는 알츠하이머의 진단, 특히 알츠하이머를 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머병(AD)과 같이 진행 단계별로 진단이 가능하다. 구체적으로, 앞서 기재한 바와 같이 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머병(AD)의 질병의 단계에 따라 변화를 나타내는 miRNA의 종류가 다르고 증감도 다르기 때문에, 그 환자군 별로 차별성이 있는 마커를 각 질환의 진단에 사용할 수 있다. 예를 들면 has-miR 378e는 NDAN과 AD에서 두 배 이상의 감소(정상군에 비해 각각 2.74배, -2.06배의 감소)를 보이지만 MCI에서는 전혀 변화가 없다. 반면 has-miR-151a-3p는 AD에서는 변화가 없으나 MCI에서 1.88배(정상군에 비해) 증가한다. 예를 들면 hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-192-5p중 하나가 1.3배 이상 증가하고 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-93-5p중 하나가 1.3배이상 감소하면 MCI라고 할 수 있을 것이다. The marker according to the present invention can diagnose Alzheimer's disease, in particular, Alzheimer's disease in stages such as preclinical Alzheimer's disease patients (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease (AD). Specifically, as described above, since the types of miRNAs that vary according to the stages of the disease of preclinical Alzheimer's disease (NDAN), mild cognitive impairment (MCI), and Alzheimer's disease (AD) are different and sensitized, according to the patient group Differentiated markers can be used to diagnose each disease. For example, has-miR 378e is more than doubled in NDAN and AD (2.74 and -2.06 times less than normal, respectively) but no change in MCI. Has-miR-151a-3p, on the other hand, increased 1.88-fold (compared to normal) in MCI. For example, one of the hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-192-5p increases more than 1.3 times, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-144-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, hsa- One of miR-302d-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378e, hsa-miR-4443, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-761, hsa-miR-93-5p If it decreases by more than 1.3 times, it can be called MCI.

또한 본원의 마커는 기존의 PIB-PET 결과, 즉 뇌의 아밀로이드 베타의 침착과 상관성이 있는 혈액의 바이오마커로서 기존 방법과 조합하여 활용가능하므로 인지장애 질환 진단의 민감도 및 효율성을 최대한 증대시킬 수 있을 것이며 초기 진단을 위한 다중 바이오마커로의 역할을 할 수 있다.In addition, the marker of the present application can be used in combination with existing methods as a biomarker of blood correlated with the existing PIB-PET results, that is, the amyloid beta deposition of the brain, which can maximize the sensitivity and efficiency of diagnosing cognitive disorders. And may serve as multiple biomarkers for initial diagnosis.

실시예 2. 선별된 miRNA의 유효성을 확인하기 위한 대표 miRNA의 개별검증Example 2 Individual Verification of Representative miRNAs for Validation of Selected miRNAs

정상군과 혈중농도를 본 nCounter expression array의 결과를 검증하기 위해 선별된 마이크로RNA 바이오마커 중 두개의 마이크로 RNA, 가장 큰 차이를 나타내는 mir126-3p과 mir378e을 대표로 선정해 개별 검증 실험을 하였다.In order to verify the results of the nCounter expression array based on the normal group and the blood concentration, two microRNAs, mir126-3p and mir378e, representing the largest difference, were selected as representatives of the selected microRNA biomarkers.

mir126-3p과 mir378-e의 개별검증시 Taqman probe를 이용한 realtime RT-PCR 을 사용하였고 실험에 사용된 참가군의 분류는 다음과 같다.Real-time RT-PCR using Taqman probe was used to verify mir126-3p and mir378-e. Participants were classified as follows.

a. 인지기능 정상/ 뇌아밀로이드 축적 없음 (CN/PIB-)a. Cognitive function Normal / No brain amyloid accumulation (CN / PIB-)

b. 인지기능 정상/ 뇌아밀로이드 축적 있음 (CN/PIB+)b. Cognitive function normal / Brain amyloid accumulation (CN / PIB +)

c. 경도 인지장애/ 뇌아밀로이드 축적 있음 (MCI/PIB+)c. Mild Cognitive Impairment / Brain Amyloid Accumulation (MCI / PIB +)

mirVana miRNA isolation kit를 제조자의 매뉴얼대로 사용하여 혈액의 버피코트(PBMC)에서 miRNA를 분리하였다(AM1560 or AM1561). Nanodrop을 이용하여 농도를 측정하였다. miRNA was isolated from blood buffy coat (PBMC) using the mirVana miRNA isolation kit according to the manufacturer's manual (AM1560 or AM1561). The concentration was measured using Nanodrop.

