KR101985914B1 - 배양 용기 및 배양 용기의 제조 방법 - Google Patents

배양 용기 및 배양 용기의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

림프구를 종래보다 고효율로 활성화 할 수 있는 배양 용기 및 그 제조 방법의 제공을 가능하게 한다. 림프구를 활성화시키기 위한 연포재로 이루어지는 주머니 모양의 배양 용기이며, 대향하는 용기 내면의 한쪽 면에 항 CD3 항체가 10 ~ 300ng / cm2의 밀도로 고정화되어 있고, 또한 용액 상태의 항 CD3 항체가 상기 한쪽 면으로 이루어진 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입되어 있다. 또한 연포재로 이루어지는 주머니 모양의 배양 용기에서 대향하는 용기 내면의 한쪽면에 항 CD3 항체를 상기 밀도로 고정화하여 용액 상태의 항 CD3 항체를 상기의 양으로 봉입한다.

Description

배양 용기 및 배양 용기의 제조 방법{CULTURE CONTAINER AND METHOD FOR MANUFACTURING CULTURE CONTAINER}
본 발명은 세포 배양 기술에 관한 것이며, 특히 림프구를 활성화시키기 위한 배양 용기 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
최근 의약품의 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.
이러한 상황에서 가스 투과성 필름으로 성형된 배양 용기에 세포와 배양액을 봉입하여 폐쇄계에서 자동적으로 세포를 대량 배양하는 것이 이루어지고 있다.
　　
특히 림프구를 배양 하는 경우에는 세포 수를 늘리기 위한 배양에 앞서, 먼저 항 CD3 항체를 사용하여 림프구를 활성화시키기 위한 배양을 할 필요가 있다. 이를 위해 항 CD3 항체가 들어있는 배양 용기에 림프구와 배양액을 넣고, 그 활성화가 이루어진다.
그런데, 배양 용기에 용액 상태의 항 CD3 항체가 소량 밖에 들어 있지 않은 경우에는 림프구에 대한 자극이 불충분하게 되어 활성화를 충분히 할 수 없다. 한편, 배양 용기에 용액 상태의 항 CD3 항체가 다량으로 들어있는 경우에는 세포의 방어 메커니즘에 의해서 세포막에 존재하는 CD3 항원이 탈락하여 림프구의 활성화는 억제된다.
　　
항 CD3 항체를 주성분으로 하는 면역 억제제는 이러한 림프구의 성질에 착안하여 만들어진 것이며, 이를 장기 ·조직 이식 후에 거부 반응이 생긴 환자에게 투여하면 다량의 항 CD3 항체가 항원에 결합하여 집적하고, 그 집적물은 세포내에 채워져서 세포 밖으로 배출된다. 또는 집적물은 효소에 의해 절단되어 세포 표면에서 항원이 제거된다. 그 결과, 세포내에 자극이 전달되지 않게 되어 림프구의 활성화는 억제된다.
이와 같이, 용액 중에 유리하는 항체를 사용하여 림프구의 활성화를 적절하게 제어하는 것은 어렵고, 종래에는 일반적으로 배양 용기의 바닥 내면에 항 CD3 항체를 고정화 (固相化)하고 이와 같은 배양 용기를 사용하여 림프구를 적당히 자극함으로써 림프구를 활성화 하는 것이 흔히 행해지고 있었다.
　　
또한 림프구의 활성화용 배양백 (이하, 간단히 활성화 백이라고 칭하는 경우가 있다)을 제조함에 있어서는, 백 내에 항 CD3 항체를 포함하는 항체 용액을 봉입하여 백 내면에 항 CD3 항체를 고정화시킨 후, 백 내를 세척하여 유리 항체를 제거한 후, 림프구와 배양액을 봉입하여 활성화 배양이 이루어지고 있었다. 이와같이 백 내를 세척하여 유리 항체를 제거함으로써 림프구의 활성화를 보다 효율적으로 할 수 있게 되어 있었다.
