KR101988578B1

KR101988578B1 - 미병 판별용 마커

Info

Publication number: KR101988578B1
Application number: KR1020170098906A
Authority: KR
Inventors: 김태형; 차성원; 김소연; 이영섭
Original assignee: 한국한의학연구원
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-06-14
Also published as: KR20190015670A

Abstract

본 발명은 미병 판별 또는 예측 마커로서의 miRNA에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 미병 판별 또는 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 미병 판별 또는 예측용 키트 및 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 미병 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

Description

미병 판별용 마커 {A marker for the determination of Mibyeong}

본 발명은 미병 판별 또는 예측 마커인 miRNA에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 미병 판별 또는 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 미병 판별 또는 예측용 키트 및 이의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 미병 판별 또는 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

신체에 피로, 통증, 수면장애, 소화불량 등 다양한 형태의 불편감을 가지고 있지만 의학적 진단결과 정상으로 판단되는 반건강 상태를 한의학에서 미병이라고 한다(JaeChul Lee et al., Eur . J. Intern. Med , 2013). 미병의 아형(subtype)들로 피로, 통증, 수면장애, 소화불량 등이 있다(JaeChul Lee et al., Integr . Med . Res, 2014). 한의학에서는 이러한 미병상태를 진단하기 위하여 설문에 대한 응답을 바탕으로 미병지수를 측정하는 장치 및 방법들을 개발하였다(한국등록특허 제10-1578270호).

피로는 신체적, 정신적, 사회적 요인들에 의해 나타나며 지속되는 기간에 따라 지속성 피로(1개월 이상 6개월 미만)와 만성피로(6개월 이상)로 분류된다(Epstein KR et al., Med . Clin . North Am. 1995). 만성피로증후군(chronic fatigue syndrome)은 질병으로 분류되며, 분명한 피로 증상이 적어도 6개월 이상 지속되고 휴식을 취해도 호전되지 않는 특징이 있으며, 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서 1994년 개정된 증례정의에 따라 진단되고 있다.

마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오티드를 가지는 짧은 단일가닥 리보핵산(RNA)으로, 세포내에서 발현되어 많은 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다(Bartel D.P., Cell, 116(2):281-297, 2004). 현재까지는 인간에서 약 2000여종이 발견되었는데, 하나의 miRNA가 여러 종류의 mRNA를 조절하는 것이 가능하기 때문에, 인간 유전자 중의 약 30%가 miRNA에 의해 조절될 것이라고 예측되고 있다(Bentwich, et al., Nat. Rev. Genet., 37(7):766-770, 2005).

miRNA는 세포내에서 자연적으로 만들어지며, 대부분 RNA 폴리머라제 II(RNA polymerase II) 에 의해 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 핵 내에서 RNase III 효소인 드로샤(drosha)와 파샤(pasha, DGCR8) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단된다. 이후, 전구체 miRNA는 엑스포틴-5(Exportin 5)에 의해 핵에서 세포질로 이동하고, 세포질내에서 RNase III 효소인 다이서(dicer)에 의하여 짧고 불완전한 이중가닥의 miRNA로 제조된다. 상기 제조된 miRNA는 리스크(RISC, RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 단일가닥으로 분리되며, 분리된 단일가닥의 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜(ribosome)에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제하거나 또는 표적 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다(Lee, et al., Nature, 425(6956):415-419, 2003).

혈청 내에서 miRNA는 매우 안정적으로 존재하며 심혈관질환 및 여러 종류의 암들에서 정상인들에 비해 발현량이 유의미하게 변화됨이 보고되었다. 따라서 이런 질환들의 진단에 매우 유용한 바이오마커로 제시 되고 있다(Xi Chen et al., Cell Research, 2008). 그러나, 아직까지는 미병 판별 또는 예측용 마커로서 miRNA의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 미병을 판별 또는 예측할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 지속성 피로가 있는 성인 남녀 개체군에서 정상 개체에 비해 발현량이 변화되는 miRNA을 확인함으로써, 이를 통해 미병을 판별 또는 예측할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 미병 판별 또는 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 미병 판별 또는 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 미병 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 미병 판별 또는 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA"란, 대부분 염색체 상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며, 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha) 등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태 (precursor-miRNA, precursor form)로 전환되는 것을 의미한다. 이 후 엑스포틴 5 (exportin 5)에 의해서 핵을 빠져 나와 다이서(Dicer)에 의해 약 18 에서 22 bp 정도 길이의 성숙된 형태의 miRNA로 바뀌게 된다. 이러한 성숙된 miRNA는 RISC(RNA induced silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다(Nat Rev Mol Cell Biol 6, 376-785; 2005). 본 발명에서는 miRNA는 microRNA 또는 마이크로RNA 등으로 혼재되어 사용될 수 있다.