실시간 PCR, qRT-PCR을 수행하기 위하여 마스터 믹스를 제조하였다. 원래 1well당 master mix solution은 20X TM primer 1 uL, PCR master mix no UNG 10 uL, 및 DW 6 uL에 cDNA product 3 uL를 첨가하므로. 세 배수 기준으로 20X TM primer 3.3uL, PCR master mix no UNG 33uL, 및 DW19.8uL로 총 56.1uL의 마스터 믹스를 제조하였다. 마스터 믹스를 넣기 전에 cDNA product를 먼저 한 well당 tube 의 바닥에 3uL 씩 넣어주고, 각 well 에 17uL 만큼의 master mix 를 tube 벽에 넣고 태핑하여 PCR을 수행하였다. Master mixes were prepared to perform real time PCR, qRT-PCR. Originally, the master mix solution per well is added 3 uL of cDNA product to 1 uL of 20X TM primer, 10 uL of PCR master mix no UNG, and 6 uL of DW. A total of 56.1 uL of a master mix was prepared using 3.3 uL of 20X TM primer, 33 uL of PCR master mix no UNG, and DW19.8 uL on a three-fold basis. Before adding the master mix, cDNA product was first put in 3uL at the bottom of the tube per well, and 17uL of master mix was added to the tube wall in each well, and the PCR was performed.

상기 실험 결과 nCounter expression array의 결과와 동일하게 유의적 감소를 CN+나 MCI+에서(CN-에 비해) 보였다. 즉, 알츠하이머성 치매 초기 단계인 CN+나 MCI+단계에서부터 이 두 마이크로RNA, 즉mir126-3p과 mir378e이 유의한 변화를 나타내었다. 이들의 각각의 ROC분석결과는 도 11에 나타나 있다.The experimental results showed a significant decrease in CN + or MCI + (compared to CN-) as in the nCounter expression array. In other words, these two microRNAs, mir126-3p and mir378e, showed significant changes from the early stage of Alzheimer's dementia, CN + or MCI +. Each of these ROC analysis results is shown in FIG. 11.