　
[특허 문헌 1]
일본특허공개공보 특개 2007 - 175028 호 공보
이에 본 발명자들은 활성화 백에 항체 용액이 잔존하는 경우의 유리 항체에 의한 활성화에 미치는 악영향을 알아보기 위해 다양한 농도의 항체 용액을 사용하여 림프구의 활성화를 하였다.
그 결과 놀랍게도 항체 농도가 활성화 백의 제조에 사용하는 정도의 비교적 고 농도인 경우에는 림프구의 활성화가 억제되지만, 어느 일정 범위의 저 농도의 경우에는 반대로 림프구의 활성화가 촉진되고 있음이 발견되었다.
즉, 활성화 백에 항 CD3 항체를 고정화함과 동시에 저 농도의 유리 항체를 봉입함으로써 활성화 백에 의한 림프구의 활성화를 촉진할 수 있으며, 그 결과 림프구의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
여기서, 특허 문헌 1의 실시예 1에는 림프구의 활성화 백을 제조하기 위해 백내에 항 CD3 항체를 포함하는 항체 용액을 봉입하여 백 내에 항 CD3 항체를 고정화시킨 후, 항체 용액을 봉입 한 채 활성화를 실시한 것이 기재되어 있다. 또한 이 실시예 2에는 백 내면에 항 CD3 항체를 고정화시킨 후, 백 내부를 세척하고 유리 항체를 제거 한 후 림프구와 배양액을 봉입하여 활성화를 실시한 것이 기재되어 있다. 그리고 그 결과, 항체 용액을 봉입한 채 활성화를 실시한 실시예 1이 백 내부를 세척하여 유리 항체를 제거한 실시예 2보다 림프구의 증식 효율이 낮았다는 것이 나타내고 있다.
　　
즉, 실시예 1에서는 백내에 다량의 유리 항체가 남아 있었기 때문에 림프구의 활성화가 억제되어 실시예 2보다 림프구의 증식 효율이 낮아진 것으로 생각된다.
한편, 특허 문헌 1에는 림프구의 활성화 효율을 보다 향상시키기 위해 항 CD3 항체를 고정화한 활성화 백에 일정 범위의 저 농도의 유리 항체를 봉입 하는 것에 대해서는 기재도 시사도 되어 있지 않다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 림프구를 종래보다 고효율로 활성화할 수 있는 배양 용기 및 그 제조 방법의 제공을 목적으로한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 배양 용기는 림프구를 활성화시키기 위한 연포재로 이루어진 주머니 모양의 배양 용기이며, 마주하는 용기 내면의 한쪽면에 항 CD3 항체가 10 ~ 300ng / cm2의 밀도 (이하, 단위 면적당 항체 고정화 양을 단순히 밀도라고 칭하는 경우가 있다)로 고정화되어 있으며, 또한, 용액 상태의 항 CD3 항체가 상기 한쪽면으로 이루어진 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입되어 있는 구성으로 되어 있다.
또한, 본 발명의 배양 용기의 제조 방법은 림프구를 활성화시키기 위한 연포재로 이루어진 주머니 모양의 배양 용기의 제조 방법이며, 마주하는 용기 내면의 한쪽면에 항 CD3 항체를 10 ~ 300ng / cm2의 밀도로 고정화하고 용액 상태의 항 CD3 항체를 상기 한쪽면으로 이루어진 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입하는 방법으로 되어 있다.
본 발명에 의하면, 림프구를 종래보다 고효율로 활성화 할 수 있는 배양 용기 및 그 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
[도 1] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기의 개략을 나타내는 정면 모식도이다.
[도 2] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기의 개략을 나타내는 평면 모식도이다.
[도 3] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기에 림프구와 배양액을 봉입하여 활성화 배양을 하는 모습을 나타내는 정면 모식도이다.
[도 4] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기의 응용예를 개략적으로 나타내는 정면 모식도이다.
[도 5] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기에 의한 각종 유리 항체 농도 (10ng / ml ~ 500ng / ml)의 세포 증식 배율을 나타내는 실험 1 (활성화 배양 공정 만)의 결과를 나타내는 도면이다.