본 발명의 목적상 miRNA는 미병의 판별 또는 예측에 사용될 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 구제적으로 hsa-let-7f-5p 또는 hsa-miR-3605-5p일 수 있으며 isoform 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 miRNA의 서열은 공지의 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다.

상기 용어 "miRNA isoform"은 isomiR은 기준 miRNA 서열에 대해 변이를 갖는 서열을 지칭한다(Morin, R. D et al., Genome Research. (2008). 18 (4): 610-621.) 구체적으로 miRNA의 코어 서열은 동일하나 코어 서열의 앞 뒤에 염기서열 일부가 추가 또는 삭제된 것을 의미한다. miRBase로부터 miRNA 시퀀스를 얻을 수 있으며, isomiR 발현 프로파일은 인종, 인구, 성별 의존성을 나타낼 수 있음이 알려져 있다.

본 발명의 목적상 miRNA isoform은 miRNA와 동일하게 미병의 판별 또는 예측에 사용될 수 있는 것이면 제한되지 않는다. 본 발명에서는 miRNA isoform은 microRNA isoform 또는 isomiR 등으로 혼재되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 각 miRNA는 상기 각 서열번호로 기재한 miRNA 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 miRNA과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 miRNA을 나타내는 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 miRNA 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 miRNA 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "미병"이란 뚜렷하게 병이 없음에도 불편한 증상을 호소하는 상태를 의미한다. 미병의 아형(subtype)들로 피로, 통증, 수면장애, 소화불량 등이 있다.

본 발명에서 미병 상태인 개체는 미병 설문(도 2a 및 도 2b)에서 14점 이상인 개체 중, 경추부의 외상 혹은 기질적인 질환, 약물 복용, 임신, 수유 등의 원인에 의하여 미병 상태를 나타내거나, 수면 장애, 우울증, 기타 병력, 약물 복용, 임신, 수유 등의 원인에 의하여 미병 상태를 나타내는 것으로 추정되는 개체를 제외하고 분류하였다. Integr med res 3, 60-66; 2014 에 따르면 미병의 정의와 미병 지수를 조사하여 점수에 따라 '미병' 상태의 개체로 분류하고 있다. 본 발명의 목적상 미병은 구체적으로 피로를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "피로"란 정신이나 몸이 지쳐 힘들거나 또는 그런 상태를 의미한다. 신체적, 정신적, 사회적 요인들에 의해 나타나며 지속되는 기간에 따라 지속성 피로(1개월 이상 6개월 미만) 와 만성 피로(6개월 이상)로 분류된다(Epstein KR et al. 1995). 만성피로증후군 (chronic fatigue syndrome)은 질병으로 분류되며, 분명한 피로 증상이 적어도 6개월 이상 지속되고 휴식을 취해도 호전되지 않는 특징이 있다. 본 발명의 목적상 상기와 같은 만성피로증후군이 아닌 지속성 피로증상을 보이는 사람을 대상으로 연구를 진행하였다.

구체적으로 본 발명에서 피로 증상을 갖는 개체는 만 35세 이상 45세 미만으로서, 일정한 직업을 가지고, 1개월 이상 6개월 미만의 지속적 또는 반복적 피로를 호소하며, Chalder Fatigue Scale(CFS) 설문(도 3)에서 15점 이상이며 미병 설문(도 2a 및 도 2b)에서 14점 이상인 개체 중 수면 장애, 우울증, 기타 병력, 약물 복용, 임신, 수유 등의 원인에 의하여 피로 증상을 나타내는 것으로 추정되는 개체는 제외하고 분류하였다.