상기한 바와 같이 nCounter expression array의 실험결과가 개별검증실험에서도 일관성있는 결과는 보여주고 있으며 따라서 nCounter expression array의 실험결과가 상당히 정확하고 믿을만함을 시사한다. 그러므로 nCounter expression array실험에서 선별된 알츠하이머성 치매나 경도인지장애에서 유효한 변화를 보였던 39개의 miRNA 바이오마커들이 유효한 바이오마커임들이 알 수 있다.As described above, the experimental results of the nCounter expression array show consistent results in individual verification experiments, thus suggesting that the experimental results of the nCounter expression array are quite accurate and reliable. Therefore, 39 miRNA biomarkers, which showed effective changes in Alzheimer's dementia or mild cognitive impairment, were identified as valid biomarkers.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.Although the exemplary embodiments of the present application have been described in detail above, the scope of the present application is not limited thereto, and various modifications and improvements of those skilled in the art using the basic concepts of the present invention defined in the following claims are also provided. It belongs to.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the meaning as commonly understood by those skilled in the art in the related field of the present invention. The contents of all publications described herein by reference are incorporated into the present invention.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> miRNA Based composition and method of diagnosis of cognitive disorder <130> DP201710002P <150> KR 10-2016-0137633 <151> 2016-10-21 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 7 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 acagguagug ucccucaggg cuguagaaca gggcugggau uacuaaagcc cuguucuaug 60 cccugaggga cacugagcau guca 84 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uugggacaua cuuaugcuaa a 21 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uacaguauag augauguacu 20 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 uaagugcuuc cauguuugag ugu 23 <210> 18 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ugaggggccu cagaccgagc uuuu 24 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uuauaauaca accugauaag ug 22 <210> 20 <211> 79 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 cugacuccag uguccaggcc aggggcagac aguggacaga gaacagugcc caagaccacu 60 ggacuuggag ucaggacau 79 <210> 21 <211> 53 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 gguggggguu ggaggcgugg guuuuagaac cuaucccuuu cuagcccuga gca 53 <210> 22 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 auucuaauuu cuccacgucu uu 22 <210> 23 <211> 59 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggaggagcag cagggugaaa cugacacagu ucuggugagu uucacuuugc ugcuccucc 59 <210> 24 <211> 78 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uuagcccugc ggccccacgc accaggguaa gagagacucu cgcuuccugc ccuggcccga 60 gggaccgacu ggcugggc 78 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 26 <211> 89 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 auuauucaaa ugcucggaga cacagaacau uagagaagac aggaguucac uguaggugau 60 ggugagagug ggcauggagc aggagugcc 89 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 28 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 ugcaggccuc ugugugauau guuugauaua uuagguuguu auuuaaucca acuauauauc 60 aaacauauuc cuacaguguc uugcc 85 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 30 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 31 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 caaagugcuc auagugcagg uag 23 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 aaggagcuca cagucuauug ag 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 auauaauaca accugcuaag ug 22 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 uaauccuugc uaccugggug aga 23 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 aauccuuugu cccuggguga ga 22 <210> 38 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 aaaaaccaca auuacuuuug cacca 25 <210> 39 <211> 75 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 guggggagcc ugguuagacc uggcccagac cucagcuaca caagcugaug gacugaguca 60 ggggccacac ucucc 75 <210> 40 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 41 <211> 86 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 auuaggagag uaucuucucu guuuuggcca uguguguacu cacagccccu cacacauggc 60 cgaaacagag aaguuacuuu ccuaau 86 <210> 42 <211> 119 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 aggauucugc ucaugccagg gugagguagu aaguuguauu guuguggggu agggauauua 60 ggccccaauu agaagauaac uauacaacuu acuacuuucc cuggugugug gcauauuca 119 <110> Seoul National University R & DB Foundation <120> miRNA Based composition and method of diagnosis of cognitive          disorder <130> DP201710002P <150> KR 10-2016-0137633 <151> 2016-10-21 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 7 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 acagguagug ucccucaggg cuguagaaca gggcugggau uacuaaagcc cuguucuaug 60 cccugaggga cacugagcau guca 84 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uugggacaua cuuaugcuaa a 21 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uacaguauag augauguacu 20 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 cugaccuaug aauugacagc c 21 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 uaagugcuuc cauguuugag ugu 23 <210> 18 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ugaggggccu cagaccgagc uuuu 24 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uuauaauaca accugauaag ug 22 <210> 20 <211> 79 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 cugacuccag uguccaggcc aggggcagac aguggacaga gaacagugcc caagaccacu 60 ggacuuggag ucaggacau 79 <210> 21 <211> 53 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 gguggggguu ggaggcgugg guuuuagaac cuaucccuuu cuagcccuga gca 53 <210> 22 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 auucuaauuu cuccacgucu uu 22 <210> 23 <211> 59 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggaggagcag cagggugaaa cugacacagu ucuggugagu uucacuuugc ugcuccucc 59 <210> 24 <211> 78 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uuagcccugc ggccccacgc accaggguaa gagagacucu cgcuuccugc ccuggcccga 60 gggaccgacu ggcugggc 78 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 26 <211> 89 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 auuauucaaa ugcucggaga cacagaacau uagagaagac aggaguucac uguaggugau 60 ggugagagug ggcauggagc aggagugcc 89 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 28 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 ugcaggccuc ugugugauau guuugauaua uuagguuguu auuuaaucca acuauauauc 60 aaacauauuc cuacaguguc uugcc 85 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 30 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 31 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 caaagugcuc auagugcagg uag 23 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 aaggagcuca cagucuauug ag 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 auauaauaca accugcuaag ug 22 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 uaauccuugc uaccugggug aga 23 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 aauccuuugu cccuggguga ga 22 <210> 38 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 aaaaaccaca auuacuuuug cacca 25 <210> 39 <211> 75 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 guggggagcc ugguuagacc uggcccagac cucagcuaca caagcugaug gacugaguca 60 ggggccacac ucucc 75 <210> 40 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 41 <211> 86 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 auuaggagag uaucuucucu guuuuggcca uguguguacu cacagccccu cacacauggc 60 cgaaacagag aaguuacuuu ccuaau 86 <210> 42 <211> 119 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 aggauucugc ucaugccagg gugagguagu aaguuguauu guuguggggu agggauauua 60 ggccccaauu agaagauaac uauacaacuu acuacuuucc cuggugugug gcauauuca 119