[도 6] 본 발명의 실시 형태에 관한 배양 용기에 의한 각종 유리 항체 농도 (5ng / ml, 10ng / ml)의 세포의 증식 배율을 나타내는 실험 2 (활성화 배양 공정 + 증폭 배양 공정)의 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 배양 용기 및 배양 용기의 제조 방법의 실시 형태에 대해서 도 1 내지 4를 이용하여 상세하게 설명한다. 도 1은 본 실시 형태에 관한 배양 용기의 개략을 나타내는 정면 모식도, 도 2는 동 평면 모식도이고, 도 3은 이 배양 용기에 림프구와 배양액을 봉입하여 활성화 배양을 하는 모습을 나타내는 정면 모식도이다. 또한 도 4는 이 배양 용기의 응용예의 개략을 나타내는 정면 모식도이다.
[배양 용기]
도 1, 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 관한 배양 용기 (10)는 상하로 마주하는 용기 벽을 가지고 있다. 그리고 용기 내면의 한쪽이 항체 (12)를 고정화한 고정화면 (11) (도 1, 2의 용기내의 바닥)이 되어 있고, 이 고정화면 (11)이 배양 표면으로서 사용된다. 또한, 배양 용기 (10)내에는 항체 (12)가 유리 (遊離)하는 항체 용액 (13)이 봉입되어 있다.
또한, 배양 용기 (10)에는 튜브 (14)가 접속가능한 포트가 구비되고, 이에 의해서 배양 용기 (10) 내에 대한 림프구와 배양액의 봉입 및 배양한 림프구와 배양액의 회수가 이루어진다. 도 1, 2의 예에서는 하나의 튜브 (14)가 배양 용기 (10)에 접속되어 있지만, 2 개 이상 접속되어 있어도 된다.
　
배양 용기 (10)는 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 갖는 필름을 사용하여 주머니 모양 (백 형)으로 형성되어 있다. 이러한 배양 용기 (10)의 재료로서 폴리에틸렌이나 폴리 프로필렌 등의 폴리올레핀 계 수지를 알맞게 사용할 수 있다.
　
고정화면 (11)에 고정화하는 항체 (12)로서는 항 CD3 항체가 사용된다. 림프구는 항 CD3 항체에 의해서 활성화되어 증식시킬 수 있다.
고정화면 (11)에서의 항체 (12)의 고정화의 밀도는 10 ~ 300ng / cm2로 하는 것이 바람직하고, 10 ~ 40 ng / cm2로 하는 것이 보다 바람직하다.
항체 (12)의 고정화의 밀도를 10ng / cm2 이상으로 하면 림프구를 효과적으로 활성화시킬 수 있다. 또한 고정화면 (11)에서의 항 CD3 항체의 최밀 충전 밀도(最密充塡密度)는 300ng / cm2 이기 때문에 항체 (12)를 이 밀도 범위까지 고정화함으로써 림프구를 적합하게 활성화가 가능하다. 또한 항체 (12)의 고정화의 밀도를 10 ~ 40ng / cm2로하면 림프구의 증식 효율을 특히 크게 향상시킬 수 있다.
　
배양 용기 (10)에는 배양 면으로서 사용되는 고정화면 (11)에서 용액 상태의 항체 (12)를 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입하는 것이 바람직하다. 배양 용기 (10)에 용액 상태의 항체 (12)를 이와같은 양으로 봉입함으로써 림프구의 활성화를 보다 향상시킬 수 있으며, 그 결과로서 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있기 때문이다.
이러한 관점에서 용액 상태의 항체 (12)를 배양면 1cm2 당 0.5 ~ 300ng 또한 0.1 ~ 600μl의 양으로 봉입하는 것이 보다 바람직하고, 1 ~ 200ng 또한 0.1 ~ 400μl 양으로 봉입하는 것이 더욱 바람직하고, 1 ~ 200ng 또한 0.1 ~ 200μl의 양으로 봉입하는 것이 한층 더 바람직하다.