상기 용어 “CFS(Chalder Fatigue Scale)설문”이란 임상 및 비 임상, 역학에서 피로의 정도와 심각도를 측정하기 위한 자체 관리 설문지이다. 원래 임상 집단에서 만성 피로 증상의 정도를 측정하기 위해 개발되었지만 '피곤함'의 심각도를 측정하는데 더 널리 사용된다. 피로는 학업 및 응용 산업 의학 모두에서 중요하며 직원 건강, 성과, 안전 및 일반적인 작업성 사이의 연관성에 대한 이해는 계속 커지고 있다. 간단한 설문지로서 간단한 응답 시스템을 사용하여 신체적 및 정신적 피로를 측정 할 수 있는 간단한 도구를 제공한다. 대한한방과학회지 제28권 4호, 791-796; 2007에 따르면 피로 지수를 조사하여 점수에 따라 '피로' 증상이 있는 개체로 분류하고 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "판별 또는 예측"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 판별 또는 예측은 미병의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에서 상기 miRNA는 서열번호 1 내지 2로 기재된 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 miRNA는 미병의 진행 또는 발병 여부를 판별 또는 예측할 수 있는 판별 또는 예측 마커로 활용될 수 있으며, 상기 서열은 미병의 진행 또는 발병 여부를 판별 또는 예측하는데 있어서 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98%의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 미병의 판별 또는 예측 마커로서 정상 개체와 발병 개체 간에 발현량 차이를 유의있게 비교하는 한, 본 발명의 상기 염기서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 miRNA, 이의 isoform 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 예를 들어, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 미병중 하나인 피로를 판별 또는 예측한 결과, 정상인과 비교하여 남성에서는 서열번호 1의 miRNA의 발현량이 상향 조절되는 결과를, 여성에서는 서열번호 2의 miRNA의 발현량이 하향 조절되는 결과를 확인하였다(표 3).

이러한 결과를 통하여, 상기 miRNA들은 미병이 진행됨에 따라 발현량이 정상군에 비하여 유의하게 차이가 나타남을 확인할 수 있었고, 본 발명의 조성물을 이용하면 미병을 효과적으로 판별 또는 예측할 수 있음을 알 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 미병 판별 또는 예측용 조성물을 포함하는 미병 판별 또는 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 판별 또는 예측 미병이 의심되는 개체의 시료로부터 상기 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써 미병을 판별 또는 예측하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 miRNA, 이의 isoform, 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.

구체적인 일례로서, miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 판별 또는 예측 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 판별 또는 예측판별 또는 예측용 조성물 또는 키트를 이용하여 미병 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1 또는 2의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miRNA의 발현 수준과 정상 대조군 시료의 해당 hsa-let-7f-5p 및 hsa-miR-3605-5p의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함한다.

또한, (b)단계에서 서열번호 1 로 이루어진 hsa-let-7f-5p의 발현 수준이 남성 정상군의 hsa-let-7f-5p 발현수준보다 상향 조절된 경우 미병이 진행된 것으로 판정하는 (c)단계를 추가로 포함한다.

상기 "상향 조절"은 정상 대조군과 대비하여 miRNA 발현량이 1배 내지 10배, 구체적으로 2배 내지 5배가 증가된 경우를 의미할 수 있다.

또한, (b)단계에서 서열번호 2 로 이루어진 hsa-miR-3605-5p의 발현 수준이 여성 정상군의 hsa-miR-3605-5p발현수준보다 하향 조절된 경우 미병이 진행된 것으로 판정하는 (c)단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 미병은 구체적으로 피로일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "하향조절"은 정상 대조군과 대비하여 miRNA 발현량이 1배 내지 5배, 구체적으로 2배 내지 3배로 감소된 경우를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 지속적으로 피로를 느끼는 지속성 피로군이나 미병이 의심되는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "대조군"이란, 피로를 느끼지 않는 정상 개체를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 표 1의 설문결과를 바탕으로 6개월 이내 피로 및 일반건강에 불편증상이 없는 개체일 수 있다.

본 발명의 용어 "시료"란, 지속성 피로를 느끼는 피로군으로부터 분리된 혈액을 의미하며, 구체적으로 상기 혈액으로부터 분리한 혈청 및 혈청에서 분리한 RNA일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 miRNA 및 이의 isoform은 미병을 판별 또는 예측할 수 있는 마커로 사용될 수 있으므로, 미병 판별 또는 예측 키트 개발 및 미병 억제 물질을 탐색하는데 있어서, 탁월한 효과가 있는 마커로 널리 활용될 수 있다.