Claims (8)

hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-1302 및 hsa-miR-144-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로알엔에이(miRNA) 바이오마커 검출용 물질을 포함하는, 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN) 진단용 조성물.
hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-1302 and hsa-miR-144-3p A composition for diagnosing preclinical Alzheimer's disease (NDAN), comprising a substance for detecting a microRNA biomarker as described above.
제 1 항에 있어서,
상기 검출용 물질은 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머인, 조성물.
The method of claim 1,
The detecting substance is a probe or primer that specifically binds to the biomarker.
제 1 항에 있어서,
상기 miRNA 바이오마커는 hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, 및 hsa-miR-374a-5p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 조성물.The method of claim 1,
The miRNA biomarkers are hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p , hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR And at least one marker selected from the group consisting of -21-5p, hsa-miR-224-5p, and hsa-miR-374a-5p. 전임상 알츠하이머병 환자(NDAN) 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
상기 진단이 필요한 대상체 유래의 혈액 시료를 제공하는 단계;
상기 시료에서 hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-1302 및 hsa-miR-144-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로알엔에이(miRNA) 바이오마커의 혈액 내 농도 또는 발현량을 검출하는 단계; 및
상기 검출된 마커의 농도를 정상 대조군의 검사결과와 비교하여, 검사 대상자의 인지장애 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 대상체의 시료에서 상기 하나 이상의 마이크로알엔에이 바이오마커를 검출하는 방법.
To provide you with the information you need to diagnose preclinical Alzheimer's disease (NDAN) patients,
Providing a blood sample from a subject in need of diagnosis;
In the sample hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-1302 and hsa-miR-144-3p Detecting the concentration or expression level in the blood of the one or more microRNA biomarkers selected; And
And comparing the detected marker concentration with test results of a normal control group and associating it with a diagnosis or prognosis of a cognitive impairment of a test subject, wherein the at least one micro-AL biomarker is detected in a sample of the subject.
제 4 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계에서,
상기 hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, 및 hsa-miR-144-3p는 발현이 감소한 경우, 그리고
상기 hsa-miR-1302는 발현이 증가한 경우, 상기 대상체를 NDAN으로 판단하는 것인, 방법.
The method of claim 4, wherein
In the associating step,
The hsa-miR-378e, hsa-miR-20a-5p + hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-192-5p, and hsa-miR-144-3p have decreased expression, and
Wherein the hsa-miR-1302 determines the subject as NDAN when expression is increased.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 miRNA 바이오마커는 hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, 및 hsa-miR-374a-5p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 방법.
The method according to claim 4 or 5,
The miRNA biomarkers are hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p , hsa-miR-3184-5p, hsa-miR-874, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR And at least one marker selected from the group consisting of -21-5p, hsa-miR-224-5p, and hsa-miR-374a-5p.
제 6 항에 있어서,
상기 hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-3184-5p, 및 hsa-miR-874는 발현이 증가한 경우, 그리고
상기 hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, 및 hsa-miR-374a-5p는 발현이 감소한 경우, 상기 대상체를 NDAN으로 판단하는 것인, 방법.
The method of claim 6,
Hsa-let-7i-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-1266, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR -3184-5p, and hsa-miR-874 when the expression is increased, and
Hsa-let-7f-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-224-5p, and hsa-miR-374a-5p, when the expression is reduced, judging the subject as NDAN.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계는 상기 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), 또는 MMSE(mini-mental status examination) 또는 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET) 중 하나 이상의 비마커 임상정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.The method according to claim 4 or 5,
The associating step may include age, sex, weight, diet, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), or mini-mental status examination (MMSE) or And further using non-marker clinical information of one or more of positron emission tomography (PET).
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