　
또한, 배양 용기 (10)에서의 유리된 항 CD3 항체의 농도 (이하, 단순히 유리 항체 농도라고 칭하는 경우가 있다)를 5 ~ 100ng / ml로 하는 것이 바람직하다. 유리 항체 농도를 이러한 범위로 함으로써 림프구의 활성화를 보다 향상시킬 수 있으며, 그 결과로서 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있기 때문이다.
　　
여기서 연포재로 이루어진 배양 용기를 사용한 세포 배양은 뛰어난 배양 효율을 얻기 위해 일반적으로 배양액의 액두께를 0.2 ~ 2cm로서 이루어지는 경우가 많다. 유리 항체 농도가 5ng / ml인 경우 액두께를 0.2cm로 하면 1cm2 당 항체량은 1ng이 된다. 또한 유리 항체 농도가 100ng / ml인 경우 액두께을 2cm로 하면 1cm2 당 항체량은 200ng이 된다. 따라서 유리 항체 농도를 5 ~ 100ng / ml로 하고 배양액의 액두께를 0.2 ~ 2cm로 하면 배양 용기 (10)에는 용액 상태 항체 (12)가 배양면 1cm2 당 1 ~ 200ng인 양으로 봉입된다.
　
또한 세포 밀도의 조정 등의 이유로 배양 액의 두께가 0.05 ~ 4cm의 범위에서 선택되는 경우가 있다. 이 경우의 유리 항체 농도를 5 ~ 100ng / ml로하고 배양을 하려면, 유리 항체 농도가 5ng / ml의 경우 액두께를 0.05 cm하면 1cm2 당 항체량은 0.25ng이된다. 또한 유리 항체 농도가 100ng / ml의 경우 액두께을 4cm로하면 1cm2 당 항체량은 400ng이 된다. 따라서 배양 용기 (10)에는 용액 상태의 항체 (12)가 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng의 양으로 봉입된다.
　
또한 용액 상태의 항 CD3 항체를 배양 용기에 배양 면적 1cm2 당 0.1 μl보다 적은 양으로 봉입하는 것은 어렵기 때문에, 0.1 μl 이상의 양으로 봉입하는 것이 바람직하다. 또한 연포재로 이루어진 배양 용기의 취급 등의 관점에서 통상적으로 사용되는 배양 용기의 용량은 배양 면적 1cm2 당 4000μl 이하인 경우가 많고, 배양액량에 대한 항체 용액량의 비율은 뛰어난 배양 효율을 얻기 위해, 바람직하게는 20 % 이하, 보다 바람직하게는 10 % 이하, 더욱 바람직하게는 5 % 이하로 하는 것이 바람직하다. 따라서 용액 상태의 항 CD3 항체를 배양 용기에 배양 면적 1cm2 당 800μl 이하의 양으로 봉입하는 것이 바람직하고, 400μl 이하의 양으로 봉입하는 것이 더욱 바람직하고, 200μl 이하의 양으로 봉입하는 것이 더욱 바람직하다.
　
이러한 배양 용기 (10)에 림프구와 배양액을 튜브 (14)를 통해서 주입하여 림프구의 활성화를 실시함으로써 항체 12의 고정화만이 이루어지고 있는 배양 용기를 사용하는 경우와 비교하여 림프구를 항 CD3 항체에 적합하게 접촉 시킬 수 있고, 림프구의 활성화 효율을 보다 향상시킬 수 있다.
도 3은 이러한 활성화 배양의 모습을 모식적으로 나타낸 것이며, 배양 용기 (10)의 바닥 내면에 항체 (12)가 고정화됨과 동시에 항체 (12)가 배양액 (30)에서 낮은 농도로 유리 하고있다. 그리고 림프구 (20)가 고정화된 항체 (12)와 유리되어 있는 항체 (12)에 의해서 활성화되도록 되어 있다.
　　
또한, 본 발명의 실시 예에 관한 배양 용기를 도 4에 도시한 바와 같이, 고정화면 (11)에 대향하는 용기 내면 (이하, 대향면이라 칭하는 경우가 있다)에 항 CD3 항체를 고정화면 (11)에서의 밀도보다 작은 밀도로 고정화 된 배양 용기 (10a)로서 구성하는 것도 바람직하다.