도 1은 전체적인 실험의 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 미병 설문이다.
도 3는 피로군을 분류하기 위한 피로지수(CFS)를 나타내는 피로설문이다.
도 4는 RT-qPCR 검증 Box plot 도이다.
도 5는 피로 miRNA ROC 분석 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 연구대상자 선정

피로 증상을 이유로 한방병원을 내원한 사람들을 대상으로 Chalder Fatigue Scale(CFS) 설문 점수와 미병 설문 점수를 이용하여 남자 83명과 여자 114명을 피로군으로 선별하였다. 그 중에서 혈청 microRNA NGS(Next Generation Squencing) 을 위하여 피로군에서 각각 남녀 5명씩을 선정하였고, 대조군(정상인)으로 남녀 5명씩을 선정하였다. 각각의 자세한 선정기준과 제외기준은 다음과 같다.

실시예 1-1. 지속성 피로군 선정 기준

- 만 35세 이상 45세 미만

- 1개월 이상 6개월 미만의 지속적 또는 반복적 피로를 호소하는 자

- Chalder Fatigue Scale(CFS) 설문에서 15점 이상인 자

- 미병 설문(피로, 통증, 수면, 소화, 우울감, 불안감, 분노)에서 14점 이상인 자

- 일정한 직업을 가진 자

Chalder Fatigue Scale(CFS) 설문 및 미병설문은 도 2a 및 도 2b 및 도 2에서 나타내었다.

실시예 1-2. 지속성 피로군 제외 기준

- 일차적 원인의 수면 장애가 있는 자(수면무호흡증, 기면증 등)

- 최근 5년 이내 우울증을 진단 받은 자

- 과거력 또는 현병력 상 피로를 유발할 수 있는 기질적 원인이 있는 자

· 장기부전(심부전, 만성신부전, 폐기종, 간경변 등)

· 만성 감염성 질환(B 또는 C형 간염 등)

· 류마티즘/염증성 질환(SLE, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 만성 췌장염 등)

· 신경학적 질환(다발성 경화증: multiple sclerosis, 간질: epilepsy 등)

· 내분비/대사성질환(당뇨병, 갑상선질환, 체질량 지수 45이상인 심한 비만 등)

· 기타 질환(빈혈, 결핵, 만성폐질환, 고혈압 등)

· 악성종양

- 최근 2주 이내에 항고혈압제, 항우울제, 항불안제, 수면제, 항히스타민제등 약물 복용 자

- 미병 설문에서 피로 증상 호소가 없는 자

- 최근 1개월 이내에 피로에 대한 의학적, 한의학적 치료를 받은 자

- 임산부, 수유부 및 6개월 이내에 임신 계획이 있는 자

- 야간근무, 교대근무, 심한 중복업무 중인 자

- 임상 연구에 영향을 줄 수 있는 약물을 복용 하거나 기타 시험 준수 사항을 따를 수 없다고 판단되는 자

실시예 1-3. NGS 분석 및 RT- qPCR 검증 대상자 선정

- CFS 설문 점수(도 3)와 미병 설문 피로점수가 모두 상위 10 % 이내에 해당되는 남녀 각각 5명씩을 NGS 대상자로 선정

- 미병 설문(도 2a 및 도 2b)에서 피로점수는 피로관련 4가지 세부항목들(피로, 불편, 지속, 회복)의 점수들을 합산하여 순위를 매김

- NGS 대상자를 제외한 피로군 내에서 1차 RT-qPCR 검증을 위해 남녀 각각 20명씩을 선정하였고, 2차 RT-qPCR 검증을 위해 남녀 각각 30명씩을 추가 선정

피로군에서 CFS 설문 점수(도 3)가 상위 10등이고 미병 설문 내용(도 2a 및 도 2b)중 피로 점수(피로정도, 불편정도, 지속, 회복력 4가지 점수 합)가 상위 10등을 모두 만족하는 남자 5명과 여자 5명을 선정하였다.

실시예 1-4. 정상인 대조군 선정 기준

표 1의 설문 결과를 바탕으로 6개월 이내 피로 및 일반건강에 불편증상이 없는 만 35세 이상 45세 미만 정상인들을 대상으로 정상인 대조군을 선정하였다.