즉, 대향면이 항체 (12)가 고정화되지 않은 비 고정화면인 경우, 예를 들면 보관시나 운송시에 용액 중의 유리 항체가 비 고정화면에 흡착하면 배양 용기에서의 유리 항체의 농도가 저하되므로 그 농도 제어가 어려워 진다.
　　
따라서, 본 실시 형태의 배양 용기 (10a)에서는 대향면에 항 CD3 항체를 고정화함으로써 배양 용기에서의 유리 항체의 농도가 저하되는 것을 억제 가능하게 하고 있다. 대향면에 고정화하는 항 CD3 항체의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 고정화면 (11)의 0.01 ~ 0.9 배 정도의 밀도로 하는 것이 바람직하다.
　　
[배양 용기의 제조 방법]
본 실시 형태의 배양 용기 (10)는, 예를 들면 다음과 같이 제조 할 수 있다.
먼저, 플라스틱 압출 성형 장치를 사용하여 저밀도 폴리에틸렌을 압출성형하여 필름을 형성한다. 그리고 임펄스 실러를 사용하여 이 필름에서 백형의 배양 용기 (10)를 제조한다. 또한 튜브 (14)를 배양 용기 (10)에 포트를 통하여 접속한다
　
다음에 배양 용기 (10)를 적재대에 적재하여 소정량의 기체를 봉입하는 동시에, 항체 (12)를 용해한 완충액을 계속 봉입한다. 그리고 배양 용기 (10)를 요동하는 등으로 배양 용기 (10)내의 바닥면상에서 완충액의 방울을 이동시키고, 완충액에 포함된 항체 (12)를 배양 용기 (10)내의 저면위에 부착시킨다.
이 때, 고정화면 (11)에 고정화하는 항체 (12)로서 항 CD3 항체를 사용하여 전술한 바와 같이, 고정화면 (11)에서의 항체 (12)의 고정화의 밀도는 10 ~ 300ng / cm2 로하는 것이 바람직하고, 10 ~ 40ng / cm2 로 하는 것이 보다 바람직하다.
　
또한 고정화면 (11)에 대향하는 용기 내면에도 항 CD3 항체를 고정화함으로써, 도 4에 도시하는 배양 용기 (10a)를 제조 할 수 있다.
이 때, 항 CD3 항체를 고정화면 (11)의 0.01 ~ 0.9 배 정도의 밀도에 의해 고정화하는 것이 바람직하다.
　　
또한, 이렇게 하여 항체 (12)가 고정화된 배양 용기 (10) (또는 배양 용기 10a) 내에 용액 상태의 항 CD3 항체를 배양면 (고정화면 (11)) 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입한다. 또한, 전술 한 바와 같이, 용액 상태의 항 CD3 항체를 배양면 1cm2 당 0.5 ~ 300ng 또한 0.1 ~ 600μl의 양으로 봉입하는 것이 보다 바람직하고, 1 ~ 200ng 또한 0.1 ~ 400μl 양으로 봉입하는 것이 더욱 바람직하며, 1 ~ 200ng 또한 0.1 ~ 200μl의 양으로 봉입하는 것이 더욱 바람직하다.
　　
이상 설명한 바와 같이, 본 실시예에 의하면, 항체 (12)가 고정화된 고정화면 (11)을 구비하는 동시에, 용액 상태의 항 CD3 항체가 상기 최적의 양으로 봉입 된 배양 용기를 얻을 수 있다. 그리고 이러한 배양 용기에 의해서 림프구를 종래보다 고효율로 활성화 할 수 있고, 림프구의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
[실시예]
다양한 농도의 항체 용액을 봉입한 배양 용기를 제조하여 림프구의 활성화를 실시하고, 각각의 배양 용기에 의한 림프구의 증식 효율을 확인하였다. 구체적으로는 다음과 같이 실시하였다.