① 피곤함의 정도가 어떻습니까 없음(없음, 약간, 중간, 심하다 항목들 중)
② 신체적인 통증 때문에 정상적인 생활에 지장이 있는가? 전혀 없음 또는 약간 있음(전혀없음, 약간있음, 어느정도 있음, 많이 있음, 대단히 극심함 항목들 중)
③ 전반적인 수면의 질은 어느 정도인가? 아주 혹은 대체로 좋음(아주 좋음, 대체로 좋음, 대체로 나쁨, 아주 나쁨 항목들 중)
④ 소화가 잘 되는가? 예(예, 아니오 항목들 중)
⑤ 당신의 건강 상태는 어떠합니까? 최고로 혹은 아주 좋음(최고로 좋음, 아주 좋음, 좋음, 조금 나쁨, 나쁨 항목들 중)
⑥ 마음이 많이 상하고 우울했었는가? 드물게 그랬음 혹은 전혀 그렇지 않았음(항상 그랬음, 대부분 그랬음, 때때로 그랬음, 드물게 그랬음, 전혀 그렇지 않음)
⑦ 신체적인 건강 문제 혹은 정서적인 문제로 인하여, 사회활동(예: 친구나 친지 방문 하는 것)에 어려움이 있었다면 어느 정도 인가? 드물게 그랬음 혹은 전혀 그렇지 않았음(항상 그랬음, 대부분 그랬음, 때때로 그랬음, 드물게 그랬음, 전혀 그렇지 않았음 항목들 중)

구체적으로, 상기 설문을 통해 피로, 통증, 소화불량 및 사회활동에 어려움이 없으며, 수면의 질이 대체로 좋고, 우울함이 거의 없고, 건강상태가 좋은 사람들을 정상인 대조군으로 선정하였다.

실시예 2. 혈청 microRNA 분석

실시예 2-1: NGS 분석(발굴 단계, 후보 microRNA 선정) 및 염기서열 분석

실시예 1에서 선별한 피로군과 정상인 대조군 그룹 별 남녀 각각 5명씩 선정하여 총 20명의 혈액으로부터 각각 1.5 ml 혈청을 분리한 후에 Mirvana Paris kit(Ambion)을 이용하여 혈청에서 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Bioanalyzer (Agilent Technologies)를 이용하여 microRNA가 포함된 small RNA들을 확인하고 분리하였다. 샘플 마다 10 ng small RNA를 NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. Illumina Nextseq 500 (Illumina) 장비를 이용하여 제작된 cDNA 라이브러리 염기서열을 분석하고, 불필요한 정보(라이브러리 제작시 발생한 어뎁터 다이머)와 낮은 퀄리티(Read length 15 미만)를 보이는 서열정보는 FASTQ Toolkit app(Illumina)를 사용하여 제거하였다. BaseSpace® Small RNA v1.0을 이용하여 분석된 염기서열(read sequence) 의 정성적 분석(인간유전체와 microRNA 데이터베이스를 이용한 mapping)과 정량적 분석(normalized read count 분석)을 실시하였다.

실시예 2-2. NGS에 의한 microRNA 양적 차이 분석

정상인 대조군에 비하여 양적으로 유의미하게 변화된 microRNA의 종류, 증감비(fold change), 통계적 유의성(P-value)들을 DESeq2(Love MI et al. (2014) Genome Biol) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 구체적으로 정상인 대조군 10명과 피로군 10명(남녀 각각 5명씩)에 대하여 NGS 분석을 하여, 피로군에서 Read count가 유의미하게(P<0.05) 증가 또는 감소되는 8개 microRNA들을 선정하였다(표 2).

피로 연관 microRNA NGS분석 결과

	microRNA	여성(피로=5, 건강=5)			남성(피로=5, 건강=5)			전체(피로=10, 건강=10)
	microRNA	증감비		P value	증감비		P value	증감비		P value
1	hsa-miR-122-5p	감소	3.0배	8.8×10-3	증가	2.3배	0.17	감소	1.4배	0.24
2	hsa-let-7f-5p	증가	1.4배	0.45	증가	4.4배	1.0×10-3	증가	2.3배	1.0×10-2
3	hsa-miR-24-3p	증가	1.2배	0.63	감소	4.3배	5.6×10-5	감소	1.5배	0.17
4	hsa-miR-203a-3p	증가	4.9배	3.1×10-3	감소	2.4배	0.069	감소	1.5배	0.21
5	hsa-miR-409-3p	증가	1.3배	0.59	증가	3.0배	1.7×10-2	증가	2.0배	0.052
6	hsa-miR-3605-5p	감소	3.0배	0.077	감소	1.9배	0.22	감소	2.2배	4.3×10-2
7	hsa-miR-4433b-5p	증가	3.0배	4.3×10-2	증가	1.1배	0.81	증가	1.7배	0.12
8	hsa-miR-30c-5p	증가	3.5배	3.9×10-2	-	-	-	증가	1.3배	0.31

표 2에 나타낸 바와 같이, 두 개 miRNA (hsa-let-7f-5p, hsa-miR-3605-5p) 들이 피로군에서 발현량이 유의미(P-value < 0.05) 하게 증감되었다. miRBase 데이터베이스에 등록된 hsa-let-7f-5p의 발현량은 피로군(미병포함) 남성에서 정상인(대조군)에 비하여 4.4 배 증가(P-value = 1.0 X 10-3) 함을 확인하였다.

반면에, 다른 miRNA 인 hsa-miR-3605-5p의 발현량은 피로군(미병포함) 여성에서 정상인(대조군)에 비하여 3.0 배 감소(P-value = 0.077) 함을 확인하였다.

이러한 결과를 통하여 본 발명의 miRNA들이 미병 발병에 따라 정상 대조군과 비교하여 남성에는 상향 조절 또는 여성에서는 하향 조절되는 것을 검출함으로써, 미병을 판별 또는 예측할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2- 3: 2단계 RT- qPCR 분석(순차적 후보 microRNA 검증)

NGS 대상자를 제외한 피로군과 정상인 대조군에서 RT-qPCR 방식으로 2차례 검증 실험을 진행하고자 하였다. 구체적으로 1차 검증에서는 피로군 40명과 대조군 40명의 혈청 샘플들을 2차 검증에서는 피로군 60명과 대조군 40명의 혈청 샘플들을 사용하였고, 각각의 그룹에서 남녀 성비는 1:1로 동일하게 하였다.

실시예 2-4: RT- qPCR 에 의한 microRNA 양적 차이 분석

후보 microRNA들 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머를 이용하여 실시간 RT-qPCR 실험을 진행하였고, 서열특이성을 가진 프라이머들이 해당 microRNA만을 선택적으로 증폭시킴을 melting curve 분석을 통하여 확인하였다.

또한, 후보 microRNA들의 Ct(threshold cycle) 값을 컨트롤 microRNA(Cel-miR-39) Ct 값으로 보정 후, 피로군과 정상인 대조군사이의 양적차이의 유의성을 Wilcoxon rank sum test로 분석하였다. 분석 결과는 표 3에 나타내었다.

피로 연관 microRNA RT-qPCR 검증 결과

microRNA	여성			남성
microRNA	증감비		P value	증감비		P value
NGS (피로 10명 vs. 정상인 10명)
hsa-let-7f-5p	증가	1.4배	0.45	증가	4.4배	1.0×10-3
hsa-miR-24-3p	증가	1.2배	0.63	감소	4.3배	5.6×10-5
hsa-miR-3605-5p	감소	3.0배	0.077	감소	1.9배	0.22
hsa-miR-30c-5p	증가	1.8배	3.9×10-2	-	-	-
RT-qPCR 1차 검증 (피로 40명 vs. 정상인 40명)
hsa-let-7f-5p	증가	1.6배	0.072	증가	5.1배	6.2×10-4
hsa-miR-24-3p	감소	1.4배	0.14	감소	1.7배	4.7×10-3
hsa-miR-3605-5p	감소	3.2배	6.0×10-7	감소	1.5배	2.0×10-2
hsa-miR-30c-5p	증가	1.2배	0.17	증가	1.2배	0.56
RT-qPCR 2차 검증 (피로 60명 vs. 정상인 40명)
hsa-let-7f-5p	증가	1.2배	0.48	증가	2.0배	2.4×10-3
hsa-miR-24-3p	증가	1.2배	0.40	증가	2.3배	5.0×10-3
hsa-miR-3605-5p	감소	2.0배	8.2×10-4	증가	1.5배	0.050
hsa-miR-30c-5p	감소	1.1배	0.51	증가	5.3배	1.7×10-6

표 3에 나타난 바와 같이, 1차 검증 결과 8개 microRNA들 중 4개(hsa-let-7f-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-30c-5p) microRNA들이 남성 및 여성 피로군에서 대조군에 비해 유의하게 증감하는 것을 관찰하였고, NGS분석 결과와 증감 경향성이 상이한 4개 microRNA들은 검증에 실패한 것으로 판단하였다.