<실험 1>
[배양 용기의 제작]
라보프라스트밀 (도요세이기제작소 제)를 사용하여 저밀도 폴리에틸렌을 압출 성형하여 두께 100μm의 필름을 성형하고, 임펄스 실러로 11cm ×20.5cm (약 225cm2) 의 백을 제작하였다.
　
[항체 고정화]
이 백에 에어 약 250ml를 봉입하여 20 μg의 항 CD3 항체 (다카라 바이오 주식회사 제)를 용해한 인산 완충액 (항체 용액, 라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사 제) 2ml를 봉입했다. 그리고 백을 요동하여 액체 방울을 10m / 분의 속도로 2.5 분간 백 내면상에서 이동시켰다. 이어서 항체 용액을 배출한 후, 인산 완충액 2ml를 봉입하여 10m / 분의 속도로 2.5 분간 백 내면상에서 이동시키고 배출함으로써 세척하고, 백 내면에서 유리 항체를 제거하였다. 고정화된 항체량을 BCA 법으로 측정 한 결과, 37ng / cm2 의 고정화 양이었다.
　
[활성화 배양 시험용 백 제작]
항체를 고정화한 백을 임펄스 실러로 5cm ×5cm로 재조정하고 활성화 배양 시험에 사용하기 위한 백을 제작하였다. 다음으로 배양시의 유리 항체의 농도가 각각 10ng / ml, 50ng / ml, 100ng / ml, 200ng / ml, 500ng / ml가되도록, 항 CD3 항체를 용해시킨 인산 완충액 (각각 1μ g / ml, 5μg / ml, 10μg / ml, 20μg / ml, 50μg / ml) 50μl를 활성화 시험용 백에 봉입히였다. 또한 대조 실험으로서 항 CD3 항체를 용해시킨 인산 완충액을 봉입하지 않은 백을 준비하였다.
　　
[림프구의 활성화 공정]
림프구의 일종인 인간 말초혈 단핵구 (Cell Applications, INC. 제) 8.2 ×10 5 개를 2 % 우태아 혈청 (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사 제)이 들어간 ALyS505N-7 (주식회사 세포 과학 연구소) 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 준비하였다. 그리고 세포 현탁액 5ml를 각각 활성화 배양 시험용 백에 봉입하였다.
　　
이들 백을 37 ℃에서 116 시간 정치 배양함으로써 림프구의 활성화를 실시하였다. (활성화 배양 공정) 그리고 활성화 배양 종료시에 백에서의 세포 수를 계산하여 증식 배율을 산출하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
이 도에 도시하는 바와 같이, 림프구의 증식 배율은 대조 실험 (고정화만 함)이 4.30 배이며, 유리 항체 농도 10ng / ml가 5.24 배, 유리 항체 농도 50ng / ml 5.20 배, 유리 항체 농도 100ng / ml가 4.88 배, 유리 항체 농도 200ng / ml가 3.77 배, 유리 항체 농도 500ng / ml가 3.18 배였다.
　　
즉, 유리 항체 농도가 10ng / ml ~ 100ng / ml인 경우 고정화된 항체만으로 활성화하는 경우보다 증식 효율이 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
이에 대해 유리 항체 농도가 200ng / ml 이상인 경우에는 고정화된 항체에 의해서만 활성화하는 경우보다 증식 효율이 저하되어 있는 것을 알 수 있다.
이와 같이, 유리 항체 농도가 상기 일정 범위의 저농도인 경우에는 림프구의 증식 효율을 보다 향상시킬 수 있다. 한편, 유리 항체 농도가 보다 큰 경우에는 림프구의 활성화가 억제되어 증식 효율이 감소되었다고 생각된다.
　　
<실험 2>
배양 용기에서의 유리 항체 농도가 10ng / ml 미만인 경우의 림프구의 증식 효율을 확인하기 위한 실험을 하였다. 배양 용기의 제작 및 항체 고정화에 대하여는 실험 1과 동일하게 하였다.