그러나, NGS와 1,2차 검증결과를 동시에 비교한 결과, 두 개 microRNA들이 피로와 연관성을 나타냄을 확인하였다. hsa-let-7f-5p는 NGS와 1,2차 검증 모두 피로 남성에서 유의하게 증가하였고, hsa-miR-3605-5p는 피로 여성에서 NGS와 1,2차 검증 모두 피로 여성에서 유의하게 감소됨을 확인하였다(표 3, 도 4)

실시예 2-5. ROC 분석결과 ( microRNA 지속성 피로 판별력 측정)

피로군 남성 50명과 대조군 정상인 남성 40명에서 let-7f-5p의 피로군 판별력을 측정하였고, 피로군 여성 50명과 대조군 정상인 여성 40명에서 miR-3605-5p의 피로군 판별력을 측정하였다.

SPSS 통계프로그램을 이용하여 나이, BMI, microRNA 발현량을 변수로 하는 로지스틱회귀분석 모델을 이용하여 각각의 샘플들에 대해 피로 예측 확률 값, 민감도(sensitivity), 1-특이도(specificity)를 계산하였다. 상기 계산된 결과 값들을 바탕으로 SPSS 프로그램을 이용하여 x축을 1-특이도로 y축을 민감도로 하는 ROC(Receiver Operating Curve)를 그리고, 판별 정확도를 의미하는 AUC(Area Under the Curve)값과 유의성을 보여주는 P 값을 계산하였다.

그 결과, 피로 남성의 경우 hsa-let-7f-5p 혈청 발현량을 이용하여 76% 정확도로 지속성 피로를 판별할 수 있었고, 피로 여성의 경우 hsa-miR-3605-5p 혈청 발현량을 이용하여 82% 정확도로 지속성 피로를 판별할 수 있음을 확인하였다(도 5). 이는 hsa-let-7f-5p와 hsa-miR-3605-5p가 지속성 피로를 판별할 수 있는 객관적 지표로서의 활용 가능성을 보여줌을 시사하는 것이다.

본 연구에서는 혈청 microRNA가 지속된 피로에 의해 성별 특이적으로 혈청 내 발현량이 변화됨을 검증하였다. 이는, 기존에 성별에 따라 대사증후군과 연관된 혈청 microRNA profile이 다르다는 연구결과(J Biomed Sci. 2013 Oct; 20(1):72)와도 상관성이 있음을 확인한 것이다.

따라서, 상기 결과들을 토대로 검증된 2개의 microRNA (hsa-let-7f-5p와 hsa-miR-3605-5p)는 피로 상태 판별용 마커로 활용될 수 있을 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> A marker for the determination of Mibyeong <130> KPA170830-KR <140> 10-2017-0098906 <141> 2017-08-04 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugaggaugga uagcaaggaa gcc 23

Claims

서열번호 1로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피로 판별 또는 예측용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 제제는 miRNA의 isoform의 발현수준을 추가로 측정하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1로 이루어진 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 인간 남성의 피로를 판별 또는 예측하기 위한 것인, 조성물.
삭제
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 피로 판별 또는 예측용 키트.
삭제
제7항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 유전자 칩 키트인 것인, 키트.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miRNA의 발현 수준과 정상 대조군 시료의 해당 miRNA의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 피로 판별 또는 예측을 위한 정보제공방법.
삭제
제10항에 있어서, 상기 (a)단계는 miRNA의 isoform의 발현수준을 추가로 측정하는 것인, 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 방법은 상기 (b)단계에서 서열번호 1로 이루어진 miRNA의 발현 수준이 남성 정상군의 miRNA 발현수준보다 상향 조절된 경우 피로가 진행된 것으로 판정하는 (c)단계를 추가로 포함하는 것인, 정보제공방법.
삭제