　　
[활성화 배양 시험용 백의 제작]
항체를 고정화한 백을 임펄스 실러로 5cm ×5cm로 재조정하여 활성화 배양 시험에 사용하기 위한 백을 제작하였다. 다음으로 배양시의 유리 항체의 농도가 각각 5ng / ml, 10ng / ml가되도록, 항 CD3 항체를 용해한 인산 완충액 (각각 0.5μg / ml, 1 μg / ml) 50μl를 활성화 시험용 백에 봉입하였다. 또한 대조 실험으로서 항 CD3 항체를 용해한 인산 완충액을 봉입하지 않은 백을 준비하였다.
　
[림프구의 활성화 공정]
림프구의 일종 인 인간 말초혈 단핵구 (Cell Applications, INC. 제) 8.6 ×10 5 개를 2 % 우태아 혈청 (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사제) 이 들어있는 ALyS505N-7 (주식회사 세포 과학 연구소) 배지에 현탁하여 세포 현탁액을 준비하였다. 그리고 세포 현탁액 5ml를 각각 활성화 배양 시험용 백에 봉입하였다.
그리고 이들 백을 37 ℃에서 122 시간 정치 배양함으로써 림프구의 활성화를 실시하였다.
　　
다음으로 활성화 된 림프구를 항체가 고정화되지 않은 접시 (코닝 제)에 옮겨 담아 적당히 희석조작을 하여 192 시간 동안 배양 하였다 (증폭 배양 공정). 그리고 증폭 배양 종료시 백에서의 세포 수를 계산하여 증식 배율을 산출하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
이 도면에 도시한 바와 같이, 림프구의 증식 배율은 대조 실험 (고정화만 함)이 73 배이며, 유리 항체 농도 5 ng / ml가 125 배, 유리 항체 농도 10 ng / ml가 103 배였다.
즉, 유리 항체 농도가 5 ng / ml 및 10ng / ml인 경우는 모두 고정화된 항체에 의해서만 활성화하는 경우보다 증식 효율이 크게 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
　
이상과 같이, 실험 1과 실험 2의 결과에 따라 배양 용기에서의 유리 항체 농도가 5 ~ 100 ng / ml인 경우 고정화된 항체에 의해서만 활성화하는 경우보다 증식 효율이 향상 할 수 있음이 확인되었다.
　
본 발명은 이상의 실시 형태나 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능함은 물론이다.
예를 들면, 배양 용기의 크기, 림프구의 종류 및 배지를 실시예와는 다르게 하는 것 등 적절하게 변경하는 것이 가능하다.
본 발명은 림프구를 대량 배양하는 경우에 적합하게 이용할 수 있다.
　
이 명세서에 기재된 문헌 및 본원의 파리 우선의 기초가되는 일본 출원 명세서의 내용을 모두 여기에 원용한다.
10, 10a 배양 용기
11 고정화면
12 항체
13 항체 용액
14 튜브
20 림프구
30 배양액

Claims (5)

  1. 림프구를 활성화시키기 위한 연포재로 이루어지는 주머니 모양의 배양 용기이며, 대향하는 용기 내면의 한쪽 면에 항 CD3 항체가 10 ~ 300ng / cm2의 밀도로 고정화되어 있으며, 또한, 용액 상태의 항 CD3 항체가 상기 한쪽 면으로 이루어진 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용액 상태의 항 CD3 항체가 상기 배양면 1cm2 당 1 ~ 200ng 또한 0.1 ~ 200μl의 양으로 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양면에 대향하는 용기 내면에 항 CD3 항체가 상기 배양면에서의 밀도보다 작은 밀도로 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양 용기내의 유리된 항 CD3 항체의 농도가 5 ~ 100ng / ml 인 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  5. 림프구를 활성화시키기 위한 연포재로 이루어지는 주머니 모양의 배양 용기의 제조 방법이며,
    대향하는 용기 내면의 한쪽 면에 항 CD3 항체를 10 ~ 300ng / cm2의 밀도로 고정화하고,
    용액 상태의 항 CD3 항체를 상기 한쪽 면으로 이루어진 배양면 1cm2 당 0.25 ~ 400ng 또한 0.1 ~ 800μl의 양으로 봉입하는
    것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
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